outline of the jbf draft bmv guideline for ligand...

The JBF draft BMV Guideline for

Ligand Binding Assay

4th JBF Symposium, 02 August 2013 in Tokyo 1

バイオアナリシス分析法（リガンド結合法）バリデーション

に関するガイドライン JBF 案の概要

（ノバルティスファーマ 1、島津テクノリサーチ 2、武田薬品工業 3、東

レリサーチセンター4、新日本科学 5、協和発酵キリン 6、中外製薬 7）

今里真実 1、南出善幸 2、掛樋真彰 3、久世洋司 3、

谷口佳隆 4、中村隆広 5、細木淳 6、宮和弘 7

Outline of the JBF draft BMV Guideline for Ligand

Binding Assay

Mami Imazato1, Yoshiyuki Minamide

2, Masaaki Kakehi

3, Youji

Kuze3, Yoshitaka Taniguchi

4, Takahiro Nakamura

5, Jun Hosogi

6,

Kazuhiro Miya7

1 Novartis Pharma K.K.,

2 Shimadzu Techno-Research Inc.,

3 Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.

4 Toray Research Center, Inc.,

5 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.

6 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.,

7 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.




要旨

「医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法のバリデーシ

ョン（BMV）に関するガイドライン案」は、本年 4月 5日に厚生

労働省から公表され、6月 4日までに意見・情報の募集が行われ

た。上記ガイドラインは、特に低分子化合物に対するクロマトグ

ラフィーによる分析法のバリデーション及び実試料分析を対象と

している。一方、高分子を中心としたリガンド結合法（ligand

binding assay、LBA）については、ガイドライン作成に関するワー

キンググループが組織され、活動が行われている。JBF は、BMV

研究班から依頼を受けて、ガイドライン作成のためのタスクフォ

ースを構成し、ワーキンググループでの議論に加わりつつガイド

ライン案を作成して BMV研究班に提出した。本発表では、リガ

ンド結合法に関する BMVガイドラインの JBF案の概要について

紹介する。

本ガイドライン案は、FDAガイダンス及び EMAガイドライン

に加え、日本国内の現状や GBC（Global Bioanalysis Consortium）

での議論などを参考に作成した。本案の特徴は以下の通りであ

る：①リガンド結合法を用いて分析する薬物であれば低分子化合

物も対象とする、②バリデーションの実施前に最小希釈倍率

（minimum required dilution: MRD）の設定が必要、③特異性の評価

が必要、④選択性の評価方法が低分子ガイドライン案とは異なる、

⑤真度及び精度の評価は検量線の上限濃度についても必要、⑥高

濃度の QC 試料の濃度を定量上限の 1/3 以上とした、⑦希釈直線性

の評価が必要、⑧重要試薬のロットや希釈倍率変更時にパーシャ




ルバリデーションが必要。なお、EMAガイドラインに記載されて

いるトータルエラーは評価項目に入れていない。また、平行性に

ついては記載を検討中である。

JBFが作成した本案が、日本におけるリガンド結合法による BMV

の議論の出発点になることを希望する。

（注意）解説で引用している低分子ガイドライン（案）とは「医

薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法のバリデーションに

関するガイドライン（案）（平成 25年 4月 5日）」のことです．




1.適用

本ガイドラインは，トキシコキネティクス試験及び臨床試験にお

ける生体試料中薬物濃度分析法としてリガンド結合法（ligand

binding assay: LBA）を用いる際の分析法バリデーション並びに当

該分析法を用いた実試料分析に適用するものとする．対象薬物は

ぺプチド及びタンパク質が中心となるが，リガンド結合法を用い

て分析する薬物であれば低分子化合物も対象とする．リガンド結

合法の代表的な例としては，酵素免疫測定法（enzyme immunoassay:

EIA）等の抗原抗体反応に基づく免疫学的測定法が挙げられる．

なお，「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準に関す

る省令」（平成 9 年 3月 26日厚生省令第 21号）の対象とならない

非臨床試験で使用される分析法は，当該ガイドラインの適用対象

ではないが，当該ガイドラインの内容を参考に必要なバリデーシ

ョン等を実施してよい．

（解説）

LBAの正式な日本語訳は存在しないと思われるが，本ガイドラ

インでは「リガンド結合法」を用いることにする．

本ガイドラインは医薬品申請の際に用いるものであり，読み手は

リガンド結合法の基本的な知識を保有していることが前提となる．

そのため，リガンド結合法の説明，定義は本文中には記載しない

が，用語解説で補足的に説明する予定である．

対象となる試料は、低分子ガイドライン案と同様，非臨床 TK，

臨床 PK（BEを含む）とする．




2.標準物質（標準品）

標準物質（標準品）は，分析対象物質を定量分析する上で基準と

なるものであり，主に分析対象物質を添加した既知濃度の試料で

ある検量線用標準試料及び Quality Control（QC）試料の調製に用

いられる．標準物質の品質は測定データに影響を及ぼすため，品

質が保証された標準物質を使用しなければならない．使用する標

準物質については，入手先が明らかにされ，かつその特性が精査

されている必要がある．ロット番号，有効期限又はリテスト日，

含量（物質量，純度又は力価），並びに保存条件等を明らかにした

分析証明書が必要である．

（解説）

バイオテクノロジー応用医薬品の用量は，生物活性を表す「力価

（単位は「単位」）」又は主にタンパク量を表す物質量で表示され

る．なお，バイオテクノロジー応用医薬品の標準物質は溶液であ

ることが多いため，力価や物質量は濃度表示で示すことが一般的

である．薬物濃度分析においても同じ用量表示を用いることが望

ましい．

定量分析に使用される標準物質は，TK試験の被験物質又は臨床

試験の治験薬と同等でなければならない．

定量分析に使用される標準物質は，ロット内及びロット間の均質

性が保証されたものでなければならない．一般に分析証明書の内

容から品質規格に適合していることが確認できればよいと考えら

れる．

定量分析に使用される標準物質は，原薬又は自家標準物質（又は

標準品）を使用できる．

バイオテクノロジー応用医薬品の場合，「特性が精査されている」

とは，構造・物理化学的性質，生物活性，免疫化学的性質及び純

度等が明らかになっており，かつ，品質規格がある場合には規格

に適合していること．構造・物理化学的性質の例としては，アミ




ノ酸配列，SS結合分析，糖組成，糖鎖含量等があげられる．

開発期間中に原薬の製造工程を大きく改変した場合は，その特性

を分析証明書等により確認しなければならない．

一般に，バイオ医薬品の成分は生物学的方法により製造されるた

め，不均一であり，また不純物を完全に除外することはできない．

したがって，バイオ医薬品をリガンド結合法で分析する場合，標

準物質のロットを変更することで結合試薬との反応性が変化し，

定量値に影響を及ぼす可能性は否定できない．ただし，結合試薬

の特性を十分にコントロールした上で使用に供することで，この

リスクを低減（許容）することは可能と思われる．原則として，

標準物質のロットを変更するにあたってリガンド結合法による評

価は必要とされない．ただし，力価で表記される医薬品でロット

間の力価／物質量比が異なる場合はリガンド結合法の評価が必要

となる場合もある．




3.分析法バリデーション

3.1フルバリデーション

ある分析施設において，薬物の生体試料中濃度を定量する際の分

析法を新たに確立する際には，フルバリデーションを実施する．

文献等で公表された分析法を使用する場合や市販されているキッ

トを使用する場合にも，フルバリデーションの実施が必要である．

フルバリデーションでは，特異性，選択性，検量線，真度，精度，

希釈直線性，安定性等を評価する．通常，フルバリデーションは，

分析対象となる種又はマトリックス（主に血漿又は血清）ごとに

実施する．

分析法バリデーションに用いるマトリックスは，抗凝固剤や添加

剤を含め，分析対象の実試料にできるだけ近いものを使用する．

希少なマトリックス（組織，脳脊髄液又は胆汁等）を対象とした

分析法を確立する場合には，十分な数の個体から十分な量のマト

リックスが得られない状況が問題となる場合がある．そのような

場合には，代替マトリックスを使用することができる．代替マト

リックスは，検量線を構成する各試料及び QC試料の調製等に用

いられる．ただし，代替マトリックスを使用する場合には，分析

法を確立する過程においてその妥当性を可能な限り検証する．

リガンド結合法では，分析法を確立する過程において試料の最小

希釈倍率（minimum required dilution: MRD）を設定し，設定した最

小希釈倍率を用いてフルバリデーションを実施する．プレートを

用いるリガンド結合法では，1試料あたり少なくとも 2穴（2 wells）

で測定し，平均値を試料の値とする．

（解説）

市販キットを使用する場合にもフルバリデーションが必要であ

る．

