Μύκητες‘ΣΚΗΣΕΙΣ... · Πολλαπλασιασμός. Ταξινόμηση...
TRANSCRIPT
Μύκητες
Βασίλειο Των Μυκήτων Ευκαρυωτικοί
μη φωτοσυνθετικοί οργανισμοί 1.500.000 είδη, 75.000 (3%) έχουν περιγραφεί
100-150 λοιμώξεις σε ανοσοεπαρκείς
Το δένδρο της ζωής
Ευκαρυωτικά κύτταρα
Μύκητες (πρώτιστα)
Πρωτόζωα (πρώτιστα)
Μετάζωα ή έλμινθες (ζωϊκό β.)
Προκαρυωτικά κύτταρα
Βακτήρια ή ευ-βακτήρια
Αρχαιοβακτήρια
Ιοί (δεν είναι κύτταρα) (20-200 nm)
Ιοειδή (5 nm)
Prions (<5 nm)
Ταξινόμηση Μικροοργανισμών
Χαρακτηριστικά προκαρυωτικών - ευκαρυωτικών
Χαρακτηριστικό Προκαρυωτικό Ευκαρυωτικό
DNA με πυρηνική μεμβράνη Όχι Ναι
Μίτωση Όχι Ναι
Χρωμοσώματα Ένα Πολλά
Μιτοχόνδρια Όχι Ναι
Μέγεθος ριβοσωμάτων 70S 80S
Χαρακτηριστικά μυκήτων
Μύκητες Φυτά Ζώα
Κυτταρικό τοίχωμα Κυτταροπλασματική μ.
Χιτίνη και γλυκάνη Εργοστερόλη
Κυτταρίνη Φυτοστερόλη
Όχι
Ετερότροφοι Ναι
Χλωροφύλλη Όχι Ναι Όχι
Πυρήνας Απλοειδής (περισσότεροι) 6-20 χρωμοσώματα
Διπλοειδής στην C. albicans
Διπλοειδής Διπλοειδής
Δομή Απλούστερη Όργανα ‘Οργανα, ιστοί
Αναπαραγωγή Σπόρια
Μύκητες
Ταξινόμηση ανάλογα: Μορφολογίας
Τρόπου πολλαπλασιασμού
Γενετικά χαρακτηριστικά
Μύκητες
Μακρομύκητες (μανιτάρια)
Μικρομύκητες Μυκηλιακοί ή υφομύκητες (moulds)
Ζύμες ή βλαστομύκητες (yeasts)
Δίμορφοι μύκητες
Aseptate Hyphae
Υφές χωρίς διαφραγμάτια
Διάμετρος 6-10 μm
Septate Hyphae
Υφές με διαφραγμάτια
Διάμετρος 3-4 μm
ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ
ΜΥΚΗΤΕΣ
ΑΝΩΤΕΡΟΙ
ΜΥΚΗΤΕΣ
Υφομύκητες
Υφομύκητες
Aseptate Hyphae
Υφές χωρίς διαφραγμάτια
σε σταθερά διαστήματα
Διάμετρος 6-10 μm
ΖΥΓΟΜΥΚΗΤΕΣ
Septate Hyphae
Υφές με διαφραγμάτια
Διάμετρος 3-4 μm
ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ
ΒΑΣΙΔΙΟΜΥΚΗΤΕΣ
ΔΕΥΤΕΡΟΜΥΚΗΤΕΣ
ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ
ΜΥΚΗΤΕΣ
ΑΝΩΤΕΡΟΙ
ΜΥΚΗΤΕΣ
Κενοκυτικές υφές
Υφομύκητες
Μυκήλιο
Πλέγμα υφών
Θαλλός
Σύνολο μυκηλίων
ΒΛΑΣΤΙΚΟ ή ΘΑΛΛΙΚΟ
Στο θρεπτικό υλικό
ΕΝΑΕΡΙΟ ή ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ
Πάνω από την επιφάνεια του θρεπτικού υλικού
Μέσα αναπαραγωγής μύκητα: σπόρια ή κονίδια
Φυγόκεντρη ανάπτυξη
Στρογγυλή αποικία in vitro
Κυκλική πλάκα in vivo
Μονοκύτταροι – μονοπύρηνοι οργανισμοί
Βλαστοκονίδια ή βλαστοσπόρια
Ψευδοϋφές: αλυσίδες επιμηκυμένων βλαστοκονιδίων
Ψευδομυκήλιο: πλέγμα ψευδοϋφών
βλαστοκονίδια
Ζυμομύκητες
περίσφιγξη
εκβλάστηση θυγατρικού
κυττάρου
Ασεξουαλικός: μίτωση (βλαστική ανάπτυξη / εκβλάστηση θυγατρικού κυττάρου από το μητρικό κύτταρο)
ανάμορφοι Μ
Σεξουαλικός: μείωση (σύζευξη δύο διαφορετικών στελεχών ή σύζευξη δύο μυκηλιακών κυττάρων / βλαστοκυττάρων του ίδιου μύκητα) [2 πυρήνες σε ζυγώτη] τελειόμορφοι Μ
Περισσότερα ανάμορφα στάδια: συνανάμορφοι
Όλα τα στάδια γνωστά: ολόμορφοι
Πολλαπλασιασμός
Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας
Μυκηλιακοί μύκητες
Ζυγομύκητες
Κοινοκυττάριες ή κενοκυττικές υφές
Ζυγώτης
