4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA

INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICADR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL

PRACTICA 7: OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO A PARTIR DE HÍGADO DE RATA Y SU CARACTERIZACIÓN QUÍMICA

*OBJETIVOSSe realizará el aislamiento y purificación del glucógeno a partir del hígado de un organismo vivo y se identificará la composición de los productos por medio de hidrólisis ácida y enzimática por medio de reacciones químicas características.

*INTRODUCCION

El glucógeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hígado y en el músculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso húmedo, respectivamente. Está formado por unidades de glucosa unidas por enlaces α(1-4) y ramificaciones α(1-6).

El glucógeno actúa como regulador de la glucosa sanguínea, almacenándola como glucógeno durante una buena alimentación (glucogenogénesis) y liberándola por fosforolisis (glucogenolisis) durante el ayuno, ya que en esta situación no hay absorción intestinal. La duración del glucógeno hepático en ayunas es de aproximadamente 24 h. A partir de este momento, la concentración en sangre se mantiene por síntesis de glucosa a partir de sustancias distintas a los carbohidratos

1

1.- Sacrificar una rata con

eter (procurando no excitarla)

2.- Extraer rapidamente el higado y lavarlo

al chorro de agua

3.- pesar y cortar rapidamente el

higado en pedazos pequeños

4.- colocar los pedazon es un

mortero previamete sumergido en hielo.

5.- Añadir acido tricloroacetico (TCA)

al 10% en proporcion de 1ml/g de tejido hepatico, triturar el higado hasta formar una

pasta homogenea.

6.- centrifugar el homogenizado durante 5 min a

2000 rpm.

7.-Decantar el .un vaso de 250 ml y mantenerlo en

hielo.

8.- Lavar el mortero y pisilo con 10 ml de TCA al 5% y en

este liquido reuspender en el

precipitado de centrifugacion

aterior

9.- dejar reposar por 5

min y centrifugar a

2000 rpm.

10.- Decatar el liquido

sobrenadante y reunirlo con el

obteido en el paso 7.

11.- Añadir 2 volumenes de etanol

por volumen de sobrenadante. agitar

esta mezcla y dejar en reposo hasta que el glucogeno flocule

12.- Centrifugar a

2000 rpm durante 5

min.

13.- Desechar el sobrenadante y resuspender el

precipitado con 5 ml de agua destilada

14.- Volver a precipitar con 2 volumenes de

etanol.

15.- centrifugar a 2000 rpm

durante 3 min.

16.- Decantar y suspender con la menor cantidad

posible de alcohol absoluto y pasarlo

a un vidrio reloj para que seque y

cristalice

4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA*Explicación de cada paso:

1.- La rata no debe excitarse puesto que si esto sucede esta empezara a segregar glucógeno lo que ocasionara que obtengamos menos de lo estimado.

2.- El Hígado debe extraerse de manera rápida puesto que entre más nos tardemos se producirán enzimas que degraden el glucógeno esta se tiene que lavar para quitar la sangre pues esta es una impureza para nuestra extracción de glucógeno.

3.- Se debe pesar el hígado pues necesitamos este dato para el cálculo de rendimiento, se cortara en pedazos pequeños para que sea más sencillo triturarlo.

4 y 5.- El tratamiento posterior con ácido tricloroacético (TCA) hace que precipiten las proteínas y ácidos nucleicos de la mezcla.

6.-Se centrifuga para que todos los componentes que no necesitas queden en el precipitado que se formara como proteínas, mezcla de células y la arena que se utilizó para triturar.

7.- Se decanta el sobrenadante para que en el obtengamos el glucógeno, y de igual manera se encontraran en esta agua y TCA.

8.- Se lava el mortero y el pistilo con el TCA para que recolectemos la pasta homogénea que quedo en ellos.

9.- se centrifuga de nuevo por la misma razón del paso 6.

10.- se decanta el sobrenadante para juntarlo con el sobrenadante inicial para poder obtener la mayor cantidad de glucógeno posible.

