OBJETIVO

El alumnos conocerá las técnicas de preparación para medios de cultivo , así como su clasificación según su uso.

FUNDAMENTO TÉORICO

Los análisis microbiológicos se basan habitualmente en el cultivo y recuento de los microorganismos. Para ello es necesario preparar y conservar adecuadamente los medios de cultivo, realizar una siembra y observar los resultados; una técnica habitual en microbiología es la tinción. Hay que recordar que para trabajar con microorganismos potencialmente peligrosos deben utilizarse las cabinas de seguridad biológica.

INTRODUCCIÓN

Medios de cultivo

Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, la cantidad de información que puede obtenerse de un individuo es muy limitada. Por ello es necesario el estudio de poblaciones, que contienen miles o millones de individuos. Estas poblaciones se obtienen al hacer crecer los microorganismos bajo condiciones más o menos bien definidas, como cultivos.

El estudio de estos cultivos permite detectar la presencia de microorganismos en una muestra y su posterior identificación, efectuar pruebas de susceptibilidad de estos microorganismos a antibióticos o a antisépticos concretos, etc.

El cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) y bajo condiciones de laboratorio (temperatura, humedad, presión de oxígeno y pH óptimos para el crecimiento del microorganismo concreto y sin presencia de microorganismos contaminantes).

Se entiende por medio de cultivo la mezcla de sustancias, naturales, sintéticas o ambas, que permite el crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que permite mantener su viabilidad.

Los medios de cultivo son otro de los productos que encontraremos en los laboratorios de análisis clínicos. La mayoría de ellos pueden prepararse en el propio laboratorio, pero cada vez es más habitual que se adquieran preparados listos para su uso.

Tipos de medios de cultivo.

Hay medios de cultivo generales y medios de cultivo selectivos:

* Medios de cultivo generales. Permiten el crecimiento de una gran variedad de microorganismos. Pertenecen a esta categoría las infusiones de extractos de carne y peptona, una mezcla de composición similar a la de los líquidos orgánicos, que se utiliza para muchas bacterias patógenas (causantes de enfermedades).

* Medios de cultivo selectivos. Favorecen el crecimiento de un género o de una especie concreta de microorganismos. Son muy útiles para aislar ciertos microorganismos a partir de una población mixta. Por ejemplo, si a un cultivo se le añade un inhibidor del crecimiento de bacterias Gram +, como el cristal violeta, nos aseguramos de que en ese cultivo sólo van a crecer bacterias Gram-.

Pertenecen a esta categoría el caldo lactosa bilis verde brillante o el agar Salmonella-Shigella.

Según el procedimiento que se utiliza para favorecer el crecimiento de microorganismos concretos, podemos distinguir entre medios de cultivo diferenciales y medios de enriquecimiento.

- Medios de cultivo diferenciales. Utilizan propiedades diferenciales del crecimiento microbiano. El medio de cultivo con agar sangre diferencia las bacterias hemolíticas de las no hemolíticas, el medio de cultivo de McConkey diferencia a las que son lactosa (+) de los lactosa (-).

- Medios de enriquecimiento. Deberían llamarse medios enriquecidos porque lo que se hace es añadir aditivos, que favorecen el crecimiento de un grupo determinado de microorganismos, y neutralizantes que inhiben el crecimiento de otros microorganismos que interferirían con el que estamos buscando. Se puede adicionar sangre, suero o extractos de tejidos animales o de plantas. Por ejemplo el caldo selenito cistina o el caldo agar sangre

Para estudiar adecuadamente los microorganismos se deben crecer en un medio de cultivo en condiciones de laboratorio.

Medios de cultivo:

Nutrientes

Condiciones físicas

Usos de los medios de cultivo:

Separación y aislamiento de microorganismos presentes en una muestra.

Paso previo para el estudio de identificación de un microorganismo.

Conocer el tipo de metabolismo que presentan en función del nutriente o sustrato que utiliza o metabolito que produce.

Estudios macroscópicos. Visualizar colonias en medio sólido.

Realización de antibiogramas. Prueba de resistencia a antibióticos.

Pruebas de CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) Prueba de resistencia a antibióticos.

Para la conservación de cepas.

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Son útiles para la identificación bioquímica del microorganismos y consiguiente clasificación taxonómica del mismo.

FUENTES DE CARBONO:

Sustancias muy sencillas: ácido acético, alcohol, citrato sódico, etc.)

Mono y disacáridos: glucosa, lactosa etc. (Mayoría de los casos)

Glúcidos más complejos: almidón , etc.

Metano, benceno, hidrocarburos, etc.

FUENTES DE NITRÓGENO:

Proteínas (gelatina, extractos de carne, sales de amonio, etc.)

Péptidos, peptonas (extractos de levadura, bio-Thione, caseína, peptona papaínica de soja, etc.)

Nitratos nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio, etc.

REQUERIMIENTOS NO ENERGÉTICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

FUENTES DE AZUFRE:

Sulfatos (mayoría de los casos)

Tiosulfatos.

Aminoácidos (metionina, tiamina, etc.)

