This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Die Autoren erweitern den Begriff Blastokolin auf alle Verbindungen, welche die Keimung bei einer Verdünnung von mindestens 1 : 10000 deutlich herab-setzen. Dabei ist die Grundvoraussetzung, daß die Blastokoline genuine Stoffe sind, völlig vernachlässigt. Es genügt nicht, Blastokoline durch ihre Wirksamkeit bei 1 : 1 0 000 zu charakterisieren. Auch die Unter-scheidung besonderer Rhizakoline, die nur eine Hem-mung des Wurzelwachstums bedingen, ist unnötig. Denn ob Sprosse oder Wurzeln gehemmt werden, ist

abhängig von der Dosierung. Jedes Rhizakolin hemmt bei einer genügend hohen Dosis sowohl die Keimung als auch das Sproßwachstum.

Der Begriff Blastokolin sollte nur dann gebraucht werden, wenn die biologische Funktion in Extrakten mit arteigenen Samen (oder Pollen, Zygoten) nach-gewiesen ist. Sonst spricht man besser allgemein von Keimungshemmstoff (germination inhibitors15) oder von wachstumshemmenden Stoffen (growth inhibi-tors).

Über die Wirkung von ds-Zimtsäure und einigen isomeren Verbindungen auf Chlamydomonas-Zygoten

V o n FRANZ MOEWUS u n d BASUDEV B A N E R J E E *

Aus dem Max-Planck-Institut für medizinische Forschung, Institut für Chemie, Heidelberg (Z. Naturforschg. 6 b, 270—273 [1951]; eingegangen am 11. Mai 1951)

Im Keimungstest mit Zygoten der blastikos-Rasse von Chlamydomonas eugametos haben Zimtaldehyd, o-Cumarsäure und /?-d-Glucosido-o-cumarsäure nur eine geringe keimungs-hemmende Wirkung. Cumarin ist etwa 100-mal wirksamer, frans-Zimtsäure etwa 10-mal aktiver als Cumarin. Die Wirkung der cis-Zimtsäure übertrifft die der irans-Form um fast das 100-fache. Die 3 allotropen Modifikationen der cis-Zimtsäure (Schmp. 42°, 58°, 68°) verhalten sich physio-logisch gleichartig. Cumarin ergibt bei 10—8 g/ccm, cis-Zimtsäure bei 10—11 und 10 _ 1 2 g/ccm eine statistisch gesicherte Keimungsförderung gegenüber der Kontrolle.

Die Zygoten der Grünalge Chlamydomonas euga-metos enthalten einen Keimungshemmstoff (Bla-

stokolin) 1. Ihre Keimung setzt erst dann ein, wenn die Konzentration dieses Stoffes innerhalb der Zelle herab-gesetzt wird. Bei der Rasse blastikos läßt sich die Kei-mung auslösen, indem man die Zygoten aus dem Kulturmedium, in welchem sie sich seit der Entstehung befanden, in frische Nährlösung überträgt. Dadurch entsteht ein Diffusionsgefälle. Der Blastokolingehalt im Zellinnern sinkt. Nach nochmaligem Wechsel sind die Zygoten dann zu mehr als 8 5 % keimfähig. Diese ausgewaschenen Zygoten wurden als Testmaterial zum Nachweis von Stoffen verwendet, die eine kei-mungshemmende Wirkung ausüben.

Da über die chemische Natur des Blastokolins nichts bekannt war, wurde zunächst die Wirkung einiger organischer Säuren geprüft. Dabei hat sich ergeben, daß trans-Zimtsäure die Zygotenkeimung auffallend stark hemmt 1 : bei einer Konzentration von 10~7 g/ccm

1 F. M o e w u s , Z. Naturforschg. 5b, 196 [1950]. 2 J. B. K o e p f I i , K. V. T h i m a n n , F. W. W e n t ,

J. biol. Chemistry 122, 763 [1937/38]; H. V e l d s t r a , Enzymologie [Den Haag] 11, 97 [1943/45].

3 G. E b e r t , Liebigs Ann. Chem. 226, 347 [1884].

wird die Keimung noch um etwa 5 0 % gegenüber der Kontrolle unterdrückt. Auch Cumarin, das Lacton der Cumarinsäure (cis-2-Oxy-zimtsäure) hat sich als sehr wirksam erwiesen. In verschiedenen pflanzlichen Wuchsstofftesten2 hatte sich gezeigt, daß c/s-Zimt-säure im Gegensatz zur trans-Form wachstumsför-dernd wirkt. Es war daher wichtig zu wissen, welche Wirkung cis-Zimtsäure und andere isomere Verbin-dungen auf Chlamydomonas-Zygoten ausüben^

