organophosphorus chemistry of fullerene: synthesis and biological effects of organophosphorus...

5
Organophosphorus chemistry of fullerene: synthesis and biological effects of organophosphorus compounds of C 60 Fuyong Cheng, Xinlin Yang, Cuihong Fan and Hesun Zhu p Research Center of Materials Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, People's Republic of China Received 23 December 2000; revised 30 May 2001; accepted 20 June 2001 Abstract ÐSynthesis of novel methanophosphonate and methanophosphonic acid C 60 derivatives was achieved, and their cytotoxicity was studied. In particular, a bis-methanophosphonate C 60 derivative displayed photo-induced cytotoxicity on HeLa cells with IC 50 value of 1.30 mM. q 2001 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Organophosphorus chemistry is an important branch of hetero-organic chemistry, and organophosphorus com- pounds are widely applied in medicine or as pesticides, extraction agents in the metallurgy industry, and additives for the petroleum industry. For example, some organo- phosphonic acids may act as insecticides and sterilizing agents; 1 some diphosphonic acids may display favorable ostaxis 2 and anti-in¯ammatory and pain-easing activities. 3 Since the bulk preparation of C 60 in 1990, many different kinds of functional groups have been covalently linked to the parent C 60 . 4 The preparation and properties of fullerene derivatives is being intensively studied, 5±7 while some of these compounds were found to exhibit versatile biological effects. 8 However, the synthesis and biological applications of C 60 -organophosphorus compounds have received less attention. So far, only a few papers have been published concerning the synthesis of fullerene derivatives bearing phosphorus substituents. 9±11 In a recent communication, 11 we reported the synthesis of the ®rst diphosphonate deriva- tive of C 60 , tetraethyl methano[60]fullerenediphosphonate 1. In this paper, the chemistry and biological effects of several organophosphorus compounds of fullerene are investigated, including the preparation of phosphonate derivatives of C 60 by an improved Bingel reaction, and of water-soluble phosphonic acid derivatives of C 60 , and the photo-induced toxic effects of the organophosphorus compounds on HeLa cells Scheme 1). 2. Results Diethyl ethoxycarbonylmethano[60]fullerenephosphonate 2 was prepared by a method similar to that for the synthesis of tetraethyl methano[60]fullerenediphosphonate 1 but using a different base. 11 Triethyl phosphonoacetate was allowed to react with C 60 in the presence of I 2 and DBU in toluene at room temperature, from which, after puri®cation by chromatography, compound 2 was isolated as a single product. A similar procedure using diethyl cyano- methylene-phosphonate and DBU as a base was employed for the preparation of the diethyl cyanomethano[60]fullerene- phosphonate 3. The mechanism of the reaction of C 60 with various methylenephosphonates can be compared to that of the Bingel reaction. 12 The reaction of I 2 with the phosphonate in situ produces iodo-methylenephosphonate which then generates a-iodocarbanions in the presence of base. The products are formed by the addition of the stabilized a-iodocarbanions to C 60 , followed by an intramolecular displacement of iodide by the anionic center generated on the fullerene core. The methanofullerene structures with C 2V symmetry for compound 1 and C s symmetry for compound 2 and 3 were assigned on the basis of FT-IR, MALDI-TOF-MS, 1 H-, 31 P-, 13 C-NMR, and UV±Vis spectra. In the UV±Vis spectra of these three compounds, two strong peaks are observed at 282 and 329 nm which are due to the characteristic absorp- tion of C 60 ; at 427 nm, a medium intensity peak appears which proves that they are 6,6-closed products. The 13 C NMR spectrum of 1 exhibits 23 signals, 19 of which are in the sp 2 hybridized fullerene region 140.3±146.1 ppm), while the similar fullerene region of 2 and 3 shows 26 and 28 signals respectively, some of which are overlapping. A comparison of the 31 P NMR resonance ppm) of 1 15.57), 2 Tetrahedron 57 2001) 7331±7335 Pergamon TETRAHEDRON 0040±4020/01/$ - see front matter q 2001 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. PII: S0040-402001)00670-6 Keywords: fullerene; organophosphorus compounds; photo-induced; cyto- toxicity. p Corresponding author. Tel.: 186-10-68913469; fax: 186-10-68915023; e-mail: [email protected]; [email protected]

