서 론

심한 골 결손의 치료에 있어 자가 이식 골과 동종 이식 골의 한계

점으로 최근 인공 골 대체물에 대한 요구가 증가되었다.1,2) 골 대

체물은 공급 및 저장이 용이하고 쉽게 소독 가능한 장점이 있다.

생물학적 관점에서 볼 때 3 인산 칼슘(tricalcium phosphate: TCP)

과 수산화 인회석 (hydroxyapatite: HA) 이 희망적인 골대체물로서

알려져 있으나 아직까지도 완벽한 골 대체물로 인정되고 있지 못

하여 많은 연구가 필요한 실정이다.

골 대체물은 어느 정도 골 구조와 유사해야 한다. 골은 세포와

이들 세포 간에 존재하는 다량의 골 기질(bone matrix) 로 이루어

Original Article J Korean Orthop Assoc 2011; 46: 18-27 • doi:10.4055/jkoa.2011.46.1.18 www.jkoa.org

가토의 장관골 골결손 부위에 골막 유래 간엽 줄기세포와 함께 주입한 나노 크기 입자 수산화 인회석의 신생골 형성New Bone Formation Following Transplantation of Stem Cells and Nanoscale Hydroxyapatite Scaffold Materials into Rabbit Long Bone Defects

강남욱* • 김휘택 • 강정한 • 이종서 • 안태영 • 전은숙† • 장희경‡ • 장석필§·이종국∥

*부산대학교 대학원 의학과, 부산대학교 의과대학 정형외과학교실, †부산대학교병원 의학 연구소, ‡고신대학교 의학부 병리학교실, §한국항공대학교 항공우주 및 기계공학부, ∥조선대학교 공과대학 신소재공학과

목적: 가토의 장관골 골 결손에 입자의 크기를 달리한 수산화 인회석 지지체와 함께 줄기세포를 이식하여 그 변화를 분석하였다.

대상 및 방법: 32마리 백색 가토의 경골 간부에 골 결손부를 만든 후 이식한 물질의 종류에 따라 4개의 군(제 1군: 마이크로 크기 수산화

인회석 입자만 이식한 군, 제 2군: 나노 크기 수산화 인회석 입자만 이식한 군, 제 3군: 마이크로 크기 수산화 인회석 입자와 줄기세포를 함

께 이식한 군, 제 4군: 나노 크기 수산화 인회석 입자와 줄기세포를 함께 이식한 군)으로 나누었다. 이식한 후 8주에 걸쳐 각 군에서의 골 형

성 정도와 지지체의 변화를 방사선학적, 조직학적, 생화학적으로 분석하였다.

결과: 마이크로 크기 수산화 인회석 입자를 이식한 군(1, 3군)에 비해 나노 크기 수산화 인회석 입자를 이식한 군(2, 4군)에서 방사선적, 조

직학적으로 골 형성이 잘 일어났으며, 줄기세포를 함께 이식군(4군) 에서 자연복구 과정 중 골 형성이 가장 균일하게 일어났다.

결론: 보다 더 우수한 골 형성을 위해서는 수산화 인회석과 같은 순수 무기질 합성물 외에 골의 구조와 더 유사한 유기질-무기질 합성물에

줄기세포를 이용한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

색인단어: 골결손, 줄기세포, 나노 크기 수산화인회석

져 있으며 골 기질은 대부분 교원 섬유(collagen fiber) 로 구성된

유기질 성분과 칼슘(Ca)과 인(P)이 주성분인 무기질 성분으로 구

성되어 있다. 칼슘과 인은 대부분 수산화 인회석 결정을 이루고

있으며 그 크기는 나노(Nano: 10억분의 1 미터) 정도의 크기로 알

려져 있다. 미성숙골(woven bone)의 경우 평균 10-50 nm의 무기

질 알갱이를 가지며 성숙골 (lamella bone)의 경우 평균 20-50 nm

길이, 2-5 nm 직경의 무기질을 가진다.3)

골에 있어서 이러한 나노 크기 입자는 기계적인 특성에서 중요

한 의미를 가진다. 골 대체물의 성분과 크기, 모양이 골의 무기질

과 비슷한 나노 크기 입자는 보다 나은 골 전도를 나타낼 수 있

다.4) 또한 나노 크기의 골 대체물을 사용한다면 단위 부피당 접촉

면적의 증가로 골 전도 성능을 크게 향상시킬 것으로 기대되며

특히 나노 크기 무기질에 단백질 흡수와 골 모세포의 부착성이

커질 수 있다.5)

본 연구는 수산화 인회석을 나노 크기 입자로 가공하여 가토의

골 결손 부위에 골막 유래 줄기세포와 함께 이식하여 골 형성능

력을 연구하였다.

접수일 2010년 3월 11일 게재확정일 2010년 11월 28일교신저자 김휘택부산시 서구 아미동 1가 10번지 부산대학교병원 정형외과TEL 051-240-7248, FAX 051-247-8395E-mail kimht@pusan.ac.kr

Copyright © 2011 by The Korean Orthopaedic Association

“This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.”