Folgende Verbindungen wurden im Keimungs-Test mit Chlamydomonas-Zygoten vergleichend untersucht:

1. Zimtaldehyd.

2. o-Cumarsäure (frans-2-Oxy-zimtsäure). Diese er-hielten wir durch alkalische Hydrolyse von Cumarin mit Natriumalkoholat nach der Methode von E b e r t 3 .

3. /?-d-Glucosido-o-cumarsäure. Sie wurde darge-stellt durch Kondensation von Helicin mit Malon-säure in Gegenwart von Pyridin und einigen Tropfen Anilin nach H e l f e r i c h und L u t z m a n n 4 .

* Senior Research Fellow of Bose Institute Calcutta, working as a Govt. of India Scholar.

4 B. H e l f e r i c h u. H. L u t z m a n n , Liebigs Ann. Chem. 537, 11 [1939],

4. Cumarin. 5. frans-Zimtsäure. 6. Die 3 allotropen Modifikationen der cis-Zimt-

säure. Nach den Angaben von S t o e r m e r 5 und S t o b b e 6 wurden die L i e b e r m a n n s e h e 7 Iso-zimtsäure (Schmp. 58°) und Allo-zimtsäure (Schmp. 68°) durch photochemische Umwandlung von trans-Zimtsäure dargestellt. Die E r l e n m e y e r sehe8 Iso-zimtsäure (Schmp. 42°) erhielten wir nach der Methode von B i i l m a n n 9 aus der L i e b e r m a n n sehen Iso-zimtsäure.

Die für diese Versuche verwendeten Zygoten waren 3 Monate alt. Nach dreimaligem Auswaschen mit dest. Wasser wurden die Zygoten entweder in Volvox-Lösung (Keim-Kontrolle) oder in die Versuchslösung gebracht, in welcher die zu prüfende Substanz in VoZuox-Lösung aufgenommen war. Jede Verbindung wurden in mehreren Verdünnungsstufen getestet, und zwar in 2 Parallelversuchen9a. Die Versuche wurden in einem Photostaten (O s r a m-HNT-Leuchte, 25 Watt) bei 15—17 cm Entfernung von der Lichtquelle und einer Temperatur von 20° bis 22° C durchgeführt. 24 Stdn. nach Versuchsbeginn wurde mit Alkohol fixiert. Aus jedem Kulturgefäß wurde ein Tropfen Zygotensuspension entnommen und auf einen Objekt-träger gebracht, der in qmm-Felder eingeteilt war. Durchschnittlich wurde an 200—300 Zygoten pro Ver-suchslösung festgestellt, ob sie gekeimt waren oder nicht.

Als Bezugsgröße für die Keimungshemmung der geprüften Verbindungen wurde der Prozentsatz ge-keimter Zygoten in VoZuox-Lösung verwendet. Dieser Kontrollwert wurde in 8 Parallelversuchen an 1186 Zy-goten bestimmt. Der durchschnittliche Keimprozent-satz betrug 85,92 ± 0 ,429%. Die 8 Einzelbestimmun-gen ergaben folgende Werte: 8 1 , 7 5 % (n = 126), 83 ,04% (n = 171), 8 4 , 6 2 % (n = 143), 85 ,44% (n = 158), 86,67% (n - 135), 88 ,34% (n = 146), 88,46% (n = 156), 88,74% (n = 151). Die Homogenitätsprü-fung ergab ein von 5,8215 und P 0,5—0,7.

In Tab. 1 sind die Keimprozente und die Zahl der geprüften Zygoten angegeben. Zimtaldehyd und o-Cumarsäure sind nur schwach wirksam. Denn bei 10—5 g/ccm wird die Keimung kaum noch beeinflußt.

