- 6 -

Westphal e coll. e da ricerche successive. Per di pi~, in pa-

recchi ceppi di Citrobacter sono presenti, come è noto, anti-

geni Vi, come in s. typhi e s. paratyphi c.

CiO va detto per sottolineare ·l'importanza di tali ricer-

• che sulla struttura antigene e sui rapporti sierologici esi-

stenti fra i diversi generi, che offrono una base più uniforme

e forse più valida di confronto per valutare l'importanza epi-

demiologica di questo o quel genere.

In altre parole ed esemplificando, la stretta affinit~ sie-

rologica tra Salrnonella ed Arizona, in associazione con il comu-

ne carattere di patogenicit~, a dispetto delle diversit~ biechi-

miche, ha posto questo ultimo microrganismo in una luce partico-

lare ed ha stimolato le ricerche di questi ultimi anni sulla sua

frequenza in natura e sulla sua importanza come agente di sindro-

mi tossinfettive.

Alla luce di queste brevi considerazioni, l'importanza del-

le cosiddette prove biochimiche ed in particolare di quelle chia-

ve risulta ridimensiona-ta ed offre motivi di riflessione al ri-

cercatore ed al laboratorista.

Tornando al discorSo della classificazione,occorre spende­

re qualche parola sui criteri seguiti da Ewing nella elaborazio-

ne del suo schema di classificazione delle Salmonelle.

1.2_- Classificazione sierolo~ica di Ewing

Ispirandosi a proposte di precedenti Autori e concordando

sulla necessit~ di riduzione del numero delle cosiddette specie

di Salmonella, fin dal 1963 tale autore ha proposto l'accetta-

- 7 -

zione di tre specie soltanto biochimicamente definite, ~

cholerae-suis, s. typhi e s. enteritidis e di considerare

tutte le altre· come sierotipi o biotipi nell'ambito della

S. enteritidis. Di conseguenza la S. paratyphi A, ad es. do-

vrebbe essere indicata come S. enteritidis sierotipo paraty-

phi A.

Questa proposta ha suscitato diverse perplessità, soprat-

tutto per la difficoltà di cancellare denominazioni ormai con-

solidate da anni di esperienza e di abitudine.

Essa non è stata accettata dalla Associazione dei Batterio-

logi americani, che nell'VIII edizione del Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology prospettano una classificazione sie-

rologica di tipo tradizionale con la importante novit~ di inse­)

rire tutti i sierotipi di Arizona nel genere Salmonella come

sierotipi di Salmonella arizonae, previa conversione dei rela-

tivi antigeni nei corrispondenti antigeni saLmonellari.

TECNICHE GENERALI DI RICERCA, ISOLAMENTO

E DIAGNOSI DELLE SALMONELLE

Verranno descritte· le tecniche riguardanti il campiona-

mento, il prelievo, il trasporto e gli accertamenti batteriolo-

gici e sierologici dei seguenti quattro gruppi di materiali: san-

gue (ed altri liquidi organici), feci, acque ed alimenti.

Le modalità di prelievo e trasporto saranno indicate spe­

cificamente per ciascuna categoria di materiali, mentre per il

campionamento verranno fatte considerazioni di carattere genera­

le; analogamente, per quanto riguarda le tecniche batteriologi-

- 8 -

che e sierologiche di diagnosi esse verranno esposte in ap­

pendice agli alimenti, dopo la descrizione delle tecniche pi~

generali di ricerca ed isolamento.

2. CRITERI DI CAMPIONAMENTO

Le considerazioni che verranno fatte in questa sede a

proposito dei criteri di campionamento vogliono essere di na­

tura molto pratica per venire incontro alle esigenze ed ai pro­

blemi che si possono presentare all'analista o all'ispettore

chiamato ad effettuare un prelievo per motivi fiscali o igie­

nico-sanitari.

Restano quindi escluse tutte quelle considerazioni di or­

dine teorico che sono alla base dell'esecuzione pratica di qua­

lunque campionamento e che possono essere reperite in tes~i spe­

cializzati di statistica.

Anche le problematiche che sono alla base di ricerche di

mercato, di indagini a largo raggio su prodotti alimentari,

di ricerche a carattere igienico-sanitario programmate, esula­

no dai nostri intendimenti pratici.

Le nostre considerazioni riguarderanno in pratica soltanto

il campionamento di prodotti alimentari, nei casi in cui l'impor­

tanza dell'episodio richieda l'intervento di un laboratorista­

ispettore per eseguire gli opportuni prelievi.

In concreto, se ci si trova di fronte ad es. ad una parti­

ta di 2000 scatolette di conserve o semiconserve di carne so­

spetta di aver dato origine ad un epiaoàio di tossinfezione

- 9 -

alimentare da Salmonella, come ci si deve comportare?

Come criterio generale, in questo ed in altri casi, oc­

corre che il campione prelevato (inteso come numero di pezzi)

sia rappresentatiVo dell'intera partita. Per realizzare ciO,

la partita deve essere sufficientemente omogenea ed il campio­

namento deve essere di tipo casuale per far sl che ogni possi­

bile campione abbia la stessa probabilitl di venire seleziona­

to dalla partita.

Il numero di prelievi da effettuare e le modalitl da se­

guire variano chiaramente in funzione della consistenza nume­

rica della partita, delle dimensioni dei singoli campioni, del

loro stato fisico, etc ••..

Dopo aver precisato che per campionamento intendiamo soltan­

to la valutazione quantitativa del numero di prelievi da effet­

tuare, mentre le modalità di esecuzione pratica rientrano chia­

ramente nell'operazione di prelievo e sono state già accennate

a proposito della trattazione di quest'ultimo, in linea molto

generale potrebbe essere sufficiente prelevare un numero di con­

fezioni o porzioni di esse pari alla radice quadrata del numero

totale di confezioni che costituiscono l'intera partita e co­

munque non meno di 2-3. Questo è chiaramente un criterio molto

generale, semplicemente orientativo. Di fatto esistono della ta­

belle che indicano l'entità del prelievo da effettuare in rela­

zione alla consistenza numerica della partita ed altre tabelle

che, utilizzando tali valori, diagrammati con livelli variabili

di aualità accettabile (Acceptance_Quality Level-AQL), cioè di

- 1 o -

valori percentuali minimi di unità difettose accettabili sulla

intera partita, forniscono i limiti di accettazione e di rifiuto

per la partita stessa.

I valori di AQL vengono definiti preliminarmente a secon­

da del rigore o grado di sicurezza igienica che si vuole dare

all 1 analisi, ed in pa~ticolare sono correlati con la presenza

di difetti critici (presenza di microrganismi patogeni), difet­

t* maggiori (che possono determinare danni organolettici al pro­

dotto - es. germi test di contaminazione fecale presenti al di­

sopra dei limiti standard previsti o consigliati) e difetti

minori.

A tito.lo di esempio ed orientativo, riportiamo due tabel­

le dello Standard Militare Americano riferite in un lavoro di

Ribeiro (4).

Tabella 1

Entit& del campionamento in funzione delle dimensioni della par­

tita.

Dimensioni della partita enti t~ del campionamento

da 2 a 8 pezzi 2 •• 9 " 15 " 2

" 16 " 25 " 3

" 26 " 50 " 5

" 51 " 90 " 5

" 91 " 150 •• 8

" 151 " 280 " 13

" 281 " 500 " 20

" 501 " 1200 " 32

" 1201 " 3200 " 50

" 3201 " 10000 " 80

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•

- 12 -

Nel presente contesto puO essere sufficiente fermare qui

il discorso sui criteri di campionamento; tuttavia va ancora

detto, a completamento, che i livelli di qualitA accettabile,

in presenza di difetti critici quali la presenza di Salmonelle

in un prodotto alimentare, debbono essere molto bassi, se non

prossimi a zero. Di conseguenza i limiti di accettazione e di

rifiuto risultanti saranno molto ristretti, come risulta dal­

la tabella 2.

3. TECNICHE PER IL SANGUE

Prelevare il sangue in quantità opportuna dalla piega del.

gomito, se si tratta di soggetti umani, e dalla giugulare, se

si tratta di animali. Il prelievo fa fatto con le tecniche ben

note, facendo uso di venule sottovuoto, con o senza anticoagu­

lante. Nel primo caso si ottiene sangue in toto, non coagulato,

che può essere utilizzato per emocoltura; nel secondo caso si

ottiene sangue coagulato che, fatto ·sierare, puO servire per

sierodiagnosi e per la ricerca di salmonelle d~l coagulo.

E' opportuno prelevare il sangue nella fase di maggior bat­

teremia, cui corrisponde di regola un rialzo febbrile, in ogni

caso nei primi giorni di malattia, pr~a che aumenti il livel­

lo anticorpale. Sarebbe anche preferibile sospendere un even­

tuale trattamento con antibiotici o sulfamidici prima del pre­

lievo, qualora ciO non fosse possibile, è necessario seminare

il sangue in una quantit& maggiore di brodo per diluire il bat­

teriostatico presente, oppure neutralizzare opportunamente gli

- 13 -

antibiotici o i sulfamidici presenti con l'aggiunta di penicil­

linasi per la penicillina e di PABA per sulfamidici.

Quando il laboratorio ~ distante dal luogo del prelievo,

si racco<.Jlie il sangue in una provetta contenente 11 liquoid 11

(disulfonato sadico di anetolo polimerizzato) nella quantità di

2 ml di una sol. 1% per 10 ml di sangue.

Se il soggetto non è stato trattato con chemioterapici, se­

minare a~eno 10 ml di sangue non coagulato in beute contenenti

un buon brodo nutritivo del tipo infuso cuore-cervello (B.H.) o

brodo tryptose (100 ml) o meglio, far sedimentare o centrifuga­

re e seminare la sola parte ·corpuscolata. La semina pua essere·

fatta anche in bottiglie di Roux da 250 ml contenenti 50 ml di

agar tryptose disteso, ricoperto da 70 ml di brodo. Quest'ulti­

ma tecnica (di Casta~eda, modificata) consente di effettuare di­

rettamente nel terreno di semina una subcoltura, in quanto pe­

riodicamente si inclina la Roux per bagnare la superficie dello

agar ed ottenere cosl colonie isolate su questo terreno. Una

ter~a possibilità è offerta dalla semina del coagulo in terreno

di prearricchimento per salmonelle, con successivo arricchimen­

to ed isolamento, come indicato nelle metodiche di analisi.

Se il soggetto si trova sotto terapia antibiotica, semina­

re 10 ml di sangue in beute contenenti 100 ml di brodo con 0,05

g di acido paraaminobenzoico/1 o una quantità opportuna di peni­

cillinasi; un criterio migliore, come già detto, è quello di di­

luire il sangue in una quantità maggiore di brodo. A tal fine si

usano bottiglie di Roux da 1000 ml contenenti 150 ml di agar di-

- 14 -

steso e 300 ml di brodo. La semina si effettua nel terreno li-

quido, si pone la bottiglia di Roux in posizione verticale, a

37•c, inclinandola ogni 24 h allo scopo di bagnare la superfi­

cie dell'agar (5). Si ottengono cosl colonie isolate in Subcol-

tura, le quali possono essere direttamente sottoposte alle pro-

ve di identificazione biochimica e sierologica, come indicato

successivamente nelle metodiche di analisi.