FUENTES DE FÓSFORO:

Fosfatos.

IONES METÁLICOS: utilizados a concentraciones muy bajas.

Sodio, potasio, magnesio, hierro

FACTORES DE CRECIMIENTO: No todas las bacterias son capaces de crecer sobre medios donde se encuentran cubiertas las necesidades elementales. Les hacen falta componentes que no son capaces de fabricar por sí solas en su crecimiento.

Vitaminas.

Bases púricas, pirimidínicas.

FACTORES DE ARRANQUE: permiten a las bacterias salir de su fase de latencia y comenzar la fase de crecimiento exponencial.

Glucosa

Algún ión, etc.

FACTORES INHIBIDORES: impiden el crecimiento de algún microorganismos por bloqueo de sus procesos metabólicos.

Azida sódica

Antibióticos

Eosina azul de metileno

. CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO

Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:

Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo.

Unas condiciones físico-químicas apropiadas.

CONDICIONES:

o Temperatura:

o Grado de humedad: cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.

o pH:

o Presión osmótica: se usan condiciones, en general, de isotonía aunque muchas bacterias pueden crecer a condiciones algo superiores.

Bacterias que pueden crecer en medios muy acuosos e hipotónicos, poseen pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa.

Bacterias halófilas; Staphylococcus crece con alta concentración de sal. Son causas excepcionales ya que las bacterias no suelen aguantar altas concentraciones salinas, de ahí que la salación sea un método de conservación de alimentos.

Bacterias halófilas facultativas: bacterias que pueden crecer con o sin sal en el medio.

o Oxígeno

Cantidad suficiente: aerobio (metabolismo oxidativo)

Crear ambientes microacrófilos con cantidades suficientes de dióxido de carbono: anaerobio facultativo (metabolismo fermentativo)

Ausencia de oxígeno: anaerobio estricto

o Dióxido de carbono: para fotoautótrofos y quimioautótrofos ( por aireación)

o Luz: para fotosintéticos

PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PROPORCIÓN EN AGUA

Medios sólidos: proporción de agar siempre por encima del 1,5%

Medios líquidos o caldos: no contienen agar.

Medios semisólidos: proporción en agar inferior al 0,5%

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN

Medios para aislamiento para obtener colonias aisladaso Medios enriquecidos o de enriquecimiento: llevan componentes que facilitan el

crecimiento de algún tipo de microorganismo. Normalmente se usa este el primero. Son líquidos.

o Medios selectivos: llevan componentes que impiden el crecimiento de algún tipo bacteriano estableciendo con ello una selección del tipo de microorganismos. Se usan para seleccionar el microorganismo buscado.

o Medios diferenciales: tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y lo que es más característico, presentan sustancias que al ser utilizadas por las bacterias dan una información suplementaria y especifica o diferencial. Ponen en relieve propiedades que el microorganismo posee. En una misma placa diferencia dos tipos de microorganismos.

Medios generales o para el crecimiento general: sirven para el crecimiento de la mayor parte de las bacterias.

Medios de mantenimiento de cepas: tienen los nutrientes necesarios para mantener las cepas durante un período de tiempo relativamente largo manteniéndose a temperaturas suficientemente bajas en cada caso para impedir su crecimiento. Ej: leche.

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN

Medios naturales:

Los componentes se encuentran en la naturaleza: huevo, patata, suero sanguíneo, etc. Son muy poco utilizados.

Medios semisintéticos:

Parte de su composición corresponde a extractos naturales a los que se añaden constituyentes sintéticos.

Medios sintéticos:

Tiene estructuras sintéticas más o menos puras y químicamente definidas. Son los más utilizados en bacteriología.

Medios complejos:

Actualmente son de uso restringido en bacteriología, pero su uso es habitual en parasitología y virología. Se preparan de forman compleja a partir de tejidos animales y más raramente vegetales. Su composición no es rigurosamente constante.

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PRESENTACIÓN

Medios deshidratados o liofilizados:

Adición de agua en el laboratorio.

Medios sólidos en placas petri:

Viene ya preparados comercialmente. Un inconveniente es que tienen unas fechas de caducidad cortas.

Medios sólidos en tubo:

Con agar inclinado y solidificados para aumentar la superficie.

Medios líquidos en tubo:

Para aumentar la concentración de microorganismos inoculados y para pruebas bioquímicas.

Medios semisólidos en tubo:

Para aumentar la concentración de microorganismos inoculados y para pruebas bioquímicas.

Medios de doble fase en frasco:

Están constituidos por una fase sólida y otra líquida, se usan para la detección rápida de microorganismos en sangre.

PARTE EXPERIMENTAL

Cajas de Petri

Matraces Erlenmeyer de 500 ml

Tubos de rosca 13 x 100 ml

Mecheros Meker

Mecheros Bunsen

Asa de picadura

Asa de nicromo

Pipetas Mohr de 10 ml

Tapones de algodón

Masking tape

Plumones indelebles

Pipeteador o perilla

Tijeras

Papel de estraza

Medios de cultivo deshidratados :

EMB , SS , Agar Nutritivo , Agar Sal y Manitol , Base para agar sangre, Mc Conkey, caldo nutritivo , MIO, Agua destilada , sangre estéruk y desfibrinada.

