Opšta fiziologija sa biofizikom – Vežba br. 6

Metode za određivanje uobličenih elemenata krvi

Postupak brojanja eritorcita

Eritrociti (crvena krvna zrnca)

Glavna funkcija eritrocita (erythros – grč. crveno; kytos – grč. udubljenje) je transport hemoglobina, koji, s jedne strane, prenosi kiseonik iz pluća u tkiva, a s druge prenosi 23 % vezanog ugljen dioksida iz tkiva u pluća. Osim toga, eritrociti sadrže veliku količinu enzima karboanhidraze koja nekoliko hiljada puta ubrzava reakciju između ugljen dioksida i vode u eritrocitima i na taj način omogućava da krv primi i transportuje velike količine ugljen dioksida iz tkiva u pluća. Usled prisustva hemoglobina eritrociti čine puferski sistem krvi.

Stvaranje eritrocita u embriogenezi počinje rano i odvija se u tri faze:

- tokom prvih nekoliko nedelja eritrociti nastaju u krvnim ostrvcima žumancetne kese;

- u drugom tromesečju intrauterinog života, glavni organ u kojem se stvaraju eritrociti je jetra, premda priličan broj eritrocita nastaje i u slezini i limfnim čvorovima;

- pred kraj trudnoće i po rođenju, eritrocite stvara koštana srž.

Tokom života eritrociti nastaju u koštanoj srži procesom eritropoeze, iz pluripotentne hematopoetske ćelije koja daje sve ćelije krvne loze. Iz nje nastaje hemocitoblast, unipotentna, usmerena hematopoetska ćelija, a zatim eritroblast u kome otpočinje sinteza hemoglobina. Hemoglobin se nagomilava u ćeliji, jedro se smežura i nastaje normoblast. Kada količina hemoglobina dostigne granicu ćelijskog mehanizma kojim se stvara hemoglobin, jedro se izbacuje, endoplazmatični retikulum počinje da resorbuje i nastaje retikulocit. Retikulociti se procesom dijapedeze provlače kroz pore krvnih kapilara i prelaze u krvotok. U krvi se nalazi oko 1 % retikulocita, koji još 1 – 2 dana proizvode hemoglobin na ostacima endoplazmatičnog retikuluma, nakon čega on iščezava i nastaje zreli eritrocit.

Na proces eritropoeze utiču hormon bubrega eritropoetin, vitamin B12 i folna kiselina.

Dimenzije eritrocita čoveka su 7, 5 µm x 2, 5 µm. Eritrociti sisara imaju oblik bikonkavnih diskova, što predstavlja optimalan oblik za razmenu gasova, ali im daje i fleksibilnost za provlačenje kroz kapilare. Životni vek eritrocita iznosi 120 dana. Membrana vremenom postaje krhka i erotrocit prska prolazeći kroz neko suženje u sistemu za cirkulaciju, što se najčešće dešava u slezini ili jetri. Hemoglobin iz raspadnutog eritrocita fagocituju i obrađuju makrofagi. Gvožđe se transportuje u koštanu srž, gde se ugrađuje u hemoglobin novih eritrocita ili se deponuje u jetri, a protoporfirin se pretvara u žučne boje.

U normalnim fiziološkim uslovima broj eritrocita u krvi je stalan u okviru jedne životinjske vrste, a takođe je karakterističan za vrstu. Stalan broj eritrocita predstavlja rezultat dinamičke ravnoteže između degradacije starih i formiranja novih. Takođe, i veličina eritrocita je karakteristična za vrstu – što su eritrociti veći, manje ih je i obratno. Referentna vrednost za

krv čoveka je 5 ∙ 1012 /l. Broj eritrocita veći je kod muškog pola i opada sa starenjem. Promena broja eritrocita može biti rezultat promene apsolutne količine eritrocita usled bolesti, ali i rezultat njihove preraspodele između krvotoka i depoa eritrocita. Povećanje broja eritrocita u krvi usled nedostatka kiseonika u krvi ili tkivne hipoksije naziva se policitemija. Tokom asfiksije (gušenja) ili stresa, usled povećanog lučenja adrenalina, kapsula slezine mnogih sisara se kontrahuje i istiskuje eritrocite u cirkulaciju. Eritropoezu stimuliše i boravak u sredini sa smanjenim parcijalnim pritiskom kiseonika.