低分子ガイドライン案にはないバリデーション項目として，特異




性，希釈直線性がある．また，選択性は低分子ガイドライン案と

実施内容が異なる．

リガンド結合法特有の考え方である最小希釈倍率（MRD）につ

いても触れた．

プレートを用いるリガンド結合法では，1試料あたり少なくとも

2 穴で測定し，平均値を試料の値とする．平均値は，2穴のレスポ

ンスの平均値から濃度を算出する，あるいは 2穴の各レスポンス

から算出された濃度の平均値を算出する，のいずれでもよい表現

とした．




3.1.1 特異性

特異性とは，用いる分析法において分析対象物質を特異的に検出

する能力のことである．リガンド結合法の場合，結合試薬（binding

reagent）が分析対象物質と特異的に結合し，試料中に共存する類

似物質（分析対象物質と構造的に類似した物質）と交差反応性

（cross-reactivity）を示さないことが重要である．類似物質が利用

可能な場合には評価する．分析法を確立する過程や初期の分析法

バリデーション終了後に評価することもある．

特異性は，ブランク試料（分析対象物質を添加しないマトリック

ス試料），並びに低濃度及び高濃度付近の QC試料に想定される濃

度の類似物質を添加した試料を用いて評価する．

ブランク試料が定量下限未満を示し，QC試料の定量値の真度が

真の値（理論値）のそれぞれ±20%以内（定量下限及び定量上限の

場合は±25%以内）であることが望ましい．

（解説）

特異性は分析対象物質と構造的に類似した物質が分析結果に及

ぼす影響の程度を評価することを目的とする．

類似物質が内因性物質の場合は選択性の結果から特異性につい

ての情報が得られることもある．一般に，生理的濃度の類似物質

の特異性は選択性の評価結果から推察できると考えられる．

リガンド結合法の特異性は結合試薬の特性なので，結合試薬の作

製過程でその特性が明らかとなっている場合はバリデーション試

験として実施する必要がない場合もある．




3.1.2 選択性

選択性とは，試料中の他の成分の存在下で，分析対象物質を区別

して検出することができる能力のことである．

選択性は，少なくとも 10個体から得られた個別のブランク試料

及び個別の定量下限の QC試料を用いて評価する．希少なマトリ

ックスを使用する場合には，10 個体よりも少ない個体から得られ

たマトリックスを使用することも許容される．

ブランク試料の 80%以上が定量下限未満を示し，定量下限の QC

試料の 80%以上において定量値の真度が理論値の±25%以内であ

ることが望ましい．

（解説）

リガンド結合法における選択性は，低分子ガイドライン案の選択

性とは異なり，個体別マトリックスに定量下限の測定対象物質を

添加して評価する．

リガンド結合法はその性質上，マトリックスの影響を受けやすく，

クロマトグラフィックな分析法よりも選択性が低くなる傾向があ

る．このため，低分子ガイドラインで要求されているよりも多く

の個体別マトリックスを用いて選択性を評価し，分析法の性質を

確認しておくことが妥当と考えられる．また，10個体全てで基準

を満たすのは現実的ではないため 80%以上の個体で基準を満たす

ものとした．




3.1.3 検量線

検量線は，分析対象物質の理論値と応答変数（レスポンス）の関

係を示したものである．

検量線の作成には，可能な限り実試料と同じマトリックスを使用

し，既知濃度の分析対象物質を添加して作成する．検量線は，ブ

ランク試料及び 6濃度以上の検量線用標準試料から構成される．

カーブフィッティングを向上させる目的で，定量下限未満の濃度

及び検量線の定量上限を超える濃度のアンカーポイントを設定し

ても良い．検量線の回帰式は，一般的には 4 又は 5-パラメーター

ロジスティックモデルであるが，これに限定されない．検量線の

回帰式の算出にはブランク試料を用いない．報告書には，用いた

回帰式及び重み付け条件並びに相関係数又は決定係数を記載する．

回帰式から求められた検量線用標準試料の各濃度の真度は，定量

下限及び定量上限において理論値の±25%以内とし，定量下限及び

定量上限以外においては理論値の±20%以内とする．アンカーポイ

ントには真度の基準を設けない．アンカーポイントを除く検量線

用標準試料の 75%以上かつ，定量下限及び定量上限を含む少なく

とも 6濃度以上が上記の基準を満たすものとする．

（解説）

リガンド結合法では，アンカーポイントの設置，回帰式の種類，

真度及び精度の基準が低分子ガイドライン案と異なる．

検量線は一般的に4又は5-パラメーターロジスティックモデルで

あり，レスポンスの上限があるので，定量下限のみならず検量線

の定量上限についても真度及び精度の基準が必要である．




3.1.4 真度および精度

真度とは，分析法で得られる分析対象物質の定量値と理論値との

一致の程度のことである．精度とは，繰り返し分析によって得ら

れる定量値のばらつきの程度のことである．

真度及び精度は，QC 試料，すなわち分析対象物質濃度が既知の

試料を分析することによって評価される．バリデーション時にお

いては，検量線の定量範囲内で，最低 5濃度（定量下限，低濃度，

中濃度，高濃度及び定量上限）の QC試料を調製する．QC試料の

濃度については，低濃度は定量下限の 3倍以内,中濃度は検量線の