11.-Se le agrega etanol para que se separe el glucógeno del sobrenadante y se precipite.

12.- Se centrifuga para que el glucogeno quede precipitado.

13.- El sobrenadante se desecha pues no contiene ningún compuesto de interés.

14 y 15.- se repite el procedimiento para que el precipitado sea el mayor posible y obtengamos mayor cantidad de glucógeno.

16.- Se decanta el precipitado en una charolita y se le agrega etanol para deshidratarlo y este cristalice.

*Caracterización química del glucógeno.

a) Preparar 15mL de una solución de glucógeno de 5mg/ml.

b) Preparar una serie de tubos según la tabla.

*RESULTADOS

Rendimiento, Porcentaje de glucógeno presente en la rata.

Charola= 1.3851g

Charola con Glucógeno= 1.9114g

Glucógeno= (1.9114g-1.3851g)= 0.5263g peso seco

Peso de Hígado= 14g 100%

Peso de hígado X % de glucógeno

14g 100%

0.5263g X X=

3.75% de glucógeno presente en el hígado de nuestra rata

2

TUBO 1 2 3 4 5 6

Glucógeno (ml) 2 2 2 2 2 2HCl 1N (ml) 2HCl 2N (ml) 2HCl 4N (ml) 2Amilasa con.

(ml)2

Amilasa 1:2 (ml) 2

NaCl al 5%1gota

1gota

Agua dest. 2Incubar 30min 92°C 37°C

4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDACaracterización química.

*ANALISIS DE RESULTADOS

Prueba de Fehling

En la hidrólisis ácida como en la hidrólisis enzimática se obtuvieron resultados positivos en los tubos hidrolizados, esta prueba se realiza para identificar los carbonilos potencialmente libres que estén involucrados en enlaces glucosidicos (azucares reductores) gracias a esto podemos decir que en nuestra muestra probablemente hay presencia de glucosa, maltosa o fructosa. En el tubo testigo del glucógeno sin hidrolizar dio negativo, debido a que sus grupos están bloqueados debido a los enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6; no posee iones libres par que se lleve a cabo la reacción.

Prueba de Seliwanoff

Los resultados fueron positivos para 5 tubos, el tubo testigo del glucógeno dio negativo debido a que no se hidrolizo. En esta prueba podemos diferenciar aldosas de cetosas, las cetosas dan rápido y las aldosas lento, por lo tanto podemos decir que el azúcar presente es una aldosa (glucosa). 

Prueba del lugol

Dio positivo en el tubo testigo del glucógeno, debido a que al no ser hidrolizado el glucógeno es capaz de atrapar al lugol por ser un polisacárido lineal, formando caltratos.

*CONCLUSIONES

-Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de reserva como es el caso del glucógeno en los animales.-El glucógeno contiene unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6.

-Se caracterizó al problema por reacciones químicas, dando como resultado la identificación del glucógeno.

*PREGUNTA EXTRA

Cascada del glucógeno

*BIBLIOGRAFIA

*Lehninger, Albert, Nelson, David L. (1993). Principios de Bioquímica´. Segunda Edición, Ediciones Omega, Barcelona, España.

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Prueba Observaciones Imagen

Ninhidrina

Negativo Nos indica que nuestro problema no

hay aminoácidos, ya que es una reacción característica para grupos

amino libres.

Biuret

Negativo En nuestro problema no hay

presencia de proteínas debido a q la reacción es para identificar

proteínas y péptidos de cadena menor a 3 unidades de a.a.

Molish

Positivo Se identifico que nuestro problema es un carbohidrato. La reacción de

Molish es general para carbohidratos.

Hidrolisis

Acida Testigo Enzimática Blanco

1 N

2 N

4 N

Glucógeno sin

hidrolizarConc. 1:2 Agua

Fehling + + + - + + -Lugol - - - + - - -

Seliwanoff

+ + + - + + -