ORlviONI

Un metodo semplificato 11er la determinazione

dei corticosteroidi diidroes iacetonici urinari

]). \'\l E\ TI ·.

L aboratorio di /Jiorhimira d ••I/'Osprdal•· ,l/uuuiurl' r·,.• Grand" di .\filano

Il metodo originario di Silber c Portcr (1) per il dosaggio d ei corticostc­roidi (CS) urinari e plasmatici ba~ato stilla n •azionc con fenilidrazina. prc­YedeYa, oltre alla estrazione dei campioni dopo idrolisi, rma purificazion•· degli estratti mediante passaggio su una colonna di Flcirisil: tale passaggio assicura rma buona specificità della determinazione. Successivamente, poichì· per le grandi serie analitiche occorre disporre di metodi semplificati, gli ste!iSÌ AA. proponevano il trattamento dir('tto dell'estratto cloroformico con la miscela cromogena (acido solforico-etanolo-fen il.idraz.ina) e l'allesti­mento, per ogni campione, di un controllo in bianco ch e viene trattato come i campioni, salvo l'impiego come r<'alt i v o finale di rma miscela di etanolo e acido solforico priva di fenilidrazina. Tale variante, che tiene conto del fatto che alcune sostanze, quali il chinino <' la paraldeidc danno luogo a t•olorazioni aspecifiche e quindi a risulta t i falsamente elevati (2) , si basa peraltro sul presupposto discutibile che 1t- interferenze delle sostanze siano Òo\'ute alla reazione con l' acido solfori<'o e non con la fenilidrazina. In r ealtà, e, ·entuali sostanze a caratter e chctonico (ad es. i corpi chetonici) possono reagire positiYamentc con la fenilidrazina senza formare composti colorati con l'acido solforico.

Abbiamo pertanto esaminato la possibilità di eliminare le sostanze interferenti mediante estrazione con una miscela di solventi pr ima dell'idro­li:;i enzimatica. In una serie di prove preliminari abbiamo studiato la ripartizione di rma serie di corticostcroidi ( tctra idrocortisolo, tetraidro-S, cortisolo e composto S) tra Ja fase acquosa e alcune miscele di solventi organici.

Abbiamo ottenuto i risultati migliori con rma miscela di diclorometano, glicolc propilenico ed etere etilico nel rapporto 20 : l : l. Nei confr onti del diclorometano impiegato da solo, questa miscela è caratterizzata da Wl

A nn. I st. Suvcr. Sanitd. (1971) 7, 4()8-410

VALENTE 409

coefficiente di ripartizione {diclorometano/H20} più favorevole; per il tetrai­drocortisolo, che è il corticosteroide diidrossiacetonico più polare, esso è di circa 50 (con il solo diclorometano è di 20). I corticosteroidi liberi, che sono eliminati con le urine in minima quantità (0,1 • 0,2 mg nelle 24 ore) , vengono asport ati dalla miscela insieme alle sostanze interferenti. I corti· costeroidi coniugati rimangono invece nell'urina; l'estrazione da parte della miscela di solventi è del tutto trascurabile. Con la miscela utilizzata vi è un importante vantaggio: la presenza di glicole propilenico e di etere riduce al minimo la formazione di emulsioni, che altrimenti è assai frequente.

Il metodo da noi messo a punto è il seguente: - si acidificano in provetto ne 6 ml di urina a p H 4, 7 circa, con

alcune gocce di acido acetico SN; - si estrae con 12 m i di miscela di solventi {diclorometano 11, glicole

propilenico 50 ml, eter e etilico 50 ml) per allontanare le sostanze interferenti ; - si trasferiscono in altro provettone 3 ml dell'urina sovrastante; - si prepara lo standard: a 0,1 mi di soluzione di cortisolo {60 mg/

100 mi di etanolo) si aggiungono 2,9 mi di acqua deionizzata; l'estinzione data dallo st andard corrisponde a un tasso di 20 mg/1;

- si aggiungono 0,3 ml di tampone a pH 4,7 e 0,4 mi di glicuroni· dasi (Ketodase della Ditta Warner-Chilcott) e si lascia per una notte a 45oC;

- si estrae con 10 mi della miscela di solventi e si elimina la fase acquosa;

- si lava con 3 ml di NaOH N preparata al momento dell'uso per diluizione di una soluzione concentrata;

- si trasferiscono 6 ml della fase organica in altro provettone; - si aggiungono 3 mi di r eattivo cromogeno {*); - si agita per 20 secondi mediante agitatore a vortice; - si elimina la fase sovrastante e si lascia per 30 minuti in un bagno

1l' acqua a 600C; - si legge a 410 nm contro il bianco dei r eattivi e si calcola il tasso

dei corticosteroidi e la quantità eliminata nelle 24 ore. Come si vede, i campioni di urina vengono sottoposti a un'estrazione

preliminare («lavaggio») con la miscela di solventi, e l'urina cosi trattat a n ene sottoposta a idrolisi enzimatica. Si r ipete l'cl:ì trazione con la stessa miscela di solventi dopo idrolisi : nella seconda estrazione si ottengono

(* ) Il reattivo si prepara nel modo seguente : Sulu/.ione A): ~ciogliere 6.5 g d i 1· loridrato di fenil idrazina \lerek in 100 ml di H ,S04 2N ; ripartire in ali')uote ùa l mi l' cons~rvare in congelatore. Soluzione B) : a 350 mi di etanolo )lerck aggiu ngere ci rca 30 mg di sodi o b oroidruro e 0,5 ml di t ampone a cetato p H 4, i: mescolare cd attendere l ora ; aggiungere 300 ml di acqua deionizzala, 500 mi di H 2S04 1·onc. e raffreddare. Poco prima deU'uso me~colare l ml d ella soluzione A) con 100 ml della soluzione B).

