pauline blin - inra · 7 cmab, hp, pyoverdine sidechain (siderophores) 2209 8 glucoside...
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Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016
Pauline Blin
Directeur de thèse : Denis Faure Equipe « interaction plantes-bactéries »
I2BC - CNRS
Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016 2
© J.Cigna
© J.Cigna
► Introduction et contexte
►Problématique
►Résultats
• Diversité des populations
• Phytoprotection
Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016
Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016 4
► Originaire d’Amérique du Sud et cultivée depuis 8000 ans
► 4ème culture vivrière la plus importante à l’échelle mondiale après le maïs, le blé et le riz
► Cultivée dans 150 pays et les surfaces de cultures sont en constantes augmentation
► Plusieurs milliers de variétés dans le monde entier, dont 200 sont inscrites au Catalogue officiel des espèces
et variétés végétales (et donc autorisées à la culture en France)
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3 filières interdépendantes :
► Consommation
► Transformation (industrie fécule)
► Plants ou semences
6% 16%
78%
Production 2010 de pommes de terre par filière
(Semence ; 350 000 tonnes/an,
Exportation : 150 000 t)
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• Comité Nord Plants de Pomme de Terre
• Bretagne Plants
• Comité Centre et Sud
Organismes certificateurs :
Les missions du Comité Nord Plants de Pomme de Terre
► Contrôle et certification des plants
► Production et multiplication des plants
► Recherche et Développement : méthodes de détéction et de lutte contre les pathogènes et création
variétale
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-Perte de 2% de la production totale des plants en France (environ 10 000 t/an)
~160 maladies
Bactéries
Virus Autres, non déterminées
Champignons Motifs de refus à la certification en France
(année 2013/2014)
Maladies de la jambe noire et
de la pourriture molle
3%
37%
60%
Autres maladies (bactéries,
champignons…)
Maladies à virus
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Causée par: - Dickeya dianthicola - Dickeya solani - Pectobacterium atrosepticum - Pectobacterium carotovorum
Jambe noire
sur tige
Pourriture molle
sur tubercule
Flétrissement
sur feuille
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► Bactéries pectinolytiques (production d’enzymes de dégradation de la paroi végétale)
► Plantes hôtes : 16 familles de dicotylédones et 10 de monocotylédones pour Dickeya
Distribution géographique des Dickeya et Pectobacterium. Toth et al., 2011
P. atrosepticum
P. carotovorum
D. dianthicola
D. solani
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P. carotovorum
P. atrosepticum
P. wasabiae
Dickeya spp., Dickeya dianthicola
Pectobacterium spp.,
P. brasiliensis
Dickeya solani
2000
Pectobacterium spp., (endémique)
1970
Dickeya dianthicola (E. chrysanthemi)
Emergence de Dickeya solani Complexe
bactérien
Epidémiologie (données champs de pomme de terre)
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Comprendre la structure génétique des pathogènes et l’associer à des traits fonctionnels Adapter les moyens de lutte à ces populations pathogènes
1
2
Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016
Journée des doctorants DIM ASTREA – 25 mars 2016
39,5
52,6
7,8
Parcelle 1 - <1% JN
41,8
57,2
0,9
Parcelle 3 – 7% JN
21,2
13,3 65,2
Parcelle 2 – 60% JN
2,3
97,4
Parcelle 5 – 3% JN
20,5
78,8
Parcelle 6 – 6,5% JN
► Détection par PCR et par séquençage de “métagénomes”
► Structure des populations très hétérogène
P. atrosepticum
P. carotovorum
P. wasabiae
D. dianthicola
D. solani
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Mappings successifs entre toutes les D.
dianthicola
Récupération des séquences alignées
Mappings successifs sur d’autres espèces
Récupération des séquences non
alignées
BLAST sur toutes les souches
Validation des clusters si présents
dans toutes les souches de
D.dianthicola uniquement
gènes length (bp)
1 organic hydroperoxide resistance, transcriptionnal regulator, muconolactone isomerase, HP 3755
2 rhamnulokinase, L-rhamnose operon regulatory, alcohol dehydrogenase 2857
3 Quinone oxidoreductase, RND efflux membrane fusion protein, Cobalt zinc cadmium efflux RND 3666
4 RND efflux transporteur 2104
5 metal dependant phosphohydrolase, putative membrane protein, pyruvate kinase 4288
6 fructokinase, sucrose-6-phosphate hydrolase 2211
7 CmaB, HP, pyoverdine sidechain (siderophores) 2209
8 glucoside transporteur, HP, fructokinase 2109
9 Copper -sensing response regulator (CusR), cation efflux system protein CusC precursor 2004
► Traits spécifiques de l’espèce D. dianthicola (11 génomes séquencés)
► 7 régions spécifiques : essentiellement des gènes de métabolisme, de transport et de réponse au
stress
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Mappings successifs entre toutes les D.
solani
Récupération des séquences alignées
Mappings successifs sur d’autres espèces
Récupération des séquences non
alignées
BLAST sur toutes les souches
Validation des clusters si présents
dans toutes les souches de D.solani
uniquement
► Identification de 40 régions spécifiques, dont 9 codants pour des protéines hypothétiques et 2 étant
localisées dans des régions non codantes
► Traits spécifiques de l’espèce D. solani (20 génomes séquençés)
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a
b
c,d d
Test de Kruskal Wallis et de Tukey 3 classes d’agressivité croissantes
20 souches de D. solani 11 souches de D. dianthicola
d
Test de Kruskal Wallis et de Tukey 1 classe d’agressivité, pas de différence
significative entre les souches
d’hôtes, de pays et d’années d’isolement différents
a
b
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EU 3296
fliN
fliC rpoS
Flagelline
Régulateur de réponse aux stress
Conseil Scientifique SIPRE 20-21 Janvier 2015
Mobilité ?
