pcr 技术及其应用

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分子生物学第五章分子杂交技术

PCR 技术及其应用

申川军广州中医药大学生物化学教研室



参考书［美］ CW 迪芬巴赫 GS 德弗克斯勒本书由美国冷泉港实验室出

版社组织国际权威实验室的专家共同研讨并撰稿，是对其 10 年前广受赞誉的第一版的全新修订。全书共 8 篇，分别介绍了 PCR 方法基本原理，样品制备，引物设计，PCR 产物的检测， PCR 介导的克隆， PCR 法制备突变体，以及利用 PCR 进行基因的差异表达分析， RNA样品的 PCR 方法等。 70元



背景由 Khorana 及其同事于 1971 年提出：“经

过 DNA 变性，与合适引物杂交，用 DNA 聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆 tRNA 基因”。

但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时 (1970 年 )Smith 等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使 Khorana 等的早期设想被人们遗忘。



１９８３年，在Ｃｅｔｕｓ公司工作的 Mullis 着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。

在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了 Mullis 一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。ＰＣＲ被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。

１９９３年， Kary Mullis 因此获得诺贝尔化学奖。



PCR 只是一个简单的不起眼玩艺 —— 凯利 · 穆利斯（ Kary

Mullis)

PCR 只是一个概念，所发生的奇迹是： PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 …

它最大的特点就是能不断推出新形式。

——Paul Rabinow



PCR 技术聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction) 简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

在模板 DNA、引物和 4种脱氧核苷酸（ dNTP）存在的条件下，由耐热 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）在体外反复酶促合成双链 DNA 的反应称为聚合酶链式反应。



# PCR 反应五要素：

● ● 模板模板 DNADNA：： 50-200ng50-200ng ，高纯度，增加反应特，高纯度，增加反应特异性异性

● ● PCRPCR 用引物：用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。根据目的基因两侧特定序列设计。约约 20bp20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在左右；Ｇ＋Ｃ含量在 40-7040-70％之间；％之间；内部不能有回文序列；３’端不能互补。内部不能有回文序列；３’端不能互补。

● ● PCRPCR 用用 DNADNA聚合酶：聚合酶：嗜热杆菌、耐热嗜热杆菌、耐热 95℃95℃

● ● PCRPCR 用用 Buffer Buffer ：： Mg2+Mg2+ 是辅基（是辅基（ 2.0mM2.0mM）。）。浓度太浓度太低酶活力降低；太高反应特异性降低。低酶活力降低；太高反应特异性降低。

● ● dNTPdNTP ：： 100μM100μM～～ 200μM200μM

● ● 模板模板 DNADNA：： 50-200ng50-200ng ，高纯度，增加反应特，高纯度，增加反应特异性异性

● ● PCRPCR 用引物：用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。根据目的基因两侧特定序列设计。约约 20bp20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在左右；Ｇ＋Ｃ含量在 40-7040-70％之间；％之间；内部不能有回文序列；３’端不能互补。内部不能有回文序列；３’端不能互补。

● ● PCRPCR 用用 DNADNA聚合酶：聚合酶：嗜热杆菌、耐热嗜热杆菌、耐热 95℃95℃

● ● PCRPCR 用用 Buffer Buffer ：： Mg2+Mg2+ 是辅基（是辅基（ 2.0mM2.0mM）。）。浓度太浓度太低酶活力降低；太高反应特异性降低。低酶活力降低；太高反应特异性降低。