5 R. S t o e r m e r , Ber. dtsch. chem. Ges. 44, 637 [1911].

6 H. S t o b b e u. F. K. S t e i n b e r g e r, Ber. dtsch. chem. Ges. 55, 2225 [1922],

7 C. L i e b e r m a n n , Ber. dtsch. chem. Ges. 23, 141, 2510 [1890].

8 E. E r l e n m e y e r , Liebigs Ann. Chem. 287, 1 [1895].

Bei 10~6 g/ccm Zimtaldehyd wird e i n » Keimung von 89,25 % erhalten, d. h. eine Förderung gegenüber der Kontrolle. Dieser Unterschied ist jedoch statistisch nicht gesichert, da die Differenz kleiner ist als 2 od (OD = 2,1 %) 1 0 . Das Glucosid der o-Cumarsäure, ß-d-Glucosido-o-cumarsäure, ist weniger aktiv als das Aglukon.

Cumarin ist etwa 100-mal wirksamer als die eben erwähnten 3 Verbindungen. Seine keimungshem-mende Wirkung hört erst bei einer Verdünnung von 10—7 g/ccm auf. In einem Vorversuch wurde bei 10—8 g/ccm eine Keimungsförderung gegenüber der Kontrolle festgestellt. Die Differenz von 5 , 7 % war jedoch statistisch nicht zu sichern. Durch Vergröße-rung des Zahlenmaterials (im ganzen 6 Auszählungen) gelang es, diesen Befund zu bestätigen. Die einzelnen Keimprozente waren: 89,07 % (n = 183), 91,07 % (n - 168), 91,49 % (n = 141), 91,50 % (n - 153), 92 ,31% (n = 183), 92 ,59% (n = 189). Hieraus ergibt sich ein Mittelwert von 91,29 ± 0,908 % (n = 964). Die Homogenitätsprüfung ergibt %2 = 2,2063 und P 0,8—0,9. Die Differenz zwischen den Keimprozen-ten bei Cumarin 10 ~8 g/ccm und der Kontrolle be-trägt 5 , 3 7 % . Sie ist größer als 3 oD (oD = 1,36 %). Somit ist die Förderung gegenüber der Kontrolle ge-sichert. Bei 10—9 g/ccm läßt sich keine Förderung mehr nachweisen.

Die Keimungshemmung durch trans-Zimtsäure er-gibt das bereits früher beschriebene Bild1 . Sie ist etwa 10-mal wirksamer als Cumarin. Bei den Kon-zentrationen zwischen 10—9 und 10—12 g/ccm ist keine Förderung gegenüber der Kontrolle festgestellt wor-den.

Die 3 allotropen Modifikationen der cis-Zimtsäure sind etwa 100-mal wirksamer als die irans-Zimtsäure. Um zu beweisen, daß sich die 3 allotropen Modifika-tionen gleich verhalten, wurden die Auszählungen einer Homogenitätsprüfung unterzogen (Tab. 2). Diese ergab für die Konzentrationen zwischen 10—8 und 10—12 g/ccm befriedigende P-Werte. Die Ergebnisse können also zusammengefaßt werden. In Tab. 1 ist der General-Mittelwert angegeben.

Bei einer Konzentration von 10—10 g/ccm ist die Förderung gegenüber der Kontrolle in Höhe von

» E. B i i l m a n n , Ber. dtsch. chem. Ges. 42, 182 [1909],

9a Bestimmungen der Wasserstoffionenkonzentration ergaben pg 6,5 für Voiuox-Lösung und für alle Versuchs-lösungen. Nur o-Cumarsäure, 10~4 g/ccm, hat pg 5,1.

10 0D wurde nach dem strengen Differenzenverfahren berechnet. Vgl. E. W e b e r , Grundriß der biologischen Statistik. 1948.

10 3 g/ccm 10"* g/ccm 10 r'g/ccm 10 6g/ccm 10 - 7 g/ccm 10 8 g/ccm 10 - 9 g/ccm 10- , n g/ccm 10~n g/ccm 10-'-g/ccm 10~13 g/ccm

Zimtaldehyd 34,17 ± 2,08 (518)

84,13 ± 2,30 (252)

89,25 ±1,69 (335)

o-Cumarsäure 36,61 ± 2,81 (295)

82,41 ±2,17 (307)

87,37 ± 1,97 (285)

/J-iZ-Glueosido- 20,14 ± 2,36 60,50 ± 2,92 85,42 ± 2,28 87,18 ± 1,89 o-cumarsäure (288) (281) (240) (312)

