Ortopedik Çimentolarda Kullanılan Brushite (CaHPO4⋅2H2O) Tozlarında Yeni Parçacık Morfolojisi

A Novel Particle Morphology for the Brushite (CaHPO4⋅2H2O) Powders Used in Orthopedic Cements

Özge Hindistan, Ibrahim Mert, Selen Mandel ve A. Cüneyt Taş

Biyomedikal Mühendisliği Bölümü, Yeditepe Üniversitesi, Istanbul

actas@yeditepe.edu.tr

Özetçe Brushite (CaHPO4⋅2H2O, dikalsiyum fosfat dihidrat) ortopedik çimentoların tozlarında kullanılan önemli bir bileşendir. Brushite içeren çimentolar son on yılda üretilmiş ve ancak son beş yılda da ticari ve klinik biçime kavuşarak, Avrupa’da, ortopedik cerrahların kullanımına sunulmuştur. Brushite tozları bugüne dek ancak 70 ile 100 mikron arası uzunluklara sahip ince ve düz kristaller biçiminde üretilebilmiş olup, bu çalışmada sunulan su leylağı şeklindeki özgün kristal formu hiç elde edilememiştir. Bu özgün biçimin eldesine olanak sağlayan sentez yöntemi bu çalışmada sunulmaktadır.

Abstract

Brushite (CaHPO4⋅2H2O, dicalcium phosphate dihydrate) is an important component of the powders of orthopedic cements. Brushite-containing cements were produced over the last ten years, and could only be submitted to the commercial and clinical use of European orthopedic surgeons in the last five years. Until now, brushite powders could be produced only as thin and long crystals with lenghts over the range of 70 to 100 microns, and the water-lily-shaped novel crystals presented here cannot be obtained yet. The synthesis procedure which allowed the production of this novel morphology is presented in this study.

1. Giriş

Brushite (CaHPO4⋅2H2O) tozları, α-BSM®/Biobon® (Etex Corp., USA) ve Biopex® (Mitsubishi Biomaterials, Japan) gibi günümüz itibariyle klinik kullanıma yeni geçebilmiş ve yüksek biyoçözünürlüğe ve biyouyumluluğa sahip ortopedik çimentoların toz bileşenlerinde önemli bir yer tutmaktadır. Örnek vermek gerekirse, α-BSM®/Biobon® çimentosunda, brushite ağırlıkça yüzde 50 oranında amorf kalsiyum fosfat tozu ile harmanlanmış olup, bu harman uygun miktarda tuzlu su (0.9 wt% NaCl) ile bir spatula yardımı ile karıştırıldıktan sonraki yaklaşık 10 dakika içinde kendiliğinden sertleşmekte ve sert dokuların minerali olan apatitik kalsiyum fosfata dönüşmektedir [1]. Öte yandan, ChronOSTM, Eurobone® ve VitalOS® çimentolarında ise çimento tozları, kristalizasyonu tetikleyici çözeltileri ile karıştırıldıktan sonraki dakikalar içinde, apatitik kalsiyum fosfat yerine brushite (CaHPO4⋅2H2O) fazına dönüşmektedirler [2]. Yukarıda anılan

ortopedik çimentolar son yıllar içinde üretilmiş olup, kemik dolgu malzemesi uygulamalarında, biyoçözünürlüğü ve in vivo özümsenerbiliği oldukça düşük olan yapay apatitik kalsiyum fosfatdan kaçışa işaret etmektedir. Bu çimentolar kullanılarak yürütülen hayvan ve klinik deneylerde, kristalizasyon ve sertleşme sonrası ana fazı brushite olan veya içinde önemli miktarlarda brushite barındıran çimentoların in vivo biyoçözünürlüklerinin yüksek olduğu ve en geç 3-4 ay içinde tümüyle özümsenerek, çimentonun uygulandığı defekt bölgesindeki yeniden kemik yapılandırılması sürecine çok olumlu bir biçimde katıldıkları rapor edilmiştir [3]. Apatitik kalsiyum fosfat’ın (HA; Ca10(PO4)6(OH)2) ise, cerrahi girişimi takip eden yıllar boyunca neredeyse hiç bozunmadan, özümsenmeden ve daha da önemlisi o bölgede olması arzulanan yeniden kemik yapılandırılması sürecine katılmadan, adeta yabancı bir madde gibi in vivo ortamda kaldığı bilinmektedir [4].