대한정형외과학회지：제 46권 제 1호 2011

19

가토의 장관골 골결손 부위에 골막 유래 간엽 줄기세포와 함께 주입한 나노 크기 입자 수산화 인회석의 신생골 형성

대상 및 방법

성에 관계없이 체중이 3.0-3.5 kg의(출생 후 8-10주) New Zealand

계 백색 가토 총 32 마리를 대상으로 하였다. 경골 간부에 부분 골

절제술 후 이식한 물질에 따라 제 1군(마이크로 크기 수산화 인회

석만 이식한 군), 제 2군(나노 크기 수산화 인회석만 이식한 군),

제 3군(마이크로 크기 수산화 인회석과과 줄기세포를 함께 이식

한 군), 제 4군(나노 크기 수산화 인회석과 줄기세포를 함께 이식

한 군) 으로 각각 8마리씩 나누어 변화를 비교 분석하였다.

1. 골막 유래 줄기세포의 분리 및 배양

체중이 1,200 gm 내외의 성장 중인 New Zealand 계 백색 가토

의 전 경골부에서 골막을 채취한 후, 무균 조작 하에 2% 항생제

(200 units/mL penicillin과 200 g/mL streptomycin)를 첨가한 PBS

(phosphate buffered saline, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 로

3회 세척하였다. 세척한 골막을 잘게 자른 다음 0.25% collagenase

(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 37oC 배양기에서 30분

간격으로 교반하며 2시간 동안 방치했다. 세포 부유액에 동량의

15% 우태 혈청 (fetal bovine serum, Gibco BRP, Grand Island, NY,

USA) 이 든 배지를 넣어 수 차례 혼합하여 원심 분리(2,500 rpm,

10분) 하였다. 상층 액을 버리고 얻은 침전된 세포를 두 차례 우태

혈청이 첨가된 배양 배지로 세척한 후, 세포수를 hemocytometer

로 측정하였다. 우태 혈청과 1% 항생제 (100 units/mL penicillin

과 100 µg/mL streptomycin)가 첨가된 α-MEM (Gibco BRL, Grand

Island, NY, USA) 배양액이 든 75 mm3 배양 용기에 세포를 넣고

37oC, 5% CO2 배양기에서 일차 배양을 시작하였다. 4일 후 부유하

는 세포는 배양액을 교환하면서 버리고 이후 2일 간격으로 배지

를 교환하며 세포를 유지하였다. 일주일 후 배양 용기 바닥에 세포

가 가득 차면 0.25% trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY,

USA) 를 처리하여 세포를 분리하여 2-4세대 계대 배양하였다.

2. 배양된 줄기세포의 골세포로의 분화 능력 검사

골막유래 줄기세포의 골세포로의 분화를 유도하기 위해서 골세

포유도 분화배지(10% 소 태아혈청, 0.1 μM dexamethasone, 10

mM β-glycerophosphate, and 50 μM ascorbic acid in α-MEM)에서

5일 동안 배양하였으며 배지는 3일에 한 번씩 교환하였다. 5일 후

분화배지를 제거한 후 PBS로 두 번 씻어준 후 70% ethanol로 15분

간 실온에서 고정시키고 증류수로 두 번 씻어주었다. 증류수 제

거 후 alizarin red S를 넣어 실온에서 10분 염색한 후 분화정도를

현미경하에서 관찰하였다

3. 수산화 인회석 입자 제조

Shinyo회사(Shinyo Pure Chemicals, Osaka, Japan)로부터 구입한 마

이크로 크기 수산화 인회석 입자를 사용하였다. 나노 크기의 수

산화 인회석 입자는 침전법으로 제조하였으며 Ca/P 몰비가 1.67

이 되도록 적정한 Ca(NO3)2·4H2O와 H3PO4 혼합 수용액을 혼합

한 후 pH 10.5인 NH4OH 수용액에 천천히 적하시켜 침전반응을

유도하였다. 반응이 진행되는 동안 용액 내의 pH는 NH4OH 수

용액을 이용하여 10.5를 유지하였고, 외부 공기로부터 CO2 침투

Figure 1. An external fixation device was applied to the rabbit tibia (A). After exposure of the tibia (B), an 1.5 cm section of the tibia was excised (C). A mixture of agar, hydroxyapatite powder, and stem cells was inserted into the bone defect (D).

20

강남욱·김휘택·강정한 외 6인

에 의한 탄산염의 생성을 억제하기 위해 반응 용기 내에 N2 가스

를 흘려주었다. 생성된 침전 입자를 원심분리를 이용하여 회수한

다음, 증류수 및 에탄올로 수회 세척하고 80oC에서 건조하여 나노

크기의 수산화 인회석 입자를 제조하였다. 입자의 결정상은 X-

선 회절기를 이용하여 분석하였고, 입자의 미세구조는 투과 전자

현미경(TEM)으로 관찰하였다.

