RESULTADOS: (GRUPO C3 )

6.1 TABLAS DE MEDIOS DE CULTIVO

A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuánto de biomasa se desea producir.

Estado: Medio líquido

Volumen del medio: 10 – 30 % del volumen del matraz

Temperatura: 35°C

pH: 4.2 (ajustar pH con tampón citrato)

Velocidad de agitación: 150rpm en el agitador orbital (shaker)

- Se utilizará como fuente de carbono y energía:

“glucosa”

Medio de Mantención:

Tabla 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL) NUTRIENTE

CONCENTRACIÓN (G/L) PESO (G)

PARA 50 ML

Extracto de Levadura 3 0.15

Peptona 5 0.25

Extracto de Malta 3 0.15

Agar 20 1.00

Glucosa 10 0.5

Medio de Activación:

Tabla 02: Concentración de Nutrientes para un medio de activación (20 mL) NUTRIENTE

CONCENTRACIÓN (G/L) PESO (G)

Glucosa 10 0.2Extracto de levadura 3 0.06Extracto de malta 5 0.1Soluciones de sales (de la tabla 04)

5ml/L 0.1

Se debe tener un Toptima= 35°C y N 240rpm

Medio Fermentación: Tabla 03: Concentración de Nutrientes para un medio de fermentación.

NUTRIENTE FUENTE CONCENTRACIÓN (g/L)

PESO (G)PARA 100 mL

xilosa C 10 1.8648Extracto de Levadura

- 3 0.6

(NH4)2SO4 N 3 0.6MgSO4.7H2O Mg 1.1 0.4KH2PO4 P y K 5 0.22Soluciones de Sales Concentradas

5 0.22

Curva de Calibrado de glucosa por Espectrofotometría por DNS (Patrón glucosa)

N° TUBO ml. de Solución Saturada

ml. de H2O destilada

Concentración (g/L)

ABS (540nm)

1 2.00 0.00 4.0 0.7922 1.75 0.25 3.5 0.6993 1.50 0.50 3 0.6114 1.25 0.75 2.5 0.5165 1.00 1.00 2.0 0.4156 0.75 1.25 1.5 0.3257 0.50 1.50 1.0 0.2028 0.00 2.00 0.0 0.000

Las concentraciones e hallaron de la siguiente manera:

TUBO N° 1 (C1)(V1) = (c2)(v2)

(2ml)(4g/L) = (2ml)(C2) C2 = 4g/L

TUBO N°2 (C1)(V1) = (c2)(v2)

(1.75ml)(4g/L) = (2ml)(C2)

C2 = 3.5g/L

Así se hizo para cada mezcla de cada tubo.

Tomando los puntos:

Concentración (g/L)

ABS (540nm)

4.0 0.7923.5 0.6993 0.6112.5 0.5162.0 0.4151.5 0.3251.0 0.2020.0 0.000

Graficamos [ abs] Vs. [X ]

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

f(x) = 0.198055137844612 x + 0.0117543859649123R² = 0.998369374126893

Curva de Calibrado de glucosa por Espectro-fotometría por DNS)

ABS (540nm) Linear (ABS (540nm) )

ABS

CON

CEN

TRAC

ION

(g/l

)

Determinación de Peso Seco Celular

CURVA PATRON DE BIOMASA

Determinación de Peso Seco Celular

MUESTRA PESO DEL CAPACHOGr.

PESO TOTAL = CÉLULA SECA + CAPACHO

PESO SECO CELULAR

1 0.1290 0.1325 0.00352 0.1242 0.1257 0.00153 0.1379 0.1422 0.00434 0.1096 0.1099 0.00035 0.1309 0.1320 0.00116 0.1338 0.1343 0.00057 0.1660 0.1661 0.0001PROMEDIO 0.0016

De las mismas muestras obtenidas (3 tubos de 5ml c/u), se determinó su absorbancia, tomando estas como 1:1, es decir, sin dilución: I.1. Determinación de biomasa por densidad óptica durante la cinética

de fermentación

TABLA Nº 02: Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124.