Per altri liquidi organici {urina, bile, essudati interni,

liquido cefalo-rachidiano, sputo, etc ••• ) e materiali bioptici

ed autoptici, eseguire una semina diretta su terreni poco selet-

-tivi (Mc Conkey agar (M.C.), Erm agar, etc . •. _r·e su terreni al-

tamente sel~ttivi (SS agar, Bismuth sulphite agar (B.S.), BGA,

agar desossicolato citrato (DCC)), nonchè una semina di arric-

chirnento (vedi oltre). Per essudati purulenti, sputo e liquido

cefalo-rachidiano è sufficiente la semina diretta.

In particolare per l'urina, centrifugare e seminare il se-

dLmento direttamente sui terreni sopra indicati e contemporanea-

mente 2-3 ml in terreno di arricchimento in provetta. Se la flora

è molto scarsa, eseguire un arricchimento con membrane filtranti

(vedi acque) (6).

- 15 -

4. TECNICHE PER LE FECI

La coprocoltura si può eseguire su tamponi rettali o,

preferibilmente, su campioni di -feci recenti raccolte in va­

setti di vetro a bocca larga.

Se i campioni di feci non possono pervenire rapidamente

in laboratorio, è consigliabile l'uso di terreni di trasporto

tra i quali indichiamo il terreno SP di Hajna ed il terreno di

Amies.

Il prLmo di questi (7) viene distribuito in quantità di

10 rnl in piccoli flaconi da 50 ml con tappo a vite e seminato

a parti uguali con le feci.

Il terreno di Amies (8) viene distribuito in piccoli con­

tainers con tappo à vite in quantità di 6 ml e seminato analo­

gamente con un ugual volume di feci. Possono essere usati anche

tamponi trattati con il terreno ed essiccati (2) •

Una volta che il campione sia pervenuto in laboratorio,

eseguire la semina contemporaneamente su terreni di arricchi­

mento (particolarmente necessaria nella ricerca dei portatori

nei quali i germi pos~ono essere presenti in piccolo numero)

e su terreni di isolamento.

Terreni di arricchimento consigliati sono il brodo seleni­

to (S) ed il brodo selenito-verde brillante (SBG) Difco per la

S. typhi ed il terreno di Muller-Kauffmann (~1-K) Oxoid per i

paratifi. Sospendere 5 g di feci in 100 ml di terreno di arric­

chimento; se il campione è perve~uto in terreno di trasporto se­

minare 10 ml della sospensione in 100 ml di terreno; se è stato

- 16 -

eseguito 11 prelievo mediante tampone rettale, la semina si ef­

fettua ~ergendo il tampone nel terreno di arricchimento (10

ml in provetta). Dopo 15-18 h di incubazione a 43°C seminare

~u piastre di isolamento con ansa (vedi metodiche di analisi) •

Come terreni di isolamento si consigliano agar al solfito di bi­

smuto (BS), agar desossicolato citrato (DCC) e agar al verde bril­

lante (BGA) •

5. TECNICHE PER LE ACQUE

I campioni da esaminare vengono raccolti in bottiglie ste­

ril~ con tappo smeriglio, osservando le normali regole di asep­

si. Il trasporto deve essere effettuato in cassette refrigerate

ed il campione deve essere seminato entro 12 h dal prelievo.

Data la grande dispersione delle salmonelle nel mezzo i­

drico, è fondamentale analizzare il maggior volume possibile del­

l'acqua in esame.

A tale scopo vienP. usata quasi universalmente la tecnica

delle membrane filtranti che consiste nel filtrare grandi volu­

mi di acqua attraverso una membrana della porosità di 0,45 mi­

cron (Millipore, Gelman). La membrana viene poi seminata in un

terreno di arricchimento; questo metodo viene usato particolar­

mente per acque di pozzo o di acquedotto. In caso di acque torbi­

de è consigliabile adottare un prefiltro di lana di vetro per

evitare il rapido intasamento della membrana.

L'unità di filtrazione consiste di un imbuto fissato con

sistema meccanico ad un supporto portafiltro su cui si colloca

- 17 -

la membrana filtrante al momento della filtrazione. Si collega

l'apparecchio ad un sistema aspirante (pompa ad acqua od elet­

trica) tramite una beuta e si fa il vuoto. Le membrane filtran­

ti, del diametro di 47 mm, si sterilizzano in pacchetti a 121•c

per 15'. Si consiglia di immergerle in acqua distillata sterile

prima dell'uso per evitare che si rompano sotto la pressione di

filtrazione. Le quantitl di acqua da filtrare variano da 200 ml

a 2 litri a seconda del grado di contaminazione. Avvenuta la fil­

trazione si consiglia di lavare la membrana facendo passare

20-30 ml di acqua sterile (9, 10, 11).

L'arricchimento viene fatto in brodo selenito e in brodo

Muller-Kauffmann Oxoid, incubando il primo a 37•c per 24 h ed il

secondo a 43°C per 24 h. Dai terreni di arricchimento si eseguo­

no isolamenti su agar SS o agar desossicolato-citrato e su BGA

o terreno di Wilson-Blair (vedi metodiche di analisi} •

Per la identificazione biochimica e sierologica delle co­

lonie iSolate vedi ugualmente il capitolo ''metodiche di analisi". •

- 18 -

6, TECNICHE PER GLI ALIMENTI

Sotto tale voce vengono raggruppati i seguenti prodotti:

Farine e derivati (paste alimentari, pane), prodotti ortofrut­

ticoli (in particolare verdure), carni di animali, prodotti

ittici (pesci e molluschi), mangimi per animali (farine di car-

ne, d'ossa e di pesce), latte (fresco, condensato, essiccato),

burro, creme-gelato, formaggi, uova e prodotti delle uova.

6.1. Modalit~ di prelievo (considerazioni generali)

Il materiale in confezione originale non richiede nes­

suna particolare modalità di prelievo, purchè la cOnfezione

sia di pic~ola taglia. Nel caso di prodotti sfusi o contenuti

in confezioni originali superiori a kg 2, i prelievi verranno

eseguiti secondo le note norme di asepsi, avendo l'avvertimen-

to di non modificare lo stato fisico del prodotto. Per grosse

confezioni, i prelievi verranno eseguiti in pift punti, preva-

lentamente in superficie, con i criteri dettati dall'esperien-

za specifica.

6.2. Modalit~ di trasporto (considerazioni generali)

Per prodotti dichiarati sterili e per quelli disidrata-

ti lasciare i campioni a temperatura ambiente fino al momento

dell'analisi.

Per prodotti surgelati-congelati, mantenere i campioni a

- 20°C fino. al momento dell'analisi.

Per tutti gli altri prodotti, mantenere i campioni al-

la temperatura di +4°C ed eseguire l'analisi entro 6-12 h;

- 19 -

ave ciO non risulti possibile, congelare il campione a -20 C

ed eseguire l'analisi entro 20 gg dal prelievo.

6.3. Modalità di prelievo e trasporto e preparazione dello

inoculo (Riferite ai singoli prodotti)

6.3.1. Farine e semole

Prelevare, quando possibile, la confezione originale.

In caso di sacchi, effettuare prelievi in piQ punti con la

tecnica del sacchetto rovesciato (1) o con altre tecniche

di asepsi e conservare a temperatura ambiente fino al mo-

mento dell'analisi.

Pesare un'aliquota di almeno 50 g in beuta sterile e

seminare in almeno 250 ml di terreno di prearricchimento (ve­ì

di metodiche di analisi) .

6.3.2. Paste alimentari

Prelevare la confezione originale e conservarla a tem-

peratura ambiente fino al momento dell'analisi.

Pesare in mixer un'aliquota di almeno 25 g del campio-

ne, aggiungendo sol. fisiologica peptonata nel rapporto di

1:5 e lasciando macerare a +4°C per 2 h. Quindi omogenizza-

re la sospensione e seminare in ugual volume di terreno di

prearricchimento a doppia concentrazione {2X) •

{1) Consiste nell 1 introdurre nella massa dello sfarinato un

sacchetto di plastica calzato sul pugno ch~uso e nel ro-

vesciarlo in maniera da prelevare una certa quantita'di

materiale.

- 20 -

6.3.3. Verdure

Risciacquare 100 g del campione con 200 ml di sol. fisio­

logica, lasciando riposare per 30', e ricercare le Salrnonelle

nell'acqua di lavaggio secondo le modalità indicate per le

acque (vedi).

6.3.4. Carni di animali fresche, refrigerate: congelate,

tritate.

In presenza di grandi masse muscolari, è opportuno ef­

fettuare un doppio prelievo, in superficie ed in profondità,

cercando di ridurre al minimo i danni alla carcassa; 1 campio­

ni prelevati, di circa 100-200 g, posti in contenitori, debbo­

no giungere al laboratorio in cassette refrigerate e, se trat­

tasi di carni congelate, queste devono pervenire in tale sta­

to al laboratorio ed essere successivamente scongelate a +4°C.

Tagliare con forbici sterili almeno 25 g di materiale,

omogenizzare in mixer con sol. fisiologica peptonata nel rap­

porto di 1:5, lasciar riposare l'omogenato per 15', quindi se­

minare in ugual volume di terreno di prearricchimento 2X.

6.3.5. Organi di animali

In piccoli animali gli organi vengono prelevati interi

rispettando le tecniche autoptiche, quindi posti in flaconi

a bocca larga ed inviati al laboratorio refrigerati o conge­

lati. Se si tratta di grossi animali, si prelever~ una parte

dell'organo con ferri sterili e si porr~ in flaconi a bocca

larga.

La preparazione dell'inoculo viene fatta come per le car­

ni, seminando l'omogenato in ugual volume di terreno di pre-

- 21 -

arricchimento 2X. Se gli organi in esame sono in incipiente

o avanzato stato di putrefazione, si eviterà l'omogenizzazio­

ne e la semina in terreno di prearricchimento, sospendendo di­

rettamente il campione nel terreno di arricchimento, dopo a­

verlo accuratamente sminuzzato in mortaio, veicolandolo se

necessario con pochi ml di sol. fisiologica.

6.3.6. Prodotti di salumeria

Valgono per essi 1 criteri indicati per le carni e per i

prodotti solidi in generale.