4. 가토의 경골 부분절제술 수술 전 합성한 마취제(ketamine 5 mg/kg, xylazine 0.25 mg/kg,

acepromazine 0.75 mg/kg을 배합) 2 mL를 복강 내에 주사하여 전

신 마취한 후 하퇴부의 털을 제거하고 골절제술을 우측 경골에

시행하였다. 먼저 0.062 inch 직경의 K-강선 4개를 경골의 장축

에 수직으로 골수강의 중심을 통과하도록 외측에서 내측으로 삽

입 후 내측과 외측에서 각각 외고정 기구(Dyna-ExterⓇ-(ST): dy-

namic external fixator for finger, BK Meditech, Seoul, Korea) 로 고

정하였다(Fig. 1A). 그 다음 두 번째와 세 번째 강선의 중간에 약

2 cm의 종 절개를 가한 후 치과용 burr를 이용하여 1.5 cm의 골편

절제술과 함께 골막을 완전히 제거한 후 전기 소작기를 이용하

여 골수 강을 제외한 주위 연부조직의 완전한 지혈을 확인하였다

(Fig. 1B, C).

5. 혼합된 유체 (동종 줄기세포와 agar gel, 수산화 인회석

입자)의 물리적 특성과 이식

실험에 사용된 줄기세포는 2-4세대의 세포를 사용하였고, 얻어

진 줄기세포는 2×107개/ 300 µL를 0.7% agar gel 300 µL와 혼합한

후 마이크로 크기 수산화 인회석 1 cc, 나노 크기 수산화 인회석

1 cc를 각각 혼합하여 중합유도 하였다. 유도된 혼합 유체는 24oC

에서 혼합유체 대비 나노크기 수산화 인회석의 부피비(volume

concentration)를 0-5%로 변화시켜서 점도를 측정하였다. 점도 측

정시 사용한 점도계는 Brookfield Model LVDV-III를 사용하였으

며 오차범위는 1% 이내였다. 유도된 혼합 유체의 점성 특성을 분

석하여 경골 결손 부위에 장착하기가 용이함을 확인한 후 골 절

제된 결손부위에 이식하였다(Fig. 1D).

6. 방사선학적 검사

수술 후 1주마다 총 8주간 경골 전후면 사진을 촬영하여 신생골

형성과 성숙 과정을 관찰하였다. 이식된 수산화 인회석과 신생골

의 형태는 1) 근위 및 원위 골편과의 연결성 유무 2) 근위 및 원위

골편과의 직경 비율(50% 이상 및 이하) 3) 방사선 음영의 균질성

에 따라 만족과 불만족으로 분류하였다. 만족은 골 음영이 근위

및 원위 골편과 서로 연결이 되면서 직경이 최소 근위 및 원위 골

편의 50% 이상이고 균일한 방사선 음영을 보인 경우였다. 불만족

은 골 음영이 근위 및 원위 골편과 연결이 되지 않거나 연결이 되

더라도 직경이 50% 미만이고 편측으로 치우쳐진 상태를 보이는

경우였다. 또한 방사선 음영이 불균일한 형태를 보인 경우였다.

또한 Hamanishi 등6)이 가토의 장관골 연장술 후 % 골밀도를 측정

하기 위해 고안한 근위(Proximal) 및 원위(Distal) 골편과 신생골

(Callus)의 수치비인(C/P+C/D)×1/2×100를 이용하여 PACS (Pic-

ture Archiving and Communication System) (Marosis m-viewTM4.5,

Marotech, Inc., Seoul, Korea)상의 pixel 값을 % pixel 비로 계산하였

다. 결과의 통계학적 분석은 이원분산 분석(two-way ANOVA)을

이용하여 각 군 간의 평균 pixel 수치를 비교하였다. p값이 0.05 미

만인 경우 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

7. 조직학적 검사 - 광학 현미경 검사

수술 후 2주, 3-4주, 5-6주, 7-8주 사이의 간격으로 각 군의 가토

를 각각 ̀2마리씩, 총 32마리를 희생시켜 조직학적 검사를 시행하

였다. 골 조직을 4% 중성 formalin에 고정시킨 후 10% nitric acid에

1주일간 탈회시켜 2시간 세척하였다. 이후 95% ethyl alcohol로 탈

수한 후 청명 과정과 paraffin 침투 후에 포매하여 4 µm로 박절하

여 hematoxylin-eosin 염색으로 100배의 광학 현미경하에서 관찰

하였다.

8. 생화학적 검사

가토의 혈청 내 alkaline phosphatase (ALP) 와 osteocalcin 은 실험

전 및 실험 후 2주, 4주, 6주, 8주에 각각 가토의 혈액을 1 cc씩 채

취하여 원심 분리(2,500 rpm, 10분) 한 후 나온 혈청을 이용하여 2

회 측정한 후 평균값을 사용하였다. 각각의 골 형성 지표는 개체,

성별에 따라 차가 심하기 때문에7) 절대값이 아닌 실험 전의 개체

별 측정치를 기준으로 실험 후 각각의 골 형성 지표의 변화 량을

비교하였다. 총 32마리의 가토 중 술기 상 혈액 채취가 힘든 경우

및 혈액 검체가 생화학 검사에 부적절한 경우를 제외하고 각 군

에서 각각 5마리씩, 총 20마리를 분석하였다.