N° HORA tiempo (horas)

Absorbancia (640nm)

1 09:30:00 a.m. 0.00 0.0282 11:11:00 a.m. 1.81 0.0383 12:50:00 p.m. 3.20 0.0484 02:58:00 p.m. 5.28 0.0335 04:05:00 p.m. 6.75 0.0346 05:20:00 p.m. 7.90 0.0327 06:15:00 p.m. 8.85 0.038

FIGURA 1: Curva de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la glucosa.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

0.05

Tiempo (horas)

Abso

rban

cia (6

40 nm

)

TABLA N° 03: DATOS DEL ANÁLISIS PESO SECO

N° Muestra

Peso inicial

(g)

Peso final (g)

X(g/5mL)

1 0.2385 0.239 0.00052 0.2446 0.2452 0.00063 0.2401 0.2406 0.00054 0.2476 0.248 0.0004

PROMEDIO 0.0005

X 1=0.0005g

5mLx

1000mL1 L

=0.1 g/L

X 2=0.0006g

5mLx

1000mL1 L

=0.12g/L

X 3=0.0005g

5mLx

1000mL1 L

=0.1g/L

X 4=0.0004g

5mLx

1000mL1L

=0.08g /L

TABLA N° 04: Datos De La Curva De Calibrado De Biomasa

[ ] ABS (640 nm)

X (g/L)

1:1

0.317 0.10.313 0.120.308 0.10.312 0.08

1:1 0.3125 0.1

1:2 0.167 0.053441:4 0.079 0.025281:8 0.042 0.01344

1:10 0.036 0.01152

0.3125 0.10.167 X

X=0.167∗0.10.3125

=0.05344

0.3125 0.10.042 X

X=0.042∗0.10.3125

=0.01344

0.3125 0.10.036 X

X=0.036∗0.10.3125

=0.01152

0.3125 0.10.079 X

X=0.079∗0.10.3125

=0.02528

Dilución 1:5 Dilución 1:10

Dilución 1:20 Dilución 1:50

FIGURA 02: Curva De Calibrado De Biomasa

0.0 0.1 0.20

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 3.125 xR² = 1

X (g/l)

Abso

rban

cia (6

40 n

m)

Dónde:

y = 0.3125 X

y: Absorbancia 640 nm

x : Biomasa g.L-1

R2 = 1

TABLA Nº 05: Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124.

tiempo (horas)

Absorbancia (640nm)

X (g/L)

00.028 0.00896

1.810.038 0.01216

3.20.048 0.01536

5.280.033 0.01056

6.750.034 0.01088

7.90.032 0.01024

8.850.038 0.01216

FIGURA 3: Curva de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124,

utilizando como fuente de carbono a la glucosa.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018

Tiempo (h)

X (g

/L)

FIGURA 4: Curva Corregida de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis

NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la glucosa.

0 1 2 3 4 5 60

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018

Tiempo (h)

X (g

/L)

El crecimiento de biomasa según se muestra en nuestra grafica se observa un crecimiento notorio hasta las 3 horas y un aproximado de 20 minutos, es en este intervalo que se

manifiesta el crecimiento y se puede determinar el µM, para la

A. Cálculo de la Productividad Celular:

Con referencia a los datos de la tabla Nº 05

Productividad Máxima:

Evaluada en la fase Exponencial:

QX /S=X−X0

t−t0

Q x/ s=0.01536−0.01216

3.2−1.81

Q x/ s=0.002302g .biomasaL .hora

Productividad Total:

tiempo (horas)

Absorbancia (640nm)

X (g/L)

00.028 0.00896

1.810.038 0.01216

3.20.048 0.01536

5.280.033 0.01056

El crecimiento de biomasa según se muestra en nuestra grafica se observa un crecimiento notorio hasta las 3 horas y un aproximado de 20 minutos, es en este intervalo que se

manifiesta el crecimiento y se puede determinar el µM, para la

6.750.034 0.01088

7.90.032 0.01024

8.850.038 0.01216

Evaluada en todo el crecimiento Microbiano:

QX /S=X−X0

t−t0

Q x/ s=0.01216−0.00896

8.85−0

Q x/ s=0.00036158g .biomasaL .hora

B. Calculo de la velocidad máxima de crecimiento exponencial (µ máx)

TABLA Nº 06: Linealización de la fase exponencial del Crecimiento

Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124 de la tabla Nº 05

Tiempo (horas)

X (g/L) Ln(X/X0)

1.810.01216 0.30538

3.20.01536 0.53899

FIGURA 04: Linealización de la Fase Exponencial del Crecimiento

Microbiano de Pichia Stipitis NRRL Y-7124.