A nn. l! t. Su per . Sanità (1971) 7, ~Oti-UO

17

l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l

410 c,()~ t UNICAZIONI

solo composti coniugati in precedenza con l'acido glicuronico, quindi i corticosteroidi presenti nelle urine sotto forma di glicuronidi.

n rischio che la prima estrazione non estragga del tutto alcune sostanze interferenti è minimo: abbiamo infatti verificato su numerosi campioni (oltre 800) che in una seconda estrazione (senza idrolisi) si ottenevano costantemente valori non distinguibili da quelli del bianco dei r eattivi. Ovviamente lo standard non dev'essere sottoposto all'estrazione preliminare.

Per il buon successo dell'analisi ha grandissima importanza la purezza dell'etanolo utilizzato per il reattivo alla fenilidrazina. Le aldeidi e altre impurità spesso presenti nell'etanolo possono infatti dar luogo con gli estratti urinari a colorazioni abnormi.

Rispetto alle determinazioni di altri gruppi di corticosteroidi, la r ea­zione di Porter e Silher presenta un indubbio vantaggio, quello della grande utilità clinica. Tuttavia rispetto ad altri metodi (ad es. quello della deter­minazione dei eorticosteroidi 17-chetogeni e dei es acetaldeidogenici) essa presenta dal punto di vista chimico un maggior rischio di errore analitico. È quindi indispensabile utilizzare reattivi purissimi e a'dottare w1a tecnica analitica assai rigorosa.

Le modifiche da noi apportate al m etodo semplificato di Silher e Porter permettono di ridurre al minimo le fonti di errore. Le modifiche riguardano:

l) l'eliminazione preventiva delle sostanze diverse dai corticosteroidi capaci di reagire con il rca ttivo alla fenilidrazina;

2) l'impiego di una particolare miscela di solventi, che permette un miglior recupero e una separazione più rapida e completa delle fasi;

3) la purificazione deJI'etanolo mediante boroidruro, che elimina le impurità aldeidiche e migliora la specificità della reazione;

4.) l'abolizione dei bianchi individuali (l'eliminazione preventiva delle sostanze interferenti li r ende superflui).

Grazie alle modifiche apportate e grazie anche all'impiego di un parti· colare dispositivo per l'estrazione contemporanea di numerosi campioni [(sino a 48): si tratta di un « Multimixer » basato sul principio degli agitatori a vortice, cfr. (3)] è ora possibile effettuare il dosaggio dei cor­ticosteroidi Silher e Porter positivi in grandi serie. Il metodo dettagliato sarà descritto in altra sede.

BIBLIOGRAFIA

(1) SJLBER, R. H. & C. C. PoRTER. Mttlwd.s Bwchem. A.nal., f, 139 (1957).

(1

) SILBER, R. H., R. D. Busu. J. Clin. Endocrinol., 15, 505 (1955).

( 1) VANZETTJ . G. Min Prva M ed., 62, 991 (1971).

d nn. lat. SuveT. Sanità (1971) 7, 408-CHI

Metodo rapido di dosaggio dell'estriolo urinario in gravidanza

B. D. PRANDINI e L. SPAXDRIO

l $IÌIIIIO di Biologia e Biorhimica degli Spedali Civili di Brescia

Il dosaggio dcll'estriolo urinario in gravidanza si va imponendo sempre più come mezzo diagnostico e prognostico per il controllo delle condizioni funzionali del complesso feto·placentare nei casi di sospetta o accertata patologia gravidica (gravidanza protratta, insufficienza placentare, gestosi, ecc.), specialmente quando esistono situazioni patologiche materne predi­sponenti (diabete, cardiopatie ecc.).

Per far fronte all'esigenza del clinico di disporre di un controllo pres· sochè quotidiano dell'escrezione urinaria dell'cetriolo nell'ultimo periodo della gravidanza, abbiamo messo a punto un micrometodo di dosaggio, sem­plificando ulteriormente il metodo di Brown (1) per il dosaggio degli estro­geni, già modificato da Spandrio e coll. (2).

Con questo metodo è possibile eseguire 3000-4000 determinazioni al­l' anno con punte giornaliere di 40 determinazioni con l' intervento di un solo operatore e con un impegno medio di lavoro di circa mezza giornata.

I r eagenti erano prodotti commerciali puri per analisi. Il reattivo cro­mogeno era costituito da idrochinone Analar BDH al 2 % in acido solforico Merck al 76 % (v:v); questa soluzione va conservata al buio. Come solu­zione standard si impiegava estriolo Vist er 100 pg/ml in etanolo assoluto. L'apparecchiatura era costituita da un agitatore multiplo a 20 posti (Ditta Cavallo, Milano) e da un colorimetro Bausch e Lomb.

In un provettone tipo Hagedorn (2,5 X 15 cm) si pongono 2 ml di urina delle 24 ore, si aggiungono 0,55 ml di HCI 6 N, si mescola e si mette per un'ora in bagno maria bollente, dopo aver posto sull'imboccatura del provettone una capsulina rovesciata con scolagocce centrale; si raffredda, si estrae il campione con circa 10 ml di eter e etilico (misurati con dosatore a galletto) agitando 3 volte per 10 sec.