Σπόροι ενδογενείς (sporangiospore)
sporangium
Αντιπροσωπευτικά γένη:
Lichtheimia (Absidia)
Mucor
Rhizopus
Rhizomucor
Conidiobolus
Basidiobolus
Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας
Μυκηλιακοί μύκητες
Ασκομύκητες
Αληθείς υφές με εγκάρσια διαφράγματα
Ασκοσπόριο
Κονίδιο (κονιδιοσπόριο)
Αντιπροσωπευτικά γένη:
Aspergillus
Penicillium
Paecilomyces
Fusarium
Δερματόφυτα
Blastomyces dermatitis *
Histoplasma capsulatum *
Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας
Βασιδιομύκητες και ατελείς μύκητες
Βασιδιομύκητες
Ψευδοϋφές (σπάνια)
Βασιδιοσπόριο
Βλαστοκονίδιο
Ανάμορφοι (ατελείς) μύκητες
Ψευδοϋφές και αληθείς υφές
Βλαστοκονίδιο, αρθροσπόριο
Αντιπροσωπευτικό είδος:
Cryptococcus neoformans
Αντιπροσωπευτικά γένη:
Candida
Trichosporon
Geotrichum
Σεξουαλικός
πολλαπλασιασμός
Γαμετοκύστεις (θήκες με λεπτό τοίχωμα)
Anteridium (αρσενικό)
Oogonium (θυληκό)
Γαμέτες (μειοσπόρια)
ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ (ΖΥΓΟΜΥΚΗΤΕΣ)
Γαμετοκύστεις = τελικά τμήματα υφών
εμιμήκυνση του ενός προς το άλλο
(zygophore) σύντειξη τοιχωμάτων
Zygosporagium δημιουργία στο εσωτερικό
ενός zygospore σποροκύστη
Σεξουαλικός
πολλαπλασιασμός
Δύο γενετικά συμβατές υφές
Ασκογόνιο (-)
Ανθερίδιο (+)
Ασκοσπόριο
ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ
Σύντηξη των άκρων των υφών
βραχεία δικαρυωτική υφή σύντηξη
πυρήνων (καρυογαμία) μείωση
μία ή διαδοχικές μιτώσεις ασκός =
εξειδικευμένη και διευρυμένη υφή με 4-8 (+ & -)
ασκοσπόρια μέσα στο ασκοκάρπιο
Ασκοσκάρπιο • κλειστοθήκιο
• περιθήκιο • γυμνοθήκιο
Σεξουαλικός
πολλαπλασιασμός
Δύο γενετικά συμβατές υφές
Βασιδιοσπόριο
ΒΑΣΙΔΙΟΜΥΚΗΤΕΣ
Σύντηξη των άκρων των υφών διπύρηνη υφή επέκταση και σχηματισμός μικρής προεκβολής
(σύνδεσμος επικοινωνίας clamp connection)
διπλασιασμός πυρήνων και μεταφορά ενός ζεύγους
πυρήνων από το ένα τμήμα της υφής στο άλλο μέσω της προεκβολής καρυογαμία στο άκρο της υφής
βασίδιο (στο βασιδιοκάρπιο) 4 βασιδιοσπόρια (2+
και 2-
Ταξινόμηση
Φύλο Μορφολογία Υφές Σεξουαλική αναπαραγωγή
Ασεξουαλική αναπαραγωγή
Χυτριδιομύκητες Chytridiomycota
Μονοκύτταροι Ωοσπόρια ζωοσπόρια
Ζυγομύκητες Zygomycota
Υφομύκητες Ευρείες όχι διαφραγμάτια
Ζυγοσπόρια Σποραγγειοσπόρια
Ασκομύκητες Ascomycota
Υφομύκητες
Λεπτές με διαφραγμάτια
Ασκοσπόρια Κονίδια
Βασιδιομύκητες Basidiomycota
Υφομύκητες (σπάνια) Ζύμες
Λεπτές με διαφραγμάτια
Βασιδιοσπόριο Κονίδια (σπάνια)
Ανάμορφοι Δευτερομύκητες
Υφομύκητες Ζύμες
Ψευδο- & αληθείς υφές
Άγνωστη Κονίδια
1000 είδη Μη παθογόνα Υδάτινο περιβάλλον
Οικολογία - Επιδημιολογία
Ενδογενής προέλευση Γαστρεντερικός σωλήνας: C. albicans
Δέρμα: άλλα είδη Candida, Geotrichum
Εξωγενής προέλευση Έδαφος: H. capsulatum, C. neoformans, A. fumigatus,
ζυγομύκητες (Mucor,…)
Οικολογικές φωλιές με οργανικά υπολείμματα
Κοσμολίτικη κατανομή Candida, Cryptococcus, Aspergillus, δερματόφυτα,...