Smanjenje broja eritrocita u krvi usled brzog gubitka eritrocita ili spore produkcije, patološko je stanje koje se naziva anemija. Aplastična anemija je posledica nesposobnosti koštane srži da stvara eritrocite, zbog zračenja, lekova i hemijskih agenasa. Maturacijska anemija nastaje zbog nemogućnosti sazrevanja eritrocita usled nedostatka eritropoetina, folne kiseline, vitamina B12 ili unutrašnjeg faktora želuca (bez njega se vitamin B12 ne bi mogao resorbovati u tankom crevu). Hemolitička anemija nastaje usled pucanja abnormalnih eritrocita sa krhkom membranom, tokom prolaska kroz krvne kapilare. Srpasta anemija je posledica supstitucione mutacije u genu za β – globinski lanac hemoglobina...

Postupak brojanja eritrocita

Potreban materijal:

Aparati: svetlosni mikroskop

Pribor: hemocitometar, lanceta, vata

Hemikalije: fiziološki rastvor – izotonični (1 % NaCl), ili Haym – ov rastvor (HgCl2, NaCl, Na2SO4), 70 % etil – alkohol.

Hemocitometar je poseban pribor koji se sastoji od melanžera za uzimanje krvi, komorice za brojanje i mikroskopa. Prema pojedinim autorima hemocitometar je sinonim za samu komoricu za brojanje uobličenih krvnih elemenata.

Melanžeri predstavljaju specijalne mikropipete sa proširenim delom na vrhu i međusobno se razlikuju po zapremini pomenutog proširenja. Melanžeri za uzimanje krvi u svrhu brojanja eritrocita imaju veće proširenje (više se krv razblažuje) i crvenu kuglicu (perlicu) za mešanje u sebi.

- Na stakleni deo melanžera navlači se gumeni nastavak pomoću koga se ustima uvlači krv.

Neubaer - ova komora za brojanje uobličenih elemenata krvi

Ova komora se najčešće koristi u kliničkim laboratorijama i u naučno – istraživačkom radu. Sastoji se od debelog predmetnog stakla na kome su urezana 4 žljeba, između kojih se nalaze 3 polja. Srednje polje je tako izbrušeno da je za 0.1 mm niže od bočnih polja. Ono je podeljeno na 2 dela jednim poprečnim žljebom. U oba dela srednjeg polja urezana je mrežica za brojanje

krvnih elementata. Dužina jedne stranice mrežice iznosi 3 mm; ukupna površina je 9 mm2. Mreža se sastoji iz 9 velikih kvadrata, čija je površina 1 mm2.

Neubauer-ova komora i izgled mrežice za brojanje (uvećano)

Svaki od velikih kvadrata u uglovima, podeljen je jednostrukim crtama na 16 manjih kvadrata. Površina svakog malog kvadrata je 1/16 mm2. U njima se broje se leukociti.

Centralni veliki kvadrat podeljen je takođe na 16 manjih, a svaki manji kvadrat je još podeljen na 25 malih kvadrata, površine 1/400 mm2.

Veliki središnji kvadrati podeljeni su u 16 manjih kvadrata, a svaki manji je podeljen na 5 pravougaonika (4 pravougaonika i po dva polupravougaonika). Svaki pravougaonik ima površinu od 1/80 mm2.