Upload: fuyong-cheng

Post on 02-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

������������� ��� ���� �� ��������� ������ ������������� ������ �� ������������� �� ���� �� ���

������ ���� ��� �� ���� ������� ��� ��� ���� ����

�������� ���� �� ������� ������� ������ ����� �� ���������� ������ ������� �������� �������� �� ����

����� �� ����� ����� ����� �� ��� ��� � ���!"� �� #�� ���

�������$%��"���� �& ��� �"����!���!����" ��� �"����!���!����� ���� �'� �����"��� (�� ������ ��� "��� ��"�"�)���"� (���"����* +� !��"��� �� � ���,�"����!���!����" �'� �����"�� ���! ��� !��"�,������ ��"�"�)���"� �� �-� � � (�"� +�.� �� � �& *�� ��* � ��� / ���� %���� -"�* 0 ����"� �����*

�� �����������

1�����!���!����� �����"�� �� �� ��!��"��" ������ �&�"��,������� �����"�� ��� ������!���!����� ���,!����� �� (�� � �!! �� �� ������ �� �� !�"�����)"���"��� ���"� �� "� �"� ���� �����"�� ��� ����"���&�� "� !"�� �� �����"��* ��� )��! ��� ������,!���!����� ����� ��� ��" �� ����"����� ��� �"�� �2������"�� ��� ��!���!����� ����� ��� ���! �� &������ ��"�)��� ��� ��"�,��3����"��� ��� !���,����� ��"���"��*�

%��� "� �� 4 !�!���"��� �& �'� �� 55� ���� ��&&��"4���� �& &���"���� ����!� ��� �� ���� �" � ��4� "�"� !���" �'�*

6 7� !�!���"��� ��� !��!�"�� �& &� �������"��� �� ���� ��"���� � �"����.89 (�� ��� �&"�� ���!����� (� &���� "� )����" ����"� ��� ����� &&�"�*: ��(�� "� ���"���� ��� ��� ����� �!! ���"�����& �'�,������!���!����� ���!����� ��� ����� ���""�"���* %� &�� �� � � &( !�!�� ��� �� !�� ������������� "� ���"���� �& &� �� �����"��� ������!���!����� ����"�"��"�*58 +� � ���" ���������"���

( �!��"� "� ���"���� �& "� ;��" ��!���!����" �����,"�� �& �'� ""��"�� �"����<'�=&� ����!���!����"�* +� "��� !�!� "� �����"�� ��� ��� ����� &&�"� �&���� ������!���!����� ���!����� �& &� �� ������"���"� ��� ����� "� !�!���"��� �& !���!����"�����"��� �& �'� �� �� ��!���� >��� ���"��� ��� �&(�"�,�� �� !���!����� ���� �����"��� �& �'� ��� "�!��"�,������ "�)�� &&�"� �& "� ������!���!��������!����� �� �-� � � ?%��� @*

�� ����

��"�� "��)�������� �"����<'�=&� ��!���!����" �(�� !�!��� �� � �"��� ���� �� "� "��" &�� "� ���"���� �&""��"�� �"����<'�=&� ����!���!����" � ��" ����� ���&&��" ���* 7��"�� !���!������"�" (�� � �(� "����" (�"� �'� �� "� !���� �& +� ��� �>A �� "� �� �"���� "�!��"�� &��� (���� �&"� !���;��"��� ��������"����!�� ���!���� � (�� ��� �"� �� � ���� !�����"* 0 ���� �� !������ ����� ��"�� �����,�"�� �,!���!����" ��� �>A �� � ��� (�� �! ���&�� "� !�!���"��� �& "� ��"�� ������"����<'�=&� ��,!���!����" �*

7� �������� �& "� ���"��� �& �'� (�"� ��������"�� �!���!����"� ��� � ���!��� "� "��" �& "�>��� ���"���* � 7� ���"��� �& +� (�"� "� !���!����"�� ��"� !������ ����,�"�� �!���!����" (���� "������"� �,�������������� �� "� !���� �& ���* 7�!�����"� �� &���� �� "� ����"��� �& "� �"��� �2��,�������������� "� �'� &� �(� �� �� ��"���� �� �����! ����" �& ����� �� "� ������� ��"� ����"� ��"� &� �� ���*

