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OGM: APPROCCIO ANALITICO MULTI-STEP
Enzo Cortini SC1 Analisi del Rischio e Sorveglianza in Sanità Pubblica Laboratorio Biofood
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OBIETTIVI DELL’ INTERVENTO:
1) ASPETTI E PECULIARITA' DEGLI OGM
2) ANALISI E INTERPRETAZIONE DEI DATI DI LABORATORIO
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DEFINIZIONE DI OGM:
“...un organismo diverso da un essere umano, il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l'accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale.... (Art.2 Direttiva 2001/18/ CE del 12/03/2001) Queste modificazioni prendono il nome di Trasformazioni o Transegenesi
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L'INGEGNERIA GENETICA:
Le tecniche di ingegneria genetica consentono di produrre OGM introducendo geni estranei provenienti da altri organismi viventi:
- Microrganismi (procarioti ed eucarioti) • - Animali • - Vegetali
Il DNA cosi ottenuto è definito DNA ricombinante L'obbiettivo è in genere quello di conferire caratteristiche utili
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PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):
Le PGM sono piante nelle quali è stato inserito un gene proveniente da un organismo “donatore” che può appartenere alla stessa specie della pianta “ricevente”, oppure a specie diverse, o addirittura a regni diversi PGM di Prima Generazione: destinate al miglioramento delle caratteristiche agronomiche
• - Aumento della resistenza agli insetti • - Tolleranza agli erbicidi • - Aumento della resistenza alle malattie
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COME OTTENGO UNA PGM? 1°Step Preparazione del Costrutto di DNA da impiegare nella Trasformazione
1) Scelta della/e sequenza/e di DNA e taglio con un enzima di restrizione 2) Taglio del plasmide con lo stesso enzima di restrizione per generare estremità compatibili 3) Inserimento di una o più “cassette geniche” (sequenza genica di interesse + promotore + terminatore) I) resistenza ad alcuni insetti II) resistenza ad un antibiotico attivo sui batteri III) resistenza ad un secondo antibiotico per la selezione delle cellule vegetali
4) Ligazione Costrutto = Plasmide + cassetta genica
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2° Step: Clonaggio e selezione della popolazione delle
cellule batteriche trasformate
Creato il Costrutto Genico occorre produrne un numero elevato
numero di copie inserendolo in batteri capaci di “amplificarlo”
Solo i batteri “modificati” sopravvivono alla selezione (e si
moltiplicano) grazie alla cassetta genica per la resistenza
all'antibiotico (II)
La popolazione batterica non “modificata” è invece sensibile
all'antibiotico
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3 Step: Trasformazione
L’inserzione di un tratto di DNA estraneo (costrutto genico), nel
genoma «ospite» di una cellula vegetale
Tecniche di Trasformazione maggiormente utilizzate:
1) Vettori plasmidici es…Agrobaterium Tumefaciens
2) Tecnica “biolistica”
3) Elettroporazione
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Fonte: BATS (Center for Biosafety Assesment Technology and Sustainability), Swittzerland
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4° step: Selezione assistita delle nuove piante “Evento di
trasformazione” mediante appostiti marcatori
es. - resistenza ad un antibiotico
- sistema G.U.S. (beta-glucoronidasi)
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Un esempio di pianta transgenica il Mais BT11 Nel genoma della pianta sono state inserite 6 copie del gene Cry I Ab (resistenza agli insetti) e del gene bla (resistenza alle penicelline) ed almeno 2 copie del gene bar (tolleranza al glufosinato)
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Le colture GM maggiormente diffuse sono: •soia •mais •cotone •colza Le principali modificazioni riguardano la resistenza agli erbicidi e la resistenza ad insetti.