Si eseguono lavaggi successivi dell'estratto etereo con : l) 2 ml di tam· pone bicarbonato pH 10,5 (preparato con 750 mi di NaHC03 8% e 110 ml di NaOH 8 % ); 2) 0,5 ml di NaOH 8 % e, senza aspirare quest'ultimo, 2 ml di NaHC03 8 %; 3) 0,5 ml di NaHC03 8 %; 4) 0,2 ml di acqua deio-

A nn. h C. Su~ e-r. SanitA (1971) 7, Ul- 413

412 CIH!UNJCAZIUN I

nizzata . Dopo ogni singola aggiunta si agita e si allontana la fase acquosa aspirandola con una pipetta Pasteur collegata con una pompa ad acqua.

Si evapora l'etere, sotto cappa, per leggero riscaldamento in bagno maria. Si riprende il residuo aggiungendo successivamente 6 goccr di eta­nolo, 1,4 ml di etere di })etrolio e 1,4 ml di benzC:'ne; si agita, si aggiungono 6 mi di acqua deionizzata, si agita nuovamente, si centrifuga e si scarta l a fase organica; l'estriolo viene in questo modo separato dagli altri estrogeni.

La fase acquosa viene acidificata con 0,4 ml di HCI 6 N c, con l'aggiun­ta di 10 mi di eter e etilico, si estrae l'estriolo dalla fase acquosa. La fase eterea, contenente l'estriolo, v iene portata a secco sotto cappa, mediante leggero riscaldamento a bagno maria.

Si procede quindi allo sviluppo del colore aggiungendo al provettonc contenente il r esiduo dell'estrazion e 6 mi di reattivo cromogeno; nello stesso tempo si allestiscono un bianco e uno standard con 20 [tg di estriolo; si scalda per 20 min in un bagno d'acqua bollente, si raffredda, si aggiungono 3 mi di acqua deionizzata, si agita e si scalda nuovamente n el bagno d 'acqua bollente per 10 min. Dopo raffreddamento, si procede ~a lettura fotome­trica utilizzando le lunghezze d'onda di 510, 475 e 545 nm.

Si applica la correzione di Allen-Talhot :

L'estinzione corretta (E') dei campioni (non dello standard) va molti­plicata per 1,4 a correzione delle perdite verificatesi durante le varie fasi del procedimento [10-20 % durante l 'idrolisi (1) e circa 20 % durante i pro­cessi di estrazione].

Si calcola la concentrazione urinaria dell'estriolo nelle 24 ore mediante la seguente formula :

ovvero:

mg/24 ore= 20 X E'c 2 X E'st

x 1,4 x v

14 mg/24 ore = --;~- X E 'c X V

E 'et

ove 20 = [tg di estriolo standard utilizzato nell~ prova; 2 = ml di urina idrolizzata; V = litri di urina delle 24 ore; E'at e E' c = estinzione cor­retta dello standard e del campione.

Il metodo proposto, pur comportando numerosi trattamenti del cam· pione, risulta assai rapido grazie all' adozione dell'estrattore multiplo e per

A nn. lat. Super. Sanitd (1971) 7, 411-413

PIIANOI N1 E SPANORIO 413

il fatto che l'intero procedimento viene t:seguito in uno stesso provcttone; quest'ultimo accorgimento contribuisce anche a rendere più riproclucihili i risultati. Il coefficiente di variazione va dal 3 % per lo s tandard al 6% per i campioni contenenti concentrazioni fisiologiche di estriolo urinario nell' ul· timo periodo della gravidanza. Il metodo è soddisfacente per quanto riguarda la specificità; s i è rilevato invece che alcune sostanze, che possono essere presenti in urine patologiche materne (glucosio, albumina), interferiscono e possono provocare delle perdite del 10-20% rispetto al valore teorico del· l'estriolo. Considerazioni dettagliate sul metodo verranno e8pos te in un lavoro pii'1 esteso in corso di prepara2.ione.

DIBLlOGRAFIA

( 1) 13ROW'I, J. B. J. 1Jiochm1., 60, 185 (1955).

e> SP.\~DRIO. l.., l -.:\. BI.\'ICIII & C. B. FOHCJII~ I . Boli. 'oc. !l!t•d. Chir. Bresrirma, 20, -l-15 (1966).

..J11 n. T• t. Su pcr . .Sanità (1971 ) 1 4 11- -113

Determinazione fluorimetrica simultanea della noradrenalina, adrenalina. dopamina e dopa (3,4 · diidrossifenilalanina)

nelle urine (*)

• C. 'r ~LOllJ. • C. A. HRl NORI. •• ' ' · ItENZil\ J e * C. POHCl~ l.l. \ 'rf

• lstituto di Pato/.Qj!iu SpcciaiP Afedica dell'Università di Prru~ia.

•• lstitu.w (li SPm riotica Medica deli'UnivPrsità di Prrugin

Iu un recente studio (i) sulla reazionr del t riidrossi-indolo per la d etf'r­minazionc fluorimetrica dell'adrenalina e della noradrenalinn è stato osser­vato che l'impiego di una soluzione al 10% di 2,3-dimercaptopropanolo (BAL) in aldeide formica 25 % p ermette di ottener e la formazione di lutinr altamente fluorescenti , stabili e con spettr i di eccitazione sufficientement~ separati per una accurata discriminazione. Con lR stcs~a procedura si ottiem· la formazion e di un derivato assai fluorescente della dopa, aventt· carattr ­ristich e spettrali completamf' nte diverse, mentrr la dopamina s"iluppa lUla fluorescenza che, anche se è assai debole rispett o a quC'lla di quaotità equi­valenti di dopa, non è completamente trascurabile, specialmente se la concentrazione di talt' ammina nel campione è notevolmente super iore a quella della dopa. SuJia base di quc;;te indicazioni è stato m1·s»o a punto un metodo per la determinazione fluorimetrica :-. imultanca dei quattro com­posti n elle uriuc, che po!òòs ie•de lill.a notevole accuratezza, sensibilità e spcti­ficità.