1) ALP activity의 측정

TRACP & ALP Assay kit (TaKaRa, JAPAN)를 사용하였다. 혈청 5

µL를 substrate solution 50 µL와 섞은 뒤 37oC에서 60분간 반응시킨

후 stop solution (0.9 N NaOH) 50 µL를 넣어 반응을 멈춘 뒤 micro-

plate reader (Molecular Device, California, USA)를 이용하여 405 nm

에서 흡광도 (optical density)를 측정하여 비교하였다.

2) Osteocalcin의 측정

Gla/Glu-osteocalcin (Gla/Glu-OC) EIA Kit (TaKaRa, JAPAN)를 이

용하였다. Osteocalcin 항체가 부착된 각 well에 혈청 100 µL를 넣

어 실온에서 두 시간 반응시킨 후 혈청을 제거하고 세척용 완충

액으로 3회 깨끗이 세척하였다. Antibody-POD conjugate solution

을 100 µL씩 분주하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 세척용

완충액으로 3회 세척하였다. 그 후 substrate solution 100 µL씩을 분

주하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 µL의 stop solution 을 첨

가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도는 microplate reader (Molecular

21

가토의 장관골 골결손 부위에 골막 유래 간엽 줄기세포와 함께 주입한 나노 크기 입자 수산화 인회석의 신생골 형성

Device, California, USA) 를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

9. 신생골 형성의 상대 정량 분석 수술 후 7-8주 사이 얻은 가토의 골 조직을 hematoxylin-eosin으

로 염색한 후 결손의 중앙부에서 400배 배율 현미경으로 신생골

형성이 가장 많이 일어난 부위 5곳을 선택하여 현미경 영상 분석

프로그램인 Image-proplus 5.1을 통해 골 형성 부위 / 절단면 넓이

의 비율을 구하였다. 결과의 통계학적 분석은 paired t-test를 이

용하여 각 군 간의 골 형성 정도를 비교하였다. p값이 0.05 미만인

경우 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결 과

1. 수산화 인회석(HA) 상분석 및 미세구조

마이크로 크기 및 나노 크기 수산화 인회석 입자의 X-선 회절 분

석 결과 입자들은 모두 수산화 인회석으로 이루어져 있으며 다른

결정상은 관찰되지 않았다(Fig. 2A, B). 각 입자들의 투과 전자현

미경 분석 결과 마이크로 크기의 입자는 1-2 µm 크기의 입자들로

이루어져 있으며 일부 큰 입자의 경우 약간의 응집이 관찰되었다

(Fig. 3A). 반면, 합성한 나노 크기 입자의 경우에는 평균 약 50-70

nm 의 침상 입자들이 균일하게 분산되어 있었다(Fig. 3B).

2. 혼합된 유체의 물리적 특성 나노 또는 마이크로 입자가 첨가된 혼합 유체인 경우 agar gel 안

에 있는 줄기세포 표면에 나노 크기의 수산화 인회석이 증착됨

을 관찰할 수 있었으며(Fig. 4A) 그 결과 동종 줄기세포가 포함된

agar gel의 점도보다 나노 크기 입자가 첨가된 혼합 유체의 점도가

5배 정도 증가됨을 관찰하였다(Fig. 4B). 이러한 현상은 일반 유체

에 나노 입자를 분산 부유시킬 경우 최근에 관찰되는 나노스케일

현상으로 보고되고 있다.8)

Figure 2. XRD patterns of micro-sized (A) and nano-sized (B) HA powders.

Figure 3. TEM micrographs of micro-sized (A) and nano-sized (B) HA powders.

22

강남욱·김휘택·강정한 외 6인

3. 방사선학적 검사

1) 수산화 인회석 및 신생골의 형태

수산화 인회석 이식 후 방사선학적 형태는 만족이 10예 불만족이

22예였다. 최종 남은 총 8마리의 경우 만족이 3예(4군 2예, 3군 1

예) 불만족이 5예(1군 2예, 2군 2예, 3군 1예)였다.

2) % pixel 비

PACS 디지털 방사선 사진상에서 표시되는 신생골의 % pixel 비

는 3군 및 4군에서 수술 후 6주째 최고치를 보이고(Table 1) 이후

감소되는 양상을 보였다. 반면 1군과 2군에서는 전 주를 걸쳐 증

감이 현저하지 않았다. 그러나 각 군간 또한 각 군의 시기에 따른

pixel 평균값의 변화는 통계학적 유의성을 찾아볼 수 없었다.