● ● dNTPdNTP ：： 100μM100μM～～ 200μM200μM



反应 BufferBuffer• pH值 , 盐离子浓度•稳定剂 ,增强剂

Mg 2 ＋浓度•过高非特异性严重•过低无扩增产物

dNTP MixturedNTP Mixture•浓度适当•避免反复冻融

* 反应体系对 PCR 扩增的影响



# 反应分为三步：

DNA模板变性 (denaturing)在在 93-95℃93-95℃之间使模板充分变性之间使模板充分变性

单链 DNA模板与引物退火 (annealling) 55℃℃左右，此温度选择根据模板和引物配对结左右，此温度选择根据模板和引物配对结

合强弱而定，是反应特异性的决定因素合强弱而定，是反应特异性的决定因素

引物延伸 (extension)70-72℃左右，为 Taq 酶最适反应温度。



# PCR 原理：



* 30次循环后靶序列扩增的数量

No. of No. Amplicon Cycles Copies of

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

20 1,048,576

30 1,073,741,824

1 cycle = 2 Amplicon










# PCR 实验方法1. 向无菌的 200或 500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液

反应物体积 10×buffer 2.5μl

dNTP(1mM) 2.5μl

MgCl2 (25mM) 2.5μl

引物 2μl

模板ＤＮＡ (20ng) 4μl

Taq 酶 (1U/ul) 1μl

无菌水 10.5μl

总体积 25μl



2. 反应体系混匀，离心3. 在 PCR仪上设定以下程序：

4. 取 20μl 反应液加 4μl Loading buffer 在 1.2％琼脂糖凝胶上 90-120V ，电泳 30-50min 。

5. 在凝胶自动成像系统上观察记录实验结果

94℃预变性 3-5min94℃变性 30s55℃退火 30s 30 个循环72℃延伸 1min72℃延伸 10min



# PCR 的种类逆转录 PCR（ reverse transcription PCR ， RT-PCR）

反向 PCR（ inverse PCR）

嵌套式 PCR（ nesting PCR）

原位 PCR（ in situ PCR）

荧光定量 PCR（ fluorescent quantitative PCR）

多重 PCR（multiplex PCR）

实时 PCR （ Real-time PCR）

多重等位基因 PCR（multiplex allele PCR）

不对称 PCR（ asymmertric PCR）

锚定 PCR（ anchored PCR）长片段 PCR（ long fragment PCR）



逆转录酶

DNA 聚合酶

mRNA

cDNA

杂化双链

PCR 扩增

RT-PCR


分子生物学第五章分子杂交技术反向 PCR- cDNA 5’- 端的快速扩增 /5’-RACE



5’ RACE 的实验方法 -PSPtet RNA的 5’末端1. 体外转录 PSPtet RNA。2.配制 PSPtet RNA和人总 RNA的混合样

品。3. 设计合成 5 条引物。4. 使用 5’ RACE法获取 PSPtet RNA的5’末端。

5. 切胶回收目的 DNA片段。6. 进行 DNA测序确认序列结果。



PSPtet RNAPSPtet RNA

体外转录体外转录

PSPtet RNAPSPtet RNA

体外转录体外转录



PSPtet RNA的电泳结果

1 ： PSPtet RNA

M： DL2,000 Marker

1 M



RNA Mixture 的配制将 PSPtet RNA与人总 RNA按 1 ： 105 的比例混合，此混

合物用于 5’ RACE实验。



人总 RNA的电泳结果

1 M

1 : Human Total RNA

M :λHind III Marker


分子生物学第五章分子杂交技术PSPtet RNA的 5’端序列AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT···········



五条引物与 PSPtet RNA的位置关系图

未知序列

5’ 3’



5 条引物的详细序列RT Primer ： 5’-(p)AAAATGACCCAG- 3’

F1 Primer ： 5’-GTCCTGTGGATCCTCTACGC- 3’

R1 Primer ： 5’-AGCCACTATCGACTACGCGAT- 3’

F2 Primer ： 5’-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG- 3’

R2 Primer ： 5’-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA- 3’



Step1. 反转录反应

RNA Mixture

10×RT Buffer

RNase Inhibitor (40 U/l)

AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/l)

5’ 磷标记反转录引物 (200 pmol/l)

RNase Free dH2O up to

30℃ 10 分钟→ 50℃ 30 分钟→ 80℃ 2 分钟→ 4℃ 保存

1.反应液组成 :

2.反应条件 :

3.0 g

1.5 l

0.5 l

1.0 l

1.0 l

15 l



Step2. Hybrid RNA的分解

1st Strand cDNA反应液

5×Hybrid RNA Degeneration Buffer

RNase H (60 U/l)

dH2O up to

30℃; 1 小时→乙醇沉淀

1.反应液组成 :

2.反应条件 :

15 l

15 l

1 l

75 l



Step3. 单链 cDNA 的自身连接反应

Step2 的 cDNA 沉淀物

5×RNA (ssDNA) Ligation Buffer

dH2O

40% PEG#6000

T4 RNA Ligase (40 U/l)

16℃; 过夜反应

1.反应液组成 :

2.反应条件 :

8 l

12 l

20 l

1 l



Step4. PCR 反应 (1st PCR)

Step3 的连接反应液

10×LA PCR Buffer II

dNTP Mixture (2.5 mM each)

Primer F1 (20 mM)

Primer R1 (20 mM)

TaKaRa LA Taq (5 U/l)

dH2O up to

1.反应液组成 : 2.反应条件如下 :1.0 l

5.0 l

8.0 l

0.5 l

0.5 l

0.5 l

50 l

94℃ 3 min

94℃ 30 sec

55℃ 30 sec

72℃ 30 sec25 Cycles



Step4. PCR 反应 (2nd PCR)

1st PCR 反应液

10×LA PCR Buffer II

dNTP Mixture (2.5 mM each)

Primer F2 (20 mM)

Primer R2 (20 mM)

TaKaRa LA Taq (5 U/l)

dH2O up to

1.反应液组成 : 2.反应条件如下 :1.0 l

5.0 l

8.0 l

0.5 l

0.5 l

0.5 l

50 l

94℃ 30 sec

55℃ 30 sec

72℃ 30 sec

30 Cycles



2nd PCR 反应结果M 1

M : DL2000 Marker

1 ： PCR 产物



●切胶回收电泳结果如下

1 ：回收DNA片段

M ： DL2000 Marker

1 M

Step5. 目的 DNA 片段的切胶回收



Step 6. DNA 片段的序列测定



未知序列

5’ 3’