Brushite ile kalsiyum hidroksiapatit’in (HA) sudaki çözünürlüklerinin kıyaslanması gerekirse, burada da durumun fazlasıyla brushite lehine olduğu görülecektir. Bu kıyaslamada, bu iki fazın logKSP değerlerinin sırasıyla şöyle olduğu rahatlıkla görülebilecektir; brushite: -6.60 ve hidroksiapatit: -117.1 [5]. Sert dokularda, sağlıklı metabolizmalarda günlük bazda süregiden yeniden kemik yapılandırılması sürecinde, salt logKSP değeri bazında çözünürlüğü HA’e kıyasla çok daha yüksek olan brushite içeren çimentoların daha iyi özümsenebilirlik sergilemeleri hiç de şaşırtıcı olmamaktadır. Bu çerçevede, brushite tozlarının üretilmesine geçen yıllar içinde daha büyük önem atfedilmesi de beklenen bir gelişmedir. Brushite, örneğin, su-esaslı çözeltilerde oda sıcaklığında kalsiyum klorür dihidrat veya kalsiyum nitrat tetrahidrat ile disodyum hidrojen fosfat veya diamonyum hidrojen fosfat gibi tuzların, Ca/P molarite oranının bir civarında tutulduğu durumlarda, basitçe karıştırılması ile derhal üretilebilecek denli sentezi kolay bir fazdır [6, 7]. Fakat bu kolaylık beraberinde bir handikapı da birlikte taşımaktadır; üretilen brushite tozları sürekli olarak ince, uzun ve oldukça büyük olarak nitelenen (70 ile 100 mikron) kristallere, parçacıklara sahip olmaktadırlar. Böyle büyük parçacıkların en önemli dezavantajı da, bunların deneysel olarak ölçülen BET (Bruanauer-Emmett-Teller [8]) yüzey alanlarının çok düşük (1 ile 5 m2/g arasında) olmasıdır. Bu, oldukça karakteristik, düşük yüzey alanına sahip brushite parçacık morfolojisi aşağıda Şekil-1’de gösterilmiştir.

Şekil 1: Tipik brushite morfolojisi [9, 10]

Bu çalışmadaki amacımız, Şekil-1’de görülen kristal/parçacık morfolojisinin değiştirilmesidir. Bu morfolojinin esas olarak daha küçük ve/veya karmaşık bir forma değiştirilmesinden elde edilebilecek en önemli kazanç ise, tozun BET yüzey alanının arttırılması olacaktır. Daha yüksek yüzey alanına sahip brushite tozlarının üretilebilmesi, bunların sert doku defektine, cerrahi girişimle uygulanması esnasında birim parçacık yüzeylerine daha çok doğal protein, büyüme faktörü, hücre, platelet, biyomolekül, vb. adsorpsiyonuna/tutunmasına olanak tanıyarak biyomalzemenin cerrahi girişimi takip eden ilk saatler boyunca biyouyumluluğunu arttıracağı yönündeki varsayımı destekler niteliktedir.

2. Deneysel Yöntem

Bu çalışmada brushite tozlarının üretimi için aşağıda anılan başlangıç kimyasalları kullanılmıştır; amonyum dihidrojen fosfat (NH4H2PO4, >99%, Katalog No. 1.01126, Merck, Darmstadt, Almanya) ve çöktürülmüş kalsiyum karbonat (CaCO3, >99%, Katalog No. 12010, Riedel de Haen, Almanya). Sentez çözeltilerinin hazırlanması için de iki kez damıtılmış su kullanılmıştır. Tipik bir sentez deneyi ise şöyle yapılmıştır. 100 mL kapasiteli temiz bir cam şişenin içine önce 85 mL saf su konmuş, buna da 15.0 g NH4H2PO4 eklenmiş ve bu tuz suda çözününceye dek oda sıcaklığında (21±1°C) karıştırılmıştır. Elde edilen berrak amonyum fosfat çözeltisinin pH değeri 4.1-4.2 aralığındadır. Bu çözeltiye 3.0 g CaCO3 tozu eklenmiş ve oluşan beyaz süspansiyon 1.5 dakika ile 24 h aralığında değiştirilen süreler boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Karışma süresinin sonunda, cam şişe içindeki beyaz süspansiyon filtre kağıdı kullanılarak süzülmüş ve yaklaşık 2 litre saf su ile yıkandıktan sonra da 90°C sıcaklıkta sabit tutulan bir etüvde 24 saat boyunca kurutulmuşlardır. Üretilen toz örneklerinin karakterizasyonu için X-ışını kırınımı (Advance D8, Bruker AXS, Karslruhe, Almanya), Fourier-dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (SpectrumOne, Perkin-Elmer, USA) ve taramalı elektron mikroskobu (Evo-40, Carl Zeiss AG, Dresden, Almanya) kullanılmıştır. X-ışını kırınımı analizlerinde, tozlar once bir agat havanda hafifçe öğütülmüşler, sonra da 40 kV, 40 mA X-ışını jeneratörü koşullarında 0.02° 2θ adım aralıkları (her adımda 3 saniye) ile X-ışını verisi toplanmıştır. FTIR analizleri yapılırken, 1 mg örnek ile 250 mg saf KBr tozu bir agat havanda karıştırılmış, bunu takiben de elde edilen tozlara

