I CONGRESO NACIONAL SOBRE FUENTES ALTERNATIVAS DE ENERGÍA Y MATERIALES

“DR. ADRIAN CHAVERRI RODRÍGUEZ”

Obtención y cuantificación de glucosamina a

partir de quitosano (Heterocarpus vicarius)

asistida por microondas

Garro, R. Ballestero, R. Andrés, L. Esquivel, M. Aguilar, A. Sibaja, M.

Raúl Esteban Garro Álvarez

San José, Costa Rica

Septiembre, 2011

2

• Componente natural de las

glicoproteínas que se hallan en

las articulaciones.

• Inhibe a las enzimas

responsables (Fosfolipasa A2 y

colágeno) de la reabsorción de

dicho tejido.

• Se ha logrado demostrar que la

GA reduce significativamente el

dolor y mejora la capacidad física

en pacientes con OA en rodilla y

cadera específicamente.

Figura 1. Fórmula estructura de la GA (2-

amino-2-deoxy-D-glucopiranosa)

GLUCOSAMINA

Critical Reviews in Food Science and Nutrition [Online] 2003. 43, P. 61.

VeriMed Healthcare Network [Online]. 2010. 21. P. 2.

Figura 2. Comparación entre una rodilla con a-)

cartílago saludable contra b-) una rodilla con

cartílago erosionado.

a b

3

• La GA es un derivado del quitosano

presente en el exoesqueleto de

camarones, langostas y cangrejos.

• Es biocompatible no sólo en

animales sino que también en tejidos

vegetales, se considera prácticamente

no tóxico (LD50 = 16 g/kg en ratones) y

posee una estructura molecular

modificable.

Figura 4. Fórmula estructural del quitosano.

Figura 3. Vista lateral del camarón

camello real (Heterocarpus vicarius).

Journal of Scientific & Industrial Research [Online] 2004. 63, P. 20.

Latin American Journal of Aquatic Research [Online] 2009. P. 547.

GLUCOSAMINA (cont.)

4

• El quitosano es capaz de ser

hidrolizado (degradación hidrolítica)

debido a la presencia de enlaces

glucosídicos en la molécula.

• La mayoría de los métodos utilizan

soluciones concentradas de HCl en

caliente.

• Lo que también garantiza la

degradación del polisacárido

dependiendo de cuán drásticas sean

las condiciones de reacción

empleadas, el tiempo y el grado de

acetilación que presente el quitosano.

HIDRÓLISIS

Figura 5. Hidrólisis ácida del quitosano

Journal of Scientific & Industrial Research [Online] 2004. 63, P. 21.

5

• Si el calentamiento se asiste por

medio de microondas, la absorción

directa de energía

electromagnética en forma de

radiaciones no ionizantes aumenta

los movimientos rotacionales del

quitosano.

• Esto sumado a la presencia de un

ácido fuerte genera una mayor tasa

de enlaces glucosídicos rotos, por

consiguiente, una mayor cantidad

de GA obtenida en menor tiempo.

MICROONDAS

Figura 6. Microondas marca CEM

modelo Discover.

6

VENTAJAS

- Transferencia energética

selectiva, uniforme y volumétrica.

- El calentamiento es rápido, ya

que se alcanzan mayores

temperaturas, y por consiguiente

velocidades de reacción más

elevadas.

- El calentamiento afecta

directamente a las moléculas, lo

que asegura una reducción de las

reacciones secundarias, la

síntesis de productos más puros

y, por tanto, rendimientos más

altos. Figura 7. Comparación entre un sistema

con aplicación energética:

a-) convencional

b-) asistida con microondas.

a

b

CEM Publishing. 2002. P. 16.

Mezcla

reactivos -

disolvente

Pared del

recipiente es

transparente

a la energía

microondas

Supercalentamiento

localizado

7

- Sistema basado en la Química verde

adaptado a la sostenibilidad del medio

ambiente producto al ahorro

energético y menor consumo de

reactivos.

- En comparación con sistemas de

reacción convencionales, los asistidos

con microondas son procesos más

controlados y por ende, seguros.

- Múltiples aplicaciones: Síntesis química (polímeros, zeolitas,

péptidos, fase sólida, entre otras); Desarrollo y optimización de

procesos; Hidrólisis química.