6.3.7. Pesci e molluschi

Le alterazioni del pesce sono dovute prevalentemente al- ·

lo sviluppo di microrganismi sulla superficie della pelle, men­

tre le masse muscolari sono interessate solo tardivamente. Una

eventuale ricerca di Salmonelle in tali animali può essere con­

dotta quindi prelevando ampie zone cutanee ed omoqenizzando in

mixer con sol. fisiologica o acqua distillata nel rapporto di

1:5 e seminando la sospensione in ugual volume di terreno di

prearricchimento 2X.

6.3.8. Mang~i per anLmali

Valgono per essi i criteri indicati per le farine. Tutta­

via, se il materiale è scarsamente disperdibile in mezzo acquo­

so, è opportuno sospendere 50 g del prodotto in sol. fisiologi­

ca peptonata (250 ml) ed agitare su shaker per 30'; quindi far

riposare per 1 h e seminare il sopranatante in ugual volume

di terreno di prearricchimento 2X.

- 22 -

6.3.9. Latte (fresco, condensato, in polvere}

Prelevare, se possibile, confezioni originali. Per il

latte non pastorizzato in bidoni, effettuare i prelievi con

apposite bottiglie sterili ed inviare al laboratorio in gior­

' nata in cassette refrigerate.

Seminare direttamente il campione nel terreno di arric­

chimento nel rapporto di 1:10. Il latte in polvere può esse­

re rigenerato secondo le indicazioni della Ditta produttri-

ce e seminato allo stato liquido oppure seminato come tale nel

rapporto di 1:10 (10-20 g).

6.3.10. Burro

Prelevare confezioni originali. Versare 250 g di prodotto

in un recipiente sterile ed aggiungere 10-20 g di sol. tampo­

ne sec. Sorensen a pH 8. Scaldare a 42-44°C fino a fusione, a­

gitare per 10', lasciar riposare per separare la ~ase acquosa,

quindi seminare 50 ml di quest'ultima in terreno di prearric­

chimento 2X a parti uguali.

6.3.11~ Creme-gelato

Prelevare ed inviare in laboratorio confezioni origina­

li allo stato congelato. Far scongelare e seminare 50 ml in u­

gual volume di terreno di prearricchirnento 2X.

6.3.12. Formassi

Prelevare confezioni originali di piccola pezzatura in in­

volucri plaStici. Nel caso di grosse forme, effettuare prelie­

vi in-asepsi mediante attrezzi sterili. omogenizzare a caldo

- 23 -

in mixer 25 g del campione con sol. fisiologica nel rappor­

to di 1:5 e seminare in ugual volume di terreno di prearric­

chimento 2X.

6.3.13. uova e prodotti delle uova

a) Le uova intere in guscio debbono essere lavate con acqua

calda saponata, aiutandosi con una spazzola a setole dure,

quindi risciacquate in acqua corrente. Immergere ciascun uovo

in alcool per 10', lasciar asciugare; quindi delimitare la ca­

mera d'aria, flambare ed asportare il guscio senza ledere la

membrana testacea; capovolgere su un becker e praticare con

ago sterile un foro sul fondo dell'uovo per far defluire il

contenuto dell'uovo stesso dopo aver rotto la membrana testa­

cea. Il contenuto dell'uovo può anche essere aspirato con pi­

petta piuttosto grossa.

Dopo aver omogenizzato tuorlo e albume, prelevare alme­

no 25 g di materiale e seminarli nel rapporto di 1:10 nel ter­

reno di prearricchimento.

b) Per le uova congela~e intere o a tuorlo e albume separati,

in lattine, effettuare un prelievo sul prodotto congelato ser­

vendosi di una sonda munita di fresa. La "carota'' estratta de­

ve avere un peso di almeno 50 grammi. Seminare 25 g nel terre­

no di prearricchimento (1:10).

c) Per le uova essiccate e cristallizzate, pesare un'aliquota

di almeno 20 g in beuta sterile, quindi seminare direttamente

in terreno di prearricchimento nel rapporto di 1:10 o, m~glio,

sciogliere il campione in sol. fisiologica peptonata nel rap-

- 24 -

porto di 1:5, agitando per 30' su shaker, quindi seminare la

soluzione in ugual volume di terreno di prearricchimento 2X

( 1 O O m l) •

' 6.4. Metodiche di analisi (per feci ed alimenti}

Tali metodiche, messe a punto e standardizzate in ambito

CEE da un gruppo di lavoro di 12 Paesi europei fra il 1968 e

il 1974, (12, 13, 14) si articolano nei seguenti punti: prear­

ricchimento, arricchimento, isolamento, identificazione biochi­

mica e sierologica.

con qualche variante esse sono riportate anche dalla

A.O.A.C. (Assoc!ation of Official Analitica! Chernists) negli

"Official Methods" XII Ed. 1975 cui rimandiamo per un maggior

approfondimento (15).

6.4.1. Prearricchimento

L'inoculo, preparato secondo le modalità indicate ai para-

grafi precedenti, viene seminato nel rapporto di 1:10 in acqua

peptonata tamponata (B.P.W.) semplice o a doppia concentrazio­

ne, a seconda dei casi. Incubare a 37°C per 18-24 h, quindi

effettuare l'arricchimento.

6.4.2. Arricchimento

Con pipetta trasferire 10 ml di brodocoltura in 100 ml di

terreno di Muller-Kauffmann (M.K.), integrato poco prima dell'u-

so con 1 ml di sol. acq. 0,1% di verde brillante e 1,9 ml di sol.

iodoiodurata per 100 ml di terreno in beuta (vedi appendice).

Incubare a 43°C per 15-18 h dopo aver scaldato le beute

- 25 - '

appena seminate in bagnomaria a 45°C per 15'. Questo tratta­

mento termico ha lo scopo di portare r~pidamente la temperatu­

ra della beuta prossima a quella di incubazione, evitando o

lLmitando lo sviluppo di germi contaminanti (protei, colifor­

mi, Pseudamonas} nelle prime ore di incubazione.

6.4.3. Isolamento

Effettuare una prima subcoltura su piastra a 24 h ed una

seconda dopo 48 h di incubazione. Usare preferibilmente pia­

stre di 14 cm di diametro o 2 piastre di 10 cm per ogni isola­

mento; questo va effettuato con ansa di 3 mm piegata ad angolo,

scaricando dapprima l'ansa per un tratto di circa 3 cm e semi­

nando quindi con il margine dell'anello.

Il terreno di isolamento standard consigliato ~ il Bril­

liant green agar (BGA} Oxoid CM 329 le cui modalità di prepa­

razione sono indicate in appendice.

su questo terreno di color ocra le Salmonelle formano co­

lonie rigogliose, traslucide, con intenso alone di alcaliniz­

zazione rosso brillante. Le eventuali colonie di Protei svi­

luppatesi si presentano di regola pift gracili e con eguale vi­

raggio al rosso, spesso confluenti insieme per sciamatura, men­

tre i coliforrni lattosio positivi rapidi danno colonie rigo­

gliose con viraggio al giallo per acidificazione del lattosio.

La metodica appena descritta si applica alla ricerca e al­

l'isolamento dei cosiddetti paratifi mentre non si presta al­

l'isolamento di S. typhi. Per quest'ultima si consiglia un ar­

ricchimento in brodo SBG Difco a 37~ e successivo isolamento

- 26 -

su BGA o meglio su Bismuth sulphite agar (B. S.). Su quest'ul­

timo terreno, come è noto, le colonie di Salmonella typhi

{anche S. paratyphi B e S. enteritidis) si presentano da gri­

gie a nere per riduzione del solfito a solfuro e con alone me-

'tallico. Altre salmonelle o protei possono formare colonie ver­

dastre senza alone metallico. La semina diretta non deve esse­

re eccessiva e la lettura deve essere eseguita entro 24-48 ore

perchè col tempo il terreno riduce la sua selettivita.

Come terreni opzionali, in aggiunta a quelli indicati più

sopra, si possono affiancare nella fase di arricchimento un

brodo selenito-cistìna (S.e.) e nella fase di isolamento un

agar desossicolato-citrato (D.C.C.).

In particolare per le uova, numerosi lavori in passato

hanno evidenziato l'opportunità di usare il brodo selenito­

cistina come terreno di arricchimento; tuttavia le ampie inda­

gini sulla standardizzazione delle tecniche di isolamento per

le Salmonelle in ambito CEE hanno mostrato che il terreno di

Muller-Kauffmann può sostituire con successo il brodo selenito­

cistina ed anche il brodo SBG.

6.4.4. Identificazione biochimica delle colonie sospette

Può essere suddivisa in tre fasi: 1) semina in terreni

differenziali (Kligler/LIA); 2) selezione delle colture sospette

ed esecuzione di prove biochimiche chiave; 3) esecuzione di pro­

ve biochimiche supplementari se necessario.

1) Semina in terreni differenziali.

Per l'isolamento in coltura pura e per un primo screening

- 27 -

delle colonie isolate in piastra, si consiglia la semina delle

colonie sospette su terreno di Kligler e/o su terreno di Ed­

wards e Fife alla lisina (Lysine-Iron-Agar= LIA).

Quest'ultimo consente di discriminare ~ ceppi di Salmonel­

la lisina positivi anche se lattosio +~

In questi ultimi anni il vecchio criterio discriminante

per le Salmonelle, basato sull'uso di terreni lattosati, è ap­

parso sempre più inadeguato di fronte all'isolamento sempre p~~

frequente di Salmonelle lattosio positive. Si è avvertita quindi

la necessità di una nuova chiave diagnostica e a tale- proposito

l'uso del terreno di Edwards e Fife (16) sembra appropriato.

Su questo terreno, preparato e seminato come il Kligler

(con butta e tranche) Salmonelle ed Arizona latto.sio positive

rapide sono gli unici gruppi di entero9atter1 che decarbossi.­

lano rapidamente la lisina e producono forti quantit·à di a 2s,

determinando per alcalinizzazione viraggio al violetto di tut­

to il terreno e annerimento. Solo eccezionalmente qualche ra­

ra coltura di Citrobacter può presentare una notevole attività

decarbossilante e forte produzione di a 2s.

Si rammenta che il terreno di Kligler, come i terreni

similari di Krumwiede, Russell e il TSI, è un terreno diffe­

renziale unico nel suo genere, preparato in modo da presentare

una parte di fondo, alta almeno 2,5 cm, detta butte ed una par­

te inclinata, corta, detta tranche. La butte si semin~ per in­

fissione, mentre la tranche si semina in superficie, con rigo

centrale o con zig-zag. Il terreno contiene glucosio (1 g/1}

- 28 -

e lattoaio (10 g/1}. La fermentazione del solo glucosio, pur

manifestandosi nelle prime ore in tutto il terreno con vi­

raggio al giallo del rosso fenolo, successivamente regredisce

in condizioni di aerobiosi, cioè hella tranche, permanendo sol­

tanto nella butte, ave prevalgono condizioni di anaerobiosi.