3) 신생골의 발달

1군과 2군(Fig. 5A, B)에 비해 3군과 4군(Fig. 5C, D) 에서 골형성의 진

행 및 최종 결과가 우수하였고 특히 4군에서는 3주부터 형성된 골

음영이 8주까지 계속 형성되어 골 결손 부위가 골로 완전히 채워진

양상을 나타내었으며 다른 군에서 보다 균일한 양상을 보였다.

4. 조직학적 검사 - 광학 현미경 검사 조직학적 소견 역시 1과 2군(Fig. 6A, B)에 비해 3군과 4군(Fig.

6C, D)에서 8주째 골 결손부가 좀 더 단단하고 균일하게 신생골로

채워지는 양상이었다.

5. 생화학적 검사

1) ALP activity 의 측정

흡광도의 증가율은 1군의 경우 실험 6주경에 급격한 상승을 보인

후 감소하였으며 2군의 경우 커다란 증가 없이 시간이 지나감에

따라 감소하는 양상을 나타내었다(Fig. 7). 3군의 경우 2주 급격한

증가 후에 감소하는 양상을 보였고 4군의 경우 4주까지 크게 증

가한 후 서서히 감소하는 양상을 나타내었다.

2) Osteocalcin 의 측정

흡광도의 증가율은 1군의 경우 실험 4주경 갑자기 증가한 후 감

소하는 양상을 보였으며 2군의 경우 실험 4주경 증가한 후 높게

유지 되는 양상을 나타내었다(Fig. 8). 3군의 경우 실험 6주경 증가

한 후 감소하는 양상을 보였으며 4군의 경우 실험 4주경 증가한

후 높게 유지되는 양상을 나타내었다.

6. 신생골 형성의 상대 정량 분석 결과 시술 후 7-8주째의 골 형성 비교에서 골 형성 부위/절단면 넓이

평균치가 1군은 0.72 (±0.45)였고, 2군은 0.83 (±0.42)였고, 3군은

Table 1. Biweekly changes in % Pixel Ratio in Groups 1 through 4

GroupWeeks after surgery

2 (n=8) 4 (n=6) 6 (n=4) 8 (n=2)

1 109.5 (±14.21) 102.7 (±11.38) 102.9 (±5.66) 100.4 (±8.54)

2 102.9 (±3.42) 108.6 (±12.93) 102.9 (±3.18) 100.1 (±4.87)

3 104.8 (±6.78) 114.2 (±11.26) 144.5 (±12.80) 92.9 (±12.02)

4 117.2 (±11.74) 117.9 (±10.25) 136.9 (±10.42) 91.55 (±9.83)

Figure 4. (A) HA nanoparticles attached on the surface of periosteum-derived stem cell. (B) The effect of particle volume fraction on the ratio of the viscosity of agar based nanofluid to that of base fluid.

23

가토의 장관골 골결손 부위에 골막 유래 간엽 줄기세포와 함께 주입한 나노 크기 입자 수산화 인회석의 신생골 형성

1.81 (±0.71), 4군은 3.60 (±1.01)로 3군과 4군에서 다른 군에 비하

여 가장 신생골 형성이 많았으며 특히 4군에서는 신생골 형성이

통계적으로 유의했다(p=0.0023). 각 군의 비교에서는 4군이 1군에

비해 의미 있게 많은 신생골 형성을 보였다(p=0.038) (Tables 2, 3).

고 찰

수산화 인회석 [Hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2]은 주로 조직의 무

기질을 구성하는 성분으로 골 대체물의 적용에 다양하게 사용되

며 상당히 우수한 생물학적 활성 (bioactivity) 과 골 전도성을 가진

다고 알려져 왔다.9,10) 일반적으로 두 가지 이상의 성분이 혼합된

인공 합성물의 경우 각 성분의 물리적 특성으로 인해 합성물이

일정하지 않게 제조될 수 있으나 수산화 인회석의 경우 고분자

용액 내에서 서로 분산되지 않고 쉽게 뭉쳐지는 특성이 있는 것

으로 알려져 있다.11,12) 이로 인해 수산화 인회석의 경우 대부분 같

은 조건하에서 침전법으로 합성물을 제조하게 된다.

생물학 분야에서도 최근 나노 기술을 이용한 소재 및 구조물 합

성이 발달하여 많은 연구가 이루어지고 있다. 나노 구조는 세포

의 부착능과 합성, 방향성, 운동성, 세포골격 조성, 세포내 신호의

조절을 포함한 세포의 특성을 변화시키는 것으로 알려져 있으며

정형외과 분야에도 적용되어 지지체에 대한 골모세포, 파골세포,

섬유모세포의 활성을 좋게 나타낸다는 연구가 있다.13)