Cumarin 0,00 49,04 ± 2,83 86,12 ± 2,05 91,29 ±0,91 84,50 ± 1,96 Cumarin (216) (312) (281) (964) (342)

irflns-Zimtsäure 0,41 ±0,41 (243)

12,48 ± 2,04 (262)

45,42 ± 3,01 (273)

67,67 ± 3,49 (180)

81,73 ±2,75 (245)

87,76 ± 2,09 (197)

86,96 ± 2,48 (184)

85,03 ± 2,01 (187)

cis-Zimtsäure 42 0,00 (296)

0,00 (313)

15,83 ± 1,87 (379)

54,63 ± 2,81 (313)

89,55 ± 1,86 (268)

92,24 ± 1,76 (232)

92,67 i 1,71 (232)

cis-Zimtsäure 58 ' 0,00 (194)

0,00 (259)

21,27 ± 2,31 (315)

48,67 i 2,89 (300)

89,80 ± 1,89 (255)

91,39 ± 1,79 (244)

91,95 ± 1,77 (23G)

cis-Zimtsäure 68 0,00 (392)

1,22 ± 0,69 (246)

16,17 ±1,84 (402)

51,96 ± 2,98 (281)

90,20 ± 1,73 (296)

90,28 ± 1,66 (319)

90,79 ± 1,63 (315)

85,07 ± 1,65 (469)

cis-Zimtsäure 0,00 0,37 17,52 ±1,31 51,79 ± 1,67 89,87 ± 1,05 91,19 ± 1,01 91,70 ' 0,99 (42°, 58°, 68°) (882) (818) (1096) (894) (819) (795) (783)

Tab. 1 Die Keimprozente der blastikos-'Zygoten von Chlamydomonas eugametos. Angegeben ist außerdem der mittlere Fehler und in () die Zahl der geprüften Zygoten.

Bei der Kontrolle beträgt die Keimung 85,92 "/<,•

cis- 10 8 g/ccm 10 'J g/ccm 10 x,) g/ccm i o - n g/ccm 10-12 g/ccm td bo

Zimtsäure + — n °/o + — n % + — ii % + — n % + — n "A.

> Z M

„ 1. Versuch 42 2. Versudi

23 37

150 169

173 206

13,29 17,96

83 ' 88

72 70

155 158

53,55 55,70

105 135

14 14

119 149

88,24 90,60

109 105

8 10

117 115

93,16 91,30

111 104

10 7

121 111

91,74 93,67

V

M M

1. Versuch 2. Versuch

27 118 145 18,62 66 75 141 46,81 111 14 125 88,80 108 11 119 90,76 114 13 127 89,76 1. Versuch 2. Versuch 40 130 170 23,53 80 79 159 50,31 118 12 130 90,77 115 10 125 92,00 103 6 109 94,49

1. Versuch 2. Versuch

32 177 209 15,31 72 71 143 50,35 127 12 139 91,30 141 17 158 89,24 131 16 147 89,12 1. Versuch 2. Versuch 33 160 193 17,10 74 64 138 53,62 140 17 157 89,17 147 14 161 91,30 155 13 168 92,20

Summe 192 904 1096 17,52 463 431 894 51,79 736 83 819 89,87 725 70 795 91,19 718 65 783 91,70

Z2 7, 252 2, 324 1,143 1,145 3,681 P ~ 0,20 0 ,80- - 0 , 7 0 ~ 0,95 0,95 0,30 -- 0 , 2 0

Tab. 2 Die Wirkung der 3 allotropen Modifikationen von cis-Zimtsäure (42°, 58°, 68°) auf blastikos-Zygoten von Chlamydomonas eugametos. Angegeben ist unter + die Zahl der gekeimten, — die Zahl der nidit gekeimten Zygoten, n die Gesamtzahl, °/o der Keimprozentsatz für je 2 Versuche. Homogenitätsprüfung und P).

3 , 9 5 % statistisch nicht gesichert, da die Differenz nur 2,63 OD beträgt. Durch Auswertung eines größeren Zahlenmaterials könnte dieser Unterschied wahr-scheinlich gesichert werden. Dagegen ist die Erhöhung der Keimprozente bei 1 0 ~ u g/ccm signifikant, da die Differenz gegenüber der Kontrolle in Höhe von 5,27 % größer ist als 3 ÖD (ÖD = 1 ,49%) . Dasselbe gilt für 10—12 g/ccm, wo die Differenz von 5 , 8 % auch größer ist als 3 ÖD (ÖD = 1,5 %). Die Konzentration 10— 1 3 g/ccm wurde nur mit der dritten cis-Modifikation geprüft. Es ergibt sich ein Keimprozentsatz, der mit der Kon-trolle befriedigend übereinstimmt.