COLTIVAZIONI OGM NEL MONDO
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Stato delle autorizzazioni degli alimenti e dei mangimi GM in EU:
12 eventi soia (di cui 1 stacked)
(+7 in corso di autorizzazione)
39 eventi mais (di cui 26 stacked)
(+9 in corso di autorizzazione)
7 eventi colza (di cui 3 stacked)
(+2 in corso di autorizzazione)
10 eventi cotone (di cui 3 stacked)
(+1 in corso di autorizzazione)
1 evento barbabietola da zucchero
2 Microorganismi GM
71 eventi autorizzati
+
19 eventi che ricadono
Reg.(UE) 619/2011
Aggiornamento 17/06/2015
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QUADRO NORMATIVO OGM
Direttiva 2001/18/CE Reg.(CE) n. 1829/2003
Reg.(CE) n. 1830/2003
Reg.(UE) n. 619/2011
Reg.(UE) n. 691/2013 del 19 Luglio 2013
Reg.(CE) n. 834/2007
Reg.(CE) n. 65/2004
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LIMITI DI LEGGE Reg.(CE) n. 1829/2003
OGM autorizzati : obbligo di etichettatura > 0.9% di un singolo ingrediente alimentare o al singolo componente di un mangime OGM autorizzati : non sussiste obbligo di etichettatura ≤ 0.9% di un singolo ingrediente alimentare o al singolo componente alimentare purché la presenza sia accidentale o tecnicamente inevitabile
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Piano Nazionale di
controllo alimenti GM
2015-2018
CONTROLLO UFFICIALE OGM IN ITALIA
Piano Nazionale di
controllo mangimi
GM 2015-2017
Piani Regionali
EMERGENZE - RASFF
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b) ESTRAZIONE DEL DNA
c) ANALISI IN REAL TIME PCR
FLUSSO ANALITICO DEI CAMPIONI PER RICERCA DI OGM
a) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LABORATORIO
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MATRICI OGGETTO DI RICERCA OGM GRANELLE: gli OGM sono considerati sostanze distribuite in modo NON OMOGENEO nel prodotto
1 solo chicco può essere GM
Per ovviare al problema occorre rendere OMOGENEO il campione in analisi all’atto del campionamento attraverso la macinazione
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ARRIVO DEL CAMPIONE IN LABORATORIO
N.B: Il campione deve essere miscelato il più possibile e ciò si ottiene attraverso l'uso di un frullatore a lame o nel caso di materie prime in grani attraverso un mulino
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Miscelazione manuale
Formazione del campione analitico
250 g di campione
Il campione deve essere miscelato il più possibile e ciò si ottiene attraverso l'uso di un frullatore a lame o nel caso di materie prime in grani attraverso un mulino
Pesata del campione
2 g (5 g per riso e mangimi)
a) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LABORATORIO
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b) ESTRAZIONE DEL DNA Da ricordare sempre L'obiettivo di un metodo di estrazione è quello di ottenere un «DNA»: In quantità adeguata Non degradato Puro e privo di sostanze inibenti Con un metodo che sia veloce ed economico nella sua esecuzione
Due replicati di estrazione di DNA per ciascun campione analitico
A B
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Proteinasi K
+ Campione
+ Lysis /
Binding
Buffer
Membrana di
silice
Eluente (Eluition
Buffer o H2O) a
bassa
concentrazione
salina
NB: Per
rimuov
ere
impurit
à.
METODO CON COLONNINE IN SILICE
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Lisi del campione in buffer acquoso CTAB (hexadecyl-trimetyl ammoniumbromide)
Necessario a solubulizzare la membrana plasmatica delle cellule da cui si ottiene una
miscela di componenti intracellulari (DNA, RNA, proteine e carboidrati).
l'EDTA presente nel tampone di lisi elimina i cationi bivalenti e inibisce l'azione
delle DNAsi.
Aggiunta di Rnase A e Proteinase K e incubazione a 65°C x 30'
Separazione mediante centrifugazione della parte solida di estrazione
Solubilizzazione della contaminante proteica con Cloroformio
Precipitazione del DNA con Isopropanolo
METODO CTAB
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QUANTIFICAZIONE DEL DNA
Lettura spettrofotometrica basata sull'Assorbanza del DNA a 260nm
rapporto di Assorbanza 260/280 > 1.8
In base alla concentrazione del DNA ottenuta si proseguirà nelle analisi in
Real Time PCR, per ciascun replicato di estrazione in doppia replica
come segue:
Monitor run HMG-LECTINA-GS- PLD DNA> 40ng/uL Analisi: DNA a 40ng/uL e 10ng/uL
Monitor run HMG-LECTINA-GS- PLD DNA < 40ng/uL Analisi: DNA Tal quale e dil 1:4
Monitor run SAD DNA < 20ng/uL Analisi: DNA Tal quale e dil 1:4
Monitor run SAD
DNA > 20ng/uL
Analisi: DNA a 20ng/uL e 5ng/uL
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APPROCCIO MULTI STEP ALL’ANALISI OGM
1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)
2) Screening costrutti genici
3) Ricerca evento transgenico specifico
4) Quantificazione evento transgenico rilevato
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HMG LECTINA
Reg. (CE) n. 1829/2003
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ESTRA
1) Screening specie vegetali dichiarate in etichetta
Presenza di DNA di Soia… POS
NEG DNA di specie assente o non amplificabile
La “monitor PCR” specie-specifica, detta anche “Inhibition run” fornisce evidenza della presenza , nel campione, di DNA amplificabile appartenente alla specie vegetale dichiarata in etichetta o nel documento commerciale Valutazione del ∆Ct tra le curve a differente concentrazione