P er la preparazione de i rcaltivi <' delle soluzioni di riferimento sono stati utilizzati r eagenti commercjali puri per analisi e acqua bidistillata in v etro (1• 2); per le misure fluorim etriche· t\ stat o u sato uno sp ettrofotofiuori­metro con r egistratore Amiuco-Bowman (American Instrumcnt Company).

La purificazionc del campione di urina c la successiva separazione della dopa dalle catecolaminc sono ottenute attraverso trn doppio passaggio cromatografico.

(") Il lavoro è stato eseguit o cou u n contrihuto dr l Consjglio i\azionale delle Ricer · che (CNR., l'\. 1150189.0A754).

A nn. lat. SupeT. Sonità (1971) 1, ~H 421

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VALORI, BRUNORI, RENZINI E l>ORCELLATI 415

a) Cromatografia su ossido di aUuminio - In un becher da 100 ml si trasferisce un volume di urina pari al 2% del volume emesso nelle 24 ore (l'urina è raccolta in bottiglia di polietilene contenente 10 ml di HC1 6 N). Si aggiungono 5 ml di EDTA 5%, 0,2 ml di una soluzione di metabisolfito di sodio al lO% e 600 mg di ossido di alluminio per cromatografia (BDH) preparato come precedentemente descritto (1) . La miscela, sottoposta a continua agitazione, viene portata a pH 8,4-8,5 mediante aggiunta, goccia a goccia, di carbonato di sodio 0,5 N; il pH è t enuto sotto controllo durante la fase di adsorbimento che viene protratta per 7 minuti; dopo 3-4 minuti di sedimentazione e successiva decantazione del sopranatante, l'ossido di alluminio è trasferito su colonna cromatografica ( diam. in t. 7 mm, altezza 30 cm, serbatoio da 10 ml) e lavato con 10-15 mi di acqua bidistillata, seguita da l mi di acido perclorico 0,05N; l'eluizione è eseguita con 10 ml di acido perclorico 0,05N aggiunto in due porzioni da 5 ml e l'eluato è raccolto in provetta contenente 0,1 ml di acido ascorbico 0,1 % (questo r eattivo deve essere conservato in bottiglia scura e rinnovato dopo una settimana).

b) Cromat-ografia su resina AG 50W-X2 --Una piccola quantità di resi­na, lavata 2-3 volte in acqua bidistillata, viene trasferita su colonna cromato­grafica (diam. int. 4 mm altezza 25 cm, serbatoio da 10 ml) fino ad un volume di 0,3 ml e nuovamente lavata per gravità con 5-10 ml di acqua bidistillata; si procede al passaggio a flusso libero, dell'eluato ottenuto in a), si lava la r esina per due volte · con lO ml di acqua bidistillata, e si eluisce selettiva· mente la dopa, mediante passaggio, a flusso libero, di 3 ml di tampone fosfato O,lM a pH 6,5. Si recuperano poi l e tre catecolamine, facendo fluire 5 ml di t etraborato di sodio 0,1 M a p H 7 ,0.

La dopa, l'adrenalina e la noradrenalina vengono determinate su fra· zioni, rispettivamente, del primo e del secondo eluato ottenuti in b) median­te la procedura fluorimetrica recentemente descritta {1).

La determinazione della dopamina viene eseguita su una frazione del­l'cluato ottenuto con tetrahorato di sodio, impiegando una procedura fluori· m etrica lievemente modificata rispetto a quella proposta da Anton e Sayre (3 ).

P er la det erminazione della dopa i 3 ml dell'eluato iniziale della resina vengono aggiustati a pH neutwò. mediante aggiunta di 5 ml di tampone acido borico· Tris a p H 8,0: l :DÙ' di tale soluzione è impiegato rispettivamente per la preparazione del bianco, per l'analisi del campione e per la misura dello standard interno. Dopo aggiunta di 0,05 ml di Cu~. 2 H:O 0,002 % ai tre tubi e di 0,1 ml di HCl 0,01 N al bianco ed al campione e di 0,1 ml di >oluzione di riferimento di dopa (100 ng) allo standard interno, si procede alla ossidazione con 0,05 ml di K 3Fe (CN), 0,25% •

..tnn. lat. Super. Sani~ (1971) 7 , 4H 421

416 COMUNICAZIONI

Dopo 3 minuti l'ossidazione è interrotta nel campione e nello standard interno m ediante aggiunta di 0,05 ml di BAL 10% in formaldeide 25%, immediatamente seguita (10-15 secondi) dall' alcalinizzazione con 0,2 ml di NaOH 10 N, m entre nel bianco si aggiungono solo 0,2 ml di N a OH lO N. Dopo 5 minuti dall'interruzione dell'ossidazione, il pH del campione e dello standard interno viene portato a circa 5,3 mediante aggiunta di 0,15 ml di acido acetico glaciale; la preparazione del bianco è completata dopo lO minuti dall'alcalinizzazione aggiungendo 0,05 ml di BAL lO % in formal­deide 25% e quindi 0,15 ml di acido acetico glaciale.