La fermentazione del lattosio, associat~ di regola a quella

del glucosio, determina invece viraggio completo di tutto il

terreno. Questo inoltre presenta un complesso di due sali ri­

velatore dell'idrogeno solforato mediante annerimento diffuso,

per formazione di solfuro ferroso, ed è in grado ancora di evi­

denziare la presenza di gas conseguente a fermentazione, a t tra-.

verso bolle o spaccature dell'agar.

Ai fini di una diagnosi differenziale su tale terreno

presentiamo la tabella 3 che mostra il comportamento su Kligler­

TSI dei diversi generi delle Enterobacteriaceae. La tabella 4

mostra invece il comportamento degli stessi generi sul terre-

no di Edwards e Fife pocanzi citato. Ai fini di una diagnosi

differenziale su quest'ultimo terreno, i Protei danno butte

gialla e tranche rossa, i Citrobacter danno butte gialla, tran­

che violetta e annerimento con produzione di gas, il gruppo

Escherichia, compreso Alcalescens-dis!•r, tranche violetta e

butte violetta o invariata a seconda della velocit~ di decar­

bossilazione della lisina, senza annerimento nè produzione di

gas, le Klebsielle danno viraggio al violetto in tutto il ter­

reno, senza annerimento e con produzione di gas irregolare, gli

Enterobacter aerogeni danno reazione alcalina senza annerimento

e con produzione irregolare di gas, le Hafnia si comportano co-

- 29 -

me gli Enterobacter aerogeni ma non producono di regola qas.

E 1 da tenere presente tuttavia che la Salmonella paratyphi A

è lisina negativa e quindi sfugge allo screening effettuato

su questo terreno,. nulla vieta nondimeno, qundo vi sia il so-

spetto di una febbre paratifoide, di affiancare al LIA terre-

ni differenziali pia tradizionali come ilKligler o il TSI.

Tabella n. 3

Reazioni delle Enterobacteriacee in Kligler-TSI

(da Ewing - mod. l

Generi e specie Butte Tranche Gas H2s

Escherichia A A + -Shigella A K - -s. typhi A K - +

Altre Salm. A K + +++

Arizona A K + +++

Citrobacter A K + +++

Edwardsiella A K + +++

Klebsiella A K ++ -Enterobacter A A ++ -E. hafniae A K + -Serratia A K o A - -Proteus vulg. A K + +++

P. mirci.bilis A K + +++

P. rnorganii A K - -P. rettgeri A K - -Providencia A K + o - -

Leggenda della tabella 3

A = reazione acida

K = reazione alcalina

- 30 -

* = reazione positiva = reazione negativa

N.B. Le reazioni in TSI differiscono di poco da quelle in

Kligler e sono dovute alla fermentazione del saccarosio in

aggiunta o in sostituzione del lattosio.

Tabella n. 4

Reazioni delle Enterobacteriaceae in Lysine Iran Agar (LIA)

(da Edwards - mod.)

Generi e specie Butte Tranche Gas H2S

Escherichia K o N K - o + -Shigella A K - -Salmone! la K o N K - +

s. typhi K K - + o -

s. paratyphi A A K + o - - o +

Arizona K o N K - l +

Citrobacter A K - o + + o -

Edwardsiella K K - o + +

Klebsiella K o N K o N + o - l -Enterobacter

cloacae A K o N +o - -aerogenes K o N K + -,

l hafniae K o N K - o + ' -

i i Serratia K o N K o N

, - -\ ' Proteus

vulgaris A R - -mirabilis A R - -morganii A K o R - -

l rettgeri A R - l -

Providencia A R - l -l

- 31 -

Leggenda della tabella 4

A = reazione acida + = K = reazione ?lcalina = N = reazione neutra (invariato)

R = colorazione rossa

reazione positiva

reazione negativa

Se l'isolamento è stato effettuato su agar desossicolato­

citrato si consiglia di prelevare le colonie incolori, con o

senza centro nero, (sospette Salrnonelle) e colonie rosse o ro­

sate con centro nero (sospette Arizona o Salmonelle lattosio

positive) e seminare su LIA.

Se vi è il sospetto di febbre tifoide o paratifoide e si

è eseguito l'isolamento su Wilson e Blair (Bismuth-sulphite

agar) si prelevano le colonie grigiastre o nere con alonernetal-

lico e si seminano su Kligler oLIA (meglio se su entr~i).

La semina contemporanea su questi due terreni può essere ese-

guita seminando dapprima la colonia per infissione in Kligler,

riprendendo quindi una traccia nel punto di infissione in Kli­

gler e seminando in LIA con una doppia infissione dell'ago nel-

lo stesso canale d'innesto.

Se l'isolamento è stato fatto su BGA si prelevano le colo­

~ie incolori con alone rosso brillante e alcune colonie gial­

le (purchè non mucose nè grasse) e si seminano su LIA.

2) Prove chiave

Le co}ture di 24 h su Kligler o LIA sospette vengono sot­

toposte a tre prove chiave fondamentali, prima di procedere ol­

tre nella loro caratterizzazione biochimica. Tali prove sono:

- 3Z -

ricerca dell'acido fenilpiruvico (APP), ricerca della beta­

galattosidasi e ricerca dell'ossidasi.

Ricerca dell'acido fenilpiruvico

Sospendere una buona ansata di agarcoltura di 24 h in

0,5 ml di sol. acq. 0,4% di l-fenilalanina ed incubare a 37•c

per 15'. Aggiungere 2 gocce del seguente reattivo:

Sol. acq. semisatura di allume ferrico

Solfato d'ammonio

Acido solforico 10%

ml 5

g 2

ml 1

In presenza di Protei (compreso il gruppo Providencia}

compare immediatamente una intensa colorazione verde bandie­

ra (17).

Ricerca della beta-galattosidasi

Sospendere una buona ansata di agarcoltura di 24 h in

0,25 ml di sol. fisiologica, quindi aggiungere 1 goccia di to­

luolo e lasciare qualche minuto a 37 4 C; quindi aggiungere 0,25

ml di reattivo ONPG (orto-nitrofenil-beta-galattopiranoside)

preparato sciogliendo 80 mg di tale reattivo in 15 ml di sol.

tampone (6,9 g di NaH2Po4 • H2o in 45 rnl di H2o, portando il pH

a 7 con circa 3 ml di NaOH concentrato e portando a 50 ml con

In presenza di ceppi beta-galattosidasi positivi si ha en­

tro qualche ora una colorazione gialla della sospensione dovu­

ta alla liberazione di nitrofenolo ad opera dell'enzima.

Ricerca dell'ossidasi

Pu~ essere fatta usando striscioline di carta 'l'l'hatman im-

- 33 -

bevute di una sol. acq. 1% di ossalato di p-arnino-dimetil­

anilina, essiccate e conservate in provettoni chiusi al buio

e a 4•c.

La prova si esegue strisciando su una cartina una trac­

cia di patina batterica; la reazione positiva è data dalla

comparsa quasi immediata di una colorazione bruno-violetta.

Gli enterobatteri sono tutti ossidasi negativi.

Nella maggior parte dei casi l'insieme di queste prove

chiave pu~ orientare sufficientemente verso la diagnosi di

Salmonella, a meno che non si tratti di sierotipi o biotipi

rari, al di fuori del subgenere 11

o di Arizona.

In questi casi è opportuno eseguire una serie di prove

biochimiche per caratterizzare meglio 1 ceppi in questione,

anche e soprattutto a fini epidemiologici.

Le prove, ben note, sono indicate e descritte succin­

tamente qui di seguito mentre i relativi terreni vengono in­

dicati in appendice.

3) Prove biochimiche per la diagnosi di genere

Fermentazione degli idrati di carbonio

Possono essere usati terreni liquidi o solidi; sono tut­

tavia preferibili i terreni liquidi.

Seminare con ago una traccia di patina batterica in

acqua peptonata con indicatore + zucchero {Phenol red broth)

ed incubare a 30°C per 1-10 gg. Per evitare !•essiccamento

del terreno usare provette con tappo a vite o di caucciU. ,

L 1 Utilizzazione dello zucchero si manifesta con acidifi-

- 34-

cazione e viraggio al giallo dell'indicatore, con o senza pro­

duzione di gas nella campanella di Durham. Per evidenziare se

l'acidificazione è dovuta ad ossidazione o ferment_azione, si

pu3 eseguire il test 0-F con il terreno di Hugh e Leifson.

a) Produzione di H2s

L'idrogeno sol!or~to si evidenzia nel terreno di Kligler,

nel terreno di Edwards e Fife (LIA), in agar SS, in acqua pep­

tonata con cartina all'acetato di piombo ed in terreno S.I.M.

Quest'ultimo viene seminato per infissione e serve anche per

accertare la mobilità e la produzione di indole. L'annerimen­

to intorno al canale di infissione o in tutto il terreno è in­

dice di positività.

b) Produzione di indole

Seminare un'acqua peptonata ricca in triptofano ed incu­

bare almeno 48 h a 30°C. Aggiungere quindi alla coltura il reat­

tivo di Ehrlich-Kovacs cosl costituito:

p-dimetilarnìnobenzaldeide

alcool arnìlìco

acido cloridrico eone.

g 5

ml 75

ml 25

Sciogliere a caldo ed usare dopo qualche giorno.

c) Produzione di acetil-metil-carbinolo

.Seminare il brodo MR-VP ed incubare a 30°C per almeno

48 h. Ad 1 ml della coltura aggiungere quindi 0,6 ml di sol.

alcoolica di alfa-naftolo 5% (Barritt A) e 0,2 rnl di sol. acq.

di KOH 40% (Barritt B1; agitare energicamente per qualche mi­

nuto •. La reazione positiva è data dalla comparsa di una colora-

- 35 -

zione rosso magenta.

d) Reazione del rosso metile

Di regola i ceppi produttori di acetil-metil-carbinolo

mantengono il pH intorno a 5, 8-6 nel terreno MR-VP, mentre

i non produttori lo abbassano notevolmente per fermentazione

del glucosio; tale comportamento è messo in evidenza dalla

aggiunta alla coltura di 1-2 gocce di sol. alcoolica di ros­

so rnetile, che a pH 4-4,5 vira al rosso mentre a pH superiori

è giallo.

e) Utilizzazione del citrato

Seminare con rigo centrale il terreno di Simmons avendo

cura di non trasportare tracce di agar. Incubare a 30°C per

1-10 gg. La reazione positiva si manifesta con crescita ed

intenso viraggio dell'indicatore al bleu oltremare.

f) Idrolisi dell'urea

Seminare il terreno di Stuart liquido con una buona an­

sata di agar-coltura ed incubare a 30§C per alcune ore; la

reazione positiva si manifesta con un viraggio dell'indicato­

re al rosso-viola per·alcalinizzazione.

g) !>1etabolismo degli aminoacidi (sec. Moeller)

Seminare i terreni di Moeller contenenti lisina, argi­

nina ed ornitina ed incubare a 30°C per 4 gg, sostituendo

il tappo di cotone con tappo di caucciU.

