1

Optinė mikroskopija: mikroskopai ir metodai

Apšvietimo būdai

Bandinį apšviesti galima įvairiai, nuo apšvietimo priklauso ir skiriamoji geba, ir kontrastas.

• Šviesus laukas: į objektyvą patenka spinduliai, išėję iš apšvietimo sistemos ir praėję pro skaidrų (arba nelabai) bandinį. Spinduliai sklinda pagal geometrinės optikos dėsnius ir nesant bandinio, gaunamas tolygiai apšviestas vaizdelis.

• Tamsus laukas: į objektyvą patenka spinduliai, išsisklaidę arba difuziškai atsispindėję nuo bandinio (t.y.) pakeitę kryptį bandinyje. Nesant bandinio, šviesa į objektyvą nepatenka.

Kam tas tamsus laukas?

Detalių matomomumas priklauso nuo kontrasto!

Apšvietimo būdai

Tamsaus lauko apšvietimas

Krentanti šviesa (šviesiam laukui)

Praeinanti šviesa (šviesiam laukui)

Bandinys

Apšvietimo būdai

Šviesosšaltinis

Šviesus laukas

Tamsus laukas

Praėjusišviesa

Šviesus laukas

Tamsus laukas

Kritusi šviesa

KreivaiTiesiai RatuIš vienos

pusės

KreivaiTiesiai RatuRibotaskampas

Apšvietimo būdai: parinkimas

• Parenkama priklausomai nuo objekto:– Jei objektas neskaidrus, lieka tik apšvietimas

kritusia šviesa (nes niekas nepraeina);– Jei objektas nesugeria ir neatspindi (lūžio

rodiklis toks pat, kaip ir aplinkos), dažnai geriau naudoti tamsų lauką.

2

Tamsaus lauko mikroskopija

• Tamsaus lauko mikroskopijojedetektuojama šviesa, pakliuvusi į objektyvą dėl – Atspindžio– Lūžio (refrakcijos)– Difrakcijos

Tamsaus lauko mikroskopija

• Apšvietimui formuojamas tuščiaviduris šviesos kūgis, kuris, nesant bandinio ‘apeina’ objektyvą:

Tamsaus lauko mikroskopija

• Jei bandinys neskaidrus, tenka apšviesti iš viršaus:

Tamsaus lauko mikroskopija

• Mikroskopinės procesoriaus nuotraukos:

Laidai geriau matosi tamsaus lauko režime (dešinėje).

Tamsaus lauko mikroskopija

• Tamsaus lauko režme daug geriau matosi visokie kraštai, ribos, skylutės ir lūžio rodiklio netolygumai, todėl šis režimas puikiai papildo šviesaus lauko režimą

Drugelio sparnas(didinimas 50X, apšviesta iš apačios tamsiu lauku)

Fazinio kontrasto mikroskopija

• Daugelis biologinių bandinių yra skaidrūs. Jie silpnai atspindi/sugeria šviesą. Tačiau, kadangi jų lūžio rodiklis skiriasi nuo aplinkos, šviesa, kuri juose difraguoja, pakeičia fazę.

• Gaila, kad akis ar fotoaparatas fazės nemato • Olandas Frits Zernike 1934 metais sugalvojo,

kaip išnaudoti šiuos fazės pakitimus ir pakeisti juos į amplitudės (fizikos Nobelio premija 1953). Taip atsirado Fazinio kontrasto mikroskopija.

3

Fazinio kontrasto mikroskopija

• Privalumai:– Nereikia fiksuoti, dažyti ar žudyti ląstelių;– Galima dirbti in vivo.

Smegenų ląstelių kultūra

Fazinis kontrastas: principas

• Skaidriame bandinyje difragavusi šviesa tiesiai praėjusios šviesos atžvilgiu užlaikoma per λ/4:

Difragavusi ir tiesiai praėjusi šviesa vaizdo plokštumoje interferuoja ir suformuoja vaizdą P. Kadangi difraguoja nedaug šviesos (D

4

Jablonskio diagrama

S0

S1

SN

T1

T2

TN

IC

ISC

abs. fluor.

phoshorescence

Stokso poslinkis

Kadangi fluorescencija visada raudonesnė už sugertį, nuo žadinimo šviesos galime išsivalyti atkertančiais filtrais.

Klausimas

Kokie turi būti žadinančio ir atkertančio filtro pralaidumo spektrai?