Dopo 5-10 ~uti si procede alle letture fluorimetriche impiegando una lunghezza d'onda ~ eccitazione di 335 nm ed una di emissione di 400 nm; la fluorescenza di quantità scalari di dopa è lineare fino ad una concen­trazione di almeno 400 ng p er ml.

La determinazione d ella noradrenalina (NA) e dell' adrenalina (A) viene eseguita analogamente su 0,2 mi dell'eluato ottenuto con tetraborato di sodio, portato ad un volume di l ml m ediante aggiunta di tetraborato di sodio 0,1 M a pH 7,0; in questo caso si preparano due standard interni, uno per la noradrenalina ed uno per l'adrenalina (100 ng di ciascuna ammina). Le letture fluorimetriche vengono eseguite a due diverse combinazioni di lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione: 400/500 e 460/500 nm. L'intensità di fluorescenza di concentrazioni scalari di NA e di A appare lineare fino ad almeno 400 ng per ml. La determinazione del contenuto in ciascuna ammina del campione viene eseguita risolvendo le seguenti due equazioni simultanee:

dove: X e Y = contenuto in ng di adrenalina e di noradrenalina del campione;

F 1 e F 2 = letture nette di fluorescenza del campione, rispettiva­mente a 400/500 ed a 460/500 nm;

NA17 NA2 ed A1 e~= valore netto di fluorescenza di l ng diNA e e di A, rispettivamente a 400/500 ed a 460/500 nm.

Per la determinazione della dopamina, a 0,2 mi di eluato ottenuto in b) con tetraborato di sodio, si aggiungono 0,5 ml del tampone acido ci­trico-fosfato disodico p H 7 ,0, sia per la preparazione del bianco che del campione e dello standardl interno. Dopo aggiunta di 0,1 mi di HCl 0,01

dnn. lat. Su:>er. Sanità. (1971) 7 414- 421

VALORI, ORUNORI, RENZINI E PORCELLATI -H7

N al bianco cd al campione e di O,l ml di soluzione di riferimento di dopa­mina (200 ng) allo standard interno, si procede all'ossidazione con 0,02 mi el i metaperiodato:di sodio 2 %· Dopo un minuto esatto, l'ossiùazionc è inter­rotta nel campione c nello standard interno mediante aggiunta di 0,2 ml di una miscela 1:1 ùi sol fito di sodio 25 % e di NaOH 5 ~. mentre a l bianco si aggiungono solo 0,1 ml di NaOH 5 "N. Dopo 3 minuti, il campione e lo s tandarù interno vengono acidificati mediante aggiunta di 0,5 ml di acido fosforico 3 M; la preparazione del bianco è completata dopo 10 minuti dall'alcalinizzazione aggiungendo 0,1 ml di solfito di sodio 25 °~ c quindi 0,5 ml di acido fosforico 3 l\1.

Le le tture fluorimetriche vengono esrguite ad una hmghezza d'onda di eccitazione di 335 nm cd una di cmi:ssione di 380 nm. La fluorescenza tli quantità scalari di dopamina è lineare fino ad almeno 800 ng per ml.

Il valore totale di eliminazione giornaliera di ciascuna delle quattro ,;ostanze determinate si ottiene tenendo conto della frazione di cluato im­piegata per l'analisi e del volume percentuale di urine delle 24 ore uti­lizzato. L' eluizione dei quattro composti catecolici daHa colonna di ossido di aUuminio (•) ha dato i segurnti valori di recupero per ciascun composto cromatografato separatamcnte in 8-10 e~perimcnti : noradrenalina, 88,1 ± 3,2 %; adrenalina, 85,6 ± 3,4 %; dopamina, 81 ,3 -l: 2,9 %; dopa, 77,2 ± 2,7 % (media ± d.s .).

Nella cromatografia su resina AG 50W-X2 la separazione prcssochè completa della dopa dalle catecolamine è confermata, da un lato dall'as­senza di una ulteriore eluizionc di dopa quando, dopo il tampone fosfato, viene fatto fluire tetraborato di sodio 0,1 M a p H 7 ,O e dall'altro dalla assenza di una eluizione significativa de1le tre catecolamine durante il pas­saggio dci 3 ml ~i tampone fosfato 0,1 M a pH 6,5.

I valori di r ecupero di ciascun composto cat ecolico, ottenuti f aceudo fissare separa tarnente sulla r esina quantità variabili dei quattro composti in lO ml di acido pcrclorico 0,05 N a contenuto in sodio sovrapponibile a quello deU'eluato dell'ossido di alluminio e calc()lati mediante determina­zione fluorimetrica, sono risultati in 5-8 esperimenti: noradrenalina, 94,2 ± 2,1 %; adrenalina, 93,4 ± 2,8 %; dopamina, 91 ,8 ± 1,7 %; dopa, 90,1 ± 2,1 % (media ± d.s .).

Quando miscele di quantità variabili dei quattro composti, aggiun te inizialmente a campioni di urina (2 % della diuresi giornaliera), erano con­dotte attraverso la doppia procedura cromatografica e ciascun composto determinato nE'l rrlativ() E' lua to mediante la rispettiva procedura fluorime­trica, si sono ottenuti valori medi di r ecupero pressochè sovrapponibili a

(*) Le curve di eluizione dall'ossido di alluu:tinio e tlllHa r esina AG SOW-X2 'ono . tute vnlutute mi. urundo la flu orescenza na tiva in campioni frazionati di eluato.

