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et discipline ou spécialité

Jury :

le

Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)

Cotutelle internationale avec l'UNIVERSITE D'ANTANANARIVO

RAKOTOARIVELO Nambinina Vololomiarana

23 Septembre 2015

Activités antipaludiques de séries chimiques à noyau indole et d'extraits naturels

ED SDM : Chimie, Biologie, Santé - CO 042

Laboratoire de Pharmacochimie et Pharmacologie pour le Développement, UMR 152 IRD-UPS

Pr Marcelle RAKOTOVAO, Université d'Antananarivo, Président

Pr Renée Grillot, Université de Grenoble, Rapporteur

Pr Luc Hervé SAMISON, Université d'Antananarivo, Rapporteur

Pr Alain MILON, Université Toulouse 3, Examinateur

Pr Pierre PACAUD, Université de Nantes, Examinateur

Pr Adolphe RANDRIANTSOA, Université d'Antananarivo, Examinateur

Pr Françoise NEPVEU, Université Toulouse 3, Directrice de thèse

Pr Voahangy RAMANANDRAIBE VESTALYS, Université d'Antananarivo, Directrice de thèse

Pr Françoise NEPVEU

Pr Voahangy RAMANANDRAIBE VESTALYS

REMERCIEMENTS

Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé dans trois équipes : l’équipe RedStress de la

Professeure Françoise NEPVEU du Laboratoire « Pharmacochimie et Pharmacologie pour le

Développement », PHARMA-DEV, UMR 152 IRD-Université (Dir. N. Fabre), l’équipe du

Docteur David RAMANITRAHASIMBOLA du « Laboratoire de Pharmacognosie

Appliquée » (LPA), IMRA et l’équipe du Professeur Herintsoa RAFATRO du « Laboratoire

d’Evaluation Pharmaco-Clinique » (LEPC), IMRA Antananarivo (Dir. C. Andrianjara).

Ce travail a été financé par la Fondation Pierre Fabre et la Fondation Mérieux (programme

Allocations de Recherche pour une Thèse au Sud, ARTS, de l’Institut de Recherche pour le

Développement, IRD). Je tiens à remercier ces deux fondations qui ont œuvré ensemble pour

le renouveau des études en sciences pharmaceutiques de l’Université d’Antananarivo et qui

m’ont soutenue lors des différentes étapes de ma formation universitaire.

A Monsieur le Professeur Jean CROS qui m’a soutenue tout au long de ma formation et a

œuvré de façon constante à son bon déroulement. Je vous remercie également pour votre

souci permanent de mon devenir professionnel à Madagascar.

A Monsieur le Docteur Thierry IMBERT qui m’a formée aux sciences pharmaceutiques,

notamment en pharmacochimie. Vous n’avez pas hésité à me faire bénéficier de vos conseils,

de vos compétences et surtout de votre aide et de votre générosité lors de mes séjours en

France.

A ma directrice de thèse Madame la Professeure Françoise NEPVEU qui m’a

chaleureusement accueillie dans son équipe et a dirigé mes travaux de thèse. Vous m’avez fait

bénéficier de vos compétences, de vos encouragements et surtout de vos précieuses aides pour

le bon déroulement de l’étude doctorale notamment lors de la recherche de ma bourse de

thèse.

A ma co-directrice de thèse Madame la Professeure Voahangy RAMANANDRAIBE

VESTALYS qui a dirigé mes travaux de thèse. Vous m’avez fait bénéficier de vos

compétences, de vos expériences et de vos précieuses aides administratives et techniques.

A Madame la Professeure Renée GRILLOT et Monsieur le Professeur Luc Hervé SAMISON

en témoignage de ma plus vive reconnaissance. Malgré vos nombreuses responsabilités, vous

m’avez fait l’honneur d’accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs et membres du

jury.

A Madame la Professeure Marcelle RAKOTOVAO en témoignage de ma profonde gratitude

et mes sincères remerciements. Vous m’avez fait l’honneur de présider le jury de cette thèse.

A Monsieur le Professeur Alain MILON, Monsieur le Professeur Pierre PACAUD et

Monsieur le Professeur Adolphe RANDRIANTSOA en témoignage de ma profonde

gratitude. Vous m’avez fait l’honneur d’accepter de juger ce travail en tant qu’examinateur

dans ce jury.

A Monsieur le Docteur Ennaji NAJAHI qui a encadré mes travaux de chimie organique. Vous

avez accepté de partager vos connaissances et vos compétences pour que je puisse synthétiser

et caractériser les composés liés à ce travail. Grâce à vous, j’ai appris les différentes méthodes

d’analyse et d’identification moléculaire.

A Monsieur Nantenaina RANDRIAMIHANTA qui a encadré les travaux phytochimiques.

Vous avez accepté de partager vos connaissances et vos compétences en extraction de plantes,

fractionnement d’extraits et isolement de molécules et de me faire bénéficier de vos

précieuses aides.

A Monsieur le Professeur Alexis VALENTIN qui a encadré les essais antiplasmodiales et les

tests de cytotoxicité in vitro ainsi que les essais antipaludiques in vivo. Vous m’avez enseigné

à cultiver le Plasmodium dans les globules rouges, à faire les essais antiplasmodiaux, à faire

les tests de cytotoxicité sur les cellules Vero, à lire les frottis et à interpréter les résultats.

A Monsieur le Docteur Hajatiana RAKOTOARIMANANA qui a encadré les essais in vivo.

Vous m’avez aidée à faire les essais antipaludiques sur les souris en m’apprenant à impaluder

les souris en iv et en ip, à faire le traitement par gavage, à lire les frottis sanguins et à

interpréter les résultats.

A Monsieur Pierre PERIO qui m’a montré l’utilisation des appareils analytiques tels que

HPLC-MS, RPE, spectromètres UV-visible et de fluorescence et appareil de voltammétrie

cyclique, à Madame Nehal IBRAHIM qui m’a formée à l’utilisation de l’homogénéisateur, à

Mademoiselle Laure-Estelle CASSAGNES qui a élaboré le protocole d’étude de la

production de superoxyde par HPLC-MS et avec qui j’ai eu des discussions scientifiques,

techniques et amicales, à Mademoiselle Stéphanie CAZE-SUBRA qui m’a formée à

l’électrophorèse SDS PAGE.

A Monsieur le Docteur Charles ANDRIANJARA, directeur de l’IMRA. Vous avez permis la

réalisation de la thèse en cotutelle en m’acceptant dans votre institut et en donnant vos

nombreux conseils.

A Monsieur le Professeur Herintsoa RAFATRO, responsable du laboratoire LEPC et

Monsieur le Docteur David RAMANITRAHASIMBOLA, responsable du laboratoire LPA.

Vous m’avez chaleureusement accueillie dans votre équipe.

Je tiens à remercier tous les membres des équipes RedStress, LPA et LEPC, les membres

passés et présents du laboratoire PHARMA-DEV pour leur bon accueil et la bonne ambiance

qui a rendu agréable le séjour dans chaque laboratoire.

Je désire remercier également le Pr Etienne HOLLANDE pour ses précieux conseils et son

aide.

Bien entendu, je remercie mes parents, mon copain, mon frère, toute ma famille et mes amis à

Madagascar pour leur soutien. Je remercie également mes amis à Toulouse avec qui j’ai

partagé des moments inoubliables.

Merci à tous ceux qui ont participé de près ou de loin à l’élaboration de ce travail de thèse.

SOMMAIRE

LISTE DES ABBREVIATIONS .................................................................................................... i

I. INTRODUCTION ........................................................................................................................ 1

II. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................................ 3

A. Paludisme, la situation en 2013 ........................................................................................... 4

B. Paludisme, la pathologie ..................................................................................................... 6

C. Paludisme, les médicaments ................................................................................................ 7

D. Composés antipaludiques en développement ...................................................................... 13

E. Nouvelles approches et structures dans la recherche de molécules antipaludiques ............ 20

F. Résumé des cibles des antipaludiques ................................................................................. 25

III. INDOLONE-N-OXYDES, SERIES DERIVES ET ACTIVITES ANTIPALUDIQUES ... 27

A. Introduction ......................................................................................................................... 28

B. Pharmacomodulation des indolone-N-oxydes ..................................................................... 32

1. Synthèse ........................................................................................................................ 33

2. Activités biologiques in vitro ........................................................................................ 34

3. Fonctionnalisation du noyau indolone-N-oxyde par un fluorophore ............................ 36

4. Conclusion ..................................................................................................................... 39

C. Dérivés 2-aryl-3H-indol-3-ones .......................................................................................... 40

1. Interactions des 2-aryl-3H-indol-3-ones avec l’albumine ............................................. 41

2. Activités biologiques in vivo ......................................................................................... 54

D. Conclusion ........................................................................................................................... 58

IV. PRODUITS NATURELS ANTIPALUDIQUES .................................................................... 59

A. Introduction ......................................................................................................................... 60

B. Clitocybines et dérivés ........................................................................................................ 60

C. Extraits issus de plantes malgaches ..................................................................................... 67

D. Conclusion ........................................................................................................................... 73

V. CONCLUSION GENERALE .................................................................................................... 74

VI. PARTIE EXPERIMENTALE ................................................................................................. 76

VII. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................. 96

VIII. LISTE DES ILLUSTRATIONS (figures, schémas, tableaux) ........................................... 122

IX. ANNEXES .................................................................................................................................. 128

i

LISTE DES ABBREVIATIONS

A

ACT : traitements combinés à base

d’artémisinine

ADN : acide désoxyribonucléique

AhR : récepteur aux hydrocarbures

aromatiques

AMP : adénosine monophosphate

APCI : ionisation chimique à pression

atmosphérique

ARNt : acide ribonucléique de transfert

ARNr : acide ribonucléique ribosomique

ATP : adénosine triphosphate

ATPase : pompe ionique ATP dépendante

av. J.-C. : avant Jésus-Christ

B

BSA : albumine du sérum bovin

C

°C : degré Celsius

C. : chromatographie

C.C. : chromatographie sur colonne

calc. : calculé

CCM : chromatographie sur couche mince

CC50 : concentration cytotoxique à 50%

CD : dichroisme circulaire

CI50 : concentration inhibant 50% des

parasites

CIN : extraits d’alcaloïdes totaux de

Cinchona

CQ : chloroquine

CT50 : concentration toxique à 50%

Cyt : cytochrome

D

DCI : désorption-ionisation chimique

DHF : dihydrofolate

DHFR : dihydrofolate réductase

DHODH : dihydroorotate déshydrogénase

DHP : dihydroptéroate

DHPS : dihydroptéroate synthase

DL50 : dose létale médiane

DMF : diméthylformamide

DMSO : diméthylsulfoxyde

DOXPR : 1-désoxy-D-xylulose 5-

phosphate réductoisomérase

E

E1/2 : potentiel de demi-vague

EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique

eEF2 : facteur d’élongation eucaryote 2

eq : équivalent

ESI : ionisation par électronébuliseur

ETC : chaine de transport d’électrons

F

FP : ferroprotoporphyrin IX ou hème

G

G3P : glycéraldehyde 3-phosphate

G3PD : glycérol-3-phosphate

déshydrogénase

G6PD : glucose-6-phosphate

déshydrogénase

GNF: The Genomics Institute of the

Novartis Research Foundation

GR: glutathione réductase

ii

GSH: glutathione

GSK : Glaxo Smith Kline

GSSG: glutathione disulfide

GST: glutathione transférase

GTP: guanosine triphosphate

H

Hb: hémoglobine

HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-

pipérazine éthane sulfonique

HMP-PP : amino-hydroxy-

méthyldihydroptéridine

pyrophosphate

HPLC : chromatographie liquide haute

performance

HSA : albumine du sérum humain

HTS : criblage à haut débit

I

IPP: isopentényl pyrophosphate

INDs : 2-aryl-3H-indol-3-ones

INODs : indolone-N-oxydes

ip : intrapéritonéale

IP : indice de polydispersité

IR : Infrarouge

IS : indice de sélectivité

iv : intraveineux

L

LC-MS : chromatographie liquide couplée

à une spectrométrie de masse

Leu : leucine

LeuRS : leucyl ARNt synthétase

M

m: masse

MAO B : monoamine oxydase B

metHb : méthémoglobine

MIC : concentration minimale inhibitrice

MQO : malate quinone déshydrogénase

MM : masse moléculaire

MMV : Medicines for Malaria Venture

MRE : ellipticité résiduelle moyenne

MS : spectrométrie de masse

N

NAD : nicotinamide adénine dinucléotide

NADP : nicotinamide adénine dinucléotide

phosphate

NADPH : nicotinamide adénine

dinucléotide phosphate réduite

nd : non déterminé

NPs : nanoparticules

NQ : 1,4-naphthoquinones

O

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

P

P : valeur-p (probabilité d’obtenir la même

valeur)