中間付近，高濃度は検量線の定量上限の 1/3 以上であるものとす

る．分析単位内及び分析単位間の真度及び精度は，分析単位内で

は各濃度あたり少なくとも 2回の繰り返し分析をし，少なくとも

6 回の分析単位を繰り返し分析することによって評価される．

各濃度における平均の真度は，理論値の±20%以内でなければな

らない．ただし，定量下限及び定量上限では±25%以内であるもの

とする．各濃度における定量値の精度は，20%以下でなければな

らない．ただし，定量下限及び定量上限では 25%以下とする．

（解説）

QC試料は定量上限も必要なので最低 5濃度である．

定量上限も測定するリガンド結合法では，検量線が一般的にシ

グモイド曲線を描くため，低分子ガイドライン案と同様に高濃度

の QC 試料（HQC）の濃度を定量上限の 75%とすることは，定量

上限と接近しすぎと考えられる．検量線内濃度に対して QC 試料

の濃度の分布を低濃度側，高濃度側で同等にするという観点から

考えると，低濃度の QC 試料（LQC）は定量下限の 3 倍以内であ

るので， HQC は定量上限の 1/3 以上とすることが適切と判断し

た．

分析単位内と分析単位間の真度及び精度は，特に識別しない記

載とした．




繰り返し数，真度及び精度の基準が低分子ガイドライン案と異

なる．

Total error について記載しなくてもよいかという議論があるが，

total errorはリガンド結合法に限定されず低分子ガイドライン案に

も共通する事項である．低分子ガイドライン案では total error の

記載をしていないことから，リガンド結合法でも記載しないこと

にした．




3.1.5 希釈直線性

希釈直線性は，検量線の定量上限を超える試料の濃度を適切に分

析できることを確認するために実施する．希釈直線性は，定量上

限を超える試料及びこの試料をブランクマトリックスで段階希釈

した複数濃度の試料を分析することによって評価される．上記試

料において，レスポンス低下（プロゾン，フック効果）の有無を

確認し，レスポンス低下が認められた場合には実試料分析に影響

を及ぼさないような手段を考慮する必要がある．また，試料の定

量値を希釈倍率で補正した後の真度は理論値の±20%以内，精度は

20%以下でなければならない．

（解説）

プロゾンは想定される最大濃度を超える濃度の試料から段階希

釈した複数試料で評価し，その有無は調製した試料全体から判断

する．

定量範囲内に 3 濃度を設定した場合，精度は 3 濃度すべての濃

度（各調製濃度の平均値）から計算する．




3.1.6 安定性

分析対象物質の安定性評価は，試料を採取してから分析するまで

の各過程が分析対象物質の濃度に影響を及ぼさないことを保証す

るために実施する．安定性の評価は，実際の保存条件又は分析条

件にできる限り近い条件で行う．安定性の評価においては，溶媒

又はマトリックスの種類，容器の材質，保存条件等に留意する．

バリデーション試験では，凍結融解安定性，短期保存安定性（室

温，氷冷又は冷蔵等），長期保存安定性を評価する．いずれの安定

性についても，実際の保存期間を上回る期間で評価する．

標準溶液中の安定性の評価には，実際に保存する標準溶液の内，

最高濃度及び最低濃度の溶液を用いる．各濃度あたり少なくとも

3 回の繰り返し分析を行う．

マトリックス中の安定性の評価には，低濃度及び高濃度の QC試

料を用いる．QC試料の調製には，抗凝固剤や添加剤を含め，実際

の条件にできるだけ近いマトリックスを使用する．各濃度あたり

少なくとも 3回の繰り返し分析を，QC試料を保存する前後に行う

ことで安定性を評価する．各濃度における平均の真度は，原則と

して理論値の±20%以内でなければならない．

（解説）

真度の数値的な基準を除き，基本的な考え方は低分子ガイドライ

ン案と同じである．前処理試料中の安定性については，リガンド

結合法では通常前処理を実施しないため，記載していない．




3.2パーシャルバリデーション

既にフルバリデーションを実施した分析法に軽微な変更を施す

場合には，パーシャルバリデーションを実施する．パーシャルバ

リデーションで評価する項目は，分析法の変更の程度とその性質

に応じて設定する．

パーシャルバリデーションを実施する典型的な事例として，分析

法の他施設への移管，分析機器の変更，重要試薬のロットの変更，

定量範囲の変更，希釈倍率の変更，抗凝固剤の変更，分析条件の

変更，試料の保存条件の変更，併用薬の分析に与える影響の確認

又は希少なマトリックスの使用等が挙げられる．分析対象となる

種やマトリックスの変更について適用される場合もある．

パーシャルバリデーションにおける判断基準には，原則としてフ

ルバリデーションと同様の判断基準を設定する．

（解説）

基本的な考え方は低分子ガイドライン案と同じである．リガンド

結合法で特徴的な事例として，重要試薬のロットの変更，希釈倍

率の変更を追加した．




3.3クロスバリデーション

クロスバリデーションは，主に同一の試験内で複数の分析施設で

分析する場合，又は異なる試験間で使用された分析法を比較する

場合に実施される．比較する分析施設及び分析法それぞれのフル

バリデーション又はパーシャルバリデーションの後にクロスバリ