• Mobilité affectée chez la souche EU 3296
swimming swarming
EU3296
3337
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►Complexification des populations (émergence de Dickeya)
►Structure des populations très hétérogènes au sein des parcelles
Observation de la structure et de la dynamique à l’année n+1
Etablir un lien entre la structure des population et les pratiques culturales
Réaliser une veille épidémiologique (nouveaux pathogènes ?)
►Identification de traits spécifiques d’espèce (7 pour dianthicola et 40 pour solani)
Caractériser ces traits spécifiques – traits d’émergence ? (création de mutants ou génétique additive)
►Agressivité variable au sein des espèce - Perte de la mobilité associée à une très faible agressivité de la
souche D. solani EU3296
Tests d’agressivité sur plante entière – corrélation ?
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Symptômes
Jambe noire
Pourriture molle
Enzymes
De macération Infection Croissance
Pectobacterium et
Dickeya
107-108 cell/g
Quorum
Sensing
N-acyl homoserine lactones (AHL)
O
O
N H R2
O R1
2. Anti-quorum sensing = Quorum quenching
1. Antibiose Y. RAOUL DES ESSARTS
Quorum Sensing : - Signaux moléculaires (AHL)
- Concentration d’ AHL - valeur seuil
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Symptômes
Jambe noire
Pourriture molle
Enzymes de
macération Infection croissanc
e
Pectobacterium et
Dickeya
107-108 cell/g
Quorum
Sensing
O
O N H R2
O R1
AHL
Y. RAOUL DES ESSARTS
Antagonistes
bactérien
(Pseudomonas)
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► Criblage et identification de 6 agents de biocontrôle contre Dickeya et Pectobacterium
► Souches isolées depuis l’environnement de la pomme de terre (rhizosphère, peau du tubercule…)
Identification de la souche Pathogène inhibé
Pseudomonas fluorescens
PA3G8
Pectobacterium et Dickeya
Pseudomonas fluorescens
PA4C2
Pectobacterium et Dickeya
Pseudomonas putida
PA14H7
Pectobacterium et Dickeya
Pseudomonas brassicacearum
PP1-210F
Pectobacterium
Pseudomonas brassicacearum
PA1G7
Pectobacterium
Bacillus simplex BA2H3 Pectobacterium
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0 3 2 Semaines
Trempage des
tubercules
puis plantation
Antagonistes (seuls ou
en mélange)
Arrosage du
substrat par
suspension
d’antagonistes
(seuls ou en mélange)
Infection
par arrosage
du substrat
avec Ddi
Observation des
symptômes 2 fois
par semaine
4 jours
Arrosage du
substrat par
suspension
d’antagonistes
(seuls ou en mélange)
► 3 apports d’antagonistes durant l’expérience
► Un seul apport en pathogène
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0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Dd04.9
Dd04.9 + PA3G8
Dd04.9 + PA14H7
Dd04.9 + PA4C2
Dd04.9 + combinaison
jours
% d
e sy
mp
tôm
es
► Dans l’ensemble, les plantes ayant reçu la combinaison des 3 antagonistes présentent moins de symptômes
que les plantes non traitées ou que les plantes traitées à l’aide d’un seul antagoniste
► Effet cumulatif de l’efficacité des agents
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Symptômes
Jambe noire
Pourriture molle
Enzymes de
macération Croissance
Pectobacterium et
Dickeya
107-108 cell/g
Quorum
Sensing
Traitement:
Rhodococcus erythropolis
R 138
O
O N H R2
O R1
AHL
= Enzyme de dégradation des NAHL (QsdA)
R138
Quorum
Quenching
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Uroz et al., (2005) Microbiology
QS-signal
Uroz et al., (2008) AEM
Pa6276 + R138
Tissus sains Pa6276 seul
Tissus macérés
Après 96h
Lactonase
Ouverture du
noyau lactone
Oxydo-reductase
Reduction de C=0
en C3 en C-OH
Acylase/amidohydrolase
Clivage de la liaison N-C
► Isolé depuis la rhizosphère de pomme de terre
► Capable d’inactiver le signal quorum sensing
► R138 est capable de limiter les symptômes dus à Pectobacterium
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Campagne 1 Campagne 2
► Diminution des symptômes avec R138 qui est
renforcée lorsque R138 est biostimulé
► Aucune diminution de symptôme, même avec
traitement R138
► Effets contrastés selon les années – Problématique multifactorielle (environnement complexe)
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►Les agents Pseudomonas et R138 montrent des effets significatifs de phytoprotection, mais doivent encore
être optimisés – effets contrastés selon les années
Mise en place d’essais en champs combinant la stratégie d’antibiose et la stratégie quorum quenching
(Pseudomonas +R138)
Mise en place d’essais en serre afin d’évaluer l’effet phytoprotecteur de R138 en s’affranchissant des
contraintes environnementales (atmosphère contrôlée) - Mise en place d’une formulation pour R138
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INTÉRACTIONS PLANTES-BACTÉRIES
Denis FAURE
Peter MERGAERT
Yves DESSAUX
Benoît ALUNNI
Eva KONDOROSI
Catherine GRANDCLEMENT
Aurélie RAFFOUX
Jérémy CIGNA
Tania TIMTCHENKO
Julien LANG
Fabienne PIERRE
Yannick RAOUL DES ESSARTS
Pauline BLIN
Slimane KHAYI
Florian LAMOUCHE
Quentin BARRIERE
COLLABORATEURS
Frédérique VAN GIJSEGEM
Jacques Pédron
Teik-Min CHONG
Kok-Gan CHANG
Valérie HELIAS
Mohieddine MOUMNI
Amélie BEURY
Euphrasie MUNIER