Περιορισμένη γεωγραφική κατανομή χρωμοβλαστομυκητίαση, μυκητώματα σε
τροπικά/υποτροπικά κλίματα
Ενδημική κατανομή Histoplasma duboisii στην Κ. Αφρική, P. marneffei ΝΑ Ασία
Παθογένεια
Μηχανισμοί παθογόνου δράσης:
Προσκόλληση
Είδη μουκορμυκώσεων: βλεννογόνος ρινός
Κονίδια Aspergillus: βλεννογόνος αναπνευστικού
C. albicans: βλεννογόνος στόματος, κόλπου
επιφάνειες από πλαστικό
Διείσδηση στους ιστούς
Μέσω ΜΦ μετά φαγοκυττάρωση: C. immitis, H. capsulatum
Ένζυμα: ελαστάση Α. fumigatus
πρωτεάση C. albicans
Ιστικός πολλαπλασιασμός
Ικανότητα πολλαπλασιασμού στους 37οC
Τροπισμός προς αγγεία Aspergillus
προς μήνιγγες και νευρικό ιστό Cryptococcus
Παθογένεια
Μηχανισμοί παθογόνου δράσης:
Διαφυγή ή τροποποίηση αμυντικών μηχανισμών ξενιστή
Έλυτρο προς αποφυγή φαγοκυττάρωσης: Cryptococcus
Προσκολλητίνες που μιμούνται υποδοχέα του συμπληρώματος (CR3 – CR2): C. albicans
Γλοιοτοξίνες ανασταλτικές της φαγοκυτταρικής λειτουργίας των ΜΦ: Α. fumigatus
Παθογόνος δράση ασπέργιλλου
Παθογόνος δράση ζυγομυκήτων
• Οι ζυγομύκητες είναι μοναδικοί μεταξύ των υφομυκήτων στην
ικανότητα να προκαλούν λοιμώξεις σε μεγαλύτερο φάσμα
ασθενών, από ότι άλλοι ευκαιριακοί παθογόνοι υφομύκητες.
• Εισπνοή των σπόρων τους ή εναπόθεσή τους στις ρινικές
θαλάμες.
• Η δερματική ζυγομύκωση είναι η πρώτη εκδήλωση σε ανοσοεπαρκείς ασθενείς, ως αποτέλεσμα εμβολιασμού μεγάλου φορτίου σπόρων σε βαθύτερους ιστούς του
δέρματος, λόγω εκτεταμένου τραυματισμού ή εγκαύματος.
• Οι σπόροι των ζυγομυκήτων αποτελούν τις τυπικές λοιμογόνες
μορφές των παραρρινίων και του δέρματος • Kυψελιδικά μακροφάγα: πρώτη γραμμή άμυνας
• Ουδετερόφιλα: δεύτερη γραμμή άμυνας
• Οι αγγειοδιηθητικές νηματοειδές μορφές είναι υπεύθυνες για
τη διείσδυση στους ιστούς και τη διασπορά τους σε διάφορα
όργανα.
Για πρόκληση λοίμωξης πρέπει οι ζυγομύκητες
να καταναλώσουν από τον ξενιστή αρκετό σίδηρο για να αναπτυχθούν ,
να αποφύγουν τους φαγοκυτταρικούς αμυντικούς μηχανισμούς και
να διεισδύσουν στα αγγεία για να διασπαρούν.