测序结果与五条引物间的关系


分子生物学第五章分子杂交技术PSPtet RNA的 5’端序列AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGA

TAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT···········



差异显示 PCR

又名mRNA 差异显示 PCR（mRNA differential display PCR ， DD-PCR）

又名差异显示反转录 PCR（ differential display reverse transcription PCR ， DDRT-PCR）



某组织总mRNA 12种 3’锚定引物（ T12MA、 T12MG、 T12MC、 T12MT）反转录酶

12种 cDNA 第一链 24~26种 5’十聚随机引物分别与第一链进行 PCR 反应 (288~312 次 ) Taq 聚合酶

cDNA双链可获得哺乳动物细胞内所有 cDNA 的片段

M=G、 C、 A



（荧光）定量 PCR

概念：以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或 PCR 过程的监测，对 PCR 起始模板量的定量。分类：分为三大类，即外标方法、动力学方法、内标共扩增方法。



外标法定量 PCR ：



原理—— Taq 酶：用于荧光定量 PCR 的 Taq 酶不仅具有 DNA 聚合酶活性（延伸DNA 引物），而且具有 5’ → 3’ 核酸外切酶活性，可以在延伸过程中实现链替换，并将被替换的单链切断。

外标法—— TaqMan 实时荧光定量 PCR ：



– 5’ 端标记信号基团或报告基团 (Reporter, R) ，单独存在时可以发光 (FAM、 VIC)

– 3’ 端标记荧光抑制基团（ Quencher ， Q ）， Q

基团对 R 基团有抑制作用，存在时可抑制 R 基因的功能，不产生发光现象

– 当溶液中有 PCR 产物时，该探针可与模板的特异序列结合，结合位点在两条引物之间

– 当 Taq 酶靠近探针时，激活了 Taq 酶的外切酶活性，将探针 5’ 的 R 切下， R 基团发出荧光

–根据荧光强度计算初始模板的数量（同步指数增长）

原理——荧光标记的基因探针：



信号基因R

抑制基因



Rn值是表示在各个反应循环数仪器所检测的荧光信号值



PCR高灵敏性

光谱技术高精确性

高灵敏性高特异性高精确性

DNA 杂交高特异性

特点：



致突变 PCR

M. Smith

加拿大生物化学家

发现 “定点突变”

源头创新、革命性、突破性。对基因学、基因组学及蛋白组学的研究具有巨大影响

1993年诺贝尔化学奖



随心所欲地在已知 DNA 序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，改变原有序列的特征。

定向性、可选择性、无 (少 ) 干扰性、可靠性、高效率、简易性、可重复性

特点：

定义：



原位 PCR

• Hasse 等于 1990 年建立。• 是指在组织细胞里进行 PCR 反应，它结合

了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的 PCR 技术的优点。

• 原位 PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。



• 组织处理有何要求：处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的 DNA或 RNA ，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。



• 原位 PCR 的实验过程：实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞玻片上滴加 PCR 反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位 PCR仪上进行 PCR循环扩增，PCR 扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。


分子生物学第五章分子杂交技术1）预处理：（ 1）切片常规脱蜡；（ 2） 0.2mol/L HCl处理 10min；（ 3） 5μg/ml蛋白酶 K消化组织 37 10min℃ ；（ 4） Nase消化组织 37 30min℃ ；（ 5）梯度酒精脱水，室温干燥。

2）原位扩增：（ 1）切片滴加特异性序列引物 30μLPCR 扩增反应液，覆

盖硅化盖玻片，石蜡油封边；（ 2） PCR热循环： 94℃， 1min； 55℃， 1min； 72℃，

1.5min ，共 25～ 30 个循环， 72℃延伸 10min；（ 3）氯仿洗去盖玻片， 4％多聚甲醛后固定 10min ，梯度

酒精脱水，干燥。 3) 原位杂交：

（ 1）加标记探针的杂交液， 98℃变性 10min ， -20℃退火

5min ， 42℃杂交过夜。（ 2）杂交后 2×SSC洗 10min/3 次， 1×SSC洗 10min/3 次（ 3）缓冲液洗涤 10min ， 3 次；（ 4）加 AP标记的羊抗地高辛抗体复合物， 37℃， 2h；（ 5）缓冲液洗涤 5min ， 3 次；（ 6） NBT、 BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。（ 7）常规脱水：透明、封固。



PCR 技术的应用• 基础研究：

扩增目的基因和鉴定重组子克隆基因基因功能和表达功能研究基因组测序制备单链模板致突变



PCR 技术的应用• 临床医学：

• 法医学：

遗传病诊断肿瘤癌症诊断病原体检测基因分型： PCR-SSOP/PCR-SSCP /RAPD-PCR

pcr 技术及其应用

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