P. : Plasmodium

pABA : acide para-aminobenzoique

PBS : tampon phosphate salin

PC : phosphatidylcholine

Pf : Plasmodium falciparum

PfATP4: Plasmodium falciparum sodium-

ATPase

PfATP6: Plasmodium falciparum calcium-

ATPase

iii

Pfcarl : Plasmodium falciparum Cyclic

Amine Resistance Locus

PfCRT : Plasmodium falciparum

Chloroquine Resistance Transporter

Pfmdr 1 : Plasmodium falciparum Multi-

Drug Resistance 1

PfNDH2 : NADH : ubiquinone

oxydoréductase

Pgh1: P-glyco-protein homologue 1

PI : phosphatidylinositol

PI4P : phosphatidylinositol 4-phosphate

PNP : purine nucléoside phosphorylase

Q

QH2 : coenzyme Q réduite

R

r : coefficient de corrélation

Rdt : rendement

RMN 1H: Résonance Magnétique Nucléaire du

proton

RMN 13

C : Résonance Magnétique Nucléaire

du carbone

ROS : espèces réactives de l’oxygène

RPE : Résonance Paramagnétique

Electronique

RPMI : Roswell Park Memorial Institute

Medium

S

SAR: relation structure-activité

SCE : électrode au calomel saturée

SDH : succinate : ubiquinone

oxydoréductase

T

TA : température ambiante

TDR : Test de Diagnostic Rapide

THF : tétrahydrofolate

Trx : thiorédoxine

TrxR : thiorédoxine réductase

U

USA : Etats-Unis

UV : Ultraviolet

V

vs. : versus

X

XTT : 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-

sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-

carboxanilide

2

Le paludisme est l’infection parasitaire la plus répandue dans le monde. Elle est redoutable

en zone tropicale où le parasite Plasmodium falciparum est très abondant. Elle est aussi

difficile à éradiquer totalement à cause des formes hépatiques dormantes de Plasmodium

vivax très répandu responsables des accès de reviviscence palustre. D’un côté, le seul

médicament efficace contre la forme hépatique de P. vivax actuellement est la primaquine qui

présente des effets secondaires. De l’autre côté, P. falciparum est devenu résistant à

l’artémisinine, menacant l’efficacité des combinaisons thérapeutiques à base d’artémisinine,

traitement de première intention recommandé. Il est donc urgent de trouver de nouvelles

molécules possédant de nouveaux mécanismes d’action pour répondre à ces besoins.

L’objectif de ce travail de thèse est, d’une part, de poursuivre l’optimisation pharmaco-

chimique d’une série de molécules antipaludiques, d’autre part, de rechercher de nouveaux

archétypes structuraux à partir de la biodiversité. Ainsi, cette thèse s’organise en trois

chapitres.

Le premier chapitre présente une étude bibliographique sur le paludisme, les médicaments

d’usage actuels et les molécules en recherche et développement.

Le deuxième chapitre est consacré à l’optimisation pharmacochimique de la série de synthèse

des indolone-N-oxydes et dérivés.

Le troisième chapitre concerne la recherche de composés antipaludiques d’origine naturelle.

Ce chapitre se divise en deux parties. La première partie présente l’étude des clitocybines

isolées de champignons et de ses dérivés isoindolinones de synthèse et la deuxième partie

présente la recherche de nouvelles molécules à partir de plantes malgaches.

4

A. Paludisme, la situation en 2013

Le paludisme est une maladie infectieuse dévastatrice. En 2013, il a été recensé 198 millions

de cas et 584 000 décès. Les femmes enceintes et les enfants sont les plus vulnérables. Les

pays de l’Afrique sont les plus menacés avec 450 000 décès d’enfants de moins de cinq ans en

2013 parmi les 525 600 décès recensés. Dans le cas de Madagascar, 30% des 23 000 000

habitants présentent un risque élevé de transmission ; environ 400 000 cas et 641 décès ont été

recensés en 2013 (WHO, 2014). Cette maladie y représente la huitième cause de morbidité.

Sa répartition est hétérogène, définissant quatre faciès épidémiologiques :

- le faciès équatorial sur la côte caractérisé par une forte et pérenne transmission ;

- le faciès tropical sur la côte ouest avec une transmission longue de plus de 6 mois ;

- le faciès subdésertique dans le sud où la transmission est épisodique et courte ;

- le faciès des Hautes Terres Centrales où le paludisme est épidémique.

Le rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) en 2014 note un progrès dans la

réduction des cas de paludisme et des décès. Cinquante cinq pays sont en bonne voie pour

réduire de 75% leur taux d’incidence de la maladie d’ici 2015, par rapport à 227 000 000 de

cas estimés en 2000. Douze pays avec transmission du paludisme en 2000 rapportent zéro cas

en 2013. De 2000 à 2013, le taux de mortalité a diminué de 47% à l’échelle mondiale par

rapport à 882 000 décès en 2000. Ces progrès ont été obtenus grâce à la prévention

(moustiquaires, pulvérisation intra-domiciliaire d’insecticides, traitements préventifs

intermittents pour les femmes enceintes) et à la prise en charge des tests de diagnostic et des

traitements antipaludiques. Ceci a été possible grâce à une augmentation importante des

soutiens financiers. En 2013, le financement atteint 2,7 milliards de dollars dont plus de la

moitié est destiné aux pays d’Afrique. Cependant, ce montant est loin d’atteindre les 5,1

milliards de dollars nécessaires (WHO, 2014).

La prévention est le premier niveau de lutte contre le paludisme. Malheureusement, une partie

de la population n’y a pas accès à cause de manques de moyens et d’éducation. Les

moustiquaires imprégnées d’insecticides sont utilisées dans 97 pays dont 45 pays africains. La

moitié de la population africaine subsaharienne a eu accès aux moustiquaires en 2013. La

pulvérisation intra-domiciliaire est pratiquée par 7% des populations à risque. Cependant dans

plus de deux tiers des pays et depuis 2010, on observe une résistance aux insecticides parmi

lesquels les pyréthrinoïdes qui sont les plus utilisés. Les traitements préventifs intermittents

pendant la grossesse ont augmenté bien que ce soit encore insuffisant. En 2013, seulement six

pays parmi 16 ont adopté la chimioprévention du paludisme saisonnier chez les enfants âgés

de moins de 5 ans recommandé par l’OMS. Les tests de diagnostic s’intensifient. Dans le cas

5

de l’Afrique, 40% des patients suspectés de paludisme ont reçu un test de diagnostic en 2010,

et ce chiffre atteint les 62% en 2013. Un meilleur accès au traitement est rapporté. Plus de

70% de patients avaient bénéficié de traitements combinés à base d’artémisinine (ACT) en

2013. Cependant, on note une moindre efficacité et une résistance à l’artémisinine dans la

région du Grand Mékong (WHO, 2014).

A Madagascar, le programme de contrôle du paludisme a été basé sur la généralisation de la

prise en charge des cas avec les ACT associées à l’utilisation de Test de Diagnostic Rapide

(TDR) dans presque la totalité des formations sanitaires publiques. Afin d’éliminer cette

maladie, un plan stratégique de lutte a été mis en place en 2013 dans le but de réduire le taux

de mortalité à zéro d’ici fin 2017.

6

B. Paludisme, la pathologie

Le parasite responsable du paludisme est le Plasmodium. Il se transmet par des piqûres de

moustique du genre Anopheles. Cinq espèces sont actuellement connues pour infecter

l’homme : Plasmodium falciparum (P. falciparum), Plasmodium vivax (P. vivax),

Plasmodium ovale (P. ovale), Plasmodium malariae (P. malariae) et Plasmodium knowlesi

(P. knowlesi) (White, 2008). Seule l’espèce P. falciparum est mortelle chez l’homme. Les

symptômes (fièvre, maux de tête et vomissements) apparaissent 10 à 15 jours après

l’infection. Dans le cas du neuropaludisme, les complications neurologiques peuvent aboutir

au coma.

Le cycle de vie du parasite comprend deux étapes : un cycle sexué chez le moustique et un

cycle asexué chez l’homme qui comprend la phase hépatique et la phase érythrocytaire

(Figure 1).

Figure 1. Cycle de Plasmodium chez l’homme (Hill, 2011 ; Delves, 2012) (illustrations

issues de Servier Medical Art http://www.servier.fr/smart/banque-dimages-powerpoint)

La phase hépatique démarre avec la pénétration des formes sporozoïtes dans la cellule

hépatique provenant de la piqûre de l’anophèle et ayant migré via la circulation sanguine vers

le foie. Le sporozoïte dans l’hépatocyte se développe sous forme schizonte sphérique

multinucléée contenant des milliers de nouveaux parasites appelés mérozoïtes. Ce processus

de maturation des schizontes peut prendre plusieurs années dans le cas d’infection par P.

vivax et P. ovale donnant des formes quiescentes de parasites appelées hypnozoïtes. Les

mérozoïtes sont libérées après éclatement des hépatocytes et migrent dans le sang.

7

La phase érythrocytaire commence par la pénétration des mérozoïtes dans les globules rouges

où ils se développent. Un mérozoïte évolue, d’une part, en forme anneau, en trophozoïte puis

en schizonte. Ce dernier contient 8 à 36 mérozoïtes qui seront libérés après éclatement de

l’érythrocyte pour infecter d’autres érythrocytes. Un mérozoïte se transforme, d’autre part, en

gamétocyte uninucléé capable de produire, une fois ingéré par un moustique, des gamètes

mâles et femelles. Le stade asexué érythrocytaire chez l’homme est le plus étudié et ciblé par

la majorité des médicaments.

C. Paludisme, les médicaments

L’histoire de la pharmacie antipaludique (Figure 2) démarre en 1820 avec la découverte de la

quinine par Pierre-Joseph Pelletier et Joseph Bienaime Caventou (Pelletier, 1820). La

découverte du bleu de méthylène, un composé redox, marque une nouvelle étape en 1891

(Guttman, 1891). Le papyrus Ebers d’Egypte datant de 1600 av. J.-C. a recommandé

l’utilisation de l’Artemisia annua (ou wormwood ou qinghao) contre les symptômes du

paludisme (Baker, 2001), mais ce n’est qu’en 1971 que l’artémisinine est isolée par des

scientifiques chinois (Qinghaosu Antimalaria Coordinating Research Group, 1979 ; Tu,

2011). Depuis de nombreux nouveaux composés ont été synthétisés de novo ou isolés de

plantes.

Figure 2. Chronologie de la découverte des médicaments antipaludiques majeurs (Hudson,

1993 ; Wells, 2011 ; Krafts, 2012 ; Patil, 2014)

1. Quinine et dérivés

La quinine 1 est un alcaloïde isolé de Cinchona en 1820 (Pelletier, 1820). Cet arylamino-

alcool est le premier médicament efficace contre le paludisme, actif sur les formes intra-

érythrocytaires du parasite mais présentant une toxicité. Ses dérivés synthétiques, la

méfloquine 7 et la luméfantrine 8, sont utilisés en combinaison avec les dérivés de

l’artémisinine 4. La méfloquine 7 est également utilisée comme traitement de prévention.

8

Quinine, 1

N

O

HON

N

CF3

CF3

HO

HN

Méfloquine, 7

Cl

HON

Cl

Cl

Luméfantrine, 8

N

HN

OH

N

Cl

Amodiaquine, 9

Des études montrent que cette classe moléculaire inhibe l’accumulation de l’hémozoïne

(forme polymérisée de l’hématine toxique pour le Plasmodium) dans les cellules infectées

(Sullivan, 1998 ; Zhang, 1999). La résistance du parasite à ces médicaments, apparue pour la

quinine en 1910, est due à l’expression du gène Pfmdr 1 (P. falciparum Multi-Drug

Resistance 1) qui code la glycoprotéine Pgh1 (Sanchez, 2010), une pompe extractive

localisée dans la membrane de la vacuole digestive parasitaire.

2. 4-aminoquinolines

La chloroquine 2, une 4-aminoquinoline, a été longtemps utilisée comme médicament

antipaludique car ce composé est efficace et peu onéreux. Ses dérivés sont l’amodiaquine 9, la

pyronaridine 10 et la pipéraquine 11 (bisquinoline de synthèse). L’amodiaquine 9 est peu

utilisée à cause de ses effets secondaires. Sa métabolisation dans le foie par le cytochrome

P450 donne un métabolite toxique de forme quinone-imine. La pyronaridine 10 et la

pipéraquine 11 sont actuellement utilisées en combinaison avec des dérivés de l’artémisinine

4.