Παθογένεια
Μηχανισμοί άμυνας:
Δέρμα Τραυματισμός: κρυπτοκόκκωση, χρωμομύκωση, σποροτρίχωση
Προϋπάρχουσες βλάβες (έγκαυμα): Aspergillus
Λύση συνεχείας του λόγω ιατρικών χειρισμών Καθετήρες: καντιντίαση
Χειρουργικοί χειρισμοί: ασπεργίλλωση
Φαγοκυττάρωση (ΠΜΠ, ΜΦ) Ουδετεροπενικοί: καντιντίαση, ασπεργίλλωση, μουκορμύκωση
Συμπλήρωμα C3a, C5a: χημειοταξία
iC3b: οψονινοποίηση
Τ-λεμφοκύτταρα AIDS:κρυπτοκόκκωση, ιστοπλάσμωση,
κοκκιδιοειδομυκητίαση, επιφανειακές καντιντιάσεις Β-κύτταρα: όχι σημαντικός ρόλος
ΝΚ-κύτταρα: πειραματική λ. από Cryptococcus
Το MAC δεν είναι ικανό από μόνο του
να καταστρέψει κάποιο μύκητα
Παθογένεια
Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς
εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,
παρακοκκιοειδομυκητίαση
Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου
λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)
Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση
Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών
Καντιντίαση
Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών
Histoplasmosis (Histoplasma capsulatum)
Coccidioidomycosis (Coccidioides immitis)
Blastomycosis (Blastomyces dermatitis)
Arthroconidia
Paracoccidioidomycosis (Paracoccidioides brasiliensis)
Παθογένεια
Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς
εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,
παρακοκκιοειδομυκητίαση
Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου
λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)
Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση
Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών
Καντιντίαση
Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών
Χρωμοβλαστομύκωση
Από Cladophialophora
Μυκήτωμα
Άμεσο
Καλλιέργεια
Παθογένεια
Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς
εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,
παρακοκκιοειδομυκητίαση
Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου
λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)
Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση
Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών
Καντιντίαση
Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών
Ζυγομύκωση
Δερματική
Ρινοκρανιακή
Ζυγομύκητες
Mycorales
Διαδεδομένοι στη φύση
Σαπρόφυτα
Έδαφος
Αποθηκευμένοι σπόροι
Φρούτα
Επιμόλυνση
Κοπράνων
Δειγμάτων δέρματος
Rhizopus arrhizus (oryzae)
R. rhizopodiformis
Lichtheimia (Absidia) corymbifera
Rhizomucor pusillus
Μυκηλιακοί μύκητες
Absidiacae
• Absidia s. str.: αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες < 40° C (μεσοφιλικοί)
• Leptomyces (μεσοφιλικοί)
• Lichtheimia: καλή ανάπτυξη σε θερμοκρασία σώματος
• L. corymbifera
• L. ramosa
• L. ornata
Boekhout Τ et al. 2009, 3:170–178
Κρυπτοκόκκωση (Cryptococcus neoformans)
Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes Aspergillus
A. fumigatus, A. flavus, …
Διαδεδομένος στη φύση Έδαφος, οργανικά υπολλείματα
Ρούχα
Κλιματιστικά – υγραντές αέρα
Υγρά διαλύματα
Μεγάλη παραγωγή σπόρων
170.000 σπόροι / gr.
Aerosol σε χειρισμούς της αποικίας 12χ106 σπόροι/m3
Μέγεθος και μορφολογία
ευνοούν τη διασπορά με αέρα
δίοδος από αναπνευστικό, μέχρι πν. κυψελίδες
Μυκηλιακοί μύκητες
Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes
Penicillium
Διαδεδομένος στη φύση Οργανικά υπολλείματα
Σε αποσύνθεση
Παλιά
Χρησιμοποίηση στη βιομηχανία τυριού
Παραγωγή πενικιλλίνης P. chrysogenum
Παραγωγή γριζεοφουλβίνης P. griseofulvum
Μυκηλιακοί μύκητες
P. marneffei
Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes
Fusarium
Διαδεδομένος στη φύση
Σαπρόφυτα ή παράσιτα φυτών
Δημητριακά
Ρύζι
Φρούτα
Καλαμοσάκχαρο
Βαμβάκι
Τοξίνες
(Μολυσμένα δημητριακά)
Acremonium (100 είδη)
Διαδεδομένος στη φύση
Μυκηλιακοί μύκητες
Παθογένεια
Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς
εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,
παρακοκκιοειδομυκητίαση
Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου
λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)
Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση
Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών
Καντιντίαση
Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών
Ζυμομύκητες
Candida Ο συχνότερος: 83%
Φυσ. χλωρίδα βλεννογόνων
C. albicans: γαστρεντερικού
C. glabrata: ουρογεννητικού
C. tropicalis: γαστρεντερικού, ουροποιητικού
έδαφος, νερό,
δημητριακά
C. parapsilosis: φ.χ. δέρματος
Καντιντιάσεις
Παθογένεια
Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς
εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,
παρακοκκιοειδομυκητίαση
Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση
Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου
λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)
Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση
Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών
Καντιντίαση
Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών
Τριχόφυτα
Μικρόσπορα
Μολυσματικό κηρίο
Διάγνωση Ξέσματα δέρματος – νυχιών
Τρίχες Υλικό
Άμεσο με ΚΟΗ
Νύχια Δέρμα
Ectothrix
Endothrix
Διάγνωση
Καλλιέργεια
Μικροσκόπηση
T. rubrum T. tonsurans
T. violaceum
Μακροκονίδια
Μικροκονίδια
Διάγνωση
Καλλιέργεια
Μικροσκόπηση
Μ. canis Epidermophyton floccosum
Μακροκονίδια
M. canis
Μακροκονίδια E. floccosum
Ζυμομύκητες
Malassezia M. furfur, M. pachydermatis
Χλωρίδα δέρματος (λιπόφιλοι μ.)