Fluorescencinis mikroskopas

Fluorescenciniomikroskopo principinė schema

Fluorescencinis mikroskopas

Filtrų kubas (fluorescencijos ir žadinančios šviesos atskyrimas)

Objektyvas yra viskas

• NA = 1.45 (imersijos alyvos n=1.52)

• 12-15 elementų, visi padengti specialiomis dangomis

• Įvairios imersijos terpėsalyva, vanduo, glicerolis

• Iki 5⋅107 pikselių

Imersinisplan-apochromatas

• Brangu !

5

Fluorescencijos mikroskopija

• Jei fluorescuoja molekulės pačiame bandinyje (pvz., amino rūgštis triptofanas, ar fotosintezės pigmentai: chlorofilas), mikroskopijos vaizde stebima autofluorescencija.

• Jei bandinys nefluorescuoja, galima jį nudažyti dažais, kurie fluorescuoja. Tai vadinamoji sensibilizuotoji fluorescencija.

Fluoroforai

Fluorescencijos mikroskopijaJaučio plaučių arterijos endotelio ląstelės Žmogaus chromosoma

DAPI (mėlyna) – branduoliaiCMXRos (raudoana) – mitochondrijosfalacidinas (žalia) – aktino skaidulos

16 skirtingų dažų!

Sensibilizatorių yra visokių: jie kabinasi prie įvairių ląstelėsdalių ir taip žymiai pagerina kontrastą:

Fotodaugintuvas

Veikimas paremtas griūtiniu elektronų srauto stiprinimu.

Fotodaugintuvas

Fotodaugintuvas su katodu priekyje

Fotodaugintuvas

Uždavinys: jei dinodo elektrono išlaisvinimo darbas atitinka 700 nm šviesos kvanto energiją, kokią įtampą reikia prijungti prie anodo, jei fotodaugintuvas turi 12 dinodų?

6

Mikrokanalų plokštė Mikrokanalų plokštė

Veikimo principas tas pats, kaip ir fotodaugintuvo, tik jų yra daug vienas greta kito. Privalumas tas, kad išsaugomas vaizdas

Fotodiodas

Atbuline kryptim prijungus p-nsandūrą, ja tekanti srovė priklausonuo krūvininkų skaičiaus nuskurdintame sluoksnyje. Krūvininkus galima generuoti šviesa.

CCD kameros

Daug šviesa užkraunamų kondensatorių, sukabintų į grandinėlę

CCD kameros

Veikimo principas – krūvio ‘byrėjimas’ iš vieno kondensatoriaus į kitą

CCD kameros

• Geriausia raiška – iki 12,000,000 pikselių• Labai greitos – iki 10,000 kadrų/sekundę

• Vaizdo intensifikatorius• mikrokanalinė plokštė

• CMOS lustai: logaritiminis atsakas, galima nuskaityti atskirus pikselius

• Didelis kvantinis našumas+• griūtinis stiprintuvas luste =• gal greitai bus galima matyti pavienius fotonus?

7

Konfokalinis skenuojantis mikroskopas

Problema: plataus lauko fluorescenciniaimikroskopai surenka fluroescenciją ne tik iš objektyvo židinio, bet ir iš vietų aplink jį (aukščiau, žemiau). Dėl to vaizdas ‘išsiterlioja’

Konfokalinis skenuojantis mikroskopas• Konfokaliniam mikroskopui

naudojamas lazeris, nes jis duodą gražų, lygiagretų pluoštą, kurį galima gerai sufokusuoti;

• Vaizdas (3D!) gaunamas judinant bandinį ir/arba skenuojant spindulį.

• Užtenka vieno detektoriaus (fotodaugintuvo), esančio už skylutės.

Konfokalinis skenuojantis mikroskopas

a, d: žmogaus kaulų smegenysb, e: triušio raumuo, nudažytas fluoresceinuc, f: saulėgrąžos žiedadulkė

Skirtumas tarp plataus lauko ir konfokalinio režimo...

Konfokalinis skenuojantis mikroskopas

Skirtumas tarp plataus lauko ir konfokalinio režimo...

Konfokalinis skenuojantis mikroskopas

Privalumai:

• Optiniai pjūviai z kryptimi;

Konfokalinis skenuojantis mikroskopasPrivalumai:

Kadangi šviesa surenkama tik iš židinio, konfokaliniamerežime gaunamas daug mažesnis triukšmas. Todėl galima lengvai stebėti net pavienes molekules.

8

Literatūra1. http://www.olympusmicro.com

2. http://www.microscopyu.com

(žiūrėta 2006.02.06)