Pojedine komorice, ukoliko su od različitih proizvođača, mogu se unekoliko razlikovati po broju linija i načinu njihovog povlačenja, međutim površine su uvek iste, odnosno ukupna površina komorice za brojanje iznosi 1mm 2 , a dubina 0, 1 mm. Postoje Thoma – Zeiss – ove, Bürker – ove, Türck – ove, Neubauer – ove komore. U zavisnosti od karakteristika komorice (od različitih proizvođača), vrši se preračunavanje broja ćelija u suspenziji na određeni način.

Brojanje ćelija pomoću ovih komorica je sporo, ali se smanjuje greška brojanja izbegavanjem agregiranih ćelija, a moguće je odrediti i broj živih (vijabilnih) ćelija.

- Uzimanje krvi za brojanje eritrocita – iz jagodice domalog prsta

1. Najpre se izvrši dezinfekcija jagodice prsta iz kojeg će krv biti uzeta, tako što se vatom natopljenom 70 % etil – alkoholom pređe preko distalne falange. Dok se alkohol na prstu suši, sterilna lanceta se vadi iz pakovanja, a zatim se vrši ubod na vrhu jagodice.

2. Potom se krv brzo uvuče u odgovarajući melanžer do oznake 0, 5 ili 1 – eksperimentator odredi do kog podeoka će da uvuče krv i potrebno je da taj podatak zapiše zbog kasnijeg proračuna razblaženja – a zatim se do oznake 101 iznad proširenja melanžera uvlači rastvor za razblaženje eritrocita, Hayem – ov rastvor (ili fiziološki, izotonični, rastvor). Ako se krv uzme do oznake 0, 5 a rastvor za razblaženje do oznake 101, krv je razblažena 200 puta. Ako se krv uzme do oznake 1, a rastvor za razblaženje do oznake 101, krv je razblažena 100 puta. Prstom se zatvaraju oba kraja melanžera da bi se krv dobro mešala – mešanje se vrši pažljivim mućkanjem melanžera (iz zgloba), 1 – 3 minuta.

3. Za to vreme na mikroskopu se izoštri mreža u komori za brojanje i pokrije pokrovnom ljuspicom. Pokrovna jluspica se pažljivo navlači!!! (potrebno je da se uoče tzv. Njutnovi prstenovi – otisci prsta u „duginim bojama“) na ovlažena bočna polja komore. Odstranjuje se nekoliko kapi iz melanžera i sledeća kap kane u neposrednu blizinu ljuspice. Ona će se razliti ravnomerno ispod ljuspice i uliti u komoru.

4. Eritrociti se broje u malim kvadratima površine 1 / 400 mm2, i to najmanje u 80 takvih kvadratića. Najzgodnije je izbrojati eritrocite u 4 polja dijagonalno i u polju koje se nalazi u gornjem desnom ili donjem levom uglu centralnog kvadrata (broji se 5 polja po 16 kvadratića, što ukupno iznosi 80 kvadratića).

Napomena: ukoliko neki eritrociti leže na ivicam polja, onda se broje oni koji leže na donjoj levoj ILI gornjoj desnoj ivici.

5. Potom se broj ovih krvnih elemenata izračunava na sledeći način:

dobijeni broj eritrocita treba podeliti sa 80, a pomnožiti sa 400 ( jer ima 400 malih kvadratića)

ovako dobijenu vrednost treba pomnožiti sa 10 (jer je zapremina između pokrovne pločice i srednjeg spuštenog dela 0, 1 mm3, te se ovim množenjem dobija broj eritrocita u zapremini od 1 mm3).

zatim sve treba pomnožiti sa razblaženjem, 100 ili 200, zavisno od toga do koje zapremine smo uzeli krv u melanžer

pomnožiti sa 106 - novi međunarodni sistem jedinica usvojio je izražavanje broja krvnih elemenata na 1 litar krvi te se stoga vrednost dobijena u 1 mm3 množi sa 106.

Dakle, broj eritrocita u litru krvi izražava se prema sledećoj formuli

Br. eritrocita po litru = br. er. u 5 polja/80 x 400 x 100 (ili 200) x 10 6