N

HN

OH

N

Cl

Amodiaquine, 9

N

N O

HNN

N

OH

Cl

Pyronaridine, 10

N

N

N N

N

N

ClCl

Pipéraquine, 11

N

HNN

Cl

Chloroquine, 2

Comme les arylamino-alcools, cette classe agit en interférant avec la polymérisation de

l’hème. Selon Sanchez CP (2010), la résistance apparue pour la chloroquine vers les années

1950 est due à :

- la mutation K76T de la protéine PfCRT (P. falciparum Chloroquine Resistance Transporter)

codée par le gène pfcrt. La forme mutée réduit l’accumulation de la chloroquine dans la

vacuole digestive du parasite où se passe la polymérisation de l’hème.

9

- la surexpression de Pfmdr 1. Les médicaments vont être emprisonnés dans un compartiment

de la vacuole où ils seront moins délétères pour les parasites.

3. Antifolates

La compréhension du rôle de l’acide folique et ses dérivés chez l’homme a permis d’identifier

et de développer des antifolates. Les agents antifolates utilisés pour le traitement du

paludisme se divisent en deux groupes.

- Les inhibiteurs de la dihydrofolate réductase (DHFR)

La proguanil 12 est le premier antifolate à visée antipaludique. Sa combinaison avec un

naphtoquinone est utilisée comme médicament de prévention. La pyriméthamine 13 est un

dérivé 2,4-diaminopyrimidine inhibant également DHFR. La résistance du parasite à ces

antifolates est due à quatre mutations de DHFR (N51I/C59R/S108N/I164L). Une seule

mutation de S108N n’est pas suffisante pour créer la résistance à la pyriméthamine 13

(Sirawaraporn, 1997).

- Les inhibiteurs de la dihydropteroate synthase (DHPS)

La sulfadoxine 14 appartient à cette classe d’inhibiteurs. Sa combinaison avec la

pyriméthamine 13 est très efficace comme traitement prophylactique et curatif. Deux

mutations de DHPS (A437G et K540E) chez des parasites sont responsables de la résistance à

la sulfadoxine 14 (Sirawaraporn, 1997).

HN

HN

HN

NHNHCl

Sulfadoxine, 14

N

N

NH2H2N

Cl

N N

O

OHNS

O

O

H2N

Proguanil, 12 Pyriméthamine, 13

4. 8-aminoquinolines

La primaquine 15 faisant partie de cette classe est le seul médicament pour traiter P. vivax ou

P. ovale. Elle tue les hypnozoites évitant les phénomènes de reviviscences. Son inconvénient

est sa toxicité pour les personnes déficientes en glucose-6-phosphate déshydrogénase*

* Le déficit en G6PD est une affection génétique prédisposant la personne à une hémolyse

dans les états de stress oxydant. Ce déficit confère une relative résistance au paludisme en

favorisant la phagocytose précoce des hématies parasitées. La primaquine est un déclencheur

causant l’anémie hémolytique sévère.

10

(G6PD) provoquant chez ces patients une anémie hémolytique (Ganesan, 2012). Son

mécanisme d’action est très peu connu mais une étude montre que son activité dépend de sa

métabolisation dans le foie par le cytochrome P450 CYP 2D6 en métabolites phénoliques

(Pybus, 2013). Ces métabolites sont oxydoréductibles et vont générer des espèces réactives

de l’oxygène (ROS) (Vásquez-Vivar, 1992) (Vásquez-Vivar, 1994). Il n’existe pas de cibles

validées pour prévenir la rechute. Aussi, aucune résistance évidente n’a été reportée. Le

manque d’études approfondies sur la résistance à la primaquine pose un problème pour la

conception de nouvelles molécules antihypnozoïtes. Un autre inconvénient est le

polymorphisme génétique provoquant une non-réponse au médicament pour certains patients

(Pybus, 2012). Néanmoins, des analogues de ce médicament sont actuellement en phase

clinique de développement tel que la tafénoquine 16 et le NPC-1161-B 17.

N

O

HNNH2

Primaquine, 15

NO

HN

NH2

O

O

CF3

Tafénoquine, 16

N

O

Cl

Cl

HNNH2

O

NPC-1161-B, 17

La tafénoquine 16 est un dérivé 5-phénoxyle de la primaquine plus efficace et moins toxique

que celle-ci (Brueckner, 1998). Elle est en phase de développement menée par l’Armée des

USA et Glaxo Smith Kline (GSK) pour le traitement prophylactique du paludisme. La phase

clinique III a démarré en 2014. Avec la chloroquine, elle permet de traiter et prévenir la

rechute avec P. vivax (Llanos-Cuentas, 2014). NPC-1161-B 17 est un autre dérivé, candidat

prometteur mais ses effets indésirables ne sont pas encore connus. Comme la primaquine 15,

ses dérivés requièrent également les enzymes CYP2D pour leur activité antipaludique

(Marcsisin, 2014). Il est donc proposé que leurs métabolites soient également

oxydoréductibles.

5. Naphtoquinones

L’atovaquone 5 (Figure 2) est un hydroxy-1,4-naphthoquinone, récemment utilisé en

combinaison avec la proguanil 12 sous le nom commercial de MalaroneTM

. Le médicament

est utilisé pour traiter et prévenir la maladie car il agit sur les formes érythrocytaires et

hépatocytaires du paludisme. L’atovaquone 5 est le seul médicament antipaludique inhibant le

cytochrome b (Cytb : partie du complexe cytochrome bc1) de la mitochondrie du parasite. La

résistance à ce médicament est rare et est due à des mutations au codon 268 du Cytb (Y268S

ou Y268C) (Fisher, 2012).

11

6. Antibiotiques

Deux antibiotiques ayant deux mécanismes d’action différents sont utilisés contre le

paludisme :

- la fosmidomycine 18. Sa combinaison avec la pipéraquine 11 est actuellement étudiée en

phase clinique. Elle agit en inhibant la 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate réductoisomérase

(DOXPR), une enzyme clé dans la voie non mévalonique de la biosynthèse des isoprénoides

dans l’apicoplaste, absente chez l’homme (Kuzuyama, 1998).

- la doxycycline 19. Elle est partiellement efficace en prophylaxie mais est utilisée dans les

régions où le paludisme est résistant à la chloroquine et à de multiples médicaments (Tan,

2011). Elle inhibe les mécanismes de synthèse des protéines dans l’apicoplaste et la

mitochondrie provoquant une dérégulation du taux de protéines (Briolant, 2010). Lors de la

multiplication parasitaire, ce phénomène va bloquer le développement des parasites filles

(Dahl, 2006). La doxycycline inhibe également la synthèse des nucléotides et

désoxynucléotides (Yeo, 1998).

P N O

OHHO

OH

O

O

H2N

O

HO

O OH OH

OHHH

N

OH

Fosmidomycine, 18 Doxycycline, 19

7. Artémisinine, dérivés et traitements combinés à base d’artémisinine (ACT)

L’artémisinine 4 est un produit isolé de l’Artemisia annua. Bien qu’utilisée depuis des

millénaires, cette molécule a été isolée et sa structure identifiée en 1971 par Youyou Tu (Tu,

2011). Elle représente le développement le plus important dans le traitement du paludisme.

L’artémisinine 4 et ses dérivés, les 1,2,4-trioxanes, agissent rapidement et sont très actifs

contre les parasites érythrocytaires mais ils ont une faible demi-vie (entre 45 min et 3 h), d’où

l’intérêt de les combiner avec d’autres médicaments antipaludiques ayant une activité plus

prolongée pour former les ACT (Eastman, 2009). Les ACT sont efficaces contre les souches

multirésistantes et sont, depuis 2006, le traitement de première intention recommandé par

l’OMS.

L’artémether 20 combiné à la luméfantrine 8 nommé Coartem® est le premier ACT de haute

qualité pour les enfants. L’artésunate 21 est le meilleur médicament pour traiter les formes

compliquées et sévères du paludisme (Li, 2010a). Il est formulé pour une injection sous le

nom d’Artesun® (plus actif que la quinine) et est également combinée à la méfloquine 7

12

(Artequin®

), à la pyronaridine (10) (Pyramax®) ou encore à l’amodiaquine 9 (Coarsucam

®, en

phase clinique IV depuis 2013). La combinaison de la dihydroartémisinine 22 avec la

pipéraquine 11 est vendue sous le nom d’Eurartesim® (Zani, 2014).

Le premier dérivé synthétique de l’artémisinine 4 est l’artérolane 23 (ou OZ277), de structure

1,2,4-trioxolane (Vennerstrom, 2004). Ce produit est combiné à la pipéraquine 11 (Valecha,

2012) sous le nom de SynryamTM

. La phase clinique III étant achevée, le médicament est

approuvé en Inde depuis 2012 et dans sept pays africains en 2014.

O

O

H

H

O

H

Artémisinine, 4

OO

O

O

H

H

O

H

Artémether, 20

OO

O

O

H

H

O

H

OO

OOH

O

Artésunate, 21

O

O

H

H

OH

H

Dihydroartémisinine, 22

OO

O

O

O

NH

O

NH2

Artérolane, 23

Les dérivés de l’artémisinine agissent dans la vacuole digestive parasitaire. La digestion de

l’hémoglobine dans la vacuole digestive du parasite est nécessaire pour l’activité de

l’artémisinine 4 et ses dérivés (Klonis, 2011). Des hypothèses proposent que l’artémisinine

interagit avec le fer(II) de l’hème en s’alkylant (Robert, 2002) formant ainsi des radicaux

libres centrés sur le carbone. Ces derniers vont créer des dommages en interférant avec des

protéines fonctionnelles comme le calcium-ATPase (PfATP6) et en détruisant les fonctions

normales de la mitochondrie (Li, 2010b).

Les premiers signes de résistance ont été remarqués après une étude conduite en 2008 par

Dondorp AM et al montrant que la sensibilité à l’artésunate 21 est réduite in vivo au

Cambodge comparée à la Thailande (Dondorp, 2009). Cette résistance s’est propagée dans

toute la région du Grand Mékong (Cui, 2012). Elle serait due à l’implication de régions des

chromosomes 10 et 13 (Takala-Harrison, 2013). Il est aussi proposé qu’elle est due à

l’expression d’une allèle régulant le métabolisme, faible chez les parasites en début de phase

érythrocytaire mais élevée en phase avancée érythrocytaire, contournant ainsi l’action du

médicament et assurant une survie étant donné la courte demi-vie de l’artémisinine (Mok,

2011). En 2013, la découverte d’un marqueur moléculaire de la résistance à l’artémisinine,

K13 – hélice, permettra de surveiller la propagation de la résistance (Ariey, 2014). Le gène

K13 situé sur le chromosome 13 du parasite code une protéine en hélices et sa mutation joue

un rôle majeur dans la résistance à l’artémisinine. Comme l’ACT est le traitement de première

intention, il est vraiment urgent et essentiel d’éliminer la menace d’émergence de résistance à

l’artémisinine (Dondorp, 2013).

13

D. Composés antipaludiques en développement

Les cibles des antipaludiques utilisés actuellement comme médicaments sont le globule rouge

parasité, la formation de l’hémozoïne dans la vacuole digestive, la voie de biosynthèse du

tétrahydrofolate (THF), le cytochrome bc1 de la mitochondrie, la protéine PfATP6 et

l’apicoplaste. La plupart des médicaments actuellement en développement en phase III et IV

proviennent de l’amélioration des structures déjà existantes et auront donc les mêmes

mécanismes d’action. La recherche de nouveaux antipaludiques a évolué récemment.

L’identification de la séquence du génome de P. falciparum en 2002 a permis de mieux

comprendre les métabolismes du parasite et d’identifier de nouvelles cibles potentielles

(Gardner, 2002). Depuis 2008, de nouvelles séries de molécules ont été découvertes par

criblages à haut débit sur la base de leurs activités antiplasmodiales principalement effectués

par trois groupes pharmaceutiques : Novartis (GNF), GlaxoSmithKline (GSK) et St Jude

Children’s Research Hospital.

En 2008, GNF a criblé 1,7 millions de composés. Environ 6000 molécules représentant plus

de 530 structures différentes montrent une activité antiplasmodiale (< 1,25 µM) (Plouffe,

2008). En 2010, GSK a criblé près de 2 millions de composés. Environ 14 000 composés sont

actifs à une concentration de 2 µM et plus de 8000 sont actifs sur une souche multirésistante

(Gamo, 2010). La même année, St Jude Children’s Research Hospital a criblé 309 474

composés. Des molécules candidates qui sont au nombre de 172 ont été révélées parmi

lesquelles ont été identifiés 13 nouveaux inhibiteurs de 4 cibles et 15 molécules se liant à des

protéines impliquées dans le paludisme (Guiguemde, 2010).