La decarbossilazione della lisina e della ornitina e

la presenza di deidrolasi per l'arginina si manifestano con

alcalinizzazione del terreno ed intensificazione del colore

- 36 -

violetto, mentre una reazione negativa determina viraggio

al giallo dell'indicatore.

h) Idrolisi della gelatina

Si possono usare brodi contenenti 15-20% di gelatina se­

minati per infìssione ed incubati a 22°C oppure dischi di

gelatina di Kohn contenenti carbone animale. L'idrolisi de­

termina in questi ultimi l'annerimento del terreno per li­

berazione del carbone.

i) Utilizzazione del malonato

Seminare brodo malonato con una buona ansata di agar­

coltura ed incubare a 30°C per 24 h; la reazione positiva è

data da un intenso viraggio dell'indicatore al bleu .oltrema-

re.

l) Riduzione del nitrato

Seminare in agar nitrato in superficie ed incubare a

30°C per 24 h. Versare quindi sulla superficie dell'agar al­

cune gocce di reattivo A e B di Griess cosl costituito:

A) acido solfanilico

acido acetico N/5

B) alfa naftilammina

acido acetico N/5

g B

ml 1000

g 5

ml 1000

La reazione positiva è data dalla comparsa di una in­

tensa colorazione rosso sangue.

In caso di reazione negativa è opportuno tuttavia ag­

giungere della polvere di zinco; se si ha colorazione ros­

sa, ci~ significa che il nitrato non è stato in precedenza

- 37 -

ridotto e quindi si conferma la reazione negativa; se non si

ha colorazione rossa, ciO significa che l'apparente negativi­

t~ della prova era dovuta a completa riduzione del nitrito ad

ammoniaca.

m) Utilizzazione degli acidi organici (tartrato e rnucato)

Seminare il terreno di Kauffmann e Peterson (vedi appen­

dice) con un'ansata di brodocoltura ed incubare a 30°C per

24 h; aggiungere quindi 0,5 ml di sol. al 50% di acetato di

piombo al terreno contenente tartrato (unitamente ad un con­

trollo) e valutare il volume di precipitato formatosi rispet­

to al controllo. L'utilizzazione del tartrato sadico-potassi-·

co si evidenzia con una riduzione del precipitato rispetto al

controllo, mentre l'utilizzazione del mucato sadico si eviden­

zia con una reazione acida del terreno e conseguente viraggio

dell'indicatore (18}.

Per un maggiore approfondimento di queste prove vedi

(19) e (20).

Le prove biochimiche ora descritte si realizzano general­

mente in provetta e rappresentano prove metaboliche conseguen­

ti a coltura del microrganismo, fatta eccezione per beta- ga­

lattosidasi, APP ed ureasi, che si eseguono con "resting cells"

cioè con cellule non proliferanti nel mestruo.

In questi ultimi anni sono state messe a punto e realizza­

te in misura sempre maggiore prove di questo tipo, indicate ge­

nericamente come "micrometodi" per i quali si rimanda il letto­

re a testi specializzati. Tuttavia riteniamo utile accennare

ad un'altra categoria di prove, di tipo colturale, ma minia­

turizzate, che si sono sufficientemente affermate, malgrado

- 38 -

11 loro costo relativamente alto; ci riferiamo al sistema

di prove "API' che sostituisce egregiamente il set di prove

biochimiche tradizionali con risparmio di tempo e di mano­

dopera.

Ai fini della identificazione biochimica concreta ri'­

teniamo utile prospettare le caratteristiche biochimiche tipi­

che per 11 genere Salmonella e Arizona onde consentire al la­

boratorista pratico di emettere una diagnosi presuntiva di

genere (ta.b. 6 -7)

Si premette che, secondo Kauffrnann, il genere Salmonella

deve essere suddiviso in quattro subgeneri che si differenzia­

no biochimicamente come da prospetto (vedi tabella 5).

- 39 -

Tabella 5

Subgeneri di Salrnonella sec. Kauffmann

Caratteri biochimici I II III IV

Dulcitolo + + - -Lattosio - - + o x -Beta-galattosidasi - x + -d-tartrato + - - -Mucato + + v -Malonato - + + -

Gelatina - (+) (+) (+)

KCN - l - - (+)

---'-----·-···.L .. --

Leggenda della tabella 5

+ = reazione positiva

= reazione negativa

x = reazione irregolarmente positiva

v = variabile

(+) = reazione positiva ritardata (dopo 3 gg)

- 40 -

Tabella 6

Caratteri Biochimici del genere Salmonella (con esclusione del

III subgenere e percentuale di positivitl in parentesi)

Gas in glucosio: + (tranne S. pullorum, s. qallinarum e s. typhi). (91,7).

Mobilità: + (tranne s. pullorum e s. gallinarum) .{94,6).

Mannitolo: + (99,7)

Dulcitolo: v {negativi s. typhi, s. cholerae-suis, s. pa­

ratyphi A e s. pullorum). (86,5); (+) (2, 7)

Adonitolo; - (0)

Inositolo: v (34 ,5)' ( +) (o' 8)

Sorbito lo: + (94,1)' ( +) ( 4)

Lattosio~ - (0,8)

Saccarosio: - (o' 5)

Arabinosio: + (89,2)' ( +) (0,8)

Raffinosio: - (3)

Ramnosio: + (90,3); {+) (1 ,1)

Salicina: - (0,8)

Indole: - (1,1)

H2s: + (tranne s. paratyphi A, S. clolerae-suis var. dif.,

S. typhi-suis, S. sendai, s. berta e rari al­

tri ceppi). (91 ,6); (+) (0,8)

Citrato: v (tranne s. typhi e rari altri ceppi). (80,1); (+) (7)

L1sina decarbossilasi: + (tranne 5. paratyphi A) (94, 6)

Ornitina decarbossilasi: + (tranne s. typhi e s. gallinarurn)

(92,7)

Arginina deidrolasi: v (58,S)j (+) (34)

Nitrato reduttasi: + (100)

Gelatinasi: -;(+) (1,1)

Beta galattosidasi: - (2)

ureasi: - (0)

Fenilalanina dearninasi: - (O)

segue tabella 6

- 41 -

KCN: - (0,3)

Rosso metile: + {100)

Acetil-metil-carbinolo: - (0)

Malonato: - (0,5)

D-tartrato: + (83,5);(-t) (6)

Mucato: -t(81,5); (+) (1,5)

Leggenda della tabella 6

+ = reazione positiva

= reazione negativa

v = variabile

(+) = positività ritardata (dopo 3 gg)

- 42 -

Tabella 7

Caratteri biochimici del genere Arizona (Salmone!la subge­

nere III con% di posi~ivtta in parentesi).

Gas in glucosio: + (99,3}

Mobilità: + (100)

Mannitolo: + (100).

Dulcitolo: - (0)

Adonitolo: - (0)

lnositolo: - (0)

Sorbitolo: + (97); (+) (2)

I,attosio: v (61,3); (+) (16,7)

Saccarosio: - (4,7)

Arabinosio: + (98); (+) (1)

Raffinosio: - (5); (+) (1)

Ramnosio: + (93) (+) (5)

Salicina: - (4,7); (+) (3,3)

Indolo: - (2)

H2

S: + (98,7)

Citrato: + (98,7); (+) 11,3)

Lisina decarbossilasi: + (100)

Ornitina decarbossilasi: + (100)

Arginina deidrolasi: (+) (84,6); + (12,7)

Nitrato reduttasi: + (100)

Gelatinasi: (+) (92); ·+ (4)

Beta galattosidasi: + (99)

Ureasi: - (0)

Fenilalanina deaminasi: - (O)

KCN: - (8,7)

Rosso metile: + (100)

Acetil-metil-carbinolo: - (0)

Malonato: + (92,6); (+) (0,7)

D-tartrato: -i(+)(·~~)

Mucato: v (56,6); (+) (2,'f)

Leggenda tabella 7

+ = reazione positiva

- reazione negativa

v = variabile

- 43 -

(+) = reazione positiva ritardata (dopo 3 gg)

E' opportuno precisare a questo punto che le Arizona, se­

condo le attuali vedute, peraltro non condivise da tutti, non

rappresentano un genere distinto dal genere Salrnonella ma ne

costituiscono il subgenere III; tuttavia per comodità didat­

tica si ~ preferito, sulla scorta di quanto si fa ancora in

letteratura, fornire due schede biochimiche separate per i due

subgeneri. D'altra parte l'ultima edizione del Bergey's Manual

ha già provveduto ad assimilare le Arizona nell'ambito delle

Salmonelle anche da un punto di vista sierologico trasforman­

do gli antigeni di Arizona nei corrispondenti antigeni salmo­

nellari.

Le affinità sierologiche di cui si è parlato e alle qua­

li si è già accennato nell'introduzione hanno posto e pongono

ancora oggi dei problemi pratici di diagnosi differenziale in-

tergenerica, soprattutto fra i generi Salmonella, Arizona e Ci-

trobd~ter, sia da un punto di vista biochimico che sierologico.

La tabella 8 mette in evidenza i principali caratteri dif-

ferenziali biochimici e le relative percentuali di positività.

- 4.5 -

Schema generale riassuntivo delle prove da eseguire per col-

tura, isolamento e identificazione di Salmonella.

1• giorno

2° giorno

3° giorno

4° giorno

Seminare contemporaneamente

BS agar

ss agar DCC agar

EMB agar

2 piastre

a scelta + 1 beuta di

prearr. ( BPW)

MC agar

L Se colonie

Se colonie non sospette------, . l sospette L

J seminare su:

Kligler

LIA!

dalle colture

su Kligler e LIA

sospette

ese~uire:

a} Àeta-galattosidasi

APP Ossidasi

b) agglutinazione

con siero poliv.

Seminare su:

MK o SBG

Seminare su: BGA o BS agar

Se colonie so­

spette prose­

guire come 2°

giorno semina

diretta

- 46 -

6. 4. 5. Sierodiagnosi de l'le Salmonelle

Per diagnosi sierologica si intende sia la sierodiagnosi

eseguita su sieri di pazienti o di animali sia la batteriodia­

gnosi eseguita cimentando un ceppo biochLmicamente sospetto

con immunosieri noti. In questo paragrafo verranno descritte

le tecniche di sierodiagnosi comunemente usate in campo uma­

no ed animale, riservando al successivo la trattazione della

analisi antigenica.

Sierodiagnosi di Widal

In campo umano ~ l'unica reazione praticamente utilizza­

ta, modificata sec. Felix; la reazione, avente lo scopo di ti­

tolare gli anticorpi presenti nel siero di sangue con sospen­

sioni H e O di germi, si applica di regola al tifo e ai para­

tifi A e B; tuttavia, data la grande diffusione delle ·salmo­

nellosi, sarebbe opportuno aggiungere alle sospensioni cita­

te anche quelle relative a S. enteritidis e S. typhimurium

(aLmeno le flagellar!}.

