光反応性架橋試薬と糖鎖特異的分子プローブを用いたヘパラン硫酸糖鎖検出法

応用生物科学部　応用生命科学課程准教授　　矢部　富雄

東海国立3大学　新技術説明会

Jun. 1, 2012

背景①

グリコサミノグリカン糖鎖

糖鎖構造をダイナミックに変化させ、生体機能を調節

細胞表面・細胞外マトリクスに存在

糖鎖構造をモニターすることで細胞の状態がわかるようになる

疾病と糖鎖構造の相関が明らかになれば診断マーカーとして有効

糖鎖構造を特異的に認識する分子プローブがあれば・・・

糖鎖構造を簡便便に識識別することは困難

しかし・・・グリコサミノグリカン糖鎖は・生体内に微量にしか存在しない

・硫酸化パターンが多様で構造が非常に複雑

・糖鎖を抗原とする抗体の作成が困難

背景②

目的

• 組織中のヘパラン硫酸糖鎖の簡便な定量と検出

• 他の硫酸化糖鎖に影響されずに検出できる

• 光架橋により，結合力にかかわらず検出可能

• キット化が容易な競合法による定量が可能

従来技術との比較

ヘパラン硫酸糖鎖二糖単位の構造

N-アセチルグルコサミングルクロン酸

ファージディスプレイ法でのスクリーニング

マウス脳由来 cDNAライブラリーをファージで提示 Phage

AT-III結合ヘパリンをタイタープレートに固定

洗浄

結合しなかったファージ

ヘパリンを認識したファージ

溶出

増幅

次のパニングに供与

Heparin-associated peptide Y (HappY)RTRGSTREFRTG

CGGACGCGTGGGTCGACCCGGGAATTCCGGACCGGT

BIACORE 相互作用解析RTRGSTREFRTG ATAGSTAEFATG

KD = 1.33 ± 0.25 nM

436 uM218 uM109 uM43.6 uM

436 uM218 uM109 uM43.6 uM

HappY 109 uMR10A 109 uM

N-biotin 364 uM1:0.0001

HappY only1:0.001

1:0.011:0.1

1:1

competition - heparin

RU

Res

p. D

iff.

Time (sec)

HappY only

+ Heparin

+ Heparan sulfate

+ Hyaluronic acid

+ Keratan sulfate

+ Chondroitin sulfate

HappYとグリコサミノグリカンの競合試験

HappY はヘパリンと特異的に結合する

ThrombinAT-III

HeparinHappY(µM) 10 50 100 200 400

***

**

* : P

0

10

20

30

40

50

heparin +– –– + ++FGF-1 +

HappY (nM) –10 1000100 10 1000100––+ + + + + + +

neur

ite le

ngth

(µm

/cell)

0

10

20

30

40

50

60

heparin –– –+–+– –– + ++FGF-1 (ng/ml) –– –55–– –– – ––FGF-2 (ng/ml) 5– 10–––– –– – ––

HappY (nM) –– ––––10 103102 10 103102

* ** : P

0

10

20

30

40

***

***

: P

HN

OHN

SS

CH3OO

NH

OHN

O

S

NHHN

O

NHO

FF

F F

NN+

-N

O

29.3 Å

35.2 Å

Mts-Atf-LC-Biotin(Methanethiosulfonate-azidotetrafluoro-LongChain-Biotin)

M.W. 953.11

HappY-Cys とジスルフィド結合

UV照射によりC-HまたはC-NH2と架橋

FITC標識ストレプトアビジンにより検出

光架橋剤の利用

Atf

N3

SSCys HappY

Biotin

HappYSHCys

Atf

N3

S

Biotin

SO O

CH3

RTRGSTREFRTGC-SH

Mts-Atf-LC-biotin

Mts

N N N+ -

UV照射

N

Nitrene

R-H

R-NH2

R

NHR

NH

RHN

NR

C-H insertion

N-H insertion

addition

UV照射により非特異的な共有結合を形成する

光架橋剤によるHappYの標識

光架橋剤標識HappYによる競合式定量法

SA-FITC

Streptavidin-coated plate

Biotin bloking

Biotinylated heparin

Ex/Em = 485/520 nm蛍光プレートリーダーで測定

UV365nm照射による架橋形成

Happy probe

GAGs

混合してから添加

Cross-linked

Atf

N3

SSCys

HappY

Biotin

Heparin-conjugated EAH-sepharose beads

Cross-linked

SA-FITC

UV365nmirradiation

光架橋剤標識HappYによる組織染色への応用

+ HappY+ HP

+ HappY- HP

- HappY+ HP

光架橋剤標識HappYによる組織染色への応用

直腸の粘膜組織の結合組織型肥満細胞を検出HR/HTase& RNase (+)

RNase (+)

酵素処理なし

HappY(Texas red)

TB染色

他の研究等との違い

疾病の状態を検査するためには、病気の種類を想定して適当な疾患バイオマーカーを選択する必要がある

これまでの疾病診断とその研究

疾患バイオマーカーを探索する

GAG糖鎖を利用した疾病診断とその研究

組織中の細胞表面の糖鎖構造を判断し、関連する疾患を特定する

糖鎖構造と疾病との関連を分子プローブを利用して解析する

お問い合わせ先岐阜大学　産官学融合本部知財戦略室　馬場大輔

TEL：058-293-3349 FAX：058-293-2032 E-mail：dbaba@gifu-u.ac.jp

番　号：WO2011/048922，特願2011-195558出願人：岐阜大学発明者：矢部富雄

本技術に関する知的財産権