Les molécules actuellement en développement sous l’égide de Medicines for Malaria Venture

(MMV) sont consultables sur le site de MMV (Figure 3). Au cours des paragraphes suivants,

les candidats présentés dans cette figure seront analysés.

1. Composés agissant sur d’anciennes cibles

1.1. Endoperoxydes

Comme l’artémisinine, ils alkylent des protéines cibles comme PfATP6 et l’hème inhibant la

formation de l’hémozoïne dans la vacuole digestive.

La plupart des produits en phases cliniques avancées sont des dérivés de l’artémisinine, des

ACT et de nouveaux endoperoxydes synthétiques.

14

Figure 3. Portefeuille des antipaludiques gérés par MMV en 2015 montrant les composés en développement (de la phase préclinique à

ceux approuvés par l’OMS) (http://www.mmv.org/fr/recherche-developpement/portefeuille-science)

15

- Dérivés de l’artémisinine 4 et ACT

De nouvelles formes galéniques des dérivés de l’artémisinine et des ACT sont proposées en

développement. L’artésunate 21 formulée en administration rectale est soumis au Programme

de Préqualificaton de l’OMS. Les produits en phase clinique III sont les combinaisons

artésunate 21 – pyronaridine 10 et dihydroartémisinine 22 – pipéraquine 11 en forme

pédiatrique, l’artémether 20 en pulvérisation sublinguale sous le nom d’ArTiMistTM

et

l’artémisinine 4 combinée à la naphthoquine 24, un 4-aminoquinoline (Arco®).

L’artémisone 25, actuellement en phase clinique II, est un nouveau dérivé de l’artémisinine,

dix fois plus actif que l’artésunate 21 sur le modèle in vitro. Il est aussi efficace sur le modèle

murin contre le neuropaludisme (Vivas, 2007).

- Nouveaux endoperoxydes

La production d’artémisinine 4 à partir de plantes est très variable et l’artémisinine 4 obtenue

par biosynthèse (Paddon, 2013) donne un faible rendement (40 - 45 %). Ainsi, il était

intéressant d’identifier de nouveaux endoperoxydes que l’on peut synthétiser à faible coût,

tels que les trioxolanes (Vennerstrom, 2004).

L’artérolane 23 qui est la première génération d’ozonides synthétiques a une courte demi-vie

(2 – 4 h). L’OZ439 26, un autre trioxolane, a une plus longue demi-vie (25 – 30 h). Cette

deuxième génération d’ozonide synthétique a une action puissante et rapide (concentration

plasmatique maximale après 3 h) et une meilleure biodisponibilité par rapport à l’artérolane

(Charman, 2011). OZ439 26 est efficace in vivo et bloque la transmission du parasite au

vecteur (Delves, 2012). En phase clinique de développement, les ozonides sont actifs

uniquement sur le stade érythrocytaire comme les dérivés de l’artémisinine. Leur activité étant

basée sur le pont endoperoxyde, ils peuvent être moins actifs contre les parasites résistants à

l’artémisinine. La combinaison d’OZ439 avec des 4-aminoquinolines est actuellement en

phase clinique IIb (Moehrle, 2013) et est comparée avec l’artésunate 21 dans les pays qui

présentent des résistances aux dérivés de l’artémisinine.

Des endoperoxydes étudiés par les équipes de O’Neill PM, de structure 1,2,4,5-tétraoxane,

sont plus stables que les 1,2,4-trioxolane (O’Neill, 2010). La tête de série de cette nouvelle

classe d’ozonide, RKA182 27, est en phase préclinique. Elle a l’avantage d’être soluble dans

l’eau, très active chez la souris, plus stable que l’artérolane 23 mais son activité

antiplasmodiale et son profil pharmacocinétique sont inférieurs à ceux de l’OZ439 26 (Wang,

2013).

16

O

O

H

H

N

H

OO

S

Artémisone, 25

O

O

OO N

O

OZ439, 26

OO

O O

N

O

NN

RKA182, 27

NCl

HN

OH

NH

Naphthoquine, 24

1.2. Nouveaux dérivés de la chloroquine

La chloroquine 2 se lie de façon non covalente à l’hème empêchant la poursuite de la

croissance de la formation du cristal d’hémozoine (Sullivan, 1996). Des analogues de la

chloroquine ont été synthétisés (Figure 12). Un produit organométallique, la ferroquine 28,

est composé d’un groupe ferrocényle oxydo-réductible (Chavain, 2008) se liant au 4-

aminoquinoline et à un alkylamine. Cette molécule inhibe la formation d’hémozoine (Dubar,

2008), cible les lipides provoquant la destruction des membranes (Dubar, 2011), et génère

des espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Dubar, 2013). AQ13 29 est un 4-aminoquinoline

à chaine courte, actif contre la souche chloroquino-résistante de Pf. Son mode d’action est

similaire à la chloroquine mais la présence de la courte chaine de liaison est supposée

permettre à la molécule de contourner le mécanisme de résistance du parasite (PfCRT)

(O’Neill, 2012). Ce produit est actuellement en phase clinique II. La N-tert butylisoquine 30

est un autre 4-aminoquinoline, métaboliquement stable par rapport à l’amodiaquine 7. C’est

un bon candidat pour le développement (O’Neill, 2009) et est en phase clinique I. D’autres

nouveaux analogues 31 sont étudiés, contenant à la chaine latérale de nouveaux groupes

comme la méthylpipérazine, liés à la 4-aminoquinoline par un acide aminé (Sinha, 2014).

NCl

HN

OH

NH

Naphthoquine, 24

NCl

HN

Fe

N

Ferroquine, 28

NCl

HN

AQ13, 29

N

NCl

HN

N-tertbutylisoquine, 30

OH

NH

NCl

HN

Dérivés

4-aminoquinolines, 31

O

N

N

n

1.3. Nouveaux antifolates antipaludiques

La cotrimoxazole est un antibiotique actuellement en phase clinique III pour le traitement du

paludisme (Manyando, 2013). Ce médicament associe deux antifolates, la triméthoprime 32

qui inhibe la dihydrofolate réductase (DHFR) et la sulfaméthoxazole 33 qui inhibe la

dihydroptéroate synthase (DHPS).

17

La diaminopyridine est une nouvelle génération d’inhibiteur de la DHFR. Elle se lie

spécifiquement sur la DHFR de P. falciparum à la place du substrat naturel qui est l’acide

dihydrofolique. Son site de liaison est différent de la pyriméthamine 13 lui permettant de

surmonter la résistance du parasite via la mutation de l’enzyme DHFR. La molécule tête de

série P218 34 est actuellement en phase préclinique selon le portefeuille de MMV.

N

N

NH2

O

O O

H2N

Triméthoprime, 32

H2N

SNH

O OON

Sulfaméthoxazole, 33

N

N

NH2

H2N

O O O

OH

P218, 34

1.4. Nouveaux inhibiteurs du complexe cytochrome bc1

Dans la mitochondrie parasitaire, ce complexe réoxyde le coenzyme Q mitochondrial qui va

être réduit par différentes enzymes déshydrogénases comme la dihydroorotate

déshydrogénase (DHODH). Il contient deux sites de liaison à la quinone, le site quinol

oxydation Qo et le site de liaison quinone Qi.

L’atovaquone 5 est un inhibiteur compétitif du site Qo (Kessl, 2007). Il existe un autre

inhibiteur de ce site : le ELQ-300 35 (Nilsen, 2013). ELQ-300 35, un quinolone-3-diaryléther,

est un candidat efficace sur les formes érythrocytaires et hépatocytaires du parasite et dans les

moustiques. Ce produit a été développé par MMV et a été recensé pour les essais cliniques en

2013. Cependant, il n’est plus inscrit dans le portefeuille de MMV de 2014, indiquant que les

études ont été interrompues. Un inhibiteur du site Qi du complexe bc1 est la classe des

pyridones (Capper, 2015). Cette classe est connue depuis 1960 pour ses activités

antipaludiques avec la clopidol (Latter, 1991). En 2006, GSK a identifié les 4(1H)-pyridones

dont le produit candidat GSK932121 36 (Bueno, 2012) est testé en phase I en 2008 mais

suspendu après un problème de sécurité. MK4815 37 est une autre molécule inhibitrice du

complexe cytochrome bc1, de structure 2-aminométhyl-3,5-di-tert-butylphénol. Elle est en

phase préclinique actuellement.

NH

O

Cl

O

O

O

CF3

ELQ300, 35

NH

O

Cl

O

O

CF3

GSK932121, 36

NH2OH

MK 4815, 37

18

2. Les composés agissant sur de nouvelles cibles

2.1. Inhibiteurs de la pompe Plasmodium falciparum Na2+

-ATPase PfATP4

Le P. falciparum Na2+

-ATPase PfATP4 est une pompe transporteuse de cation ATP

dépendant PfATP4 qui régule l’homéostasie sodique du parasite. Son inhibition entraine une

concentration intracellulaire élevée en sodium provoquant un changement physique des

cellules infectées comprenant l’augmentation de la rigidité de la membrane et l’externalisation

de la phosphatidylsérine conduisant au suicide érythrocytaire. Trois classes de molécules

inhibant cette protéine sont en phase de développement : les spiroindolones, les

dihydroisoquinolones et les pyrazoleamides.

Les spiroindolones sont une classe découverte après un criblage effectué par Novartis

(Plouffe, 2008). La molécule tête de série KAE609 38, aussi appelée NITD609 (Rottmann,

2010), est une molécule de synthèse, active sur les souris à une dose unique et bloque la

transmission au vecteur (van Pelt-Koops, 2012). En 20 ans, c’est le premier candidat ayant

un nouveau mécanisme d’action et qui entre en phase clinique, actuellement en phase II

(White, 2014). SJ733 39 est la tête de série de la classe des dihydroisoquinolones. Cette

molécule tue rapidement les parasites in vivo et a un bon profil pharmacocinétique et

toxicologique (Jiménez-Díaz, 2014). Elle est actuellement en phase préclinique. C’est aussi

le cas de PA92 40, un pyrazoleamide, qui a une activité potentielle contre les gamétocytes

matures et est efficace in vivo sur les souris humanisées infectées par P. falciparum. Son

mécanisme d’action est similaire à celui du KAE609 38 en détruisant l’homéostasie sodique

du parasite (Vaidya, 2014).

2.2. Inhibiteur de la protéine Pfcarl (P. falciparum Cyclic Amine Resistance

Locus)

Une molécule de la classe des imidazolopipérazines, actuellement en phase IIa (Kuhen, 2014)

(Leong, 2014) est très prometteuse. C’est la KAF156 41 aussi nommée GNF156. Cette classe

a été identifiée comme active sur les stades érythrocytaires et hépatocytaires du parasite par

criblage à haut débit, fondé sur l’imagerie effectué par Novartis avec plus de 4000 produits.

L’imidazolopipérazine la plus active pour la prophylaxie sur rongeurs (Meister, 2011) a été

optimisée (Nagle, 2012) donnant le candidat clinique KAF156 41. Cette molécule pourrait

cibler la protéine Cyclic Amine Resistance Locus (Pfcarl) (Meister, 2011) mais le mécanisme

d’action reste inconnu (Flannery, 2013). Des études (Winzeler, 1999) suggèrent que Pfcarl

jouerait un rôle dans le repliement des protéines du réticulum endoplasmique et serait

nécessaire pour les stades hépatiques et érythrocytaires du parasite (Jonikas, 2009).

19

NH

NH

NH

F

Cl O

Cl

KAE609, 38

N

O

CF3

N

O

HN

CN

F

SJ733, 39

N NNH

N

N

F Cl

O

PA92, 40

N

N

NF

NH

F

O

H2N

KAF156, 41

2.3. Inhibiteurs de la synthèse de la phosphatidylcholine

La phosphatidylcholine est un constituant majeur des membranes. Des analogues de la

choline vont empêcher sa synthèse. En phase clinique II, SAR97276 42, un bromure

d’albitiazolium (Caldarelli, 2012) inhibe le transport de la choline dans le parasite. Cet

albitiazolium va s’accumuler irréversiblement dans le Plasmodium. En phase clinique I,

CDRI 97-78 43 est une molécule hybride constituée d’un 1,2,4-trioxane contenant une

structure analogue à la choline. Elle pourrait donc agir en inhibant la formation de

l’hémozoine et en même temps bloquer la biosynthèse de la phosphatidylcholine parasitaire

(Shafiq, 2014).