1.5 1.7 1.9 2.1 2.3 2.5 2.7 2.9 3.1 3.3 3.50.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

f(x) = 0.16850317769179 xR² = 0.999999478880591

Tiempo (h)

Ln (X

/Xo)

lnXX0

=μmax . t

La ecuación lineal es: y = 0.1685X

Reemplazando las variables según las gráficas:

lnXX0

=0 .1685 t

Entonces:

µ máx. = 0.1685 h-1

C. Calculo del tiempo de duplicación:

td=ln2μmax

Reemplazando:

td=ln20 . 1685

td=4 .1136horas

Esto es: td =4.1136 horas

D. Determinación de azucares reductores (Fuente de Carbono): Método

DNS

Tiempo (hr) ABS glucosa (g/l) Glucosa (g/l)*Dilución

(1:12)0 0.6854 1.1462 13.75449102

0.05 0.68 1.1372 13.646706590.1 0.665 1.1123 13.34730539

0.15 0.657 1.0990 13.187624750.2 0.64 1.0707 12.84830339

0.25 0.634 1.0607 12.728542910.3 0.623 1.0424 12.50898204

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.350.800

0.850

0.900

0.950

1.000

1.050

1.100

1.150

1.200

1.250

1.300

DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES

Tiempo (hr)

Conc

(g/l

)

Esta grafica de consumo de azúcares reductores nos da que la levadura

degrada la Glucosa para convertirla en azúcares, es por eso la

concentración de Glucosa disminuye en a través del tiempo por parte

de la levadura Pichia stipitis NRRL Y-7124, hasta el punto en que la

Glucosa es degradada casi por completo, entonces la concentración de

azúcares reductores empieza a disminuir ya que su consumo por parte

de la levadura se ve incrementada en mayor proporción que la

degradación de la Glucosa.

E. Curva de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato

Tiempo

(Hr)

X Biomasa

(g/l)

Sacarosa (g/l) Sacarosa

(g/l)*Dilución

0 0.00896 1.262 10.0958083

8

1.5 0.01216 1.225 9.80306054

6

3 0.01536 1.174 9.39055222

9

4.5 0.01056 1.127 9.01796407

2

5.5 0.01088 1.064 8.51230871

6

6.5 0.01024 0.949 7.59414504

3

8 0.01216 0.881 7.04856952

8

0 1 2 3 4 5 6 7 86

7

8

9

10

11

12

0.008

0.009

0.01

0.011

0.012

0.013

0.014

0.015

0.016

Sacarosa (g/l)*Dilución X Biomasa (g/l)

Tiempo

Conc

(g/l

)

F. Cálculo de rendimiento (Yx/s)

a. Sustrato en célula:

Y xs

= 0.01216−0.0089610.09580838−7.048569528

Y xs

=0.00105(gr debiomasa¿¿gr de sacarosa)¿

Y xs

=0.105 %

Esta grafica resumen, se observa

de como el sustrato (Glucosa) va

disminuyendo conforme aumenta

la biomasa, esto se debe por que

la biomasa va consumiendo el

sustrato.

G. método enzimático en la experiencia con Pichia stipitis NRRL

Y-7124 utilizando glucosa como fuente de carbono.

|¿|0.3264 X (glucosa gL )

TIEMPO ABS ABS*Factor [ ] GLUCOSA

0 0.158 1.264 3.87254902

0.05 0.166 1.328 4.068627451

0.1 0.14 1.12 3.431372549

0.15 0.151 1.208 3.700980392

0.2 0.156 1.248 3.823529412

0.25 -0.085 -0.68 -2.083333333

0.3 0.151 1.208 3.700980392

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.253

3.2

3.4

3.6

3.8

4

4.2

TIEMPO (HORAS)

CON

CEN

TRAC

ION

G/L

Tabla Nº04: Parámetros cinéticos y rendimientos determinados en la

experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando

glucosa como fuente de carbono.

Parámetro cinético

y rendimientos

Valor obtenido

experimentalmente

m (h-1) 0.1685

td (h) 4.1136

Qmáx x/s (g/L*h) 0.002302

Xmax (g/l) 0.01536

H. Variación del pH durante el crecimiento celular:

Tabla Nº 05: Variación del pH Respecto al Tiempo

Tiempo pH

1 4.5

7.5 4.552

I. CROMATOGRAFÍA DE GASES.

Existe Una gran variedad factores que impidieron producir etanol, una de ellas posiblemente

fue la mala manipulación de la muestra en el análisis de la curva de DNS, donde la muestra fue

expuesto al aire por mucho tiempo causando esto la evaporación del etanol.