Trichosporon beigelii Διαδεδομένος στη φύση
Φ.Χ. δέρματος, ΓΣ, φάρυγγα
Geotrichum G. candidum: κοσμοπολίτικος μ.
(έδαφος, νερό)
στα φυτά, παράγωγα ζώων (γάλα) [βιομηχανία γάλακτος & τυριού]
G. capitatum: λιγότερο συχνός στο περιβάλλον
άνθρωπος (ΓΣ, ΑΣ)
Pityriasis versicolor
Malassezia spp.
Εργαστηριακή διάγνωση
Άμεση μικροσκοπική εξέταση
Καλλιέργεια – απομόνωση - ταυτοποίηση
Ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι
Ανίχνευση κυκλοφορούντων Ags
Ανίχνευση ειδικών Abs
Μοριακές τεχνικές
Ιστολογική εξέταση
Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά
Ι. Άμεση μικροσκοπική εξέταση
Χωρίς χρώση
Με χρώση Lactophenol blue (γιά όλα τα είδη δειγμάτων)
India ink [ανίχνευση γλυκοκάλυκα Cryptococcus neoformans]
Gram stain
May-Grunwald Giemsa
Μετά διαύγαση με KOH Κύρια πρακτική για νύχια, τρίχες, δέρμα (διάλυση
κερατίνης)
Μερικά δείγματα πύου ή εκκρίσεων
Χρώση Gram
Ζυμομύκητες (βλαστοκονίδια και ψευδοϋφές): Gram (+)
Υφομύκητες: Gram(-)
Υαλοϋφομύκητες (Aspergillus, Fusarium, Scedosporium) υφές διαμέτρου 4-6μm με παράλληλα και χωρίς περισφίξεις τοιχώματα ομοιόμορφα κατανεμημένα διαφραγμάτα διχοτόμηση υπό γωνία 450
Ζυγομύκητες (Mucor, Rhizopus) υφές ευρείες και ακανόνιστες χωρίς διαφραγμάτα με βολβοειδείς πλάγιες διογκώσεις διχοτόμηση υπό γωνία 900
Η μικροσκοπική εξέταση πολύ σημαντική αν
ο μύκητας είναι μη βιώσιμος λόγω
λήψης αντιμυκητιακής αγωγής
ΙΙ. Καλλιέργεια
Ειδικά υλικά απομόνωσης μυκήτων (Sabouraud) Χλωραμφαινικόλη: μη ανάπτυξη βακτηρίων Ακτιδιόνη: αναστολή ανάπτυξης σαπροφυτικών μυκήτων,
επιτρέπει ανάπτυξη παθογόνων (εκτός C. neoformans, Mucor)
Παράγοντες ανάπτυξης (βιταμινούχο υλικό για T. ochraceum) Υλικά με αίμα για δίμορφους μύκητες (φάση ζυμομύκητα)
Δύσκολη – αδύνατη για μερικούς μύκητες
Histoplasma - Rhinosporidium
Επώαση Μύκητες επιφανειακών μυκητιάσεων 260 C Μύκητες εν τω βάθει μυκητιάσεων 370 C
Διάρκεια Ζυμομύκητες: 24-48 h
Υφομύκητες (Aspergillus, Penicillium, Mucor): 2-4 d
Υπόλοιποι παθογόνοι μύκητες, δερματόφυτα: 6-15 d
Θρεπτικά καλλιεργητικά υλικά για την απομόνωση μυκήτων
Εκλεκτικό θρεπτικό υλικό Sabouraud dextrose agar (SDA) με αντιβιοτικά
Πενικιλλίνη 20U/mL, στρεπτομυκίνη 40U/mL, γενταμυκίνη 5μg/mL, χλωραμφαινικόλη 16μg/mL
Κυκλοεξαμίδη ή ακτιδιόνη 0.5μg/mL
Μη-εκλεκτικό θρεπτικό υλικό BHI (Brain Heart Infusion): απαιτητικοί μύκητες
[δίμορφοι (ιστόπλασμα)]
Αναστολή βακτηρίων
Αναστολή σαπροφυτικών μυκήτων
Αλλά και ευκαιριακά παθογόνα 1. C. neoformans 2. Τrichosporon asahii 3. Μερικά είδη Candida 4. Μερικά είδη Aspergillus 5. Πολλούς ζυγομύκητες Koneman, 6th ed. 2006