S

N+HO

N+

S OH

12

SAR97276, 42

OO

O

O O OO

HO

CDRI-97-78, 43

2.4. Inhibiteurs de la dihydroorotate déshydrogénase (DHODH)

Cette enzyme mitochondriale flavine dépendante, reconnue comme cible potentielle, catalyse

la conversion de dihydroorotate en orotate. Sa fonction est importante pour la voie de la

biosynthèse de novo des pyrimidines, essentielle pour la formation des acides nucléiques, des

glycoprotéines et des phospholopides (Ittarat, 1994). Les inhibiteurs de cette enzyme sont

sélectifs car DHODH est une molécule différente de son homologue chez l’homme.

Un premier criblage à haut débit (Baldwin, 2005) a permis d’identifier les inhibiteurs

potentiels de cette enzyme. Une nouvelle classe chimique a été identifiée, les

triazolopyrimidines, active in vitro sur P. falciparum mais inactive in vivo sur modèle de

souris infectées par P. berghei. Des modifications chimiques de la série (Gujjar, 2011) pour

avoir une meilleure liaison avec l’enzyme mènent à la molécule tête de série DSM265 44

active in vitro et in vivo. Elle est testée en phase clinique IIa actuellement au Pérou.

20

Encore en phase de recherche, les benzimidazolyl thiophène-2-carboxamides sont aussi des

inhibiteurs potentiels de PfDHODH. Ils sont actifs in vivo et présentent des bons profils

pharmacologique et toxicologique sur les rongeurs. Le 5-(4-cyano-2-méthyl-1H-

benzo[d]imidazol-1-yl)-N-cyclopropylthiophène-2-carboxamide 45 est un candidat potentiel

pour le développement (Skerlj, 2011).

2.5. Inhibiteur de la phosphatidylinositol 4 kinase (PI4K)

La phosphatidylinositol 4 kinase (PI4K) est un lipide kinase qui régule les signalisations et le

trafic intraparasitaires. C’est la cible de deux nouvelles classes d’antipaludiques. Les 3,5-

diaryl-2-aminopyridines (Ghidelli-Disse, 2014) ont été identifiées après un criblage de la

chimiothèque de BioFocus SoftFocus (Paquet, 2012). MMV390048 46 est la molécule

candidate active in vitro et in vivo (Younis, 2012). La phase I est actuellement effectuée en

Afrique du Sud (Nordling, 2013). Les imidazopyridines ont été identifiées à partir du criblage

effectué par Novartis (Plouffe, 2008). L’optimisation de cette série a conduit aux

imidazopyrazines (McNamara, 2013) actifs in vivo. KDU691 47 est le meilleur composé

testé en prophylaxie à une dose unique chez les souris (Zou, 2014).

N

N

N

N

HN

SF5

F F

DSM265, 44

NN

SNH

O

NC

5-(4-cyano-2-methyl-1H-

benzo[d]imidazol-1-yl)-N-

cyclopropylthiophene-2-carboxamide, 45

N

NH2

N

CF3

S

O

O

MMV048, 46

N

NN N

OHN

Cl

KDU691, 47

E. Nouvelles approches et structures dans la recherche d’antipaludiques

Dans la recherche et l’optimisation des molécules candidates, plusieurs approches sont

étudiées en se basant sur les nouvelles cibles protéiques, la compréhension de l’équilibre

redox de l’érythrocyte parasité et la médecine traditionnelle.

1. Les inhibiteurs de protéines

1.1. Inhibiteurs des protéines de la mitochondrie de Plasmodium falciparum

La chaine de transport des électrons de la mitochondrie contient plusieurs protéines. Les

études sont surtout focalisées sur les inhibiteurs du complexe cytochrome bc1 (Complex III)

et de DHODH (Nixon, 2013) mais les autres constituants comme NADH : ubiquinone

21

oxydoréductase (PfNDH2), malate quinone déshydrogénase (MQO) et glycérol-3-phosphate

déshydrogénase (G3PD) sont également des cibles potentielles.

PfNDH2 et MQO n’existent pas dans la mitochondrie humaine donc ce sont des cibles

intéressantes. PfNDH2 est inhibée par des quinolones qui ont de bonnes activités

antiplasmodiales, de l’ordre de nanomolaire. C’est le cas de CK-2-68 48 et SL-2-25 49

(Leung, 2012).

Le G3PD est une enzyme clé dans la glycolyse (dégradation du glucose pour avoir de

l’énergie sous forme d’ATP et de NADH+H+). Il catalyse la conversion de glycéraldéhyde 3-

phosphate en 1,3-diphosphoglycérate en utilisant le nicotinamide adénine dinucléotide

(NAD+) comme accepteur d’électrons. Des dérivés 3-bromo-isoxazolines 50 sont criblés sur

cette cible valide. Ces dérivés inactivent l’enzyme par liaison covalente et sélective de la

cystéine catalytique (Bruno, 2014).

NH

O

N

OCF3

SL-2-25, 49

NH

O

ClOCF3

CK-2-68, 48

N O

Br

R

Dérivés 3-bromo-

isoxazolines, 50

1.2. Inhibiteurs des protéines de la vacuole digestive et du cytosol

Cinq types d’enzymes sont des cibles potentiels : les cystéines protéases, la purine nucléoside

phosphorylase (PNP), la leucyl ARNt synthétase (LeuRS), la glutathione réductase (GR) et le

facteur d’élongation du parasite PfeEF2 (Eukaryote elongation factor 2).

Les cystéines protéases sont des enzymes impliquées dans la digestion de l’hémoglobine en

acides aminés nécessaires aux parasites pour la synthèse de ses protéines. Ces enzymes sont

une cible des chalcones 51 (Tadigoppula, 2012).

La PNP est une enzyme impliquée dans la synthèse des purines, éléments de base des acides

nucléiques et joue un rôle central dans le métabolisme. Le Bcx4945 52 est un analogue de

l’état de transition de hPNP (PNP chez l’hôte) et PfPNP (PNP chez le parasite). Son

mécanisme d’action unique, sa faible toxicité et son efficacité font de lui un bon produit pour

des thérapies combinés (Cassera, 2011). Ce produit était en phase préclinique en 2011;

depuis, aucune publication n’a été indiquée dans la littérature.

Une autre enzyme cible est la LeuRS. C’est une enzyme cytosolique de la famille des

aminoacyl-ARNt synthétase catalysant la liaison de la leucine avec l’ARNt en présence

22

d’ATP. La molécule ainsi obtenue va participer à la synthèse des protéines dans les

ribosomes. AN9271 53 fait partie de la famille des oxaboroles. Il inhibe le leucyl ARNt

synthétase plasmodial (LeuRS).

La GR est une enzyme cible inhibée par certaines molécules antipaludiques tels que les

composés nitroaromatiques 54 (Çakmak, 2011) et les nitrates organiques 55 (Sentürk, 2009).

O

Chalcones, 51

N

NH

HN

O

NH2

HO

HO

Bcx4945, 52

OB

OHCl

O

HO

AN9271, 53

NO2R

Composés

nitroaromatiques, 54

NO2

Nitrates

organiques, 55

OH

Récemment, le facteur d’élongation du parasite PfeEF2, une enzyme intervenant dans la

biosynthèse de protéines, a été identifié comme cible d’une nouvelle molécule antipaludique

qui est le DDD107498 (Baragaña, 2015). Outre son action sur le stade asexué érythrocytaire

du parasite, cette molécule prometteuse inhibe les formes schizontes hépatocytaires et les

formes gamétocytes érythrocytaires. Elle présente de bonnes propriétés pharmacocinétiques.

N

NHON

F

N

O

DDD107498

2. Molécules modifiant l’équilibre redox du globule rouge parasité

La surcharge de stress oxydant due à une surproduction de ROS est toxique au parasite. Ainsi,

cibler le métabolisme redox du parasite et/ou de sa cellule hôte est une stratégie pour

découvrir de nouveaux médicaments antipaludiques (Vennerstrom, 1988 ; Ginsburg, 1998 ;

Krauth-Siegel, 1999 ; Loria, 1999 ; Müller, 2004 ; Kehr, 2010 ; Jortzik, 2012 ; Nepveu,

2013). Plusieurs séries de molécules possédant ce mécanisme d’action ont été étudiées ou sont

en cours d’étude. On peut citer le bleu de méthylène et ses dérivés (Layne, 1969), les

naphtoquinones (Morin, 2008) et les séries des indolone-N-oxydes développées dans notre

laboratoire d’accueil depuis une quinzaine d’années. Nous présenterons ici les données sur le

bleu de méthylène, les naphtoquinones et leurs dérivés. Par contre, le bilan des connaissances

sur les indolone-N-oxydes et sur les séries dérivées sera donné en introduction de la partie III

consacrée à ces dérivés (pages 28 - 31).

23

2.1. Bleu de méthylène et dérivés

Le bleu de méthylène 3, synthétisé pour la première fois en 1876 par Caro H, a été utilisé en

1891 pour traiter le paludisme (Guttman, 1891), mais abandonné pour ses effets indésirables

sur les patients (urine verte, sclère bleue). Il a été repris dernièrement pour être combiné avec

un 4-aminoquinoline, l’amodiaquine 9. Cette association est actuellement étudiée en phase

clinique II. Cette combinaison ne présente pas de risques pour les patients avec et sans

déficience en glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PD). Des dérivés de cette molécule

sont biologiquement actifs et ont été également synthétisés (Brown, 2012). L’activité

antipaludique du bleu de méthylène 3 est liée à ses propriétés oxydo-réductrices. En effet, il

est réduit par NADPH (coenzyme nécessaire pour la formation de l’antioxydant glutathione

(GSH)) et oxydé par la méthémoglobine (metHb) générant des espèces Fe(II) toxiques pour le

parasite (Layne, 1969).

2.2. Les naphtoquinones

Les naphtoquinones sont des molécules oxydo-réductibles potentiellement antipaludiques

(Morin, 2008) interférant dans les cycles redox des globules rouges parasités. Les 1,4-

naphtoquinones (NQ) 56 sont des composés actifs à des concentrations nanomolaires in vitro

et in vivo. Ils provoquent des cascades de réactions catalysées par la glutathione réductase de

l’hôte (hGR) et la glutathione réductase du parasite (PfGR) (Müller, 2011). Réduits par hGR

dans le cytosol érythrocytaire, ils sont transportés dans la vacuole digestive parasitaire pour

être oxydés en présence des produits ferriques. Les formes oxydées seront réduites à nouveau

par PfGR dans le cytosol parasitaire. Puis les formes réduites vont de nouveau être oxydées

dans la vacuole digestive, et le cycle redox des naphthoquinones impliquant PfGR du cytosol

et les produits ferriques de la vacuole digestive continue (Johann, 2012) (Figure 4). Seul

l’atovaquone n’a pas d’effet sur les réductases. Son potentiel d’oxydoréduction est très faible

(- 0,51 V). Même en conditions intracellulaires fortement réductrices, estimée à -0,34 V pour

NADPH (Deponte, 2012), l’atovaquone n’est pas réduite. Par contre, le bleu de méthylène, à

pH 7, a un potentiel de réduction de + 0,01 V (Impert, 2003). Ainsi, il est réduit facilement.

Ses réactions de transfert d’électrons sont cinétiquement réversibles (Morin, 2008), lui

permettant de faire des cycles redox.

24

Figure 4. Mécanisme d’action des 1,4-naphtoquinones (Müller, 2011)

3. Les produits naturels

Comme nous l’avons exposé précédemment, les plantes ont été la source des premiers extraits

ou des premières molécules reconnues comme ayant des activités antipaludiques : Cinchona

et quinine, Artemisia annua et arémisinine. La biodiversité végétale reste la source la plus

étudiée. Actuellement, dans le développement de nouveaux antipaludéens, deux extraits de

plantes sont testés en phase clinique II. Il s’agit de :

- l’extrait éthanolique nommé PR 259 CT1 et provenant de l’écorce de Nauclea pobeguinii

(Rubiacée), une plante médicinale de Congo. Cet extrait est actif in vivo sur des rongeurs

infectés (Mesia, 2010) et est efficace chez l’homme (Mesia, 2012). La plante contient

plusieurs alcaloïdes dont la strictosamide 57 qui est le principal constituant (5,6 %), et des

glycosides (Xu, 2012). Les composés isolés ne sont pas actifs in vitro.

- la décoction de la plante Argemone mexicana (Papaveracée) qui est active in vitro (Diallo,

2006) et est également efficace chez l’homme (Graz, 2010). Cette plante est utilisée

traditionnellement dans les pays africains comme le Bénin, le Mali et le Soudan pour traiter

le paludisme. Les trois alcaloïdes actifs in vitro de la décoction sont l’allocryptopine 58, la

protopine 59 et la bérbérine 60 (Simoes-Pires, 2014).

La recherche de nouvelles molécules s’oriente également vers les algues rouges marines.