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418 COMUNlCAZI0:-\1

quelli calcolabili in v ia teorica sulla base dei r ecuperi in ciascun passaggio cromatografico (Tab. l ).

Applicata alla detl'rminazione delf eliminazione urinaria giornaliera in soggetti normali. la metodica permette di ottenere 11-tture del campione

TABELLA l

Recupero (media _j_ d.s.) di noradrenalina (NA) in miscela, adrenalina (A), dopamina (DA) e dopa aggiunte al campione di urina e sottoposte alt 'in­

tero procedimento analitico.

6

5

Quan&-ità • &giunte

(l'g)

NA 2,0

A 0,5

DA 20,0

Dopa 2,0

NA 10,0

A 0,5

DA 10,0

Dopa 0,5

n~c:upt-ro ~o

(wedi• ± oi.J.)

79,2 ± 2.3

78,1 ± 2,7

75,3 ± 1,9

1 1,0 ± 2,2

78,8 ± 2,1

79,0 ± 2.3

76,4 ± 2,6

69,6 ..L 2,4

altamente s ignificative per ognuno dei quattro composti catecolici e la registrazione di spettri di ecci tazione e di emissiont' perfrttamcnte sovrap­ponihili a quelli della sostanza pura (Fig. l , 2 e 3).

In un gruppo di 10 soggetti normali sono stati ottenuti i seguenti valori di eliminazione giornaliera (mcdia ± d.s.): noradrenalina 1.8,6±2,3 ,ug; adre­nalina 2,8±1,1 ,ug; dopamina 164,2 ±13,6 ,ug; dopa 24,6±3,1 pg.

La doppia procedrura cromatografica di separazione dalle urin e dei quattro composti catecolici, presenta numerosi vantaggi rispetto ad altre metodiche finora descritte. Essa risulta, oltre che semplice, anche di rapida esecuzione e permette di ottener e eluati finali sufficientemente concentrati ed assai purificati e di separare contemporaneamente la dopa dalle cateco­lamine. La specificità d ella determinazione della dopa è notevole quando si consideri che alla sua separazione cromatografica viene abbinata una pro­cedura fluorimetrica ch e comporta una interferenza di quantità equivalenti di ciascuna d elle tre catecolamine inferiore a 0,4 %· Pertanto, l'eventuale presenza di tracce delle tre ammine nell'eluato della dopa risulterebbe del tutto trascurabile.

.tnn. Itt. Supe'f'. SartiW (1971) 1 . H.._421

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Fig. l. - Spettri di eccitazione del bianco, del campione e dei r elativi standard interni di noradrenalina e di adrenalina (100 ng). La flu oresct'nza degli standard in­terni è demoltiplicata x 10.

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Fig. 2. - Spettri di emissione del bianco. dd campione e del relativo Rtandard inttmo di dopa (100 ng). La fluorescenza dello standard interno è demoltiplicata x 3.

A nn. l st. SUDOT. Sanità (1971) 7. 41~~1

420 W~! U.Sit:AZION I

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Fig. 3. - Spettri di eccitazione del b ianco rl.ri rcngcuti, del binuco lh·l campioni' , tll'l cam· pione e di uno standard esterno di dupamino (lOti ng).

Tale doppia procedura di SC)Jaraz.ione cromatografi ca e rcluizion~: sclet· tiva determinata dagli ioni borici assicurano anche un eluato d elle tre cat e· colamine estremamente purifi cato cd a pH già ottimale p<'r la applica· rione delle r elative procedure fluorimetriche. in assenza di ogni inconv(•· niente fluorimetrico come smorzamento variahile di fluor escPn2a o diffi­coltà nella preparazione dei bianchi. N ella det <'rminazion c fluorim etri<:n della noradrenalina e dell 'adrenalina l'interferf•nza della dopamina. è in­feriore a 1,2 % a 400/500 nm l'd a 0,5 % a 4·60i500 nm per quantitiì. equivalenti ili dopamina , e rispettivamente di noradrenaliua c' di adrena­lina. Se ritenuto necessario, tuttavia, può essere fatta un'opportuna corr<'­zione introducendo anche uno s tandard interno di dopamina. La discrimi­nazione tra noradrcnalina ed adrenatina sulla bast' delle- du e diverse com­binazioni di lt1nghezza d'onda risulta accurata fino ad una proporzion e rela­tiva delle due ammine di 25:1 e sufficient ement e accurata fino a 50:1; per­tanto, non abbiamo ritenuto necessario abbinare anche l'ossidazionc a due divers i valori di pH, che certamente avrebbe incr ementato il valore di di­scriminazione.

Nella procedura fluorimetrica per la determinazione della dopamina , proposta da An ton e Sayre (S) c da noi lievement e modificata ed adattata all ~;

caratteristiche dell ' eluato, il fatto che il fluoroforo non sia appropriata­mente s tabilizzato (tende acl aumentare lentament<: t' progressivamente in

A nn. h t Supe'l". Sa,.itò (1971 ) 7 ~14-42 1

I'A l.Of\1, RRU:'i0111 , llt:XZINI E POHCE l.LATI 421

intens ità nel tempo) non comporta errori apprezzabili di valutazione, per la contemporanea esecuzione dello s tandard interno.

I valori di recupero dei quattro composti catecolici attraverso tutta la procedura sono soddisfacenti, ma ciò che più è importante risultano rela­tivamente costanti, indice questo di una buona riproducibilità della me­todica.