ΙΙ. Καλλιέργεια
Δείγματα αναπνευστικού
Πτύελα – βρογχικές εκκρίσεις
Επιμόλυνση από χλωρίδα στόματος
Επιμόλυνση από περιβάλλον
Απομόνωση Aspergillus όχι απόδειξη λοίμωξης (ύπαρξη προδιαθεσικών παραγόντων)
Καντιντουρία
Επιμόλυνση από χλωρίδα γεννητικού συστήματος
Ποσοτική καλλιέργεια
> 100.000 CFU / ml λοίμωξη
10.000 – 100.000 CFU / ml λοίμωξη πιθανή
< 10.000 CFU / ml επιμόλυνση
Λοίμωξη νεφρού: (+) υπερηβική κ/α, (+) κ/α αίματος,
(+) ορολογικές εξετάσεις σε ασθενή με προδιαθ. παράγοντες
Προσοχή στην αξιολόγηση θετικών καλλιεργειών
ΙΙ. Καλλιέργεια
Θετική κ/α αίματος
Θετική κ/α από 3 διαφορετικές περιοχές
Θετική κ/α άσηπτου υλικού
(εκτός ουροδόχου κύστης)
Προσοχή στην αξιολόγηση θετικών καλλιεργειών
Συστηματική μυκητίαση
Είδος μύκητα Αντιγόνο, αντίσωμα, ένζυμο,
μεταβολίτης Κλινικό δείγμα
C. neoformans Γλυκουρονοξυλομαννάνη* ΕΝΥ, ορός
Aspergillus Γαλακτομαννάνη * Ορός, BAL
(ENY, ούρα??)
Candida Μαννάνη, αντιμαννάνη* Ορός, ΕΝΥ
Candida Ενολάση Ορός
Candida Αντι-ενολάση & αντισώματα έναντι άλλων ενδοκυττάριων
αντιγόνων Ορός
Candida D-αραβινιτόλη Ορός
Μύκητες άλλοι
εκτός Ζυγομυκήτων και C. neoformans
(1,3)-β-D-γλυκάνη * Πλάσμα / ορός
* Χρησιμοποιείται στη ρουτίνα
ΙV. Μοριακές τεχνικές
Ανίχνευση DNA σε κλινικό δείγμα με PCR Aspergillus σε δείγματα αναπνευστικού
Όμως 25% υγιών ατόμων θετικό αποτέλεσμα λόγω αποικισμού
Candida από δείγματα αίματος Πρόβλημα επιμόλυνση λόγω αποικισμού δέρματος
Cryptococcus
Ειδικοί ανιχνευτές (probes) για γρήγορη ταυτοποίηση H. capsulatum
B. dermatitidis
C. immitis
Επιδημιολογική μελέτη απομονούμενων στελεχών
Μοριακές τεχνικές (PCR, real-time PCR)
Μέθοδοι μη προτυποποιημένες
Δεν συμπεριλαμβάνονται στα διαγνωστικά κριτήρια (Ascioglu S. et al. CID, 2002)
(De Pauw B., et al., CID, 2008)
Στάδια που πρέπει να προτυποποιηθούν:
1. παρασκευή κλινικού δείγματος
2. επιλογή του κατάλληλου στόχου πολλαπλασιασμού
3. μέθοδοι ανάγνωσης του αποτελέσματος
4. πρόληψη ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων
Εμπορικά διαθέσιμες μοριακές
τεχνικές
• Άμεσος υβριδισμός
▫ Σημασμένος probe με
φθορισμό FISH ή χρωμογόνο
CISH
DNA probes
peptide nucleic acid – PNA
probes
▫ Στόχος: rRNA
▫ Συνδυασμός με Gram χρώση
▫ Ταυτοποίηση σε 2 ½ h
Βακτήρια
Ζυμομύκητες
1. Μοριακές τεχνικές σε θετικές καλλιέργειες
C. albicans cells
detected by the C.
albicans PNA FISH
method appear as
bright green
fluorescent yeast
cells on a reddish
smear background
C. glabrata cells
are slightly visible
as reddish yeast
cells infiltrated in
the smear.
Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization
Πώς εφαρμόζεται η PNA-FISH σε θετικές αιμοκαλλιέργειες
Οι μικροοργανισμοί αυτοί προκαλούν
> 90% των μικροβιαιμιών
Όριο ανίχνευσης: 3-30 CFU/ml
2. Μοριακές τεχνικές ανίχνευσης παθογόνου απευθείας
στο κλινικό δείγμα
Η μεθοδολογία “Spacer Technology” που χρησιμοποιεί το SeptiFast
test επιτρέπει τη διαφορική ανίχνευση σε επίπεδο είδους
16S 23S ITS (Spacer)
Generic Primers
(“pan bacteria”) Specific Probes
Group (e.g. Enterobacteriaceae)
Amplification curve
Cycles Tm
Probe Melting Point(s)
E. coli Enterobacter cloacae
Sample Two Tm = 84.4 C
Sample One Tm = 91 C
Non specific product
Negative Control
Δύο διαφορετικά προϊόντα PCR έχουν τελείως διαφορετική Tm.
Με την Real Time PCR μπορούμε να ανιχνεύσουμε την Tm ανεβάζοντας σταδιακά τη θερμοκρασία, ανοίγουν οι αλυσίδες, και φτάνοντας στο υψηλότερο σημείο όπου το 50 % του προϊόντος μας θα είναι αποδιαταγμένο.
Αυτό παρουσιάζεται από το λογισμικό του μηχανήματος σαν γράφημα που δείχνει τον αρνητικό λογάριθμο του φθορισμού προς την θερμοκρασία -dF/dT και παρουσιάζει για κάθε προϊόν PCR ένα ειδικό peak.
Mελέτη της καμπύλης αποδιάταξης του DNA
(Melting Curve Analysis)
Συνδυασμός λύσης και
μηχανικής δύναμης
για τη διάσπαση του
μυκητιακού κυτ. τοιχ.
15 διαφορετικά είδη
• Α. fumigatus
• A. flavus
• A. terreus
• A. niger
Στόχος: 18S rDNA
Internal control
Target sensitivity:
<=50 copies (~ 1 A. fumigatus genome)
A commercially available Aspergillus PCR assay provides a
methodology that is standardized and reagents that are quality
controlled. This facilitates multicenter evaluation of the clinical
utility of PCR diagnosis.
The performance of the MAP assay is comparable to that of the IHP
assay and to those in previously reported studies evaluating
commercial tests (GM enzyme-linked immunosorbent assay).
White PL et al., JCM 2011; 49:2169
Ασθενείς της μελέτης: 10 proven/probable IA (104 οροί) & 21 control χωρίς στοιχεία ΙΑ (66 οροί)
Comparison of MycAssay Aspergillus test with galactomannan
detection in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid samples of
haematological and ICU patients
• Aspergillus DNA in BAL fluid specimens from IA patients:
▫ high sensitivity and specificity rates and its performance was
comparable to that of GM.
• Improve the diagnosis of aspergillosis in haematological and critically ill
patients and warrants incorporation to routine work up to establish its
role in the management of these at risk patient groups.
R. Torelli et al., ECCMID 2011 & JCM 2011
Detection of Aspergillus in lung and other tissue samples
using the MycAssay Aspergillus real-time PCR kit.
• Ασθενείς: 9 μεταμοσχευμένοι και 33 με αιματολογική κακοήθεια
▫ Πνεύμονας (n = 30), δέρμα (n = 4), και άλλα.
Για όλα τα δείγματα
• Ευαισθησία και ειδικότητα 82% και 79% (σε σχέση με μικροσκοπική)
90% και 64% (σε σχέση με καλλιέργεια)
• Θετική και αρνητική προγνωστική αξία: 69% και 88% (καλλιέργεια)
88% και 69% (μικροσκοπική)
Lass-Flörl C et al., Can J Microbiol 2011;57:756
DNA arrays
Σύνολο μικρών στοιχείων ή
κηλίδων τακτοποιημένων σε
σειρές και στήλες σε στερεή
επιφάνεια (γυαλί ή διοξείδιο της
σιλικόνης).
Υβριδισμός μορίων-στόχων
του υπό εξέταση δείγματος με
μόρια σημασμένα
Ανάγνωση αποτελέσματος
Ανάλυση της εικόνας μέσω
Η/Υ
Garaizar J et al, FEMS Yeast Res, 2006;6:987
DNA ανιχνευτές ειδικοί του είδους
γονίδια αντοχής στα αντιμυκητιακά
γονίδια λοιμογόνων παραγόντων
C. glabrata
C. parapsilopsis
C. lipolytica
C. krusei
C. norvegensis
C. lusitaniae
C. multigemmis
C. tropicalis
C. utilis
C. g.
C. p
.