La sospensione O si prepara da un agarcoltura di 24 h

raccogliendo la patina con sol. fisiologica addizionata di

un egual volume di alCool etilico e diluendo questa sospen­

siJne madre fino ad ottenere 500 milioni/ml.

La sospensione H si prepara da ceppi molto mobili, col­

tivando in agar e raccogliendo la patina con sol. fisiologi­

ca forrnolata allo 0,5%.

Tecnica della reazione

Si utilizzano due metodi, ii lento e il rapido (vedi

tabelle 9 e 1 O).

Tabella 9

Sierodiagnosi di Widal lenta in pr_ovetta

provetta n• 1 2 3 4 5 . 6. 7

siero 1 '1 o 0,5 0,2 0,1 --- --- --- ---siero 1 '1 00 --- --- --- 0,5 0,2 o' 1 . ---

sol.fisiol. --- 0,3 0,4 --- 0,3 0,4 0,5

antigene 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

titolo 1 '20 1 '50 1 '1 00 1 '200 1:500 1:1000 contr.

Tabella 10

Sierodiagnosi di Widal rapida su lastra

siero 0,08 0,04 0,02 0,01 . 0,005

antigene eone. 1 goccia 1 goccia 1 goccia 1 goccia 1 gocci

mescolare· ruotando la lastra; leggere dopo 3.

titolo appros-

simativo equi- 1 '20 1 '4 o 1 '80 1 '1 6 o 1 '320

valente alla tecnica in prov

.

- 4S -

Significato dell'aggiutinazione

Le agglutinine O compaiono nel siero verso il 7°- ~ gior­

no di malattia, le H più tardivamente. Nel periodo di stato del­

la malattia aumenta 11 titolo delle agglutinine e si hanno si­

multaneamente agglutinine O e H, queste ultime a titoli più e­

levati.

Per quanto riguarda la significatività del titolo in un

paziente non vaccinato, un titolo di 1:100 di agglutinine o è

presuntivo di una malattia in atto, soprattutto se un succes­

sivo esame mostra un aumento del titolo in O e comparsa di ag­

glutinine H.

Nelle agglutinazioni per sospetta febbre tifoidea, se si

rilevano solo agglutinine TO, si deve sospettare un'infezione

da salmonella avente l'antigene O comune con la s. typhi ma un

diverso antigene H (ad es. s. enteritidis); in tal caso con­

verrà ricercare l 1 agglutinazione H con una sospensione H di

s. enteritidis.

Analogamente si farA con una sospensione H di s. typhi­

murium se la sospensione BO è la sola agglutinata dal siero

in esame.

La presenza di sole agglutinine H può essere relativa

ad una precedente vaccinazione; nei casi di infezione in at­

to debbono invece essere presenti anche le agglutinine O.

Nella tabella 9 diamo alcuni esempi di risultati della

reazione di Widal.

- 49 -

Tabella 11

Esempi di risultati della reazione di Widal

1 2 3 4 5 6 7

'

TO 400 200 200 100 --- 400 ---TH 800 --- --- --- 400 1600 200

AO --- 100 --- --- --- --- ---AH --- --- --- --- 100 100 ---BO --- 400 --- 200 --- --- ---BH --- 800 --- --- 200 200 ---

1) febbre tifoide

2) febbre paratifoide B con coagglutinazione dovuta ai fatto­

ri O comuni (12)

3) a = febbre tifoide all'inizio

b = infezione dovuta ad un sierotipo avente antigene o co­

mune con la S. typhi, ma un antigene H diverso.

4) a = paratifo B con coagglutinazione TO

b = infezione dovuta a s. typhimuriurn

5) paziente vaccinato con vaccino TAB

6) paziente vaccinato con febbre tifoide in atto

7) a~ paziente che ha avuto in passato un'infezione tifoide

b = infezione dovuta a salrnonella con antigene H comune a

S. typhi ma con antigene O diverso.

In campo animale la tecnica di sierodiagnosi più usata

resta pur sempre la sieroagglutinazione che si esegue con

tecniche analoghe a quella descritta per la Widal, facendo

uso di antigeni colorati reperibili in commercio o di antige-

-50 -

ni preparati in laboratorio da agarcolture sospese in solu­

zione allo 0,5% di fenolo. Tuttavia, a scopo di ricerca, so­

no state sviluppate anche tecniche diverse, quali la devia­

zione del complemento, la emoagglutinazione indiretta, etc.

sulle quali non riteniamo opportuno soffermarci poichè trat­

tasi di tecniche piuttosto complesse difficilmente applica­

bili nella diagnosi di routine.

6.4.6. Batteriodiaonosi (analisi antigenica o ricettoriale)

Serve a mettere in evidenza e ad identificare gli anti­

geni somatici e flagellar! presenti nelle salmonelle median­

te l'uso di sieri immuni agglutinanti polivalenti, gruppo

specifici e·antigene specifici.

Gli antigeni sornatici, indicati da Weil e Felix con O,

sono di natura complessa, glicidolipidica, sono identifica­

bili con la endotossina e strutturalmente sono costituiti da

una parte profonda o "core" e da catene laterali di natura

glucidica più superficiali responsabili della specificita del­

la reazione. L'insieme di queste catene laterali costituiace

una specie di mosaico qi antigeni, che sono stati indicati con

numeri arabi, nella classificazione di Kauffmann-White. In po­

che specie di enterobatteri, quali s. typhi, s. paratyphi C,

alcuni Citrobacter, all'esterno degli antigeni O è presente,

in strato continuo o discontinuo, un altro antigene, il Vi

(antigene della virulenza) di natura polisaccari~ica, ma, a

differenza dell'antigene O, terrnolabile, essendo distrutto a

6DPC per 1 h. Questo antigene in molti casi pu~ impedire nel-

- .5i -

la S. typhi l'agglutinazione dell'antigene O sottostante,

per cui è opportuno, quando si ha questo sospetto, tratta­

re a caldo a 100°C per 15' una sospensione densa del germe

in esame e cimentarlo di nuovo con antisiero O gruppo spe­

cifico.

In particolari condizioni, le Salmonelle possono anda­

re incontro a dissociazione 5-R con modificazioni fenotipi­

che delle colonie e modificazioni strutturali dell'antige­

ne O che perde la parte più superficiale conservando il

"core", di natura lipopolisaccaridica. Esso ha importanza

in diagnostica perchè pub rendere spontaneamente agglutina­

bili ceppi batterici in fase R.

Gli antigeni flagellar! sono di natura proteica e sono

presenti all'interno delle ciglia nei germi mobili. Sono

stati indicati con H da Weil e Felix.

H.entre l'agglutinazione degli antiaeni O si presenta,

sia in provetta che su vetrino 1in forma di granuli scarsa­

mente dissociabili, la agglutinazione di tipo H ~ fioccosa

e in provetta si risospende facilmente per scuotimento.

In passato Andrewesha messo in evidenza nelle Salmonel­

le una dissociazione di fase che porta alla comparsa di colo­

nie costituite da germi mobili provvisti di antigeni flagel­

lar! leggermente diversi da quelli di partenza e comuni ad

altri sierotipi; per questo egli ha distinto una fase spe­

cifica predominante ed una fase aspecifica. Le Salmon,elle

che si compOrtano in tal modo sono dette difasiche mentre

-52-

quelle indissociate sono dette monofasiche specifiche. Tut­

tavia la dissociazione può portare anche alla completa tra­

sformazione dell'antigene in senso aspecifico; in tal caso

si parla di specie rnonofasiche aspecifiche in cui è scompar­

so completamente l'antigene specifico.

Poichè tuttavia si è visto successivamente che la fa-

se aspecifica è solo apparentemente assente nelle specie mo­

nofasiche aspecifiche ma in realt~ è presente in piccola per­

centuale, si è preferito parlare di fase 1 e fase 2.

Pu~ accadere che un ceppo di Salmonella normalmente di­

fasico contenga in quantità sufficiente solo uno dei due an­

tigeni flagellar! (di regola quello di fase 1), per cui la e­

satta diagnosi risulta impossibile. In tali casi si pu~ ri­

correre ad una esaltazione della rnobilit~, quindi ad una mag­

giore produzione di germi ciliati, mediante la tecnica di

Craigie in provetta o tecniche equivalenti in piastra {27).

Nel primo caso si coltiva il germe in un agar molle (vedi

appendice) contenente un tubicino di vetro, seminando allo

interno di quest'ultimo e riprendendo il germe all'esterno;

contemporaneamente si esalta la produzione di antigeni H di

fase 2 {della fase non presente in generale) aggiungendo al

terreno fuso e raffreddato a so•c una goccia di antisiero

"specifico per adsorbimento" della fase presente che viene

cosi inibita.

Gli antigeni della fase 1 nello schema di Kauffmann­

White sono indicati con lettere minuscole dell'alfabeto, gli

antigeni di fase 2 sono invece indicati con numeri arabi dal-

- 53 -

1'1 al 7 e con lettere dell'alfabeto.

Sulla base delle conoscenze sulla struttura antigene del­

le Salmonelle Kauffmann ha elaborato uno schema di classifi­

cazione di queste in gruppi e sottogruppi, al quale bisogna

fare costante riferimento nell'esecuzione pratica di una bat­

teriodiagnosi (analisi ricettoriale) •

La formula antigenica di una Salmonella consta di tre

parti: Dapprima vengono gli antigeni O espressi da numeri a­

rabi che vanno dall'uno al 65; poi vengono gli antigeni H

presenti in fase 1, indicati con lettere dell'alfabeto mi­

nuscole ed infine gli antigeni H presenti in fase 2, indi­

cati con numeri arabi da 1 a 7 e, in casi particolari, da

antigeni chimicamente ed immunologicarnente simili ad alcu­

ni presenti nella fase 1, come e,n,x;lw;z6 ;z15 ,etc.

L'identificazione pratica di questi antigeni si esegue

cimentando con sieri Lmmuni agglutinanti reperibili in com­

mercio (Difco, Behring, Wellcome, etc.) le colture batte­

riche di 24 h in agar o in Kligler. Esistono sieri immuni

somatici anti-0 e sieri ~uni flagellar! anti-H, gli uni

e gli altri polivalenti e rnonovalenti.

Come primo passo nell'identificazione sierologica, do­

po aver controllato che il ceppo in esame sia in fase S,

cioè non agglutini spontaneamente, si cimenta una sospen­

sione del germe in sol. fisiologica (o direttamente nel sie­

ro immune) con un siero polivalente anti-0, che agisce di

regola contro gli antigeni presenti nei gruppi A-B-C-0-E-F-G

- 5~-

di Kauffmann-White (Wellcome e Behring poli·1); altre Dit­

te allestiscono antisieri per i gruppi minori (Oifco e Beh­

ring poli-2) fino all'antigene 60, coprendo cosl fino al 98-

99% delle salmonelle conosciute (circa 1400). Se questa pro­

Va su vetrino conferma il primo sospetto di Salmonella, si

cimenta il germe con antisieri O corrispondenti ai gruppi O . . principali contenuti nell'antisiero polivalente.