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MAIS HMG: sequenza che codifica per la proteina High Mobility group
SOIA LECTINA: sequenza che codifica per la Lectina
RISO PLD: sequenza che codifica per la proteina
Fosfolipasi D
1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)
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Barbabietola
da
zucchero
GS: seqenza che codifica per la proteina Glutamine Synthetase
LINO SAD: sequenza che codifica per la proteina stearoyl-acyl carrier desaturase
UPGase: sequenza che codifica per la proteina
UDP-glucose pyrophosphorilase PATATA
1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)
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COLZA
COTONE Acp1 sequenza che codifica per Acyl carrier protein
1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)
CruA promotore del gene cruciferina A
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Promotore 35S: sequenza promotore 35S del Virus del mosaico del cavolfiore Terminatore NOS: gene Nopalina sintetasi di Agrobacterium tumefacies PAT: gene fosfotricin acetiltransferasi di Streptomyces viridocrhromogenes NPTII: gene per neomicin fosfotransferasi II di Escherichia coli CP4-EPSPS: derivato dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefacies Costrutto CTP-CP4-EPSPS: derivato dalla congiunzione della sequenza codificante per CTP da Arabidopsis thaliana e la sequenza EPSPS dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefacies
2) Screening costrutti genici
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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta
2) Screening costrutti genici
POS
POS Presenza gene/costrutto
NEG Assenza gene/costrutto
ESISTONO ECCEZIONI
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p35S Tnos NPTII PAT CP4-
EPSPS
(IT)
CTP-
CP4EPSP
S (IT)
CTP2-
CP4EPSP
S
(DE/ISO)
BAR
ATTESO
VERIFI
CATO ATTESO
VERIFI
CATO
ATTE
SO
VERIFI
CATO
ATTE
SO
VERIFI
CATO
ATTE
SO**
VERIFICA
TO
VERIFICA
TO
VERIFICA
TO ATTESO
VERIFI
CATO
cotone MON1445 7 P + P + P + A - P - + +3
A -4
cotone MON15985 8 P + P + P + A - A - - A -4
cotone MON531 7 P + P + P + A - A - - A -4
cotone LL25 P + P + A - A - A - - P +3;4
cotone GHB614 A - A - A - A - A - - A
cotone 3006-210-23 x 281-24-236 A - A - A - P + A - - A -4
cotone MON88913 8 P1
+ A - A2
+ A - P - + +3
A -3
cotone GHB119 P + P + A - A - A - - P +3
cotone T304-40 P + P + A - A - A - - P +3
mais Bt11 P + P + A - P + A - - A -4
mais DAS1507 P + A - A - P + A - - -3;4
A -4
mais DAS59122 P + A - A - P + A - - -4
A -4
mais GA21 A - P + A - A - A - - -3;4
A -4
mais MIR162 A - P + A - A - A - - -3
A
mais MIR604 A - P + A - A - A - - -3
A -4
mais MON810 P + A - A - A - A - - -3;4
A -4
mais MON863 P + P + P + A - A - - A -4
mais MON88017 P + P + A - A - P + - +3;4
A -4
mais NK603 P + P + A - A - P + - +3;4
A -4
mais T25 P + A - A - P + A - - -4
A -4
mais MON89034 P + P + A - A - A - - A
mais 3272 A - P + A - A - A - - -4
A -3;4
mais 98140 P + A - A - A - A - - A
mais DAS40278-9 A - A - A - A - A - - A -3
mais MON87460 P + P + P + A - A - - - A -
mais Bt176 (b) 6 P + A - A - A - A - - -4
P +3;4
mais LY038 A - A - A - A - A - - -3
A -3
mais DAS59132-8 (Event 32 or E-32) P + A - A - P + A - - A
colza MS8/RF3 A - P + A - A - A - - -4
P +3;4
ELEMENTO DI SCREENING
COSTRUTTO CTP-EPSPS (3 METODI):
Specie vegetale Evento GM
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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta
2) Screening costrutti genici
3) Ricerca evento specifico
POS
POS
POS Rilevato DNA di Soia RRS… NEG
Contaminzaione botanica? Contaminazione in tracce?
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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta
2) Screening costrutti genici
3) Ricerca evento specifico
4) Quantificazione evento transgenico rilevato
POS
POS
POS
Valore riscontrato in %
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Il metodo che utilizziamo è la Quantificazione Relativa è basato sulla valutazione del Ct: Ct dell' evento transgenico che si sta cercando (es. RRS Round up Ready Soy evento MON 40-3-2) VS Il Ct del gene specifico di specie (es. Lectina) Per fare questo si costruisce una curva standard utilizzando Materiale certificato (CRM) a concentrazione nota di materiale GM
4) Quantificazione evento transgenico rilevato
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Algoritmo di calcolo quantificazione relativa
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PER CONCLUDERE (1):
Se si tratta di OGM autorizzati > 0.9% dichiarato in etichetta: CAMPIONE CONFORME
< 0.9% NON dichiarato in etichetta: CAMPIONE CONFORME > 0.9% NON dichiarato in etichetta: CAMPIONE NON CONFORME
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PER CONCLUDERE (2):
Il crescente numero a livello Europeo di eventi di trasfromazione che vengono
autorizzati rende, dal punto di vista analitico, sempre più difficile per i laboratori
rimanere al passo.
A tal riguardo lo sviluppo tecnologico sarà un valido supporto????
– Sviluppo di metododi di screening usando multiplex real time PCR
– DDPCR (Digital Droplet PCR)
– NGS Next Generetion Sequencing
SI