VENTAJAS (cont.)

Journal of Scientific & Industrial Research [Online] 2004. 63, P. 20.

Latin American Journal of Aquatic Research [Online] 2009. P. 547.

8

Obtención de Quitina de camarón camello real grado técnico

Purificación de Quitina de camarón camello real grado técnico

Obtención de Quitosano de camarón

camello real grado técnico

Purificación de Quitosano de

camarón camello real grado técnico

Preparación de la muestra

Caracterización del quitosano

Obtención de GA:

- Hidrólisis ácida convencional

- Hidrólisis ácida asistida con microondas

Cuantificación de GA mediante HPLC

Figura 8. Procedimiento utilizado para la obtención de GA a partir de quitosano

del camarón camello real (Heterocarpus vicarius).

ESQUEMA METODOLÓGICO

9

Figura 9. Sistema de reacción utilizado

para la hidrólisis ácida del quitosano

asistida por microondas.

Ramp time (min) 10

Hold time (min) 5

Temperatura (°C) 40

Módulo de presión Open Vessel

Potencia (KW) 30-70

Cuadro 1. Condiciones de operación

del horno de microondas.

10

Parámetro Valor

Tipo de columna Lc-NH2

Tipo de detector Índice de refracción (IR)

Fase móvil ACN : H2O :

CH3COONa · 3 H2O

Proporción de

fase móvil 70 : 30 : 0,25

Flujo de fase

móvil (mL · min-1) 0,550

Volumen

inyectado (L) 20

Temperatura del

auto-muestreador

y columna (ºC)

28

Temperatura del

detector (ºC) 30

Cuadro 2. Condiciones de operación del cromatógrafo líquido de alta

eficiencia para la determinación de la concentración de GA.

Figura 10. Cromatógrafo líquido de alta

eficiencia marca Ultimate modelo 3000.

11

Peso molecular viscosimétrico (±95) Da 56900

Grado de desacetilación (±0,2)% 88,4

Porcentaje de cenizas (0,03)% 1,69

Porcentaje de humedad (0,05)% 13,35

Cuadro 3. Resultados obtenidos para las

pruebas de caracterización del quitosano.

• Un alto peso molecular viscosimétrico, permite obtener mayor cantidad de

GA. Este factor depende de las condiciones de extracción del quitosano

(tiempo y temperatura de reacción, concentración de NaOH), fuente del

quitosano (hongos, crustáceos, entre otros) y tamaño de partícula.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 11. Quitosano purificado.

12

• El grado de desacetilación afecta

directamente la cantidad de GA

obtenida, ya que la hidrólisis podría

promover la obtención de N-acetil

glucosamina.

• Un porcentaje de humedad tan bajo

como el logrado (< 15%), permite

predecir que la gran mayoría de

hidrólisis realizadas sean gracias a la

cantidad de ácido en el medio y no

precisamente de agua. Asimismo, un

porcentaje de cenizas bajo (< 5%) se

asocia a cantidades de impurezas en

la muestra de partida.

Figura 12. Fórmula estructural de la N-

acetil glucosamina.

Journal of Scientific & Industrial Research [Online] 2004. 63, P. 25.

0,0 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0

-200

250

500

750

1.200GLUCOSAMINA 12 #2 [modified by Polimeros] MUESTRA 7 RI_1µRIU

min

13

Figura 13. Comparación entre cromatogramas para:

- Negro: Disolución patrón de GA a 25% m/v.

- Rojo: Hidrólisis ácida de quitosano a 7 horas de reacción en posición de reflujo.

- Verde: Hidrólisis ácida de quitosano asistida con microondas a 5 min de reacción en

posición de reflujo, 70 KW, 1 atm.

14

• Tal y como se mencionó con

anterioridad, se logran

mejores resultados si la

hidrólisis ácida del quitosano

se asiste con microondas.

• Inclusive, se constató que

manteniendo constante el

tiempo (5 min) y variando la

potencia de la radiación, se

logran mejores porcentajes de

rendimiento (Fig. 7) en un

rango bajo de potencia (30-70

KW).