L’algue Callophycus serratus contient la molécule active bromophycolide A 61 qui agit en

ciblant la cristallisation de l’hème (Kubanek, 2005 ; Lane, 2009 ; Lin, 2010 ; Stout, 2011 ;

Teasdale, 2013). Les algues renferment également d’autres produits comme les monoterpènes

halogénés (Afolayann 2009).

25

Bromophycolide A, 61Strictosamide, 57

O

O

HO

Br

OH

Br

Br

NH

N O

O

O

OH

OH

HO

OHO

N+

OO

O

O

Berbérine, 60Allocryptopine, 58 Protopine, 59

OO

N

OO

O

N

OO

O

O

O

Les produits naturels représentent une source importante dans la recherche de nouveaux

archétypes structuraux (Nogueira, 2011). Voici quelques exemples de composés

antipaludiques issus de sources autres que les plantes. Dans les éponges marines sont

retrouvés des terpènes (Wattanapiromsakul, 2009 ; Rao, 2010), des alcaloïdes (Scala, 2010)

ou encore des endoperoxydes (Fattorusso, 2010). Les coraux renferment des diterpènes actifs

(Wei, 2010). Les bactéries sont sources de peptides (Linington, 2009) et d’alcaloïdes (Lopes,

2009). Nous verrons dans l’introduction de la partie intitulée « Clitocybines et dérivés »

(pages 60 – 62) des produits antipaludiques recherchés dans les champignons.

Dans mon travail de thèse, les nouveaux archétypes à activités antipaludiques sont recherchés

à partir de deux sources naturelles, les champignons et les plantes. Pour des raisons de clarté,

l’état de l’art sur ces deux sources sera donné en introduction de chacune des parties

correspondantes du chapitre « Produits naturels antipaludiques ».

F. Résumé des cibles des antipaludiques

Nous pouvons clore ce chapitre en faisant un bilan synthétique des cibles actuellement

identifiées et mises en jeu dans les mécanismes d’action des médicaments antipaludiques et

des molécules en cours de développement ou d’étude (Figure 5). Les cibles des

antipaludiques sont majoritairement localisées dans le parasite. Il s’agit :

- des voies de dégradation de l’hémoglobine pour la formation de l’hémozoïne ou des acides

aminés,

- des voies de biosynthèse de constituants du parasite comme les protéines, les acides

nucléiques, les folates, les lipides,

- des protéines de régulation des ions, du stress oxydant et de la chaine respiratoire

mitochondriale.

Dans le globule rouge, les cibles connues sont les protéines glutathione réductase et hPNP.

26

Figure 5. Cibles des médicaments antipaludiques, des molécules en développement et en recherche et quelques cibles potentielles (Gardner,

2002 ; Bozdech, 2004 ; Nduati, 2005 ; Tekwani, 2005 ; Kehr, 2010 ; Lev, 2010 ; Cassera, 2011 ; Pidathala, 2012 ; Nepveu, 2014)

28

A. Introduction

Connues depuis la fin du 19ème

siècle (Bayer, 1881), les indolone-N-oxydes (ou 3-oxo-3H-

indole 1-oxyde, INODs) ont été étudiées pour différentes activités biologiques telles que les

propriétés neuroprotectrices ou antiinfectieuses (Hooper, 1965 ; Foster, 1978 ; Spedding,

1978 ; Sahasrabudhe, 1980 ; Hagen, 1982 ; Foster, 1983 ; Menton, 2002 ; Wihlborg, 2003)

et comme piégeurs de radicaux (Nepveu, 1998 ; Ramana, 2010).

C’est en 2003 que le Pr F. Nepveu avec son équipe découvre l’activité antipaludique de ces

composés, avec des activités antiplasmodiales remarquables (CI50 = 1 à 100 nM) pour de

nombreux représentants de la série (Nepveu, 2010).

N+

O

O-

R4

R1

R2

R3

1

2

34

5

6

7

Figure 6. Structure des indolone-N-oxydes

L’étude de la relation structure-activité des indolone-N-oxydes (INODs) (Figure 6) montre

que le groupement phényl du noyau indolone-N-oxyde est essentiel pour l’activité, le

groupement phényl lié en position 2 du noyau indolone-N-oxyde permet d’avoir une bonne

activité et les substitutions en positions 5 et 6 (R

1 et R

2) n’ont pas d’effet aussi important sur

l’activité in vitro, les meilleures activités étant obtenues avec un groupement méthoxy

(Nepveu, 2010).

La molécule tête de série qui présente une bonne activité antiplasmodiale et la meilleure

activité antipaludique in vivo est actuellement le 6-(4-chlorophényl)-7H-[1,3]dioxolo[4,5-

f]indol-7-one-5-oxyde, 62. Ses principales propriétés sont résumées dans le tableau 1.

In vivo, l’activité antipaludique est très faible quand la molécule 62 est administrée po du fait

d’une métabolisation rapide dans les microsomes hépatiques et d’une faible biodisponibilité

(Ibrahim N, 2012). Afin d’éviter ce passage hépatique et obtenir une meilleure

biodisponibilité, des essais ont été menés avec une administration par voie ip, cependant

l’activité demeure faible. Afin de vaincre les limitations de cette série, faibles solubilité

aqueuse (< 10 µg/mL) et biodisponibilité, métabolisation hépatique rapide, il a été décidé de

procéder à une formulation de la tête de série, 62, afin de mener de nouveaux essais in vivo

pour estimer l’intérêt ou non à poursuivre les étapes de pharmacomodulation sur cette série.

Différents efforts de formulation ont été menés : microémulsions, liposomes et

cyclodextrines.

29

Tableau 1. Propriétés physicochimiques et biologiques de 6-(4-chlorophényl)-7H-[1,3]dioxolo[4,5-f]indol-7-one-5-oxyde 62, tête de série

Composé Log

Pcalca

In vitro In vivo

t1/2

(min)

d

CI50 en nM CC50 en µMb IS

b % inhibition de

parasitémie P. berghei c Temps

de

survie

des

sourisc

FcB1b 3D7

b K1b

Isolats

humains e

MCF7 KB

MCF7/

FcB1

KB/3

D7

po (30

mg/kg/

4j)

ip (30

mg/kg/

4j)

iv (25

mg/k

g/4j)

N+Cl

O-

O

O

O

62

2,07 75 ± 63 58 ± 17 88 ± 37 48,6 15,9 27 212 450 14,5 62,1 99,1f > 34 j

f < 1

Chloroquine 2 4,63 151 ± 6 35 ± 27 850 ± 57 45,6 19,4 44 167 1257 - 100 - 26 j -

Artésunate de sodium 2,41 6 ± 3 4 ± 3 4 ± 3 3,43g 9,8

36,18 ±

8,09 1633 9045 99,1

h - - 8,2 jh -

aLog P calculé avec le logiciel VCCLAB (http://www.vcclab.org/lab/alogps/start.html);

b(Nepveu, 2010);

c(Ibrahim, 2014);

dtemps de demi-vie dans les microsomes

hépatiques de souris; e(Tahar, 2011);

fvaleurs pour le produit formulé en nanoparticules à base d’albumine;

gvaleur pour la dihydroartémisinine (Tahar, 2011) ;

h10 mg/kg/3j

(Chadwick, 2011)

30

Aucun de ces essais n’ayant été concluant, il a été choisi de procéder à une préparation du

composé 62 sous forme de nanoparticules à base d’albumine (Ibrahim, 2014). Ce choix a été

fait car l’albumine est un biopolymère endogène, non toxique et non immunogène (Desai,

1999) qui est sélectivement capté et dégradé par les globules rouges infectées par Pf où il sert

de source supplémentaire d’acides aminés en plus de l’hémoglobine (cette consommation

n’est pas observée chez les globules rouges sains) (El Tahir, 2003 ; Duranton, 2008). Elle se

lie au composé 62 avec une affinité modérée de l’ordre de 104

M-1

, favorable pour un candidat

médicament (Ibrahim, 2010) et est également la seule thérapie adjuvante qui diminue le taux

de mortalité dans le cas du paludisme sévère et cérébral (John, 2010). Les nanoparticules

biodégradables ainsi formées sont bien tolérées, assurent un transport des molécules dans tout

le corps et une distribution à la surface des cellules (Elzoghby, 2012), préservent l’action

rapide du composé et permettent d’augmenter le temps de circulation du composé suivant la

dégradation du polymère (Ishihara, 2008). Leur taille permet une moindre pénétration des

tissues et ainsi une moindre toxicité. Cette formulation a permis d’obtenir une meilleure

solubilité (10 mg/mL), ainsi augmentée d’un facteur mille.

La propriété de bioréductibilité des INODs dans les globules rouges sains et parasités a été

démontrée pour le composé 62 par la formation d’un métabolite réduit actif 62-HH (dihydro-

INOD) (Schéma 1) (Ibrahim, 2011). Elle a été également étudiée par voltammétrie cyclique

et électrochimie couplée avec la spectroscopie RPE, montrant que la 1ère

réduction est celle de

la fonction N-oxyde en radical nitroxyde anion (-0,88 V < E1/2 < -0,50 V vs. SCE) et la 2ème

réduction est celle de la fonction cétone (-1,65 V < E1/2 < -1,14 V vs. SCE) comme l’indique

le schéma 2 (Reybier, 2012). Ces études montrent que le pharmacophore redox des INODs

constitué du noyau nitrone conjugué à la fonction cétone leur confère des propriétés pro-

oxydantes à l’origine de leur activité antipaludique (Yen, 2013).

N+Cl

O-

O

O

O NCl

H

O

O

O

OH2 e- + 2 H+

62 62-HH

CI50 : 87 nM CI50 : 1027 nM

Schéma 1. Biotransformation du composé 62 en métabolite réduit dans le globule rouge

N+Cl

O-

O

O

O NCl

O

O

O

O

+ 1 e-

62

NCl

O

O

O

O

+ 1 e-

Schéma 2. Réduction du composé 62

31

L’étude du mécanisme d’action des INODs montre actuellement que les INODs provoquent

des cascades de réactions qui vont perturber l’homéostasie redox des globules rouges

infectées. Un stress oxydant créé entraine une cascade d’évènements qui vont aboutir à la

déstabilisation de la membrane, en passant par l’activation de la Syk kinase (Pantaleo, 2009)

et l’augmentation de la phosphorylation de la bande 3 (protéine majoritaire de la membrane

des globules rouges parasités). Des agrégats membranaires contenant les protéines bande 3

hyperphosphorylées, Syk kinase et hémoglobines dénaturées se forment et se libèrent par

microvésiculation entrainant la rupture de la membrane avant maturation du parasite causant

ainsi sa mort (Pantaleo, 2012). La cible première de ces molécules, à l’origine de la cascade

de réaction n’est pas connue.

Les principales propriétés biologiques de la série sont résumées dans le tableau 2.

Etant donné les connaissances actuelles sur les indolone-N-oxydes et les limites des propriétés

notamment pharmacocinétiques de la tête de série actuelle : quasi insolubilité dans l’eau et

métabolisation très rapide dans les microsomes hépatiques entrainant une faible

biodisponibilité citées dans le tableau 2, plusieurs efforts de pharmacomodulation sont

nécessaires afin d’améliorer les propriétés biologiques de ces composés à visée antipaludique

et préciser leurs mécanismes d’action, dans les phases initiales de la pénétration

érythrocytaire. Ces travaux ont été entrepris depuis plusieurs années par l’équipe du Pr

Nepveu, en collaboration avec des équipes de biologistes.

Tableau 2. Bilan des qualités et des défauts de la série des indolone-N-oxydes

Qualités Défauts

- activités antipaludiques de l’orde du nM in vitroa

- indices de sélectivité élevésa

- activité sur les formes anneaux du stade érythrocytaire du parasitéb

- pas de résistance croisée avec les souches mutli-résistantes de Pfb

- pas de risque de génotoxicité prouvé par le Test d’Ames

- risques signalés pour seulement 2 (MAO B et AhR) sur 55 essais

sur récepteurs (tests de toxicité effectués par GSK)

- inhibition de parasitémie élevée pour la tête de série (Tableau 1)

- prolongation du temps de survie (34 j contre 8,2 et 26 pour

l’artésunate et la chloroquine, respectivement)c

- insolubilité dans

l’eau

- faible stabilité sur

les microsomes

hépatiques

- faible

biodisponibilité

a(Nepveu, 2010) ;

b(Tahar, 2011) ;

c(Ibrahim, 2014)

32

Les questions clés de ces étapes de pharmacomodulation sont :

- le choix de la position (R1 – R

4) et de la fonction à utiliser pour améliorer significativement

la solubilité aqueuse des produits ;

- l’impact de substituants à fort encombrement stérique sur l’activité antiplasmodiale en

position R1, R

2 voire R

3. La position R

4 ne peut pas être utilisée car elle est décisive pour

l’activité antipaludique. Ces substituants encombrants doivent permettre de mimer ce

qu’induirait un fluorophore lié en position R1 et R

2 de la molécule. De tels dérivés

fluorescents sont nécessaires pour compléter l’étude des mécanismes d’action, notamment

pour localiser la molécule dans les globules rouges sain et parasité par imagerie de

fluorescence ;

- l’identification de la cible à l’origine de la réduction extrêmement rapide des indolone-N-

oxydes dans le globule rouge sain et parasité. Cette identification permettrait de mener des

étapes de pharmacomodulation in silico et d’ajuster au mieux la structure de la molécule à

sa cible ;

- l’impact de la réduction de la fonction nitrone (ON=C → N=C) sur l’activité

antipaludique.