E' consigliabile iniziare con il siero anti-0 4, ca-

ratteristico del gruppo B, poichè i sierotipi pi~ diffusi

nel nostro territorio appartengono a questo gruppo {S. typhi­

murium, s. wien}. In caso di reazione positiva, si prosegue

cimentando il ceppo con il siero anti-0 5 che consente una

ulteriore discriminazione tra le salmonelle appartenenti a

questo gruppo. In caso di reazione negativa, si procede con

gli altri sieri anti-0: 6,7,8; 9; 3,10,15; 11; 13,23. E' da

tenere presente l'esistenza nello schema di Kauffmann-White

di sottogruppi per i quali sono disponibili in commercio sie-

ri più specifici, quali 1'8 per il sottogruppo c 2 , il 10, 15,

19 per sottogruppi E2 , E3 , E4 , etc.

Nel caso di reazione negativa con i sieri gruppo speci-

fi~i (e soprattutto se qualche prova biochimica autorizza il

sospetto di s. typhi (scarsa o nulla produzione di H2S, man­

canza di gas nella fermentazione del glucosio, mancata uti-

lizzazione del citrato) si cimenta il ceppo col siero Vi e,

in caso di risposta positiva, si ripete la prova con il sie­

ro anti-9 su una sospensione del germe scaldata a 1oo•c per

- 55 -

15 1 per inattivare l'antigene Vi.

Una vol~a identificato il gruppo somatico, si procede

alla identificazione degli antigeni flagellar!.

A tale scopo ci si può avvalere di due tecniche: rapida

su vetrino e lenta in provetta.

La tecnica di agglutinazione rapida su vetrino, analoga

a quella descritta per gli antigeni O, si esegue cimentando

la coltura in esame anzitutto con un siero polivalente H con-

tenente anticorpi verso tutti gli antigeni di fase 1 e 2; in

caso di reazione positiva, si pu~ cimentare la coltura con

sieri polivalenti pia ristretti, reperibili in commercio, ed

infine con sieri monovalenti specifici di tipo H (a, b, c, d,

etc •• }, fino all'identificazione dell'antigene di fase 1.

A questo fine può tornare utile l'uso dei tre sieri dia-

gnostici rapidi della Wellcome per un primo screening degli

antigeni flagellar! secondo lo schema seguente: {tab. 12).

Tabella 12

Determinazione degli antigeni flagellar! di fase 1

mediante sieri diagnostici rapidi

'

Antigene !Poli-1 (b,d,E,r) Poli-2(b,E,k,L) Poli-3(d,E,G,k)

b + + -d + - + E (x) + + + G (o) - - + k - + + L (co) - + - l r + - - l ______._

l

!

a

b

c

d

e,h

- 57 -

Tabella 13

Riconoscimento degli antigeni di fase 1 con i sieri

di Spicer-Edwards

Antigeni H pool A pool B pool c pool

+ + - -+ + - + + + - -+ - + + + - + -

G complex (X) + - - + i + - - -k - + + + r - + - + y - + - -z - - + + z4 complex (o) - - + -

•10 - - - +

•.29 - + + -

D

Antigeni H Sieri anti-H complex aggiuntivi

e,n,x; e,n,z15

l,v; l,w; l,z13 ; l,z28

1,2; 1,5; 1,6; 1,7

EN Complex

L Complex

1-7 Cornplex

l

- 58 -

Leggenda della tabella 13

(x) Il componente G Compl~x dei sieri polivalenti A e D rea­

gisce con gli antigeni fg, fgt, gm, ~ms, gmt, gp, ~pu,

gq, gst e mt.

(o) Il componente z 4 Complex reagisce con z 4 , z 23 , z.4 , z 24 e

z4,z32"

L'antigene utilizzato per la reazione è costituito da 10

ml di una brodocoltura dì 18-24 h in terreno "H broth" inat-

tivata con l'aggiunta di 1 ml di sol. fisiologica contenente

aldeide formica al 4%.

La reazione si esegue in una serie di 7 provette da ag-

glutinazione in ognuna delle quali vengono distribuiti 0,5 ml

della sospensione di antigene ottenuta come descritto in pre-

cedenza; in ogni provetta vengono poi aggiunti 0,5 ml di una

diluizione 1:800 in sol. fisiologica di un singolo pool di

siero~ Le provette vengono poste in bagnomaria a 50 C e le let-

ture si effettuano dopo circa 3 h di incubazione. In caso di

reazione positiva, si nota la formazione di un flocculo bian-

castro con conseguente chiarificazione della sospensione che

rimane invece torbida in caso di reazione negativa.

In alcuni casi l'agglutinazione in provetta va integrata

con prove supplementari su vetrino. Se ad es. il ceppo in esa-

me mostra di possedere l'antigene G cornplex o z 4 cornplex, lo

si dovrà cimentare con i singoli sieri specifici per gli anti-

geni indicati nella tabella 13.

- 59 -

Appendice I

Terreni di coltura per la diagnosi di Salmonella citati nel

testo.

1) Brain-Hearth infusion {infuso cuore-cervello)

Infuso di cervello di vitello g/l 200, o Infuso di cuore di bue " 250,0

Peptone " 10,0

Sodio cloruro ., 5,0

Destrosio " 2,0

Fosfato bisodico " 2,5

pH 7,4

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire e sterilizzare

a 121•c per 15'.

2) Tryptose broth (brodo tryptose)

Tryptose

Destrosio Sodio cloruro

pH 7,4

g/l

" "

20

1

5

Sciogliere in 1 iitro di H2o, distribuire e sterilizzare

a 121°C per 15'.

3) Tryptose agar (agar tryptose)

Tryptose

Destrosio

Sodio cloruro

Agar

Tiamina cloridrato

g/l

" " .,

"

20

1 5

15

0,005

- 60 -

pH 7,4

Sciogliere in 1 litro di a 2o, distribuire e sterilizzare

a 121°C per 15'.

4) Mc Conkey agar

Peptone

Lattosio

Sali biliari

Rosso neutro Agar

pH 7,4

g/1 ., .,

" "

20

1 o 5

0,075

12

Sciogliere in 1 litro di H20, distribuire e sterilizzare

a 121e~c per 15'.

E' un terreno differenziale, scarsamente selettivo, che

consente l'isolamento di Salrnonelle ed altri enterobatteri

patogeni. Le Salmonelle formano colonie piccole., incolori 1

mentre i coliforrni formano colonie rosse per preciPitazione

d~l rosso neutro in ambiente acido.

5) Eosin Methylene Blue Agar (terreno di Levine)

Peptone g/1 1 o Lattosio " 5

Saccarosio " 5

Fosfato bipotassico " 2

Agar " 13.5

Eosina y .. 0,4

Bleu di metilene .. 0,065

p H 7,2

- 61 -

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire e sterilizza­

re a 121•c per 1S'a

La sterilizzazione riduce il bleu di metilene a leu­

cobase lasciando il terreno di color arancio. Il colore bleu.·

puO essere ripristinato agitando dolcemente durante la pre­

parazione delle piastre.

E' un terréno scarsamente selettivo, che inibisce sol-

tanto la flora coccica e putrifica banale gram positiva. Le

Salmonelle formano colonie color ambra mentre i coliformi

danno colonie rossoviolacee, con o senza riflessi metallici.

6) SS Agar (Agar Salmonella-Shigella)

Estratto di carne g/1 5

Peptone " 5

Lattosio " 10

Sali biliari " 8,5

Citrato sadico " 8,5

Tiosolfato sadico " 8,5

Citrato ferrico " 1

Agar " 15

Verde brillante " 0,00033

Rosso neutro " 0,025

pH 7

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire senza steri­

lizzare.

E' un terreno molto selettivo che, oltre alla flora

gram-positiva, inibisce anche i coliformi e talvolta 1e stes-

se salmonelle.

- 62 -

Queste formano colonie piccole, rugiadose, incolori,

mentre i coliformi danno colonie rosse o incolori con cen­

tro rosso (vedi testo) •

7) Desoxycholate Citrate Agar {agar desossicolato citrato

di Leifson) (Difco o BBL)

Infuso di suino g/1 330

Proteose peptone ., 10

Lattosio " 10

Citrato sodi co " 20

Citrato ferrico ammonico " 2

Desossicolato sadico " 5

Agar " 13,5

Ross·o neutro " 0,02

pH 7,5

Sciogliere a modico calore in 1 litro di H2o, e di­

stribuir~ direttamente in piastra senza-sterilizzare. E'

un terreno sufficientemente selettivo in grado di inibire

gram positivi, coliforrni e protei. Le Salmonelle formano

colonie piccole, rugiadose, incolori o con centro nero,

Arizona e Citrobacter formano colonie rosate con centro

nero, i coliformi danno colonie rosse o incolori con centro

rosso.

8) Selenite Broth (brodo selenito F)

Peptone

Lattosio

Sodio fosfato

Selenito acido di sodio

pH 7

g/1

"

" .,

5

4

1 o 4

- 63 -

Sciogliere a calore moderato in 1 litro di a 2o, di­

stribuire e sterilizzare a vapore fluente per 15'.

9) Selenite Cystine Broth (brodo selenito cistina)

Peptone g/1 5

Lattosio " 4

Sodio fosfato " 10

Selenito acido di sodio " 4 L-Cistina " 0,01

pH 7

Sciogliere a calore moderato in 1 litro di a2o, di­

stribuire e sterilizzare a vapore fluente per 15'.

10) Selenite Brilliant Green Broth (brodo SBG)

Estratto di lievito 9/1 5

Peptone " 5

~1annitolo " 5

Sodi o taurocolato " 1

Selenito di sodio " 4

Fosfato bipotassico " 2,65

Fosfato monopotassico " 1 , 02

Verde brillante " 0,005

pH 7,2

Sciogliere in 1 litro di a 2o, distribuire e sterilizza­

re a 121°C per 15'.

11) Terreno SP di Hajna

Estratto di lievito

Fosfato ammonico

Fosfato monopotassico

g/1

" "

1

4

2

Sodio cloruro

1-lagnesio solfato

Sodio citrato

Desossicolato sadico

- 64 -

g/l

"

"

"

5

0,4

5

0,5

Sciogliere in 700 ml di H2o ed aggiungere 300 ml

di glicerolo neutro. pH finale 7. Distrib~re 10 ml in pic­

coli flaconi da 50 ml con tappo a vite e sterilizzare a 11s•c

per 15' .

