Praktikum Biokimia Modul Respirasi 2015Sistem pernapasan berperan dalam keseimbangan O2 dan CO2 dan pertukarannya. Proses transport O2 keseluruh tubuh diperankan oleh Hemoglobin (Hb) yang terkandung dalam eritrosit.Hb berikatan dengan O2 dan selanjutnya melepaskan O2 (deoksihemoglobin). Derivat Hb dapat ditentukan dengan pengenceran.Membran sel biologis terdiri dari lipid dan protein yang dihubungkan oleh ikatan nunkovalen. Lipid sebagai sekat non permeabel sedangkan protein sebagai katalisator reaksi intrasel.Proses oksidasi dapat berlangsung secara enzimatik dan nonenzim dengan melibatkan logam seperti Fe. Hasil dari oksidasi adalah radikal bebas yang dalam peroksidasi lipid berbentuk malondialdehide (MDA). Sehingga semua hal diatas dapat diketahui dengan praktikum ini.Tujuan Praktikum1.2.1. Memperlihatkan bahwa Hb dapat mengikat dan melepas O21.2.2. Memperlihatkan ikatan Hb dengan CO lebih larut dibanding dengan O21.2.3. Demonstrasi spektrum derivat Hb1.2.4. Memperlihatkan pengaruh larutan hipotonik dan pelarut organik terhadap membran sel darah merah1.2.5. Penetapan kadar Hb KuantitatifMETODOLOGIALAT DAN BAHAN A. Uji oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin Darah segar Pereaksi stokes Larutan NH4OHB. Uji karbonmonoksidahemoglobin (HbCO) Darah segar Sumber gas CO Pereaksi stokes NH4OHC. Uji untuk methemoglobin Darah segar Pereaksi K3Fe (CN)6 Pereaksi stokesD. Penetapan kadar Hb dengan metode sianmethemoglobin Darah yang akan diperiksa Pipet sahli 0,2 ml Pipet volumetric 5 ml Pereaksi Drabkin (larutan NaHCO3, 52mg KCN beracun dan 18 mg K3Fe(CN)6 dalam 1 L air suling (simpan dalam botol) Spektofotometer dan kuvet Standar HbE. Hemolisis sel darah merah Darah segar Larutan NaCl 2%F. Pengaruh pelarut organic terhadap membrane sel darah merah Darah segar Larutan NaCl 0,9% Kloroform Eter G. Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum Hemolisat darah Larutan asam trikloroasetat (TCA) 10% Larutan TBA 0,67%

CARA KERJAA. Uji oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin OksiHb1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 2 ml darah dengan 6 ml air . Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksihemoglobin yang terbentuk.2. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing-masing tabung berisi 4 ml. gunakan tabung 1 sebagai kontrol.

Pembentukan deoksiHb1. Isi tabung ketiga dengan 2 ml pereaksi Stokes dan tambahkan NH4OH secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbentuk. Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat.2. Masukkan beberapa tetes larutan Stokes ke dalam tabung 2. Terlihat perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1.

Pembentukan kembali oksiHb dari deoksiHb1. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali oksigenasi dari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk.2. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang-ulang.

B. Uji karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)1. Encerkan 2 mL darah dengan 8 mL air suling. Bagi 2 darah encer itu (masing-masing 5 mL) dalam dua tabung reaksi.2. Pada tabung 1 alirkan gas CO (dalam lemari asam). Oksihemoglobin akan berubah menjadi karbonmonoksihemoglobin. Bandingkan warna kedua tabung tadi. 3. Pindahkan masing-masing 1 mL dari tabung 1 (yang berisi HbCO) ke dalam tabung 3 dan 4, dan masing-masing 1 mL dari tabung 2 (yang berisi HbO2) ke dalam tabung 5 dan 6. 4. Tambahkan pereaksi stokes pada tabung ke 3 dan 5. Jelaskan hasil yang didapat!5. Encerkan isi tabung 4 dan 6 dengan 4 mL air suling. Bandingkan warna kedua cairan itu. OksiHb berwarna kekuning-kuningkan, sedangkan HbCO bersemu kemerahan (carmine tint).

C. Uji untuk methemoglobin1. Encerkan 1 mL darah dengan 4 mL air suling dalam tabung reaksi.2. Ke dalam tabung itu tambahkan beberapa tetes K3Fe(CN)6 33%. Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Kemudian tambahkan pereaksi Stokes ke dalam tabung itu dan kocok kuat-kuat. Perubahan apakah yang terlihat?3. Encerkan 3 mL darah dengan 3 mL air suling dan panaskan sebentar, lalu tambahkan 6 mL K3Fe(CN)6. Campur dengan membalik-balikkannya. Perhatikan gelembung- gelembung oksigen yang terbentuk.

D. Penetapan kadar Hb dengan metode sianmethemoglobin1. Pipetkan dengan pipet volumetric 5 mL perekasi drabkin ke dalam sebuah tabung reaksi2. Tambahkan 0,02 mL darah yang akan diperiksa pada tabung yang berisi pereaksi Drabkin, bilas pipet tersebut 3 kali dengan pereaksi Drabkin dalam tabung tersebut3. Diamkan selama 10 menit4. Pindahkan campuran tersebut ke dalam kuvet spektofometer dan tentukan serapannya pada 540nm. Sebagai blanko digunakan pereaksi Drabkin5. Tentukan kadar Hb dalam 9% dari standar Hb yang disediakan dengan rumus sbb6. Kadar Hb =Ru/Rs x 10 g%= g%

E. Hemolisis sel darah merah1. Ke dalam 10 tabung reaksi, isiskan campuran berikut:

TabungAir suling (mL)NaCl 2% (mL)%NaCl

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2. 3. Campurkan dengan baik4. Tambahkan 2 tetes suspense ke dalam setiap tabung dan kocok dengan membalik-balikkan tabung perlahan. Diamkan 1 jam5. Perhatikan dan catatlah derajat hemolisis pada tiap tabung

F. Pengaruh pelarut organic terhadap membrane sel darah merah1. Ke dalam 6 tabung reaksi, masukkan setiap 10 mL larutan NaCl 0,9%.2. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol dan pada ke 5 tabung lainnya tambahkan setiap 2 tetes kloroform, eter, aseton, toluen, dan alkohol secara berurutan.3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan kontrol.G. Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serumBahan Uji (mL)Blanko

Hemolisat darah0,25 -

Akuades -0,25

Larutan TCA 10% dingin0,500,50

Kosong, pusing, ambil supernatan

Larutan TBA 0,067%0,750,75

Masukkan penangas mendidih 10 menit, didinginkan/ baca serapan pada panjang gelomang 532 nm

Hasil A 532 kadar MDA