デーションを実施し，分析対象物質を添加した同一の QC試料又

は実試料を分析し，QC試料の各濃度の平均真度を評価又は実試料

の濃度の乖離度を評価する．

同一の試験内で複数の分析施設を用いる際のクロスバリデーシ

ョンにおいては，室内及び室間再現精度を考慮し，低濃度，中濃

度及び高濃度各濃度の QC試料の平均真度は，原則として理論値

の±30%以内でなければならない．実試料を使用する場合では，少

なくとも 3分の 2の試料の乖離度が±30%以内でなければならない．

異なる分析法等を用いる際のクロスバリデーションにおいては，

分析法の性質を考慮した上で，科学的な判断に基づき，個別にそ

の実施方法及び許容できる乖離度による基準を設定して評価する．

（解説）


ン案と同じである．平均の真度の基準は，室内及び室間再現精度

を考慮し，±30%以内とした．また，実試料を用いた場合の乖離度

の基準も，室内及び室間再現精度，並びに，ISRでの乖離度を参

考に±30%以内とした．




4.実試料分析

実試料とは，トキシコキネティクス試験又は臨床試験等から得ら

れる試料のうち，生体試料中薬物濃度分析に供する試料のことで

ある．実試料分析には，分析法バリデーションによって確立され

た分析法を用いる．実試料分析では，分析法バリデーションで安

定性が確認された条件下で実試料を取り扱い，安定性が確認され

た期間内に検量線（ブランク試料及び 6濃度以上の検量線用標準

試料）及び QC試料（3 濃度以上）と共に実試料を分析する．なお，

プレートを用いるリガンド結合法では，1試料あたり少なくとも 2

穴で測定し，平均値を試料の値とする．

（解説）


結合法ではプレートを用いることが多いため，プレートを用いた

場合の試料の測定方法について記載した．




4.1実試料分析における分析法の妥当性と再現性

実試料分析での分析法の妥当性は，分析単位ごとに検量線，QC

試料で評価する．プレートを用いる分析法では，プレートを分析

単位とする．薬物動態を主要な評価項目とする試験では，異なる

マトリックスごとに代表的な試験を選択して ISR（incurred sample

reanalysis；定量値の再現性確認のため，異なる日に別の分析単位

で投与後試料を再分析すること）を実施し，分析法の再現性を確

認する．

（解説）


結合法ではプレートを用いることが多いため，プレートを用いた

場合における分析単位の定義を記載した．また，プレートを用い

たリガンド結合法においてはキャリーオーバーが問題となること

は稀であるため，妥当性の評価項目には含めなかった．




4.1.1 検量線

検量線は，実試料中の分析対象物質の濃度を算出するために用い

られる．実試料分析に用いる検量線は，分析法バリデーションで

確立した方法によって，分析単位ごとに作成される必要がある．

検量線の回帰式及び重み付け条件には，分析法バリデーションの

ときと同様のモデルを用いる．

回帰式から求められた検量線用標準試料の各濃度の真度は，定量

下限及び検量線の定量上限においては理論値の±25%以内，それ以

外の濃度においては理論値の±20%以内でなければならない．アン

カーポイントには真度の基準を設けない．アンカーポイントを除

く検量線用標準試料の 75%以上かつ少なくとも 6濃度の検量線用

標準試料が上記基準を満たさなければならない．

実試料分析において，検量線用標準試料の定量下限又は検量線の

定量上限が基準を満たさなかった場合には，これらの次の濃度の

検量線用標準試料を定量下限又は検量線の定量上限としてもよい．

その場合，変更された検量線の濃度範囲は，少なくとも 3濃度（低

濃度，中濃度及び高濃度）の QC 試料を含まなければならない．

（解説）


ン案と同じである．アンカーポイントの取り扱いについて，真度

の基準を設けないことを記載した．




4.1.2 QC試料

QC試料は，検量線や実試料の分析に用いられた分析法の妥当性

を評価するために分析される．

検量線の濃度範囲内で，少なくとも 3濃度（低濃度，中濃度及び

高濃度）の QC試料を分析単位ごとに分析する．分析する QC試

料の数としては，各濃度あたり 2試料又は分析単位内の実試料数

の 5%以上のいずれか多い方とする．

QC試料の真度は理論値の±20%以内であるものとし，全 QC試料

の 3分の 2以上かつ各濃度の 2 分の 1以上の QC試料が上記基準

を満たさなければならない．

（解説）


ン案と同じである．リガンド結合法ではプレート単位で分析され

ることが多いため，低分子ガイドライン案にある「QC 試料は，

少なくとも実試料の前後で測定される必要がある」との記載は削

除した．




4.1.3 ISR (Incurred samples reanalysis)

生体試料中薬物濃度分析においては，分析法バリデーションや実

試料分析に用いられる検量線用標準試料及び QC試料による分析

法の妥当性確認を実施しても，実試料を用いた分析結果に再現性

がない事例が少なくない．実試料の不均一，コンタミネーション

のような操作誤りに基づくものから実試料に特有の生体由来成分

や未知代謝物の影響に至るまで，その原因には様々なものが想定

される．ISRとは，定量値の再現性確認のため，異なる日に別の

分析単位で投与後試料を再分析することであり，ISRを実施して，