7� �"����&� �� �"���"��� (�"� �� ����"�� &�����!���� � ��� �� ����"�� &�� ���!���� � ��� � (�������� �� "� ����� �& �7,+� �0-�+,71�,�% �, � B, ��,C�� ��� AD8D�� �!�"��* +� "� AD8D�� �!�"�� �&"�� "�� ���!����� "(� �"���� !�4� �� ������ �"�:� ��� ��5 �� (���� �� �� "� "� ������"���"�� �����!,"��� �& �'�� �" 6�9 �� � ����� ��"���"� !�4 �!!���(���� !���� "��" "�� �� '',� ��� !�����"�* 7� ��C�� �!�"��� �& � )����"� �� ����� � 5 �& (���� ���� "� �!� �������2� &� �� ����� ? 6�*�8 6'* !!�@(�� "� ���� �� &� �� ����� �& � ��� � ���(� �' ����: ����� � ��!�"�� � ��� �& (���� �� ��� �!!���* 0���!������ �& "� � B C�� ������� ?!!�@ �& � ? .*.9@ �

7"������� .9 ?��� @ 9�� 89��.B������

7/7�0�/��1C

��6�86���E� EF , � &���" ��""� � ��� / ���� %���� -"�* 0 ����"� �����*B++G %��6�,6���?� @��'9�,'

!��"��#�G &� ��� ������!���!����� ���!������ !��"�,������� ��"�,"�)���"�*� �����!������ ��"���* 7 *G �:', �,':5 �6'5� &�)G �:', �,':5 .����,��� G ��2��H��"*��*��� ) ����H��"*��*��

$% ���� � ��% & ������#�� '( )*���+ (,,�-(,,'9���

? �* .@ ��� � ? �*�9@ ��� �����"��" "� ��� ���� &&�"�& "� ����"�"�"� ����!�*

���!��� (�"� �'� "� !� ���"�� �& �"� ���������"� � ���� � ������ ����4�� � ��� "��� �� ��� �"�� � ����!��� ���" �* 7�� �� ��� � �� ��� �2� �� �� ��"����� �� "� �� ��� � ��� ���* +� ��� � "� �� ��� �"��� ��� "��� '� �� � � * ��(�� "�� �����" � �� ���, �2� �� ���� � !� �� �� ��"� (�"� �"���� !� ���"�� ���� ��� ���� � ��� ��%1* ���� "� ���"��� �& �'� (�"� )����"�� �!���!����"� ? G�8 G'@ ��� "� !���;��"��� �&"� !�����"� �� ������"����!�� "(� ���,�����"� �&!���!����" �����"��� �& �'� ��� ! (� ��"����*7� �� ��� �"�� �& ���!����� ��� ! �� ��� �������� "�� ��� � ��� � ����� �� ��"� I��" ��&&��"�� ��"� ��� ����� "� �� �� ���&��� ��"�� "���� ��� ��%1* +" �� (��"� ��"��� "��" �� "� "� ��&;�� "�!���"��� �� � �� �� ��� ������"����!�� ��"�� �&

��� ! �� � !�� ���!���� ��" ��� � � ��)"�� �& ��&&��"���������� �& "��� ���,�����"�*

7� �����!������ ���� �����"��� &��� ���!����� � ���� � (� )!�"� "� � ��"���� �� ����� ����* ��(���� � ���,�� 4� �"� !�����" (�� ��"���� (�����!���� � (�� ����� �2� �� "� �� ��" �"��� �&�� 4� �"��� (�"� �����"���"�� �� �� � !����� � �� "�"� �"��� �������� �& &� �� ��� ��� "� "(� � ��!���!����" ����!�* 0 "���"�� � "� !���!����� ���������"��� � ��� " ��� � � ���� � &���� �&"� ���"����& ���!����� � ��� � �" �3�) �� �����"��"� �I���� �� ���� �� 0� �"���!�� &�� "�� ����* ���!����� � ��� "(� ���! " � ���� �� �� �I���� ����� ��� �����" ��� �� �� ��"�� (�"�* +�"��"��� � "�� ���!�����(� ��" �� �� �� �I���� C�1� �� C��1� ��" (��� �� �� �� �I���� �� �"��� ���"������ � ��� �����"�& "��"�� ���� ? J@* 7�� ��� "� ���( "��" "� ������

#��� � �� %��"���� �& ���!����� �8" ?�@ +� ? I���*@ ���?B1?1/"@�@� ? I���*@ C�� ?�� I���*@ "� �� 6��� 5 �� ?�@ +� ? I���*@ ���?B1?1/"@�,?�11/"@ ? I���*@ �>A ?� I���*@ "� �� �" 6 �� ?�@ +� ? I���*@ C����?B1?1/"@� ? I���*@ �>A ?� I���*@ "� �� �" 6 �� ?�@ +� ?' I���*@���?B1?1/"@�@� ?' I���*@ C�� ? �� I���*@ "� �� �" . �� ?@ +� ?� I���*@ ���?B1?1/"@�?�11/"@ ?� I���*@ �>A ? � I���*@ "� �� �" . ��?&@ �� �3�) ��� ?�@ �� �3�) ��*

$% ���� � ��% & ������#�� '( )*���+ (,,�-(,,' 9���

�� "� �& ���!����� � ��� " �� ��" �� �� �� �I���� �� �,"��� (�� "��� "��"�� �������� �� "� ��* ���!����� ���� " �� ��� �� �� �� ��%1 �� �� "� ���,�����"� ���!*

�� "� "��� ������!���!����� &���"��� ����!� ���!����� ! � ��� " �� )!�"� ��" �� � "� ���! �� "� !��!�"���& &� �� �"� & ��" � �� "� ���( ��� ���I� ��� ����� &&�"� �& "� ��� ����!�* %��� ��%1 �� ��� � �� �� ��(�"� ��� ��� �"" ����� "� � � �" �( �����"��"���"� ��%1 �I���� �� �"���� �& ���!����� ! � ��� "��� !���!�"�� �!! ���"���� �� "� ; � �& ���������*7� &&�"� �& "� ��%1 �I���� �� �"���� �& "�� &������!����� �" �( �����"��"��� ?6 ��@ �� "� ���("� �&�-� � � �� ��"�� (� ����"���"� �� "� �77 "�"* 6

%�� �����;���" ��� "� (� ��"����* A��� ���,�������"��� � �& "�� ��� �� &&�"� �� "� � �� �����������"��� ��������" ���(� ��"�"�)���"� (�� "����������"� � " ��� "� ��������" ! ��� �� &&�" ?���* �@* 7� ��"�"�)���"� �& ���!���� �" ��&&��" �����"��,"���� �� ���(� �� ���* �* 0� ���!��� (�"� "� ���"�� ?���@ �* J ��%1 �"� & ��� �� ��"�"�)���"� �� � ����� ��"� �����"���� ��"�� ���!���� �" "� �����,"��"���� �& �86 �� ��� ���� ���,�������"���* ��(�����!���� �� �" �( �����"��"��� ? *� ��@ ��� �������" "� � ���("� ���� �������"��� ?���*� ���!���(�"� "� "��"��" �& �* J ��%1@* 7��&�� "� !��"�,������ ��"�"�)���"� �& ���!���� (�� ���,�!���"*���"����� +�.� �� � �& ���!���� (�� �� �� �"� �� *�� �� &��� ���* �* 1����� ���� �����"� �!"��� ��������! "� ���! �& "� � � (�"� "� ���!����)!��� "� ���" ���� ����� ������"��� "� � � (������� ��� �*

�� $�����

7� ��� "� ( !���" &�� "� ;��" "�� ����" "� &&�"� �&"� ������!���!����� �����"��� �& �'� �� �-� � � ����� ������&� * ���� �������� ��� !������ ����� ��� "��" "� !��"�,������ ��"�"�)���"� �& "� &� ,��� ��� "��� �����"��� (�� ���� � �� "� "� ���"���)��� �!��� ?�1%@ !������ �� "��* .8 : 0�������� "�"� �"���� �& ������ ��� ��� ��(��4�� 5 "� �1% !��,������ &;����� �& &� �� �����"��� �� ���!���" �&