C. l.
C. k.
C. n.
C. li
.
C. m
.
C. t.
C. u.
Microarray
Macroarray
Development and
optimisation of a
Novel Multiplex
Assay for Identifying
Candida Species
• The MycArray Yeast ID
has been optimised to
identify 18 clinically
relevant yeast species
from agar plates and
positive blood culture
bottles
• The array process can be
completed in 4 hrs
X.Cui et al. TIMM 2009
Μοριακές τεχνικές και αντοχές
Antifungal drug resistance: do molecular methods provide
a way forward? David S. Perlin Curr Opin Infect Dis 2009; 22:568–573
Direct detection of triazole resistance in A. fumigatus
from airway secretions (Park S et al., 2011 ECCMID)
High-frequency triazole resistance found In nonculturable
Aspergillus fumigatus from lungs of patients with chronic
fungal disease (Denning DW et al., 2011 CID;52:1123
Μοριακή διάγνωση σε επιφανειακές μυκητιάσεις
New molecular tools in the diagnosis of superficial
fungal infections
RJ Hay et al., Clinics in Dermatology 2010;28:190–196
Brillowska-Dabrowska A et al., JCM 2007
ΙV. Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά
Εμφάνιση αντοχών π.χ. Αζόλες
C. albicans από HIV(+) και ΜΜΟ ασθενείς C. neoformans από ασθενείς με AIDS C. glabrata (3o αίτιο μυκηταιμίας) [αντοχή
σε κετοκοναζόλη, φλουκοναζόλη] Α. fumigatus σε ασθενείς υπό θεραπεία με
ιντρακοναζόλη Αμφοτερικίνη Β
σε ασθενείς με καρκίνο C. lusitaniae και στελέχη C. albicans
C. tropicalis: αντοχή στη 5-φλουροκυτοσίνη
Απομόνωση από αίμα στείρα υγρά παρακεντήσεων και ιστούς ασθενείς με επαναλαμβανόμενες μυκ. λοιμ.
Γιατί ??
Πότε ??
ΑΜΒ Κ F I V C
Aspergillus +++ 0 0 ++ +++ ++
C. neoformans +++ + +++ ++ +++ 0
Candida
C. albicans C. glabrata C. guilliermondii C. krusei C. lusitaniae C. parapsilosis C. tropicalis
+++
++
++
++
++
+++
+++
++
+
+
+
++
++
++
+++
++
+++
0
+++
+++
+++
+++
++
+++
++
+++
+++
+++
+++
++
+++
++
+++
+++
+++
+++
+++
++
+++
+++
++
+++
Fusarium ++ 0 0 + ++ 0
Mucor, Rhizopus άλλοι ζυγομύκητες
+++ 0 0 0 0 +
Φάσμα δράσης διαφόρων συστηματικά χορηγούμενων αντιμυκητιακών
Προσαρμογή από Manual of Clinical Microbiology, 9th ed.
Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά
Ζυμομύκητες: μικρο- και μακρο μέθοδοι αραιώσεων σε ζωμό οδηγίες CLSI M27-A2 για Candida spp., C. neoformans οδηγίες EUCAST (CMI 2008; 14: 398-405) για
ζυμομύκητες που ζυμώνουν τη γλυκόζη (Candida spp.) [όχι Cryptococcus, δίμορφους]
Εναλλακτικά: Χρωματομετρική μέθοδος: εμπορικές (FUNGITEST, Sensititre
YeastOne), μη εμπορικές (tetrazolium salt μέθοδος) Σπεκτρο-φωτομετρική μέθοδος Μέθοδος κυτταρομετρίας ροής
μέθοδος διάχυσης δίσκων: fluconazole / voriconazole οδηγίες CLSI Μ44-Α για Candida spp. E-test
Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά
Υφομύκητες
μικρο- και μακρο μέθοδοι αραιώσεων σε ζωμό
οδηγίες CLSI M38-A (προτεινόμενες - proposed)
Εναλλακτικά: Χρωματομετρική μέθοδος
Μέθοδος διάχυσης δίσκων
Πιστοποιημένη για caspofungin και voriconazole
Έλεγχος επαναληψιμότητας
Ε-test
Συμφωνία με μέθοδο σε ζωμό >90% για τριαζόλες (F, I, V), αλλά >80% για αμφοτερικίνη Β
Ο λοιμωξιολόγος
Ο κλινικός Ο Βιοπαθολόγος
Φαρμακοβιομήχανος
Ο Παθολογοανατόμος
?!