GRUPO A2 ETANOL M3

ABS=0.048

GRUPO C3 ETANOL

Para realizar la curva de calibración se usó una solución de etanol, metanol y propanol como patrón interno, se les midió el área a diferentes concentraciones y se hizo la relación de área entre los dos picos. Los datos para esta se muestran en la gráfica relación de área vs porcentaje de etanol (v/v).

Y=aX+b

a=6.872274 e−006

b=−0.3801215

R2=0.9981825

R=0.9990908

0 50000 100000 150000 200000 Area0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

Conc.(x100)

CON. ÁREA0.2 83.5960.6 141.8331 205.383

1.4 256.076

De esta curva se obtiene la ecuación lineal y = mx.

Y=6.872274−6 X−0.3801215

Entonces se adiciona una masa conocida del estándar interno a una masa conocida de

muestra y esta mezcla se inyecta al cromatógrafo. Del cromatógrama se obtienen las áreas

de analito y del estándar y luego con la ecuación de calibración y conociendo la masa del

estándar se puede obtener la masa del analito en la muestra.

% (v /v )=Relaciónde área−0.3801215

6.872274−6 %¿¿¿

CONSUMO DE SUSTRATO

Se diluyó la muestra inicial en 1/3 es decir se colocaron en casa tubo de ensayo 1ml de muestra

(sobrenadante) + 2ml de H2O destilada. Luego se siguió con el proceso indicado para determinar

Azúcares Reductores por el Método DNS.

La siguiente ecuación, se obtuvo de la Curva de Calibrado para el consumo de sustrato.

Donde: y = Absorbancia; x = Conc. Sustrato

TiempoAbs.(540 nm)

Concentración Sustrato

(g/L)

Concentración Sustrato

(g/L) * factor de DILUCIÓN (2)

0 0.648 3.3345 10.00351 0.640 3.2935 9.88052 0.638 3.2832 9.84963 0.635 3.2678 9.80344.5 0.634 3.2626 9.78786 0.633 3.2525 9.75757.5 0.630 3.2422 9.72669 0.613 3.1549 9.4647

Ahora, vamos a graficar el Crecimiento Celular con el Concumo de Sustrato a través del tiempo

y = 0.1949X-0.0019

0 1 2 3 4 5 6 7 8 93.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

Tiempo Vs. So (Conc. Sustrato)

Tiempo (h)

Conc

entr

ació

n Su

stra

to (g

/L)

TiempoConcentración Celular (g/L)

Concentración Sustrato (g/L)

8:30am (Punto 0) 0.110599078 7.595064498

9:30am (Punto 1) 0.110599078 7.583847448

11:30am (Punto 3) 0.122119816 7.2809871

2:00pm (Punto

5.5) 0.168202765 6.697700505

5:00pm (Punto 8) 0.099078341 6.686483455

Xo

Observamos en la gráfica que el crecimiento celular no fue el esperado, ya que hubo muerte celular a las 5.5 horas de iniciada la fermentación. El consumo de sustrato, por ende, no será demasiado, ya que al haber una mínima cantidad de masa celular, el consumo de sustrato será demasiado para ellas. La variación de sustrato, aproximadamente, fue de 0.9g/L. No se determinó el máx ya que no seμ preesenció un crecimiento logarítmico adecuado.

So

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

6.2

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8

Tiempo Vs. [X] y [S]

Series2Series4

Tiempo (hr.)

Conc

entr

ació

n (g

/L)

Entonces, graficamos el Tiempo versus el Ln(x), de la siguiente manera:

Si se quisiera determinar el valor de Umáx, se tendría que hacer lo siguiente:

(dx/dt) = u.x

(dx/x) = u.dt

INTEGRAL DE Xo – X de (Lnx) = INTEGRAL DE 0 – t (u.dt)

Ln(x) – ln(xo) = u.t

Ln(x) = u . t + ln(xo)

Y = 0.3614x - 07466

0 0.5 1 1.5 2 2.5

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0f(x) = 0.361427948908082 x − 0.746639684805616

ln(x) vs tiempo(horas)

tiempo(horas )

ln(x

)

μmáx = 0.3614

Tiempo (horas) ln(x)

Concentració

n Celular

(g/L)

0 -0.73563723 0.4792

1 -0.40721664 0.6655

2 -0.01278133 0.9873