再現性を確認しておくことが分析値の信頼性を高めるものとなる．

また，ISRで再現性が確認できない分析法がある場合に，その原

因を調査し，改善策を講じる契機となる．

通常，ISR は薬物動態を主要なエンドポイントとする試験で異な

るマトリックスごとに代表的な試験を選択して実施される．例え

ば，非臨床試験ではトキシコキネティクス試験の異なる動物種ご

とに，臨床試験においては，健康被験者，腎機能又は肝機能異常

のある被験者を対象とするそれぞれの薬物動態試験から代表的な

試験，並びに生物学的同等性試験で実施される．なお，非臨床試

験の ISRを実施する実試料には，採取条件が同等である非臨床試

験の予備試験等から得られる実試料を活用することもある．

ISRを実施する試料数は，できるだけ多くの個体から通常最高血

中濃度及び消失相付近の試料を含むよう選択し，安定性が保証さ

れた期間内に ISR を実施する．ISRを実施する実試料数は，1000

を超えない実試料数に対してその約 10%，1000 を超えた実試料数

では，それに 1000 の超過数に対して約 5%に相当する試料数を加

えた数を目安とする．

ISRの評価には，乖離度を用いる．乖離度は，ISRにより得られ

た定量値と初回の定量値の差を両者の平均値で除した値に 100 を

乗じることで算出される．ISRを実施した試料のうち，少なくと

も 3分の 2以上の試料において，乖離度が±30%以内でなければな




らない．ISRの結果が上記基準を満たさなかった分析法では，そ

の原因を調査し，実試料分析への影響を考察して必要に応じた対

応を取らなければならない．

なお，ISRは，乖離度のばらつきを評価するために実施している

ものであり，個別の実試料において ISRの結果が±30％を超えても，

その初回の定量値を，再分析値へ置き換える又は棄却してはなら

ない．

（解説）

乖離度の数値的基準を除き，基本的な考え方は低分子ガイドライ

ン案と同じである．




4.2注意事項

4.2.1 定量範囲

リガンド結合法の定量範囲は結合試薬の特性に大きく依存する

ため，定量範囲を任意に設定することが困難なことがある．その

場合は希釈直線性の範囲を適切に設定するよう注意しなければな

らない．

定量範囲を変更する場合には，パーシャルバリデーションを実施

する．ただし，検量線の定量範囲又は QC試料の濃度又は数を変

更する前に分析した実試料を，これらの変更後に再分析する必要

はない．

（解説）

定量範囲とは，試料中において分析対象物質を信頼できる真度及

び精度で定量することができる濃度の範囲のことである．実試料

の濃度が検量線範囲の上限を超えると想定される場合は，希釈直

線性の項目で評価する試料がその濃度を包含しなければならない．

結合試薬の説明は 4.2.5重要試薬の項目に記載した．

定量範囲を変更する場合のパーシャルバリデーションでは，安定

性以外の妥当性の評価項目を確認する必要があると考えられる．




4.2.2 再分析

サンプルの分析を実施する前に，あらかじめ再分析を実施する場

合の理由，再分析の手順及び再分析を行った場合の定量値の取扱

いに関する事項を計画書又は手順書に設定する．

再分析を実施する際の例として，検量線又は QC試料が分析法の

妥当性の基準を満たさなかった場合，定量値が検量線の定量上限

を超えた場合又は過剰希釈により定量下限未満となった場合，投

与前試料又は実薬非投与群の試料中に分析対象物質が認められた

場合，分析操作又は分析機器の不具合が発生した場合に実施され

る他，異常値の原因追求等が挙げられる．

薬物動態学的な理由による再分析については，可能な限り実施し

ないことが望ましい．特に生物学的同等性試験においては，薬物

動態的に不自然という理由のみで再分析を実施して定量値を変更

してはならない．ただし，臨床試験において，患者の安全性に影

響を及ぼす可能性がある予期しない結果又は異常な結果が確認さ

れた場合に，特定の試験サンプルを再分析することは制限されな

い．

いずれにせよ，再分析を実施した場合には，用いた試料の情報，

再分析を実施した理由，初回の定量値が得られている場合には初

回定量値，再分析によって得られた定量値並びに採用値及びその

選択理由と選択方法を報告書に記載することが必要である．

（解説）

LC-MS/MS に固有の用語を除いて，低分子ガイドライン案を踏襲

した．




4.2.3 キャリーオーバー

キャリーオーバーとは，分析装置に残留した分析対象物質が定量

値に影響を与えることである．

プレートやチューブを用いて分析する場合はキャリーオーバー

を考慮する必要はないが，同一のフローセル，流路，オートサン

プラーを用いて分析する場合は考慮する必要がある．

キャリーオーバーの回避が困難な場合には，その程度を検討し，

実際の実試料分析に影響を及ぼさないような手段を考慮する．キ

ャリーオーバーが実試料中の分析対象物質の定量分析に影響を及

ぼすと懸念される場合には，実試料分析中にキャリーオーバーを

評価し，定量値への影響について考察する．

（解説）

リガンド結合法においては，一般的にプレートやチューブを用い

て測定しており，キャリーオーバーが問題となることは稀であり，

注意事項とした．ただし，フローセル，流路，オートサンプラー