1 cm iç çapa sahip çelik bir kalıp içinde 10 ton basınç uygulanarak pastiller elde edilmiştir. Bu pastiller FTIR cihazında 128 kez taranarak, 4000 ile 400 cm-1 aralığında veri toplanmıştır. Taramalı elektron mikroskobu ile elde edilen tozların parçacık morfolojileri incelenmiştir, bu inceleme öncesinde de tüm örnekler, elektriksel iletkenliklerinin arttırılması amacı ile, yaklaşık 25 nm kalınlığında bir altın tabakası ile kaplanmışlardır.

3. Bulgular ve Tartışma

Şekil-2’de 2.5 ile 24 saat aralığında karıştırılan CaCO3 içeren amonyum dihidrojen fosfat süspansiyonlarından elde edilen tozların X-ışını kırınım verileri topluca gösterilmiştir. Bu veriler elde edilen tozların çok yüksek oranda brushite içerdiğini göstermiştir. Şekil-3’te ise 90 saniye ile 1 saat arası karıştırma ile elde edilen tozların X-ışını verileri sunulmaktadır.

Şekil-2: 2.5 ile 24 saat aralığında karıştırılarak elde edilen brushite tozlarının X-ışını verisi

Şekil-3: X-ışını verileri; 90 saniye ile 1 saat arası karıştırma

Şekil-3’te verilen X-ışını analizleri 90 saniye karıştırmanın brushite oluşturmak için yeterli olmadığını göstermiştir.

Ama yalnızca 6 dakika karıştırmanın, brushite oluşumu için yeterli olduğu, bunun üzerindeki ve özellikle de bir saati aşan karıştırmaların toz içinde ikincil bir faz olarak monetite

(CaHPO4) oluşumuna yolaçtığı (bkz. Şekil-2) bulunmuştur. Dolayısıyla, deneysel yöntem bölümünde verilen sentez reçetesi kullanılarak, yalnızca 30 dakika oda sıcaklığında karıştırma yüksek saflıkta brushite tozu üretimi için yeterlidir.

Şekil-4’te, yarım saat karıştırma ile elde edilen, yüksek saflıktaki brushite tozlarına ait FTIR verisi gösterilmektedir. Bu dıyagramda gözlenen tüm bantlar brushite fazına aittir [6].

Şekil-4: Yarım saat karıştırma ile üretilen brushite tozlarının FTIR verisi

Taramalı elektron mikroskobu fotomikrografları ise bu çalışmada geliştirilen yöntemle üretilen tozların morfolojilerini (30 dakika karıştırma ile) göstermektedir. Aşağıdaki fotomikrograflarda gösterilen morfoloji bugüne dek, dünya literatüründe brushite tozları için hiç rastlanılmamış bir kristal/parçacık biçimine işaret etmektedir.

Şekil-5: Su leylağı şeklindeki brushite kristalleri-1

Şekil-5 ve Şekil-6’da verilen fotomikrograflardan da görüleceği üzere, yeni yöntemle üretilen brushite tozlarının parçacık boyutları çok fazla düşürülememiş olmasına (Şekil-1’e kıyasla) karşın, morfolojileri köklü biçimde değiştirilebilmiştir. Bu tozların yüzey alanının 1 ile 5 m2/g’dan çok daha yüksek olarak ölçüleceği rahatlıkla öngörülebilmektedir. Parçacık morfolojisindeki bu köklü değişikliğe (Şekil-1’e kıyasla) ne yol açmıştır? Bu sorunun yanıtı başlangıç malzemesi olarak kullandığımız CaCO3’ın morfolojisi ile verilebilecektir.

Şekil-6: Su leylağı şeklindeki brushite kristalleri-2

Bu çalışmamızda kullanılan CaCO3 tozlarının parçacık morfolojisi Şekil-7’de verilmektedir.