TÉCNICA

1. Preparación de los medios de cultivo :

A) Leer cuidadosamente las instrucciones del fabricante para cada uno de los medios a preparar.

B) Pesar la cantidad de medio deshidratado de acuerdo a las especificaciones y vaciar en matraces Erlenmeyer.

C) Hidratar, y colocar al fuego, agitando constantemente para evitar que se queme. Hervir por un minuto.

D) Esterilizar a 15 lbs, durante 15 minutos .

E) Vaciar en las cajas de Petri a una temperatura aproximada de 45 grados centigrados . Dejar solidificar.

2. Preparación del Agar sangre :

A) Seguir las instrucciones de preparación del fabricante.

B) Esterilizar a 15 lb de presión por 15 munutos.

C) Dejar enfriar a 45 grados centigrados y agregar la sangre estéril a 5% , homogenizar perfectamente cuidando de no causar hemólisis.

D) Vaciar a cajas de Petri.

3. Preparación del Agar SS:

A) Preparar según las instrucciones del fabricante.

B) NO esterilizar.

C) Vaciar en cajas de Petri y dejar solidificar.

4. Preparación de los tubos con medio sólido (inclinado)

A) Preparar según las instrucciones del fabricante.

B) Vaciar 5 ml del medio a cada tubo , tapar el tubo sin apretar.

C) Esterilizar a 15 lbs de presión durante 15 min.

D) Apretar la rosca del tubo e inclinar , dejar solidificar.

5.Preparación de los tubos con medio semisólido (recto)

A) Preparar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.B) Esterilizar a 15 lbs de presión durante 15 min.

C) Dejar enfriar en posición recta.

6.Preparación de los tubos con caldo :

A) Preparar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. B) NO calentar.

C) Esterilizar a 15 lbs de presión durante 15 minutos.

D) Dejar enfriar.

TÉCNICA DE PLAQUEO

Se disponen las placas alrededor del mechero con la parte basal de la placa apoyada en el mesón. Se vierten , en forma aséptica unos 20 ml de medio de cultivo autoclavado y enfriado ( aproximadamente a 50 grados centigrados) . Se dejan las placas semiabiertas durante 1 a 2 min. Para eliminar el exceso de vapor de agua. Luego , se tapan y se deja solidificar el medio a temperatura ambiente. Se rotulan , y se guardan las placas en el refrigador en posición invertida hasta su uso.

CUESTIONARIO

1.¿Qué necesidades nutricionales en términos de sustancias químicas necesita toda forma de vida para su desarrollo y funcionamiento? Oxígeno, carbono, hidrogeno, nitrógeno , potasio , sodio , magnesio, azufre, zinc.

2.¿Cuáles son las ventajas del uso de medios de cultivo sintéticos? Por que contienen cantidades precisas de sustancias orgánicas e inorgánicas puras disueltas en agua destilada.

3. ¿Qué pasos se deben seguir en la elaboración de un medio de cultivo? Pesar el medio según las indicaciones del envase,calentar agua, vaciar el medio a un matraz Erlenmeyer y disolverlo, calentarlo con agitación hasta que se haga translucido, cuidando que no ebulla demaciado u asi evitar que se derrame, se prepara se prepara para esterilizar y se procede a hacerlo a 15 lbs./ 15 min. ya esteril esperar a que se baje la temperatura hasta poder asirla con las manos ya que si se enfria demaciado se gelatiniza vaciar el medio a las cajas de

petri, dejandola en la campana esteril abierta hasta que se enfrie, ya fria se tapa y se almacena en un refrigerador, previamente envuelto en papel hasta su uso.

4.¿Cuál es la principal diferencia entre un medio de cultivo sólido y un semisólido , en cuanto a su formulación? La cantidad de agar sólidos mas de 15% en su contenido menos de 5% de agar en semisólidos.

5.Enliste los componentes de la formulación del caldo nutritivo y diga que tipo de nutriente puede proveer al organismo que se cultiva

6. Escriba la clasificación de los medios de cultivo por su uso , y de un ejemplo de cada uno . ( No mencione los que se usaron en la práctica)

Comunes: agar nutritivo.

Inhibidores : Mc Conkey

Multiplicación : caldo infusión cerebro corazón (BHI)

Transporte : Stuart – Amies , Cary – Blair.

7.¿ Por qué no se debe esterilizar el medio de cultivo SS? Porque contiene productos que se degradan con el calor.

8. Realiza la formulación de un medio de cultivo imaginario que contenga todos los requerimientos energéticos que se necesitan para el crecimiento de un microorganismo :

VRBG: suspender 41,5 gr en 1 litro de agua destilada , calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante un minuto dejar enfriar y a 45 grados centígrados y emplear de inmediato. No esterilizar en autoclave.

CONCLUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA

http://www.mailxmail.com/curso-analisis-clinicos/analisis-microbiologicos-medios-cultivo-tipos

http://html.rincondelvago.com/cultivo-de-microorganismos.html