を用いて分析する場合にはキャリーオーバーを考慮する必要があ

る．なお，注意事項であるため，具体的な評価内容については記

載していない．




4.2.4 クロストーク

クロストークとは，プレートを用いた分析において，蛍光あるい

は発光等が隣接するウェルに漏れ，定量値に影響を与えることで

ある．

クロストークの回避が困難な場合には，その程度を検討し，実際

の実試料分析に影響を及ぼさないような手段を考慮する．クロス

トークが実試料中の分析対象物質の定量分析に影響を及ぼすと懸

念される場合には，実試料分析中にクロストークを評価し，定量

値への影響について考察する．

（解説）

クロストークは常に生じるものではないため，注意事項とし，具

体的な評価内容については記載していない．




4.2.5 重要試薬（Critical reagent）

重要試薬とは，リガンド結合法による生体試料中薬物濃度分析に

おいて分析結果に直接影響する試薬を指し，主に結合試薬（抗体

及びその標識体等）が該当する．

重要試薬は，分析対象物質に対する特異性に留意して選択し，品

質が維持できる条件で保存する．重要試薬の品質は，分析法バリ

デーション並びに実試料分析に使用される期間を通じて適切に保

証される必要がある．使用する期間中の検量線及び QC 試料の分

析結果を評価することにより，重要試薬の品質を確認することが

望ましい．また，重要試薬のロット変更の際にはパーシャルバリ

デーションが必要である．

（解説）

本項は注意事項であり，評価方法や基準等を具体的に規定するも

のではない．

重要試薬として取り扱うべき対象には，分析結果に直接影響する

試薬，主として結合試薬（抗体及びその標識体等）が該当すると

しているが，これに限定されない．標準物質（標準品），ブランク

マトリックス，希釈や洗浄に用いる緩衝液，反応停止液，プレー

ト等は本項でいう重要試薬の範疇には含めない．

重要試薬の品質は，使用する期間中の検量線や QC試料の分析結

果の評価で確認することとしており，使用期限の設定を必要とし

ていない．また，ロット変更の際にはパーシャルバリデーション

が必要としているが，どのような変更の際にどの程度の評価をす

るかを本ガイドライン内で詳細に規定することは意図していない．

重要試薬に関する記録類の保存については「5. 報告書の作成と

記録等の保存」に規定している．

なお，重要試薬に関する記載は FDA Guidance（2001）では「V.

METHOD DEVELOPMENT: MICROBIOLOGICAL AND

LIGAND-BINDING ASSAYS」，EMA Guideline（2011）では「7.1.1.12.




Reagents」にあるが，いずれも評価方法や基準等を具体的に規定す

るものではない．




4.2.6 平行性（Parallelism）

検討中

（解説）

平行性は実試料を用いて評価するが，平行性がみられない場合は

稀である．ただし，実試料においては，分解物，代謝物，さらに

抗薬物抗体等が存在しており，平行性に影響を与える可能性は否

定できない．

また，EMA Guideline（2011）の「7.1.1.10. Parallelism」には平行

性について記載があるが，稀な現象であることから，本ガイドラ

インにおいては妥当性の評価項目とはせず，注意事項に記載する

かについて議論した．現時点では，注意事項として平行性をガイ

ドラインに記載するかについては結論が得られていない．

平行性の不成立に関する議論，及び Regulated bioanalysis におけ

る平行性に関する最近の議論については以下が参考になる．

・Determination of Parallelism and Nonparallelism in Bioassay Dilution

Curves, B. D. Plikaytis et al, J.Clin. Microbiol., Vol. 32, No. 10,

2441-2447 (1994)

・2012 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis and Alignment of

Multiple Guidelines, B. DeSilva et al, Bioanalysis, Vol. 4, No. 18,

2213-2226 (2012)

・The European Bioanalysis Forum community’s evaluation,

interpretation and implementation of the European Medicines Agency

guideline on Bioanalytical Method Validation, P. van Amsterdam et al,

Bioanalysis Vol. 5, No. 6, 645-659 (2013)

・Global Bioanalysis Consortium website, L2: Large molecule specific

assay operation, Progress & Status Reporting

(http://www.globalbioanalysisconsortium.org/L2/)