Le travail de pharmacomodulation nécessite ainsi des allers et retours entre la conception des

molécules et leur synthèse, et l’étude des activités biologiques ce qui explique que la

découverte d’un candidat médicament prenne plusieurs années et engage plusieurs équipes de

recherche.

Ma contribution à ce travail de pharmacomodulation, décrit dans cette thèse, a consisté à :

- introduire des groupements aminés en position R4 et R

2 afin d’obtenir une meilleure

solubilité tout en conservant une activité antiplasmodiale. Ces dérivés aminés sont nommés

« aminoindolone-N-oxydes » et ont donné lieu à une publication (Najahi, 2014b) ;

- fixer sur un groupement aminé positionné en R2 un fluorophore et étudier par imagerie la

pénétration de la molécule dans le globule rouge sain et parasité ;

- analyser les activités biologiques de la série des 2-aryl-3H-indol-3-ones, dérivée des

indolone-N-oxydes par réduction de la fonction nitrone.

B. Pharmacomodulation des indolone-N-oxydes

Ce paragraphe décrit les modifications effectuées autour du noyau indolone-N-oxyde,

l’impact des substituants sur l’activité antiplasmodiale et le marquage avec des fluorophores.

33

Des modifications en R1, R

2 et R

4 (Figure 6) ont été effectuées. En R

4 et R

2, des groupements

aminés ont été positionnés pour améliorer la solubilité dans l’eau. En position 5 et 6 de

l’INOD, des groupements à fort encombrement stérique ont été testés pour examiner leur

impact sur l’activité antiplasmodiale et la possibilité de marquer ces dérivés sur ces positions

par un fluorophore, groupement très volumineux. Ce marquage pourrait permettre de localiser

le site d’action des INODs dans le globule rouge parasité.

1. Synthèse

Le protocole de synthèse utilisé dans cette thèse est celui élaboré et amélioré dans l’équipe

(Nepveu F, 2010 ; Najahi, 2013). La synthèse des aminoindolone-N-oxydes se divise en deux

étapes (Schéma 3) :

- le couplage de Sonogoshira entre un 2-halonitroaryl, 63 et un alcyne, 64 pour donner

l’intermédiaire o-nitrophénylacétylène (65 - 73)

- la cycloisomérisation de l’intermédiaire pour former l’indolone-N-oxyde (74 - 82).

La réaction est très générale et facile à exécuter. Elle a permis d’obtenir neufs nouveaux

dérivés porteurs de groupements amino dont deux sont des sels d’INODs (76 - 84) regroupés

dans le tableau 3.

NO2

R5

N+

O

R5

O-

R1

R2

R1

R2NO2

XR1

R2

R5i ii

74-8265-736463

iii

N+

O

R5

O-

R1

R2

83-84

Cl-H+

X : I ; Br

R1 : H ; OCH3

R2 : H ; NH2

R5:

(i) Pd(PPh3)2Cl2 (5 mol %), CuI (10 mol %), Et3N, N2, TA ; (ii) Pd(CH3CN)2Cl2, CH3CN, N2, reflux 86 °C ; (iii)

HCl, TA

Schéma 3. Schéma de synthèse des indolone-N-oxydes

La pureté des molécules a été analysée par chromatographie et leur structure identifiée par

différentes méthodes spectrales (spectrométrie de masse (MS), spectroscopie infrarouge (IR)

et résonance magnétique nucléaire du proton et du carbone (RMN 1H et

13C)) (voir la partie

expérimentale, pages 79 - 83). La pureté des produits se situe entre 96 et 99%. L’analyse LC-

MS a permis d’observer le pic quasi-moléculaire [M+H]+. Les spectres IR présentent des

NH2O

ON Cl

NO

O

; ;NH ; ; ; ;

34

bandes dans l’intervalle 1690 – 1720 cm-1

confirmant la présence de la fonction C=O. Les

spectres RMN 13

C confirment l’obtention des composés par la disparition des signaux à δ

équivalents à 89 et 95 ppm relatifs au groupement acétylène de l’intermédiaire et l’apparition

de signal à 184 – 188 ppm relatif au carbone de la fonction C=O du dérivé INOD. La

structure des composés synthétisés est donnée dans le tableau 3.

Les valeurs de Log Pcalc des composés ont été déterminées à partir du logiciel VCCLAB

(http:/www.vcclab.org/lab/alogps/start.html) et sont comprises entre 1,23 et 3,36. Le composé

77 est le plus lipophile et 82 le moins lipophile. Les composés sont insolubles dans l’eau. Les

produits sous forme de sel 83 et 84 dont les Log Pcalc sont respectivement -0,36 et -0,60 ont

une meilleure solublité aqueuse bien que celle-ci reste encore faible.

Les deux composés 85 et 86 contenant des groupements volumineux, éthoxycarbonyl en R2

pour 85 et chlorophénylalcényl en R1 pour 86 ont été obtenus de MDPI (Postfach 4005 Basel,

Suisse). Le composé 87 possédant un groupement méthyl protecteur de la fonction N-oxyde a

été synthétisé par E. Najahi et G. Tchani dans le laboratoire Pharma-Dev.

2. Activités biologiques in vitro

Les dérivés synthétisés ont été testés sur une souche de P. falciparum chloroquino-résistante

FcB1 et sur des cellules mammaires tumorales humaines MCF7 afin d’évaluer leurs activités

antiplasmodiales et leur toxicité en déterminant l’indice de sélectivité (IS) MCF7/FcB1. Les

résultats sont rapportés dans le tableau 3. Les molécules de référence ont été la chloroquine et

l’artésunate de sodium.

La moitié de la série des dérivés aminés présentent une activité contre la souche chloroquino-

résistante FcB1 avec une CI50 inférieure à 150 nM. Les molécules synthétisées présentent un

indice de sélectivité élevé sauf pour les composés 78 et 82. En remplaçant le groupement N-

diméthyl en R4 du composé 74 (meilleur hit in vitro, Nepveu, 2010) en groupement NH2 (75),

la lipophilicité diminue (Log P allant de 2,24 à 1,63) et l’activité antiplasmodiale est

conservée. Le remplacement du groupement méthoxy en R1 de 75 par un H (76) diminue

l’activité antiplasmodiale (168 ± 84 contre 24 ± 19 pour 75) et l’indice de sélectivité (77

contre 528 pour 75). Les formes salines des composés 75 et 74 (chlorhydrates 83 et 84,

respectivement) sont très actives avec des CI50 inférieures à 3 et 0,3 nM, respectivement. Le

composé 77 contenant le groupement butylamino en R4 qui lui confère une propriété plus

lipophile a une bonne activité. En positionnant NH2 en R2

(78, 80, 81 et 82), on a une

diminution considérable de l’activité (CI50 > 1000 nM) et de l’indice de sélectivité.

35

Tableau 3. Activités antiplasmodiales et cytotoxicité des indolone-N-oxydes

Composé Structure Log Pcalc b

CI50 (nM)

FcB1

CC50 (µM)

MCF7

IS

MCF7/FcB1

62a

N+Cl

O-

O

O

O

2,09

75 ± 63 15,9 212

74a

N+

O

O-

NO

2,24 < 3 43,9 > 14 623

75a N+

O

O-

NH2

O

1,63 24 ± 19 12,7 528

76 N+

O

O-

NH2

1,61 168 ± 84 13 77

83 N+

O

O-

NH3+

O

Cl-

-0,36

< 3

9,7 > 3 233

84 N+

O

O-

NH+O

Cl-

-0,60 < 0,3 33,7 > 112 333

77 N+

O

O-

O

NH

3,36 21 ± 23 43,2 2 057

78 N+

O

O-

N

H2N

1,88 12 264 ± 178 21,3 1,8

79 N+

O

O-

Cl

H2N

2,20 183 11 60

80 N+

O

O-

O

H2N

1,65 1565 ± 447 > 37,3 >33

81 N+

O

O-

O

H2N

2,72 1319 7,8 6

82 N+

O

O-H2N

NO

O

1,23 8301 6,6 0,8

85 N+

O

O-

EtO

O

2,25 284 ± 54 26,4 91,9

86 N+

O

O-NO2

Ph

Cl

4,35 840 59 70

87 N+

O

N

CH3O-

2,48 - - -

Chloroquine 5,28 151 ± 6 19,4 167

Artésunate de sodium 2,29 6 ± 3 9,8 1 633 a(Nepveu, 2010) ;

bLog P calculé avec le logiciel VCCLAB (http://www.vcclab.org/lab/alogps/start.html)

36

L’étude de relation structure activité effectuée sur les INODs (Nepveu, 2010 ; Nepveu, 2014)

montre que des substitutions en position 5 et 6 du noyau indolone n’a pas d’effet majeur sur la

CI50. On remarque effectivement que l’activité antipaludique in vitro diminue modéremment,

restant dans le domaine du nanomolaire (CI50 = 284 nM et 840 nM pour 85 et 86

respectivement) après avoir introduit des groupements volumineux en R1 et R

2.†

Aucune amélioration significative de la solubilité aqueuse n’a été constatée. Celle des

aminoindolone-N-oxydes reste inférieure à 10 µg/mL. Les formes chlorhydrates 83 et 84 de

Log P négatifs (- 0,36 et - 0,60 respectivement) sont les plus hydrosolubles (12,5 µg/mL pour

84 et 14 µg/mL pour 83).

Le composé 79, un analogue de la molécule tête de série 62 avec un chlore en position R4, est

le seul composé substitué en R2

par NH2 qui conserve l’activité antiplasmodiale, avec une CI50

égale à 183 nM et un IS MCF7/FcB1 égal à 60. Ceci indique qu’il est impératif de conserver

le chlore en position R4. La diminution modérée de l’activité antiplasmodiale observée après

substitution du noyau indolone-N-oxyde avec des groupements volumineux indique que le

greffage avec les fluorophores peut être effectué en position 6.

3. Fonctionnalisation du noyau indolone-N-oxyde par un fluorophore

Un fluorophore est une substance chimique appliquée en biologie moléculaire capable

d’émettre de la lumière de fluorescence après excitation. Il est utilisé pour marquer

spécifiquement un compartiment subcellulaire (exemples : marquage nucléaire par DAPI,

marquage des mitochondries par Mito Tracker…) (Cruz, 2011), marquer une protéine

spécifique par un anticorps fluorescent (immunofluorescence) (Bloemberg, 2012), fusionner

une protéine d’intérêt avec une protéine naturellement fluorescente comme la protéine GFP

(green fluorescent protein) pour former des protéines recombinantes (Chalfie, 1994) et

marquer une molécule d’intérêt par couplage covalent (en général pour suivre la pénétration et

déterminer les cibles de peptides (Weber, 1998 ; Fischer, 2002 ; Unciti-Broceta, 2009)).

Grâce à ces fluorophores, la microscopie confocale est une technique permettant d’observer à

haute résolution des cellules fixées, des cellules vivantes et des tissus marqués par un ou

plusieurs fluorophores. Elle permet d’obtenir des images en 3 dimensions, d’étudier la

localisation des molécules d’intérêt et d’étudier leur dynamique. Dans notre cas, la liaison

d’un fluorophore à une indolone-N-oxyde pourrait permettre de la localiser dans les globules

† Les essais sur les activités biologiques du composé 87 ne sont pas encore effectués, ne

permettant pas de connaitre l’impact d’un groupement encombrant en R3.

37

rouges par microscopie confocale afin d’élucider dans quel compartiment de la cellule hôte ou

du parasite elle aboutit.