골 전도는 주입되는 물질의 표면에 골 성장으로 정의된다.1) 본

연구를 통해 볼 때 마이크로 크기의 수산화 인회석에 비해 나노

크기 수산화 인회석의 골 전도가 향상된 결과를 나타내었다. 그

원인에 대한 연구가 정밀하게 이루어져야 하겠지만 지금까지 보

고된 연구에 의하면 골모세포가 기존 크기 수산화 인회석 가루에

비해 나노 크기 수산화 인회석 가루에 세포 반응이 증가하며 훨

씬 커진 표면적에 골모세포가 잘 부착하기 때문인 것으로 생각되

며 이러한 특성은 이식되는 유체의 점성을 측정한 본 연구결과에

서도 비슷한 결과를 나타내었다. Anselme14)에 의하면 나노 크기

입자를 사용한 합성물에서 세포의 활성이 증가하는 이유는 초기

Figure 5. Serial radiographs of groups 1 through 4. In group 1 (A), diffuse bone formation was seen at 3 weeks and consolidation was complete after 8 weeks, but only in the lateral portion of the defect. In groups 2 (B), 3 (C), and 4 (D), bone formation and consolidation were seen as time passed. More abundant bone formation was seen in the groups transplanted with stem cells (C, D).

24

강남욱·김휘택·강정한 외 6인

세포의 결합이 훨씬 높기 때문이라고 했다. 이는 초기 세포 결합

에서 세포내의 신호전달을 통한 이동, 증식, 표현 단계에서 더 우

수한 영향을 미치기 때문이라고 하였다. 이러한 점들을 이용하여

최근 마이크로 크기인 박테리아(포도상 구균) 의 부착을 감소시

키고 나노 크기의 항생제가 첨가된 골 모세포의 부착을 증가시

켜 인체내 삽입물의 감염률을 감소시켰다는 보고도 있다.15)

Thorwarth 등16)에 의하면 동물실험에서 나노 크기 수산화 인회

석 입자를 골 결손부에 이식한 후 12주에 새로운 골로 형성되어

골 결손 부위가 없어졌다고 보고하였다. 본 연구에서도 나노 크

기 수산화 인회석과 줄기세포를 함께 이식한 군에서 3주째 골 소

주가 형성되어 골 결손 중앙 부위로 뻗어나가고 4주째 해면골 형

성이 특징적으로 나타나 골 소주의 방향이 중앙을 향하였으며 8

주째 새로 형성된 골로 결손부가 완전히 채워지며 남아있는 수산

화 인회석을 볼 수 없었다. 특히 나노 크기 입자를 사용한 군에서

기존의 마이크로 크기 입자를 사용한 군에 비해 신생골 형성이

방사선학적 및 조직학적 결과에서 우수하게 나타났고 줄기세포

를 이식한 군에서는 보다 균일하게 골 형성이 이루어진 것을 알

수 있었다.

Alkaline phosphatase17,18)와 osteocalcin19,20)의 발현은 골 형성 시

스템에서 골모세포의 활성도를 반영하는 대표적인 초기 표지자

(early marker) 로 알려져 있으나 그 변화 양상은 다양하게 보고되

고 있다. 본 연구에서 alkaline phosphatase 의 경우 줄기세포가 포

함된 군에서 높게 측정되며 기존의 연구결과17)와 같이 4주 이후

에 증가하며 이후 차츰 감소하는 결과를 나타내었으나 osteocal-

cin 의 경우 일정한 결과를 얻을 수 없었다. 줄기세포를 사용하지

않은 1군, 2군에 비해 특히 나노 크기 수산화 인회석과 줄기세포

를 이식한 4군에서는 2주, 4주에 측정한 alkaline phosphatase 가 상

당히 높게 측정되어 초기 세포의 활성이 높음을 간접적으로 알

수 있었다. 이는 기존의 수산화 인회석 지지체에 비해 나노 크기

수산화 인회석 지지체의 경우 골모세포가 잘 부착하여 이들 초

기 표식자들의 활성도가 높아지고21) 이러한 결과는 나노 크기 지

지체에서 증가된 이온 방출과 혈장 단백질 흡수가 증가하기 때문

Figure 6. Microscopic findings of new bone at 8 weeks after transplantation (H-E, x100). (A) In group 1, cartilaginous components were predominant. (B) In group 2, well-formed lamellar bone was observed. (C) In group 3, defects showed mostly loose connective tissue, with scant amounts of woven and lamellar bones. (D) In group 4, the tibial defects were almost filled with inflammatory cells, with conspicuous bone formation.