Die verschiedene Wirkungsweise der geprüften Substanzen soll an der graphischen Darstellung (Abb. 1) diskutiert werden. Die Versuchsergebnisse sind in Prozent Hemmung gegenüber der Kontrolle ausgedrückt. Förderungen liegen oberhalb der O-Linie. Die Werte für 50-proz. Hemmung lassen sich mit Hilfe der gestrichelten Linie ablesen. Es ergibt sich folgende Reihe der Wirksamkeit:

/?-d-Glucosido-o-cumarsäure etwa 1 6000 o-Cumarsäure etwa 1 20000 Zimtaldehyd etwa 1 30000 Heteroauxin etwa 1 75000 Cumarin etwa 1 800000 irans-Zimtsäure etwa 1 10000000 cis-Zimtsäure etwa 1 800000000

Die starke Aktivität des Cumarins könnte vor-getäuscht sein. Es ist vorstellbar, daß unter Öffnung des Lactonringes die cis-Form der 2-Oxy-zimtsäure ( = Cumarinsäure) entsteht. Diese sollte wirksamer sein als die frans-2-Oxy-zimtsäure ( = o-Cumarsäure). Denn ein ähnlicher Unterschied zwischen eis- und trans-Form konnte bei der Zimtsäure tatsächlich nach-gewiesen werden. Die cis-2-Oxy-zimtsäure ist in freiem Zustand nicht beständig und konnte daher an Chlamydomonas-Zygoten nicht getestet werden.

Auch die relativ hohe Wirksamkeit der frans-Zimt-säure könnte wenigstens zum Teil darauf zurück-geführt werden, daß durch die Belichtung während der Versuchsdauer11 bereits eine Umlagerung von trans- in cis-Zimtsäure vollzogen wird. Der auffallend

breite Wirkungsbereich der frans-Zimtsäure (Abb. 1) würde dann auf Addition beider Isomeren beruhen. Dann wäre zu erwarten, daß sich bei genügend gro-ßem Zahlenmaterial vielleicht doch die geringe För-derung bei 10— 1 0 und 10— 1 1 g/ccm trans-Zimtsäure als signifikant herausstellt. Im Kressewurzel-Test12

war der Unterschied zwischen eis- und frans-Zimt-säure sehr deutlich. Die trans-Form hatte nur wachs-tumshemmende Wirkung, die c/s-Form ergab in ver-dünnten Lösungen Wachstumsförderungen.

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\ \ X \ \ \ 1 o \\ r

Abb. 1. Die prozentuale Keimungshemmung gegenüber der Kontrolle ( = O-Linie) von Zimtaldehyd ( ^ — ± ), o-Cumarsäure ( o • ), /?-d-Glucosido-o-cumarsäure (+ 1-), Cumarin ( ° o ), frans-Zimtsäure (x x), cis-Zimtsäure ( • • ), getestet an Zygoten der blastikos-Rasse von Chlamydomonas eugametos. Auf der gestrichel-ten Linie sind die Konzentrationen für 50-proz. Hemmung ablesbar. + bedeutet Förderung (oberhalb der O-Linie).

Nach früheren Untersuchungen1 wurde vermutet, daß trans-Zimtsäure das natürliche Blastokolin der Chlamydomonas-Zygoten sein könnte und daß in 10 g getrockneten Zygoten etwa 800 mg enthalten sein müßten. Jetzt hat sich aber herausgestellt, daß die cw-Zimtsäure etwa 100-mal wirksamer ist. Wäre sie das Blastokolin, dann wären in der gleichen Menge Zygoten nur etwa 8 mg zu erwarten. Besonders auf-fallend ist es, daß cis-Zimtsäure in hohen Verdün-nungen keimungsfördernd wirkt. Sie verhält sich wie ein pflanzlicher Wuchsstoff, bei dem es von der Kon-zentration abhängt, ob er das Wachstum hemmt oder fördert.

F. M o e w u s , Biol. Zbl. 63, 169 [1943]. 12 F. M o e w u s , Biol. Zbl. 68, 118 [1949].