3.95

4.00

4.05

4.10

4.15

4.20

4.25

4.30

4.35

4.40

20 40 60 80

Porc

enta

je d

e r

endim

iento

(%

)

Potencia (KW)

Gráfico 1. Variación del porcentaje de rendimiento

con respecto a la potencia de microondas en la

hidrólisis ácida de quitosano (Heterocarpus vicarius)

asistida con microondas.

15

• Es posible obtener GA con la hidrólisis ácida de quitosano asistida con

microondas, así como su posterior cuantificación por HPLC con los respectivos

parámetros utilizados.

• Inclusive, las cantidades de GA obtenida con el empleo de microondas fueron

mejores que la hidrólisis ácida convencional con tiempos de reacción menores.

• A pesar que los porcentajes de rendimientos son pequeños, el rango de

potencia así como el tiempo de reacción es bajo.

• Se sugiere aplicar el estudio realizado a quitosano proveniente de diferentes

fuentes (distintas especies de camarón, cangrejo, langostino, hongos, entre

otros), para determinar cuál de ellos permite extraer la mayor cantidad de GA.

Siendo deseable que el procedimiento de extracción de quitosano de su fuente

sea distinto.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

16

[1] Pech, G. Coronado, R. Diez, M.P. Renán, S. Chávez, D.D. Valoración funcional en pacientes con

osteoartrosis de rodilla tratados con glucosamina y un programa de rehabilitación. Acta Ortopédica

Mexicana [Online] 2003, 17, P. 3.

[2] Richy, F. Bruyere, O. Tejen, O. Cucherat, M. Henrotin, Y. Reginster, J.Y. Structural and symptomatic

efficacy of glucosamine and chondroitin in knee osteoarthritis. Arch Intern Med [Online] 2003, 163,

Pp.1514-1522.

[3] El-Saharty, Y.S. Abdel, A. High-performance liquid chromatographic determination of neutraceuticals,

glucosamine sulphate an chitosan, in raw materials an dosage forms. Analytica Chimica Acta [Online]

2001. 462, Pp. 125-131.

[4] Esquivel, M. Obtención de Hidrogeles de Quitosano a partir del langostino Pleuroncodes planipes.

Tesis de Licenciatura en Química Industrial. Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica, 2005, Pp. 2-5.

[5] Chebotok, E.N. Novikov, V.Y. Konovalova, I.N. Depolymerization of Chitin and Chitosan in the Course

of Base Deacetylation. Russian Journal of Applied Chemistry [Online]. 2006. 7. Pp. 1163.

[6] Binns, A. Identificación y caracterización de quitooligómeros obtenidos por hidrólisis química del

quitosano proveniente del camarón camello real (Heterocarpus vicarius). Tesis de Licenciatura en

Química Industrial. Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica. 2006, Pp. 15-25.

[7] Wehrtmann, I.S. Nielsen-Muñoz, V. Pesca en aguas profundas a lo largo de la costa Pacífica de Costa

Rica, América Central. Latin American Journal of Aquatic Research [Online]. 2009. P. 547.

[8] Xing, R. Liu, S. Yu, H. Guo, Z. Wang, P. Li, C. Li, Z. Li, P. Salt-assisted acid Hydrolysis of Chitosan to

Oligomers under Microwave Irradiation. Carbohydrate Research [Online]. 2005. 340. Pp. 2150-2153.

[9] Makover, M.E. Osteoarthritis: The care and management of osteoarthritis in adults. VeriMed

Healthcare Network [Online]. 2010. 21. P. 2.

[10] Hayes, B. Microwave Synthesis: Chemistry and Speed of Light. CEM Publishing [Online]. 2002. Pp.

16-17.

[11] Aradilla, D. Oliver, R. Estrany, F. La Química de la radiación de microondas. Rev. Técnica Industrial

[Online]. 2009. 284. Pp. 56-58.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

17

AGRADECIMIENTOS

I CONGRESO NACIONAL SOBRE FUENTES ALTERNATIVAS DE ENERGÍA Y MATERIALES

“DR. ADRIAN CHAVERRI RODRÍGUEZ”

Obtención y cuantificación de glucosamina a

partir de quitosano (Heterocarpus vicarius)

asistida por microondas

Garro, R. Ballestero, R. Andrés, L. Esquivel, M. Aguilar, A. Sibaja, M.

Raúl Esteban Garro Álvarez

San José, Costa Rica

Septiembre, 2011