"� 4���� �& ������ ��" ������ (�"� �� ������ �& "������ �����* %� �� � ��� �2��� &��� "� !��"�����"��&;����� �& &� �� �����"��� "� !��"�,������ ��"�,"�)���"� �& "� ���������"� � ��� " ���� � � �"����� "���"� ��������" ��� "��" �& ! ���� � � ��� "� "��" �& *��(�� ��� )!����"� ��� "� �� ������� � ��&&��"*7� ��"���"� �& (�� &���� ���� ����� "��� ���!����� !� ��� " ?���* @* 7��&�� �" �� �����"� "��" �� "� "����! )�"� �& "� ��� ����� ���"� ����� �& "� ���� �,��" �& "� �1% !������ �� "� &� �� ��� "� �"���,"��� ��� "� !��!�"�� �& "� ����"��� ����!� ��� � �� ! ���� ��!��"��" �� �� "� ��"�"�)���"� �& "� &� �������"��� �!��� � �" �( �����"��"����* 7� ���������& "� !��"�,������ ��"�"�)���"� �& "�� ������!���!��������!����� �� ��( ���� ����"���"��� �� ��� ��*

� ��������

+� ���� ����� ���� �!��;� ������!���!����� �����,"��� �& &� �� (� ���"���2� ��� "��� ��"�"�)���"�"�"�* 0���� "�� ���!���� (�� "�)�� "�(���� �-�� � (�� !��"�,������ (���� ��! �� �"� !�"�"�� �!! ���"��� �� "� !��"�������� "���!�*

!� %&��� �����

!��� '������

7� +� �!�"�� (� ������ ����� � �0KC0 �7E+�,.'�?C��� " ���!��� L>� ! "@* 7� �, � B, ��� �� C��(� ������ �� � ���,��� C�� ?>��4� ���!���@ ���"� ������ ���&"� � �� �&��� "� 7�% ? �@ ��B16 ?

� B@��� ��� � ?99*� !!� ��@ ��!�"�� �* �0-�+,71�,�%(� ������ �� � /+�-/�,� �% ?>��4� ���!���@ (�"��,�����,6,�����)� ,������� ���� ?��0@ �� ��"��)* AD8D�� �!�"�� (� �"�"� �� � A "���!� ���� AD8D���� �!�"��!��"��"� ?0������ B��������@* ��� �77 �����1� �� �� (� )����� �� � ��� ..� �����! �"���� ?>��,���@*

!����� #������ �� ���������� ������(��)��������*������������ �� 7"��"�� �"����<'�=&� ��,��!���!����" � (�� !�!��� ��������� "� "� �"���������� !������ �*

+���� �� 7� ��"�"�)���"� �& ���!����� ! � ��� " �" "� �����"��"��� �& 6 �� ?�@ ��� �& ���!���� �" ������� �����"��"���� ?�86 ��@ ?�@ �� �* J��%1 �I���� �� �"���� ������" �-� � �*

$% ���� � ��% & ������#�� '( )*���+ (,,�-(,,'9��6

!����� #������ �� ������� ����&��������� ������(��)*������������������ �� 7� � �"���� ��� "� �� �� �"���?��� � @ ���"������ �'� ?�.� �� �*�. ��� @ +� ?5 ���*�. ��� @ ��� �>A ? .� � *� ��� @ (�� ���� "��"�� !���!������"�" ?9� � �*�. ��� @* 0&"� �"������ �" ����"�!��"�� ���� 0� &�� 6 � "� ��)"�� (�� �����""� "��� ��� ������"����!�� ?%�1�@* ������ �'� (�� �"�(�"� "� �� ��� "� ���"��� !�����" (�"� �G "� ��E��� �* 0&"� ��!���"��� "� ��"���� �� �� !�����" (��(���� (�"� �"���� ��� ���� �� ������ �" '��� &�� �� �"� ��� � � ��4 �� ��G .� �� ?6.J@* �G �7,+� � ?��� @?L>�@G�6�: �5:� �5�� �:6� ���5 '�5 6�. �99 �6' ��: :.� 96� .�9* �0-�+,71�,�% ?�,�����,6,�����)� ,������� ���� ?��0@ �� ��"��)@ .E/ 5'. ? ��@<��C�=� 56� ?9:@ <�=� 9�� ? �@ <��B1?1/"@�M�11/"� =� 9�� ?�:J@ <�'�=