25

가토의 장관골 골결손 부위에 골막 유래 간엽 줄기세포와 함께 주입한 나노 크기 입자 수산화 인회석의 신생골 형성

이며 또한 나노 지지체가 더 발달된 다공형태를 가지기 때문으로

생각되었다.22)

수산화 인회석 이외 다른 골 대체물로는 생분해가 가능한 고분

자와 결합된 생합성 세라믹과 같은 합성 지지체23)와 골의 구조와

유사한 나노크기 무기질과 교원섬유로 구성된 합성지지체 등이

있다.24,10) 나노 크기를 이용한 연구는 인체 삽입물 및 지지체에 대

해 골 모세포, 파골 세포, 섬유 세포의 활성을 좋은 방향으로 조절

할 수 있으며, 은을 이용한 나노 크기 입자는 상처 치유 능력 및

항 박테리아에 있어 우수한 성질을 보여줌으로써 주목을 받고 있

다.15) 또한 교원섬유-수산화 인회석 합성물을 만들어 교원섬유

가닥을 따라 나노 크기 수산화 인회석 침착물이 접촉하도록 유도

하는 연구가 있다.25,26) 본 연구의 결과는 기존의 마이크로 입자 크

기에 비해 나노 크기 입자에서 우수한 신생골 형성과 균일한 골

형성을 보인 나노 크기 입자의 우수성을 나타낸 이들 보고와 부

합되는 결과를 나타내었다.

결 론

골결손 부위에 대한 골 대체물로서 나노 크기 입자 수산화 인회

석의 단위 부피당 접촉 면적 증가와 골막 유래 간엽 줄기세포로

부터 분화된 골모세포의 높은 부착성을 이용하여 좋은 골형성을

기대할 수 있을 것으로 생각된다.

참고 문헌

1. Moore WR, Graves SE, Bain GI. Synthetic bone graft substi-tutes. ANZ J Surg. 2001;71:354-61.

2. Nkenke E, Schultze-Mosgau S, Radespiel-Tröger M, Kloss F, Neukam FW. Morbidity of harvesting of chin grafts: a pro-spective study. Clin Oral Implants Res. 2001;12:495-502.

3. Webster TJ, Ejiofor JU. Increased osteoblast adhesion on nanophase metals: Ti, Ti6Al4V, and CoCrMo. Biomaterials. 2004;25:4731-9.

4. Du C, Cui FZ, Zhu XD, de Groot K. Three-dimensional nano-HAp/collagen matrix loading with osteogenic cells in organ culture. J Biomed Mater Res. 1999;44:407-15.

5. Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, Siegel RW, Bizios R. En-hanced functions of osteoblasts on nanophase ceramics. Bio-materials. 2000;21:1803-10.

6. Hamanishi C, Yoshii T, Totani Y, Tanaka S. Bone mineral den-

Figure 7. Biweekly changes in optical density of alkaline phosphatase (ALP) for groups 1 through 4. Optical density of ALP was measured at 405nm. Control values were measured 1 day before surgery; values for control through 6 weeks are the means obtained from 5 rabbits.

Figure 8. Biweekly changes in optical density of osteocalcin (OC) for groups 1 through 4. Optical density of OC was measured at 450nm. Control values were measured 1 day before surgery; values for control through 6 weeks are the means obtained from 5 rabbits.

Table 2. Quantitative Analysis of New Bone Formation in Group 1 through 4

Group 1 Group 2 Group 3 Group 4

*Mean (±SD) 0.72±0.45 0.83±0.42 1.81±0.71 3.60±1.01

ANOVA test (p-value)

0.190 0.121 0.064 0.0023

*Values in the table represent the mean percentage of each microscopic view that was taken up by new bone.

Table 3. Quantitative Analysis of New Bone Formation by Paired t-test in Each Group

Group 1 Group 2 Group 3 Group 4

Group 1 − p=0.886 p=0.112 p=0.038

Group 2 p=0.886 − p=0.429 p=0.101

Group 3 p=0.112 p=0.429 − p=0.128

Group 4 p=0.038 p=0.101 p=0.128 −

26

강남욱·김휘택·강정한 외 6인

sity of lengthened rabbit tibia is enhanced by transplantation of fresh autologous bone marrow cells. An experimental study using dual X-ray absorptiometry. Clin Orthop Relat Res. 1994;(303):250-5.

7. Heraeus Kulzer. Ostim-Vollsynthetischer Knochenersatz "ready to use". Das Deutsche Zahnarzteblatt. 2003;5:67.

8. Jang SP, Lee JH, Hwang KS, Choi SUS. Particle concentration and tube size dependence of viscosities of Al2O3-water nano-fluids flowing through micro- and minitubes. Appl Phys Lett 2007;91:243112.

9. LeGeros RZ. Apatites in biological systems. Prog Cryst Growth Charact. 1981;4:1-45.

10. LeGeros RZ. Calcium phosphate materials in restorative den-tistry: a review. Adv Dent Res. 1988;2:164-80.

11. Kim HW, Knowles JC, Kim HE. Hydroxyapatite and gelatin composite foams processed via novel freeze-drying and cross-linking for use as temporary hard tissue scaffolds. J Biomed Mater Res A. 2005;72:136-45.

12. Yaylaoğlu MB, Korkusuz P, Ors U, Korkusuz F, Hasirci V. Development of a calcium phosphate-gelatin composite as a bone substitute and its use in drug release. Biomaterials. 1999;20:711-9.

13. Schwartz Fo HO, Novaes AB Jr, de Castro LM, Rosa AL, de Oliveira PT. In vitro osteogenesis on a microstructured tita-nium surface with additional submicron-scale topography. Clin Oral Implants Res. 2007;18:333-44.