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A nn. lat. Supe r. Sanità (1971) 7 , 411-421

Valutazione critica del dosaggio dello iodio proteico

con la t ecnica automatica Technicon a ftu so continuo:

metodo modificato

.\ . HO SI 1: E. CRE.'-CA

TI procedimento Tedmil·un per il dosaggio automatit·o drllo iodio pro­tciro nel sieru, modificato dagli Autori p~'r otlcnt·n• un ruiglioratnrn to di'Ila st•nsibiJjtìt ed unu riduziont• Jdf rrrore clovulo alla con tamirHtzion(• fra cam­pioni sucrrssh i {1) i: stato sottoposto acl una valutuzionr dell'a ('<·urntczza dei risultati in n ·laziont' al t·ontenuto proteico del campÌOIII' analizzato. Si è <'seguito iuoltrr un confronto fra s ieTi di controllo dt·l commerc·io n con­tenuto noto di iodio e soluzioni standard di KIOJ.

L'apparN·rhio « Techniron PBI » utilizzato era l'Ul-Ì modifi cato: a ) Sul t•ampionatore, alla camma in dotazione r hc• regola i t empi di

prclic'o (2 min per il campione e l min per l'acqua di laYaggio). rrn .,lata &ostituita una camma cbt•. pur conservando la mede.,ima frequenza di analisi di 20 campioni ora. dà luogo a tempi di prelieYo im t•rtiti {l m in per iJ cam­piouc e 2 min per l' arqua di lavaggio).

b) Soli u la pompa proporzionante L il tubicino (blu-blu: porta t n 1 ,60 ml, min) di nlimrntazione del serbatoio di acqua di lavaggio è stato Rostituito cou due tubicini (viola-bianco: portata= 3,4 ml/min) per ottenere un più efficiente r ican1bio dell' acqua (port ata complessh·a - 6,8 ml/min) che può venire contaminala dalla superficie esterna dell'ago di prelievo.

c) Temperatura del bagno termostatico = 700C (anzichè ssoq. Tra i reattivi richiesti per l'analisi, quello costitujto da acido arsenioso

0,2 N in H2S0,1 N (Technicon AR-122-62) veniYa sottoposto a diluizione con H2SO~ N in misura tale da ottenere dall'apparecchio una linea di base intorno a 11 % T.

I campioni analizzati erano costituiti o da soluzioni standard di KI03

(pg 2.5- 5 - 10 - 15 - 20 di iodio/100 ml) o da soluzioni a contenuto protei­co noto preparate da albumina umana 20 % Behringwerke (purezza non

A nn. r.t. Supcr. Sanitcl 11971\ 7, 42Z-4Zò

IIOSSJ E CRENCA 423

inferiore al 95 %) o da vari s ieri di controllo del commercio a contenuto noto di iodio.

Si è ritenuto opportuno procedere alla valutazione della accuratezza d ei risultati t enendo conto di quanto riportato da Peyrin e Barbier sull'interferenza delle proteine nell' analisi dello iodio con il metodo auto­matico (2) . Una miscela di sieri preparata in modo da avere 7 g di pro­teine e 13 .ug di iodioflOO ml è stata utilizzata per ottenere, mediante di­luizione, una serie di campioni a contenuto scalare. Analogamente si è operato sull'albumina umana, previa diluizione della soluzione iniziale fino ad ottene­r e una concentrazione proteica di 7,40 g/100 mi (I = 14,8 ,ug/ 100 ml).

È evidente che - se le proteine non influissero - si sar ebbero do­vute trovare concentrazioni di iodio proporzionali alle diluizioni effettuat e. I risultati ottenuti indicano che, nelle condizioni adottate, l'« effetto pro­teico» comporta un errore, nel dosaggio dello iodio, che comincia ad essere evidente a partire da una concentrazione proteica di oltre 4 gf l OO ml (Fig. l). Infatti, nell'esperimento con la miscela di sieri, p er quantità di proteine totali di 5,0-6,0-7,0 g/100 ml si aveva rispettivamente una quantità di iodio trovata in meno di 2,41-4,84-8,96 %· Nell'esperimento con albumina umana, per quantità di albumina di 5,0-6,0-7,0-7,4 gfl OO mila quantità di iodio tro-vata in m eno era rispettivamente di 2,36-4,53-8,29-10,3 %· ·

È da notare che i r isultati ottenuti da P eyrin e Barbier (2) indicano, per lo l' rrore dovuto all'effetto proteico, v alori considerevolmente più elevati.

Essi fecero due esperimenti: uno su pool di sieri deiodizzati con resina che fissa gli ormoni tiroidei, l'altro su albumina b ovin a a bassa concentra­zione di I. In ambedue i casi essi prepararono diluizioni scalari a ciascuna delle quali aggiunsero Kl03 fino ad ottenere concentrazioni iodiche di 5-10-15 ,ug/100 mi. Ottennero il seguente risultato:

- nel caso della miscela dei sieri, la quantità di I« trovato» dimi­nuisce dal 6 al 26 % rispetto a quello realmente presente, quando la concen­trazione proteica aumenta da l a 5 g/100 ml;

- nel caso dell'albumina bovina, lo I «trovato» diminuisce dall'8 al 35 %, quando la concentrazione albuminica aumenta da 4 a 8 g %.