�* � C�� ?��� ��2��� �@G� 6*.. ?I 0�9*� �2 '�@ *.' ?" 0�9*� �2'�@ *69 ?" 0�9*� �2 ��@*� B C�� ?��� ��2 ��� �@G� �* .* �� C�� ?��� ��2 ��� �@G � '6 69*' 69*. 6.*� 6.*� 6.* 6.* 6.*� 66*5 66*: 66*: 66*9 66*' 66*' 66*' 66*� 6�*: 6�*� 6�* 6�* 6�*9 6�*� 6�* 6�*� 6 *5 6�*: �'*5 9�*6 '6*' '�*6 �5*9 '*' 6*�* AD8D�� ?"� ��@���) ?��@ ?�@G �:� ? �':6�@ �� ?6�':�@ 6�: ?��:�@*

!����� #������ �� ������� ����� ������(��)��������*���������� �� A���� ��"�� ������"�� �!���!����"�� �"��"��� ��"��� �� � ���� �� !�!��� �"��� "� ������" (�"� G "� ��E��� � �� ���" "� ;�� !�����"� (��!���"�* 7� !�����"� ������ "(� !��"�G "� ;��" &���"����� � ���(� �� �� (�� "� !�� ���������" � ? �J@ ��� "������ (�� � ��)"�� �& ��������"� "� !�"������"�* �G �7,+� � ?��� @ ?L>�@G�6�: �5:� �5�� �:6� ���5 '�5 6�. �99 �6' ��: :.� 96�.�9* �0-�+,71�,�%?��0 �� ��"��)@ .E/ :5. ?5'@ <�=� :9� ?�.@<���C� =� 9.: ?96@ <��B1?1/"@�=

� 9�� ? ��J@<�'�=

�* � C�� ?��� ��2 ��� �@G � 6*'� ?I 0�9*� �26�@ *'. ?" 0�9*� �2 '�@* � B C�� ?��� ��2 ��� �@G � �*�9* �� C�� ?��� ��2 ��� �@G � 6'*. 6'*. 6'*6 6'*� 6'*� 6.*5 6.*� 6.*5 6.*: 6.*9 6.*' 6.*. 6.*6 6.*6 6.*� 6.*� 66*5 66*� 66* 66*� 66*� 6�*5 6�*� 6�* 6�* 6�*' 6�*� 6�*� �5*9 6*. '5*� ''*6 ��*5 9*'* AD8D��?"� ��@ ���) ?��@ ?�@G �:� ?6'9.�@ �� ? 6.��@ 6�:?�6��@*

!��� � #������ �� ������� �� ���������� ������(��)*�������������������� � 7� � �"���� ��� "� �� �� �"���?.�� � @ ���"������ �'� ?.�� �� �*9 ��� @ +� ?9�: ��6*� ��� @ ��� C�� ?� �@ (�� ���� ""��"�� �"�� �,��!���!����" ?'5' � 6*� ��� @* 0&"� �"������ �" ����"�!��"�� ���� 0� &�� . � "� ��)"�� (�� ; "�� �&&��� "� ; "��" (�� �����""� "� �� ��� ������"����!��?%�1�@* 7� ���������" (�� �"� (�"� ��� � ��� "���������" (�"� "�� ��"�"* 0&"� ��!���"��� "� �� ��!�����" (�� ���� �� ������ �" '��� &�� �� � "� ��� � � ��4�� �� ��� (���� '� �� ?��J@* G �7,+� � ?��� @ ?L>�@G�5� �:9� �'� �'9 ��: .�9* �0-�+,71�,�%?��0 �� ��"��)@ .E/ � 6 ?5'@ <��C�� =� �5�? ��J@ <�=�* � C�� ?��� ��2 ��� �@G� 6*6' ?!0�9*� �2 '�@ *6 ?" 0�9*� �2 �6�@* � B C��?��� ��2 ��� �@G � '*.�* �� C�� ?��� ��2��� �@G � 69*� 69*� 6'*9 6'*' 6.*' 6.*� 66*9