14. Anselme K. Osteoblast adhesion on biomaterials. Biomateri-als. 2000;21:667-81.

15. Colon G, Ward BC, Webster TJ. Increased osteoblast and de-creased Staphylococcus epidermidis functions on nanophase ZnO and TiO2. J Biomed Mater Res A. 2006;78:595-604.

16. Thorwarth M, Schultze-Mosgau S, Kessler P, Wiltfang J, Schle-

gel KA. Bone regeneration in osseous defects using a resorb-able nanoparticular hydroxyapatite. J Oral Maxillofac Surg. 2005;63:1626-33.

17. Yaakobi T, Maltz L, Oron U. Promotion of bone repair in the cortical bone of the tibia in rats by low energy laser (He-Ne) irradiation. Calcif Tissue Int. 1996;59:297-300.

18. Yoo JU, Johnstone B. The role of osteochondral progeni-tor cells in fracture repair. Clin Orthop Relat Res. 1998;(355 Suppl):S73-81.

19. Obrant KJ, Merle B, Bejui J, Delmas PD. Serum bone-gla pro-tein after fracture. Clin Orthop Relat Res. 1990;(258):300-3.

20. Ohishi T, Takahashi M, Kushida K, et al. Changes of biochem-ical markers during fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 1998;118:126-30.

21. Kim HW, Kim HE, Salih V. Stimulation of osteoblast respons-es to biomimetic nanocomposites of gelatin-hydroxyapatite for tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 2005;26:5221-30.

22. Elias KL, Price RL, Webster TJ. Enhanced functions of osteo-blasts on nanometer diameter carbon fibers. Biomaterials. 2002;23:3279-87.

23. Yamaguchi I, Tokuchi K, Fukuzaki H, et al. Preparation and microstructure analysis of chitosan/hydroxyapatite nanocom-posites. J Biomed Mater Res. 2001;55:20-7.

24. Hench LL. Bioceramics: from concept to clinic. J Am Ceram Soc. 1991;74:1487-510.

25. Mann S, Ozin GA. Synthesis of inorganic materials with com-plex form. Nature. 1996; 365:499-505.

26. Zerwekh JE, Kourosh S, Scheinberg R, et al. Fibrillar collagen-biphasic calcium phosphate composite as a bone graft substi-tute for spinal fusion. J Orthop Res. 1992;10:562-72.

27

가토의 장관골 골결손 부위에 골막 유래 간엽 줄기세포와 함께 주입한 나노 크기 입자 수산화 인회석의 신생골 형성

New Bone Formation Following Transplantation of Stem Cells and Nanoscale Hydroxyapatite Scaffold Materials

into Rabbit Long Bone Defects Nam Wook Kang, M.D.*, Hui Taek Kim, M.D., Jeong Han Kang, M.D., Jong Seo Lee, M.D., Tae Young Ahn, M.D.,

Eun Suk Jun, M.S.†, Hee Kyung Chang, M.D.‡, Seok Pil Jang, Ph.D.§, and Jong Kook Lee, Ph.D.||

*Department of Medicine, Graduate School, Pusan National University, Department of Orthopaedic Surgery, Pusan National University Hospital, †Medical Research Institute, Pusan National University Hospital, ‡Department of Pathology, Medical College, Kosin University, Busan, §Aerospace and Mechanical Engineering, Korea Aerospace University, Goyang, ||Department of Advanced Materials Engineering,

Chosun University, Gwangju, Korea

Purpose: We observed new bone formation following the transplantation of allogenic periosteum-derived stem cells and different sizes of hydroxyapatite (HA) scaffold materials into rabbit long-bone defects.Materials and Methods: Thirty-two white rabbits were grouped according to the material transplanted into their tibial bone defects: group 1 (microscale HA only); group 2 (nanoscale HA only); group 3 (microscale HA plus stem cells); and group 4 (nanoscale HA plus stem cells). Viscosity was controlled by the relative amounts of HA and agar. After surgery, radiologic, microscopic, and biochemical observations were performed weekly for 8 weeks.Results: Nanoscale HA (groups 2 and 4) provided better bone formation than microscale HA (groups 1 and 3). The rabbits that had been transplanted with nanoscale HA plus stem cells (group 4) had more homogeneous bone formation during the natural repair process than the other groups.Conclusion: Further study is required using nanoscale HA plus organic substance and stem cells, which are more similar to human bone structure, for better bone formation.

Key words: bone defect, stem cell, nanoscale hydroxyapatite

Received March 11, 2010 Accepted November 28, 2010Correspondence to: Hui Taek Kim, M.D.Department of Orthopaedic Surgery, Pusan National University Hospital, 1-10 Ami-dong, Seo-gu, Busan 602-739, KoreaTEL: +82-51-240-7248 FAX: +82-51-247-8395 E-mail: kimht@pusan.ac.kr