Şekil-7: Kullanılan CaCO3 tozları

Kullandığımız CaCO3 (kalsit) tozları, NH4H2PO4 içeren su çözeltilerine eklendikleri andan itibaren bir “template” işlevini üstlenmekte; bir yandan yavaşça çözünmeye başlamaktalar, ama aynı zamanda da orada kristalize edecek olan brushite fazının oluşumu için bir tür iskelet olmaktadırlar. Aynı miktarda NH4H2PO4 içeren su çözeltilerine, aynı molaritede ama suda kolayca çözünen kalsiyum klorür dihidrat veya kalsiyum nitrat tetrahidrat eklendiğinde, oluşan brushite fazının parçacık morfolojisi yalnızca Şekil-1’de verilen ile aynı oluyordu. Bir başka deyişle, pH değeri 4.1-4.2 olan bir fosfat çözeltisinde termodinamik olarak en kararlı faz brushite’tır. O çözeltide serbest kalsiyum katyonları (kalsiyum klorür veya kalsiyum nitrat ile çözeltiye sağlanan) herhangi bir template yokluğunda, sadece Şekil-1’deki morfolojiyı oluşturmaktadırlar.

Böylesi özgün morfolojiye sahip, bu yöntem kullanılarak üretilecek brushite tozları ile oluşturulacak yeni ortopedik çimento formülasyonlarının çalışılması bundan sonraki araştırma evremiz olacaktır.

4. Sonuçlar Bu çalışmada, brushite tozlarının parçacık morfolojisi literatürde ilk kez olmak üzere değiştirilmiştir. Su leylağına benzer morfolojiye sahip brushite parçacık veya kristallerinden oluşan tozlar üretilmiştir. Bu tozlar, çöktürülmüş kalsiyum karbonat (CaCO3, kalsit) tozlarının NH4H2PO4 içeren su-bazlı ve asidik çözeltilere eklenerek 6 dakika ile 24 saat aralığında istenen süreler boyunca oda sıcaklığında cam şişeler içinde kolayca karıştırılması ile elde edilmektedir. Bu morfolojideki tozların yeni ortopedik çimento formülasyonlarının geliştirilmesinde kullanılması planlanmaktadır.

5. Kaynakça [1] D. Knaack, M. E. P. Goad, M. Aiolova, C. Rey, A.

Tofighi, and D. D. Lee, “Resorbable calcium phosphate bone substitute,” J. Biomed. Mater. Res. Appl. Biomater., vol. 43, pp. 399–409, 1998.

[2] M. Bohner, U. Gbureck, and J. E. Barralet, “Technological issues for the development of more efficient calcium phosphate bone cements: A critical assessment,” Biomaterials, vol. 26, pp. 6423–6429, 2005.

[3] D. Apelt, F. Theiss, M. Bohner, and B. von Rechenberg, “In vivo behavior of three different injectable hydraulic calcium phosphate cements,” Biomaterials, vol. 25, pp. 1439–1451, 2004.

[4] E. M. Ooms, J. G. C. Wolke, M. T. Van de Heuvel, B. Jeschke, and J. A. Jansen, “Histological evaluation of the bone response to calcium phosphate cement implanted in cortical bone,” Biomaterials, vol. 24, pp. 989–1000, 2003.

[5] F. C. M. Driessens and R. M. H. Verbeeck, Biominerals, pp. 37–59. CRC Press, Boca Raton, FL, 1990.

[6] A. C. Taş and S. B. Bhaduri, “Chemical processing of CaHPO4⋅2H2O: Its conversion to hydroxyapatite,” J. Am. Ceram. Soc., vol. 87, pp. 2195-2200, 2004.

[7] M. Kumar, J. Xie, K. Chittur, and C. Riley, “Transformation of modified brushite to hydroxyapatite in aqueous solution: Effect of potassium substitution,” Biomaterials, vol. 20, pp. 1389–1399, 2000.

[8] S. Bruanauer, P. H. Emmett, and E. Teller, “Adsorption of gases in multimolecular layers,” J. Am. Chem. Soc., vol. 60, pp. 309-319, 1938.

[9] Ö. Hindistan, “Changing the persistent particle morphology of CaHPO4⋅2H2O (brushite) powders,” BME 492, Graduation Project Thesis (Supervisor: A. C. Taş), Dept. of Biomedical Engineering, Yeditepe University, İstanbul, 2009.

[10] İ. Mert, “Modification of the morphology of brushite crystals,” BME 492, Graduation Project Thesis, (Supervisor: A. C. Taş), Dept. of Biomedical Engineering, Yeditepe University, İstanbul, 2009.