66*. 66*6 6�*' 6�*� 6�*5 6�*� 6 *5 6 *: 6�*9 �5*� �9*: '�*5 �5*9 '*'*

!���!� #������ �� ������� �� ������� ����&���������* ������(��)������������������ !� 7� � �"���� ���"� �� �� �"��� ?��� � @ ���"������ �'� ?�.� ���*�. ��� @ +� ?�:. �� *�. ��� @ ��� �>A ?6.� � �*� ��� @ (�� ���� "��"�� !���!������"�" ?� � � *�. ��� @* 0&"� �"������ �" ���� "�!��"�� ���� ��0� &�� . � "� ��)"�� (�� �����""� "� �� ��� ������"�,���!�� ?%�1�@* 7� ����� ���������" ��� ��N�� ��������"! (� �"� �� "��� ���� (�"� �G "� ��E��� �* 0&"���!���"��� "� !�����" (�� ���� �� ������ �" '��� &���� � "� ��� � � ��4 �� �� ��� (���� 5� �� ?��J@* !G �7,+� � ?��� @ ?L>�@G �5� 9�9 �95 ��' �.9 � 5.��* �0-�+,71�,�% ?��0 �� ��"��)@ .E/ :' ? ��@<��C�=� '� ?9�J@ <�=�* � C�� ?��� ��2��� �@G� 6*.� ?! 0�9*� �2 ��@ *.. ?" 0�9*� �2 ��@ *6� ?" 0�9*� �2 '�@* � B C�� ?��� ��2��� �@G � �*'6* �� C�� ?��� ��2 ��� �@G � '6*� 6'*. 6'*6 6'*� 6'*� 6.*� 66*5 66*. 66*� 6�*5 6�*9 6�*' 6�*� 6 *' '6*� '�* �5*. '*6 6*�*

!����� #������ �� ������(��)����������������������� �� 0 �� �"��� �& �� �� �& � �� �����"��"� �I������ ?�� � @ (�� � �(� "� �3�) &�� "�� ����* 7� ��� ",��� ��)"�� (�� ��"��&���* 7� !���!�"�" (�� (����&��� "��� (�"� ���"� � (�"� ��� ����� �� �� (�"����"������ "��"�� ���� ? J@* 0&"� ��"��&���"��� "����� ���� �� ��� !�����"� ��� "� �I���� !���(�� �����;� (�"� �����"��"� �I���� �� * 7� ��� "���!���!�"�" (�� ��"��&��� (���� (�"� (�"� ��� ;�� ����� �� ������ "� ��� � ���(� !�(�� � ? 6 �� 9:J@G�7,+� � ?��� @ ?L>�@G �5� �:9� �'� �'9 ��: .�9*�0-�+,71�,�% ?��0 �� ��"��) ���"�� ���@ .E/ :5�? ��J@ <�� =�* � B C�� ?��� ��2 '�,��%1@G � :*6�*AD8D�� ?��1E/"�C J@ ���) ?��@ ?� @G ��� ?.6'��@ �'�?6:9.�@ ��5 ? :.�@*

!���"� #������ �� ������(��)����������������������� "� ���!���� " �� � ���(� !�(�� �� 9�J �� � (��!�!��� �� � ���� �� �"��� "� � �"��"��� &��� ���!�����* "G �7,+� � ?��� @ ?L>�@G ��9 : �� �5� .:'.96 .'� .�9* �0-�+,71�,�% ?��0 �� ��"��) ���"�����@ .E/ :.' ? ��J@ <�� =�* � B C�� ?��� ��2 '�,��%1@G � 9*� * AD8D�� ?��)E�� ��1E/"�C@G ���?'95.�@ �'. ?.95� @ ��� ?����@*

!��� ������&����� ����� �������

7� �"��4 �� �"���� �& ���!���� ! � ��� " (�!�!��� �� ��%1 ?6 ��@* %"�� �� �"���� &�� � )!��,��"� (� ��"���� �� ; "���� "�� �� �"���� "�������*� ��,!��� �������*

����� ����) �"�� "����,����� �-� � � (��� "��� �� �� �"���!�� (�"� .J �1� ��� �" �9�� ����,"���� �� � C0B�1 �1� ������"�� ��� �� ��B+ '6������ ���"������ .J ��",����"���"� &"� �� & ������� �� ���"� � � !���� �� ��� �� �� � � �"�!"�,�����* ��"�"�)���"� �"�����"��� �& �'� �����"��� (�������� ��" (�"� �6,( ! ��"�� �� "�� ! �"�* 7� �

$% ���� � ��% & ������#�� '( )*���+ (,,�-(,,' 9��.