・Recommendations on the interpretation of the new European

Medicines Agency Guideline on Bioanalytical Method Validation by

Global CRO Council for Bioanalysis (GCC), M. Boterman et al,

Bioanalysis Vol. 4, No. 6, 651-660 (2012)

http://www.globalbioanalysisconsortium.org/L2/




4.2.7 干渉物質

干渉物質とは，薬物の可溶性リガンドあるいは抗薬物抗体等，実

試料分析において定量値に影響を及ぼす可能性のあるものをいう．

干渉物質が実試料中に存在する可能性がある場合には，定量値へ

の影響の程度を検討しておくことが望ましい．

（解説）

干渉物質が実試料分析における定量値に影響を与える場合は限

定されているため，注意事項とし，具体的な評価内容については

記載していない．




5.報告書の作成と記録等の保存

十分な再現性及び信頼性を有することを保証するため，分析法バ

リデーション及び実試料分析によって得られた結果を，以下に示

すバリデーション報告書及び実試料分析報告書として作成し，関

連の記録や生データと併せて適切に保存する．

また，関連の記録や生データは，標準物質及びブランクマトリッ

クス及び重要試薬に関する授受，使用及び保存の記録，試料に関

する授受，調製及び保存の記録，分析の実施記録，装置の校正記

録及び設定値，逸脱の記録，通信の記録，並びに分析結果等の生

データは，棄却された分析単位において得られたデータも含めて

全て保存する．

バリデーション報告書

バリデーションの要約

標準物質に関する情報

ブランクマトリックスに関する情報

重要試薬に関する情報

分析方法（最小希釈倍率を含めて記載する．）

バリデーションの評価項目と判断基準

バリデーションの結果及び考察

分析の棄却及びその理由

再分析に関する情報

計画書及び手順書からの逸脱事項並びに試験結果に対する影

響

参照する別試験，手順書及び参考文献の情報




実試料分析報告書

実試料分析の要約

標準物質に関する情報

ブランクマトリックスに関する情報

実試料の受領及び保存に関する情報

重要試薬に関する情報

分析方法

分析の妥当性に関する評価項目と判断基準及びその結果

実試料分析の結果及び考察

分析の棄却及びその理由

再分析に関する情報

計画書及び手順書からの逸脱事項並びに試験結果に対する影

響

参照する別試験，手順書及び参考文献の情報

（解説）

基本的な考え方は低分子ガイドライン案と同じである．ただし，

リガンド結合法の性質（重要試薬が分析に直接影響すること，バ

リデーション報告書には設定した最小希釈倍率（MRD）の情報が

必要であること，クロマトグラムが発生しないこと）を考慮し，

これらの点を低分子ガイドライン案の該当箇所から削除あるいは

追記している．




当該ガイドライン案に記載しなかったこと： Total error

Total error はリガンド結合法に限定されず低分子ガイドライン

案にも共通する事項である．低分子ガイドライン案では total error

の記載をしていないことから，リガンド結合法でも記載しないこ

とにした．

DeSilva et al. Pharm. Res. 20: 1885-1900 (2003)より引用、改変




用語解説対象リスト（案）

日本語英語

アンカーポイント Anchor point

安定性 Stability

応答変数（レスポンス） Response variable

乖離度 Assay variability

干渉物質 Interfering substance

希釈直線性 Dilutional linearity

キャリーオーバー Carry over

クロストーク Cross talk

クロスバリデーション Cross validation

結合試薬 Binding reagent

検量線 Calibration curve

検量線用標準試料 Calibration standard

交差反応性 Cross-reactivity

最小希釈倍率 Minimum required dilution

再分析 Reanalysis

実試料 Study sample

重要試薬 Critical reagent

真度 Accuracy

精度 Precision

選択性 Selectivity

代替マトリックス Surrogate matrix

定量下限 Lower limit of quantification (LLOQ)

定量上限 Upper limit of quantification (ULOQ)

定量範囲 Quantification range

投与後試料 Incurred sample

特異性 Specificity

パーシャルバリデーション Partial validation

バリデーション Validation




日本語英語

標準物質（標準品） Reference standard

標準溶液 Working solution

フック効果 Hook effect

ブランク試料 Blank sample

フルバリデーション Full validation

プロゾン Prozone

分析 Analysis

分析対象物質 Analyte

分析単位 Batch

平行性 Parallelism

マトリックス Matrix

リガンド結合法 Ligand binding assay

ISR Incurred sample reanalysis (ISR)

QC試料 Quality control (QC) sample




【今後の議論のポイント】

標準物質と被験物質・治験薬のロットの異同

標準物質ロット更新の際の生体試料分析での確認

平行性の扱い

Total errorについて

など

【謝辞】

BMV研究班の先生方

LBA-WG の先生方

座長：石井明子

片島正貫、前川浩太郎、光岡俊成、奥田晴宏、

香取典子、川崎ナナ、新見伸吾

JBF-SC

黒川達夫、荻中淳、升島努、奥田晴宏、香取典子

大津善明、間渕雅成、五十嵐春江、内山仁、大住孝彦

河村正則、小林信博、佐々木和彦、佐野善寿、富樫一天

中井恵子、原久典、松丸剛久、八幡憲治、工藤忍

（敬称、所属略）

本発表資料に掲載した図表の一部は，国立医薬品食品衛生研究所生物

薬品部第二室室長石井明子先生よりご提供いただきました。この場を

借りてお礼申し上げます。

outline of the jbf draft bmv guideline for ligand...

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