12) Terreno di Amies

Sodio cloruro g/1 3

Potassio cloruro " 0,2

Fosfato bi sadico anidro " 1 , 15

Fosfato monopotassico " 0,2

Tioglicolato sodi co " 1

Calcio cloruro sol. 1% m l 10

Magnesio cloruro sol. 1% " 10

Agar g 4

Sciogliere in 1 litro di H2o iniziando dall'agar, quin­

di aggiungere da ultimo 10 g di carbone animale. Distribuire

in piccoli containers con tappo a vite (6 rnl) e sterilizzare

a 121°C per 15'. Conservare in luogo fresco. Possono essere

usati anche tamponi trattati con il terreno (senza carbone).

Per la preparazione di questi ultimi vedi Edwards - Ewing

( 2) •

- 65 -

13) Soluz~one fisiologica peptonata

Peptone

Sodio cloruro g/1

"

1

8

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire e steriliz­

zare a 121°C per 15'.

14) Acqua peptonata tamponata

Peptone g/1 10

Sodio cloruro " 5

Fosfato bisodico.12 H20 " 9

Fosfato monopotassico " 1 '5

pH 7,2

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire e steriliz­

zare a 121°C per 15'.

15) Acqua peptonata

Peptone (tryptone)

Sedia cloruro

g/1

" 10

5

Sciogliere in 1 litro di H20, distribuire e steriliz­

zare a 121•c per 15'.

1 6) Terreno di Muller-Kauffmann (Oxoid C~! 343)

Tryptone g/1 7

Peptone di soia " 2,3

Sedia cloruro " 2,3

Calcio carbonato " 25

Bile di bue essiccata " 4,75

Tiosolfato sadico " 40,7

- 66 -

Sciogliere in 1 litro dì H20 e portare all'ebollizio­

ne. Distribuire in beute (100 ml). Al momento dell'uso ag­

giungere alla beuta 1 ml di una sol. acq, di verde brillan­

te ~allo 0,1%, sterilizzaVa. in bagnomaria bollente per 30',

e 1,9 ml dì una sol. iodo-iodurata preparata sciogliendo

25 g di ioduro dì po~assio in 100 ml di acqua e versando

quindi lentamente 20 g dì iodio fino a soluzione. Le due so-

luzionì si conservano al buio.

1 7) Brilliant Green Agar (BGA) (Oxoid CH 329)

Estratto di carne g/1 5

Peptone " 10

Estratto di lievito " 3

Fosfato bi sadico " 1

Fosfato monosodìco " 0,6

Lattosio ., 10

Saccarosio " 10

Rosso fenolo " 0,09

Verde brillante " 0,0047

Agar " 20

pH 6,9

Sciogliere a calore moderato, distribuire, non steri­

lizzare in autoclave. Le piastre debbono essere preparate

alcuni giorni prima dell'uso e lasciate asciugare bene.

- 67 -

18) Bismuth Sulphite Agar (terreno di Wilson e Blair)

Estratto di carne g/1 5

Peptone " 10

Destrosio " 5

Fosfato bi sodi co " 4

Solfato ferroso " 0,3

Solfato di bismuto " 8

Agar " 20

Verde brillante " 0,025

pH 7,7

Sciogliere a calore moderato in 1 litro di H20 e distri­

buire direttamente in piastra senza sterilizzare. Non far

solidificare nè rifondere l'agar. Le piastre debbono essere

preparate alcuni giorni prima dell'uso e lasciate asciugare

bene. La semina può essere effettuata sia in superficie che

nella massa del terreno. La Salmonella typhi, la S. paratyphi E

e la s. enteritidis crescono in forma caratteristica dando

colonie nere con alone metallico sia in superficie che nel-

la massa. Altre salmonelle e protei formano colonie verda­

stre.

- 68 -

1 9) Kligler Iran Agar { terl·eno di KU gler)

Estratto di carne g/1 3

Estratto di lievito " 3

'Peptone pepsico " 1 5

Proteose peptone " 5

Lattosio " 10

Glucosio " 1

Solfato ferroso ., 0,2

Sodio cloruro " 5

Iposolfito di sodi o " 0,3

Agar ., 15

Rosso fenolo " 0,024

pH 7,4

Sciogliere dolcemente a caldo in 1 litro di H2o, distri­

buire in provette e sterilizzare a 121~C per 15'. Far solidi­

ficare a becco di clarino con un fondo (butte) di almeno

2,5 cm.

20) Triple Sugar Iran Agar (TSI)

Ha la stessa formula del precedente con l'aggiunta di

10 g di saccarosio.

- 69 -

21) Lysin Iran Agar (terreno di Edwards e Fife)

Peptone g/1 5 Estratto di lievito .. 3

Glucosio .. 1

1-lisina .. 10 Ferro ammonio citrato .. 0,5

Tiosolfato di sedia .. 0,04

Bromocresolporpora .. 0,02 Agar .. 20

pH 6,7

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire in provette

e sterilizzare a 121•c per 12'. Far solidificare a becco

di clarino con una butte di almeno 2,5 cm. Dopo la semina

sostituire il tappo originale con un tappo di caucciù.

22) Phenol Red Broth (brodo per fermentazione zuccheri)

Estratto di carne g/1 1

Proteose peptone .. 1 o Sodi o cloruro " 5

Rosso fenolo " 0,018

Zucchero " 5

pH 7,4

Sciogliere a caldo in 1 litro di H20, distribuire in

provette con campanella di Durham e sterilizzare a 12fDC

per 15'.

- 70 -

23) Terreno di Hugh-Leìfson

Peptone g/1 2

Sodi o cloruro " 5

Fosfato bipotassico ., 0,3

Bleu di bromotimolo sol. 1% m1 3

Agar g 3

pH 7,1

Sciogliere a caldo in 1 litro di H2o, distribuire in

provette e sterilizzare a 121cC per 15'. Al momento dello

uso, fondere il terreno ed aggiunqere 1 rnl di una sol. di

glucosio sterile al 10%. Far solidificare e seminare per

infissione 2 provette, ad una delle quali si stratifica so-

pra dell'olio di vasellina.

24) Terreno s.I.H.

Tr}'Pticase g/1 20

Tiosolfato di sodi o " 1

Solfato ferroso ., 0,2

Agar " 12

pH 7,4

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire in provette

e sterilizzare a 121ec per 15'.

25) MR-VP (terreno per rosso metile e acetoina)

Peptone

Glucosio

Fosfato bipotassico

pH 7,5

g/1

"

"

5

5

5

- 71 -

Sciogliere in 1 litro di H20, distribuire in provette

e sterilizzare a 121,C per 15'.

26) Simmons Agar

Sodi o cloruro g/1 5

Solfato di magnesio-? H2o " 0,2

Fosfato rnonoammonico " 1

Fosfato bipotassico ,, 1

Citrato di sodio " 5

Bleu di bromotimolo sol. 1% m1 8

Agar g 20

pH 7

Sciogliere in 1 litro di H20, distribuire in provette

e sterilizzare a 121~c per 15'.

27) Terreno di Stuart

Fosfato monopotassico

Fosfato bisodico

Estratto di lievito

Rosso fenolo sol. 0,2%

O rea

pH 6, 8

g/1

" " m1

g

9 ,1

9,5

o ,1

5

20

Sciogliere tutti i componenti a freddo, in 1 litro

di H2o, sterilizzare per Seitz e distribuire sterilmente

in provette (3 rnl) .

- 72 -

28) Falkow Lysine Broth (terreno di Hoeller)

Peptone g/1 5

Estratto di carne " 5

Glucosio " 0,5

Piridossale " 0,005

Bleu di bromotimolo sol. 0,2% m1 5

Rosso cresolo sol. 0,2% " 2,5

1-lisina g 1 o

pH 6

Sciogliere a caldo in 1 litro di H2o, distribuire in

provette e sterilizzare a 115°C per 10'. Dopo la semina so­

stituire il tappo originale con un tappo di caucciù.

29) Gelatina

Brodo nutritivo

Gelatina

pH 7,2

g 1000

g 120-150

Sciogliere a caldo, distribuire e sterilizzare a 115°C

per 15'.

30) Malonate broth (brodo malonato)

Estratto di lievito

Ammonio solfato

Fosfato bipotassico

Fosfato monopotassico

Sodio cloruro

Malonato di sodio

Bleu di bromotimolo

pH 7

g/1

" " " " " "

1

2

0,6

0,4

2

3

0,025

- 73 -

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire in provet­

te e sterilizzare a 121°C per 15'.

31) Terreno al KCN

Peptone g/1 10

Sedia cloruro " 5

Fosfato bisodico " 5,63

Fosfato rnonopotassico " 0,22

Agar " 1

pH 7,5

Sciogliere in 1 litro di H2o, distribuire in provet­

te sottili (8x180) e sterilizzare a 121°C per 15'.

Al momento dell'uso aggiungere a ciascuna provetta

(contenente 2 ml di terreno) 0,1 rnl di una sol. 0;5% di

RCN sterilizzata pa~ Seitz. La suddetta soluzione può es­

sere conservata a4°'C per 1 mese.

32) Nitrate agar (agar nitrato)

Estratto di carne g/1 3

Peptone " 5

Nitrato potassico " 1

Agar " 12

pH 6,8

Sciogliere a caldo in 1 litro di H2o, distribuire in

provetta e sterilizzare a 121bC per 15'.

- 74 -

33) Terreno al tartrato

Peptone

Bleu dì bromotirnolo sol. 0,2%

D-tartrato sadico potassico

g/1 1 o m1 12

g/1 1 o

Sciogliere a caldo peptone e indicatore in 1 litro di

H2o, quindi aggiungere· il tartrato e correggere il pH a

7,4 con NaOH 5 N, distribuire 3 ml in provette e steriliz­

zùre a 121ec per 15'.

34) Terreno al mucato

Al terreno base di cui sopra aggiungere a caldo

acido mucico {1%), quindi aggiungere NaOH 5 N per portare

in soluzione l'acido mucico come mucato sadico e corregçe-

re il pH a J,4; distribuire 3 ml in provette e sterilizza­

re a 121°C per 10',

35) Terreno per variazione di fase

Peptone

Gelatina

Estratto di carne

.::,')dio cloruro

Agar

g/1

" " " "

10

80

3

5

4

Sciogliere a caldo in 1 litro di H20, distribuire e

sterilizzare a 110°C per 15'.

- 75 -

36) "H" Broth (di Hajna)

Thyotone peptone g/1 1 o Estratto di carne " 3

Destrosio " 1

Sodio cloruro , 5

Fosfato bipotassico " 2,5

pH 7,2

Sciogliere in 1 litro di H2 0, distribuire e steriliz­

zare a 121°C per 15'.

- 76 -

APFE:-JDICE II Schema nae) e

di Kauffmann-White con i l ::;ubgenere III (S. arizo-i sierotipi

of Bergey' s Manual

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Determinative Bacteriology 1970. {da VIII ed.)

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FEBBRAIO- 1979