���("� �� �� "�� ����� (�"���" ?���@ �� (�"� �* J �&��%1 (�� � �� �"�"�* ���� �!�"� (� ����"�4� &����� ���! *

O�� � � ��� �!��� ( �� "� ��""�� �& �� "�� ! �"��'� �����"��� (� ���� ��"� "� �� "���* 7�� "��� "��� (� �������"� (�"� � ��� O �� ��� ��! �""����!��" &��� �� �� ���"��� ��� "� �� "���* 7� ����� "���",����� "� � � "� ��" !������ �� "� ��! (������� �� � !�� �& ��" ��� � � ���* 7� �������"��� (�������� ��" "�� "��� ��� �6 � &�� �*. �* 0&"� "� "�����������"��� ��� �� ;����� "� ���� � ����� (���"����� �� "� �77 ����� ������" �* 6 7� �!"��� ����"� �� � ?1� �� �@ (���� �!���"� "� � �����(�� ������ (�"� � �����! �" ���� �� � ��� (�� ��"�(��* 7� ��"���� ��"� (� �"�"��"��� � ��� �2�*

��,��-����� ���

O "���4 "� C�"���� C�"��� %���� &�����"��� �& �����&�� !�������� "� ;������ ��� ?C�* .59����5@* O �� � ����� ���"&� "� B��&���� #��4 ������� �& A������"P�Q0���� ����� (�� 4��� � ��� ���" � ! �� "���!�����" �& "��� ��������!"*

���������

* L�4���"� C*� �������� 7*� 04��� �* 0% 1����.�% ���.%

�..� ,�' �698�.�*

�* 7�� O* �* 0% ���% 2���% �#% �./" ( '�8'6*

�* +������� �*� %�4���"� %*� 0� 7* #!�* L�4�� 7�4�� L���

#B'��5..5.� ���.% 3���% 96�::�*

6* 7�� �� �*� O� "� �* �* �* 2���� �..� ,4, ':.8'5�*

.* ������� �*� 7�� �� �* ������ �..� *(� � 98���*

'* B��"� �* 0% ���% ���.% �.." ( �598 �5*

9* /������ -*� /������ -* /* 3��% ���.% ���% �../ ,�

.5�8'� *

:* #��� 0* O*� O� ��� %* �*� %����"� �* +* ������% �#%

���.% �..� 5 9'98 '5*

5* ������ %*� ������(� �*� ��4�� �*� C�4����� /*

������#�� �..� '* .�5 8.�5:*

�* ������ %* �*� - �* �*� %��"���� L* �*� ���� �* �*

0% 1��% ���.% �... 45 ::':8::9�*

* ���� �* �*� ���� �* -*� ��� �* %* ������#�� 6�% ����

5� �5698�5.�*

�* >��� �* ���.% ���% �..� �*4 5.98 5.5*

�* ��L��� �* /*� ���� �* 7*� ����� C* �*� ��L��� �* �*

������#�� 6�% �."" * ..8 .:*

6* ������� 7* 0% �..���% ���#� �./� 4' ..8'�*

.* C�4�N��� C*� C���� �*� -� �* �*� +4��� �* $������� ���%

������% �..� 5 8 5*

'* ���� �* �*� ���� �* -*� ��� �* %* $������� ���% ������%

���� � �8 �6*

9* %�"�� �*� ��"��� L*� L����� �*� ������� 7*� C����� 7*�

����� �*� 7�4������� +* 7��% 0% ����.����% �.." ,*(

9.8 : *

:* �������� �* �*� K����� �* ����% 7��������.% ���% �..!

�� ':68'5.*

5* ������ 7*� 14��� L*� ������� 7*� ����� �* ���.%

��..�% �.." � 8��*