Si ritien e di poter escludere ch e l'errore sia imputabile a deficiente mi­n eralizzazione n el procedimento automatico (~). Non sembra possano es­servi dubbi che l'errore s ia originato dalle proteine, dal momento che esso si verifica anche in soluzioni di albumina pura, mentre appare più verosimile che - indipendentemente dalla tecnica autamatica - la causa possa attri­blùrsi alla presenza, nelle proteine, di un inibitore il quale influirebbe a livello della complessa r eazione cerico-iodio-arseniosa.

L'errore può essere eliminato dosando anche le proteine su ciascun campione ed apportando la r elativa correzione, oppure, considerando che esso si manifesta a partire da una concentrazione proteica di circa 4 g/100 ml,

.4 nn. lat. S uvar. S ani t<\ (1971) 7, •2'2-427

424 COMlJNICAZIONI

pg J/100 m t llplrÌIIIIt CIMI

,. MISCELA DI SIERI

Il

11 ..

.. ti

"'

2 4

IMO m l

.. ,.,. ... ALBUMINA UMANA

1 proteine tot/10 O m t 6 7 l

1 alhamJJUt/100 mi ~---------2~--~3~--~4----~5~--~6----~7~--~ •

. Fig. 1. - lnfiueraa della concentrazione proteica nel dosaggio deUo iodio proteico.

diluendo il siero. Una diluizione non elevata (ad esempio 2 : 3), mentre non influisce eccessivamente nel caso di ipoiodemie, consente di ottenere una concentrazione proteica al massimo del 5-6/100 ml, con conseguente errore in iodio del 2-5 %-

n contenuto in iodio di sieri di controllo del commercio è stato calcolato eulla base della curva ottenuta con soluzioni standard di KI08 •

d nn. l at. Supcr. Sanitd (1971) 1. 4!2-'27

STAHDARD KJ~

•

es· _.._, a · metodo 'technk.on' ........... l , ,

SIERi • ~TROLLO

425

FiJt. 2. - Raffronto fra i trncctnll analitici ottenuti wgli t-landnrd r ~ui gruppi di ~ieri

in e":une con il metodo or iginale« Technicon» e il metodo modilicato.

18

-i26 COM UNICAZIO~l

La Fig. 2 mostra la registrazione grafi ca ottenuta s ia con il metodo « Technicon » originale che con il m etodo moclificato. Si può notare, con quesfultimo. la maggior e sensibiHtà, dimostrata dalla maggiore altt·zza dci picchi, c la migliore separazione dei campioni, e quindi la minon · conta­minazion e, ùimostrata dal ritorno quas i completo alla linea di base.

I risultati ottl' nuti (Tah. l ) banno mostrato buon accordo con i valori dichiarati per la maggior parte dei sieri analizzati; in due casi soltanto (nO 4

e no 6). la corrisponrlenza dei Yalori era scarsam<'nlc sodJisfaceute. Un in­quinamento durante la ricostituzione di questi sieri ì: da escludcn>, dal mo­mento che 'lono stal<' impiegate la medesima buretta e la medesima acqua

TABELLA l

Analisi di sieri di controllo del conunercio contro stnndard di KI03

l VA t.UHI lH CJJI ARPI VAt.ORI O'l''rE:"CTTI COJ'I'1'ft0 STANIJAlto

Slt: H O IH KJO,

LM'1u Cou"""""'l l l &ionr l ~rtodu mt':totlo mod. nt"t odo or·ig. /'g{ IIIOml

2.9 H yc~l l l - JODOTHOL L 3.1 Borker

PBL- 36 3 .2 Teehnicon 3,40 - 3,45 3, 40 - 3.40 l

l 2 - VERSA TOl. A 3 ,7 - 3,90 3,90 4.10-4, 10 027 50 47

5, ·1 H ycel

6,00-6.00 l 3 - JODOTROL 5,9 Burker PBI- 140 5.9 Technìcon s. 70 - 5.70

4 - )fONITROL l 5,7 Hycei-Barkllt LTD- 88 6.6 Tecbnjcon 7,25 -7 ,50 7,50-7,60

5 - VERSATOL. 7,3 - 7. 20 -7, 55 7 ,30- 7 ,so 2!1 70 39

9 ,4 Hycel 6 - MONITROL Il 11.0 Tecbnìcon 12 ,9 - 13,3 12. 7-12.6

PTD-15 11 .3 Barker

9,2 Hycel

l 7 - JODOTROL H 11 ,o Technicon 10 ,8 - 11 ,2 10,5- 10,1.1 PBH-236 11. 5 Borker

Differemn media (ìn ,ug 1/ 100 mi) rispmo al valort dichiarato l l 2 3 4 5 6 7

+ 0 , 22 + 0 ,20 - 0 ,20 + 0,77 + 0,07 ..,... 2, 1 - 0.00 rnet. m od. + 0,20 - 0.40 + o. 10 + 0, 95 - 0. 10 - 1.6 - 0,30 met. ccTech»

-- - ---

~

l

RU351 E CREI'ICA 427

usate per ricostituire gli altri sieri. Trattandosi di un risultato più elevato del valore dichiarato e tenendo conto che l'analisi è stata condotta su due 6a­concini diversi del medesimo lotto, si presume che i 6aconcini stessi fossero contaminati.

Dalla buona coincidenza dei valori ottenuti con gli altri sieri di controllo si può concludere che l'uso di standard di KI03 è del tutto valido per l'analisi dello iodio proteico.

Ringraziamo il Signor Antonio Ciadini, perito chimico del laborator io, per i dosaggi delle proteine.

BIBLIOGRAFIA

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l nn. hl . Supo: r . Snrulà t l97l l 7, ~22-~27