En examinant les globules rouges sains en suspension dans du PBS ou du milieu RPMI par

microscopie de fluorescence (Plateforme du réseau d’imagerie T.R.I. Genotoul, Auzeville,

France), aucune autofluorescence n’a été observée. Ainsi, on peut travailler dans un large

intervalle de longueur d’onde d’émission et choisir sans contrainte le fluorophore à utiliser

pour le marquage de molécules. Nous avons choisi d’utiliser deux dérivés de la fluorescéine,

a) la 6-carboxyfluoresceine 88 et b) l’isothiocyanate de fluoresceine (FITC) 89 pouvant se lier

aux indolone-N-oxydes aminés par liaison amide (-C(=O)-NH-) et liaison thiourée (-NH-

C(=S)-NH-), respectivement.

a) La 6-carboxyfluoresceine 88 absorbe à la longueur d’onde d’excitation 492 nm et

émet une couleur verte à 517 nm. La première étape de son utilisation est son activation pour

former la 6-carboxyfluoresceine succinimidylester 90 en présence du chlorhydrate de N-

éthylcarbodiimide (EDC) et de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans le DMF (Adamczyk,

1997). La formation de cet intermédiaire a été confirmée par spectrométrie de masse. La

deuxième étape a consisté à faire réagir le succinimidylester obtenu 90 avec une amine

(Bondarev, 2013), soit l’INOD 79 directement, soit le réactif 4-iodo-3-nitrophénylamine

d’abord pour obtenir l’intermédiaire 91, puis former le noyau indolone-N-oxyde 92 après

(Schéma 4). Cependant, il n’a pas été possible d’établir la liaison amide de 91 et 92 entre le

fluorophore et les molécules aminées. Ces réactions ont été suivies par CCM et spectrométrie

de masse. L’origine de l’échec de cette synthèse pourrait être due au fluorophore très

encombrant ne permettant pas le rapprochement des sites de réaction des deux molécules.

b) Le FITC est un fluorophore très utlisé, ayant une absorbance maximale à 495 nm et

émettant une couleur jaune-vert à la longueur d’onde d’émission 525 nm. La réaction entre ce

fluorophore et le composé 79 a été effectuée dans le dioxane à température ambiante à l’abri

de la lumière mais cette fonctionnalisation était impossible car le fluorophore est trop

volumineux et ne permet pas un rapprochement suffisant des deux fonctions, amine de

l’indolone-N-oxyde 79 et isothiocyanate de FITC 89.

Face à ces problèmes stériques, il a été nécessaire d’introduire un bras espaceur. Un

groupement propoxylamine a été choisi pour aboutir au composé 96. Avant de procéder au

marquage, il a été nécessaire de synthétiser l’indolone-N-oxyde substitué par le bras espaceur,

94 et vérifier son activité antiplasmodiale.

38

O

O

OH

HO

OO

OH

O

O

OH

HO

O

O

O N

O

O

I

NO2H2N

O

O

OH

HO

O

O

HN

NO2

I

O

O

OH

HO

O O

NH

N+

O-

O

Cl

Cl

N+Cl

O-

O

H2N

v vi

vi

i + ii

88

79

90 91

92

(i) Pd(PPh3)2Cl2 (5 mol %), CuI (10 mol %), Et3N, N2, TA ; (ii) Pd(CH3CN)2Cl2, CH3CN, N2, reflux 86 °C ; (v)

EDC, NHS, DMF, N2, TA, abri de la lumière ; (vi) Et3N, DMF, 0 °C – TA

Schéma 4. Fonctionnalisation de l’aminoindolone-N-oxyde 79 avec la 6-carboxyfluoresceine

Le schéma de synthèse (schéma 5) décrit une première étape qui est la réaction entre le 4-

iodo-3-nitrophénol et le 3-chloropropylamine pour former le premier intermédiaire 93, suivie

du couplage de Sonogashira avec le 1-chloro-4-éthynylbenzène et d’une cycloisomérisation

du deuxième intermédiaire.

Cl

HO

I

NO2Cl NH2 OH2N

I

NO2

HCl

OH2N N+

O-

O

Cl

vii i + ii

9493

(i) Pd(PPh3)2Cl2 (5 mol %), CuI (10 mol %), Et3N, N2, TA ; (ii) Pd(CH3CN)2Cl2, CH3CN, N2, reflux 86 °C ; (vii)

K2CO3, ACN, reflux

Schéma 5. Schéma de synthèse du composé 94

Le composé 94 possédant une longue chaine aminopropoxyle placée en position 6 conserve

l’activité antiplasmodiale ; sa CI50 est égale à 87,7 nM ce qui est un excellent résultat. Ce

composé est donc approprié pour le marquage avec le fluorophore. Pour cela, le schéma de

synthèse (Schéma 6) a été de fonctionnaliser l’intermédiaire 93 avec le FITC avant de former

le composé final 96. La fonctionnalisation n’a pas été possible car au lieu d’avoir

l’intermédiaire voulu 95, on obtient des produits non identifiés après vérification en

spectrométrie de masse. La synthèse n’a donc pas abouti à la formation de l’INOD marqué

96.

39

O

O

HOOH

ON

OH2N

I

NO2

CS

O

O

HO OH

ONHN

H

S

O

O2N

Iviii

89 9593

O

O

HO OH

ONHN

H

S

ON+

-O

OCl96

i + ii

(i) Pd(PPh3)2Cl2 (5 mol %), CuI (10 mol %), Et3N, N2, TA ; (ii) Pd(CH3CN)2Cl2, CH3CN, N2, reflux 86 °C ;

(viii) THF, TA, abri de la lumière

Schéma 6. Fonctionnalisation de l’aminoindolone-N-oxyde 94 avec l’isothiocyanate de

fluoresceine

4. Conclusion

Les efforts de marquage des INODs avec un fluorophore n’ont pas abouti, ne donnant pas la

possibilité d’étudier par imagerie la pénétration de la molécule dans les globules rouges sain

et parasité. Parmi les dix aminoindolone-N-oxydes synthétisées dans cette thèse, quatre ont

une CI50 inférieure à 150 nM sur P. falciparum (FcB1). Les chlorhydrates 83 et 84 sont les

plus actifs. Possédant le groupement chloro en R4, les composés 79 et 94 substitués en R

2 par

un groupement amino et une longue chaîne aminopropoxyle, respectivement, conservent

l’activité antiplasmodiale et sont de bons candidats pour de futurs essais de fonctionnalisation.

Etant donné la difficulté à améliorer la solubilité aqueuse des INODs par l’introduction de

groupements amino, nous avons choisi de poursuivre les études sur la série des 2-aryl-3H-

indol-3-ones où la fonction ON=C est réduite. Cette série a été préparée par synthèse dans le

laboratoire.

Ce travail a donné lieu à une publication (voir Annexe 6, page 134):

Najahi E, Rakotoarivelo NV, Valentin A, Nepveu F. Amino derivatives of indolone-N-oxide:

preparation and antiplasmodial properties. Eur J Med Chem 2014, 76, 369-375

40

C. Dérivés 2-aryl-3H-indol-3-ones

La série des 2-aryl-3H-indol-3-ones (INDs) a été conçue par l’équipe afin d’étudier sa

stabilité et sa biodisponibilité, comparativement à la série des indolone-N-oxydes. Elle est

obtenue par réduction de la fonction N-oxyde, une réaction effectuée dans l’acétonitrile en

présence de trichlorure d’indium anhydre (Najahi, 2014a). Najahi et al démontrent qu’il

existe une similitude de résultats entre les deux séries ayant les mêmes substituants, comme

illustrée dans le Tableau 4. Les composés non substitués sont les moins actifs (99 et son

homologue INOD) et les composés ayant les groupements diméthylamino en position R4 et

méthoxy en R1 sont les plus actifs in vitro dans les deux séries (98 et son homogue INOD 74).

En comparant les INDs avec leur homologue INODs, une légère diminution de l’activité

antiplasmodiale et de l’indice de sélectivité est observée pour les INDs en général. Afin de

poursuivre les études sur cette série IND prometteuse, mon travail de thèse a consisté à

étudier les interactions entre l’albumine et quatre représentants de la série des 2-aryl-3H-

indol-3-ones (les composés les plus actifs 97, 98 et 100 et le composé le moins actif 99) pour

choisir le meilleur candidat pour des essais in vivo et à analyser les résultats d’essais in vivo,

dirigés par le Pr A. Valentin, sur cette série IND réduite. Dans ces essais in vivo, il s’agissait

de comparer l’activité de la substance libre et de la substance formulée sous forme de

nanoparticules dans l’albumine.

Tableau 4. Activités antiplasmodiales et cytotoxicité de quatre dérivés 2-aryl-3H-indol-3-

ones

Comp

osé

Structure

Log Pcalcb

CI50 (nM)

FcB1

CC50 (µM)

MCF7 IS MCF7/FcB1

97c

N

O

OO

2,64 (2,07)a 80 ± 21 (40 ± 39) 30,7 (> 35,3) 381,4 (> 882)

98c

N

O

NO

3,01 (2,24) 49 ± 37 (< 3) 20,7 (43,9) 423,4 (> 14 623)

99c

N

O

2,94 (2,06) 1327 ± 24 (889 ± 88) 164 (19,5) 135 (22)

100c

N

O

OHO

2,70 (2,00) 99 ± 36 16 164

Chloroquine 5,28 151 ± 6 19,4 167

Artésunate de sodium 2,29 6 ± 3 9,8 1 633 ales données entre parenthèses correspondent aux homologues indolone-N-oxydes (Nepveu, 2010) ;

bLog P

calculé avec le logiciel VCCLAB (http://www.vcclab.org/lab/alogps/start.html); c(Najahi, 2014a)

41

1. Interactions des 2-aryl-3H-indol-3-ones avec l’albumine

L’albumine du sérum humain (HSA) est la protéine la plus abondante dans le sang avec une

concentration de 42 mg/mL (Ding, 2010 ; Barbosa, 2010). Elle joue un rôle important dans la

distribution et le transport des petites molécules dans le sang. Ainsi, l’interaction avec cette

protéine détermine les effets pharmacocinétiques et pharmacologiques des médicaments. Les

deux principaux sites de liaison de HSA sont Sudlow I et Sudlow II (Sudlow, 1975 ; Sudlow,

1976) localisés dans les sous-domaines hydrophobes IIA et IIIA respectivement, permettant

aux médicaments hydrophobes d’être plus solubles dans le plasma (Olson, 1996). Le Sudlow

I contient le seul tryptophane de la protéine (Trp-214).

Parmi les INDs synthétisés, les quatres composés 97, 98, 99, 100 ont été étudiés pour

comparer leur interaction avec l’albumine dans les conditions physiologiques. Ces études

permettent de choisir la ou les molécules les plus adéquates pour les essais in vivo. En

utilisant les techniques de spectroscopies UV-visible, fluorescence et dichroisme circulaire

(CD), ont été étudiés (i) l’effet des composés sur la conformation de la protéine (ii) le site de

liaison des composés avec la protéine (iii) le mécanisme d’interaction entre les deux

molécules (quenching et forces de liaison) et (iv) l’effet des ions métalliques.

1.1. Effet des composés INDs sur la conformation de la protéine

L’étude du changement de conformation de HSA a été effectuée à l’aide du dichroisme

circulaire (CD). Le dichroisme circulaire (CD) est la différence d’absorption des deux

composantes lumineuses circulaires (gauche, L et droite, R) d’une lumière polarisée. Son

signal est obtenu pour les substances chirales possédant des chromophores (substance

optiquement active, qui absorbe différemment la lumière selon sa polarisation droite ou

gauche). Cette méthode fournit des informations globales sur les structures secondaires de la

protéine étudiée. Le spectre CD de HSA montre deux bandes d’absorption négatives

maximales à 222 et 208 nm (Figure 7) caractéristiques de l’hélice α (Gore, 2000 ; Zhang,

2006).

La teneur en hélice α de HSA est calculée selon les équations 1 et 2 suivantes :

Hélice α (%) = [( - MRE208 – 4000) / (33000 - 4000)] ×100 (1)

MRE208 = CDobs 208 x 106 / Cp × n × l × 10 (2)

où MRE208 est l’ellipticité résiduelle moyenne (MRE) (en deg·cm2·dmol

-1ou θ) à 208 nm

(Barbosa, 2010 ; Gao, 2004) ; 4 000 est la MRE de la forme β et conformation aléatoire de la

bobine à 208 nm, 33 000 est la MRE de la forme α pure à 208 nm ; CDobs 208 est la valeur de

42

CD observée à 208 nm (en mdeg) ; Cp est la concentration molaire de la protéine (en µM) ; n

est le nombre d’acides aminés de HSA (585) et l est la longueur du trajet optique (en cm).

Figure 7. Spectres de dichroisme circulaire de l’albumine du sérum humain (0,5 µM) en

présence du composé 98 à différentes concentrations (0, 0,5, 1, 2, 4 µM) correspondant aux

courbes 1 à 5 ; T = 25 °C ; pH = 7,4 (le même profil de courbes est obtenu pour les trois

autres composés étudiés, voir annexe 1, page 129)

Le tableau 5 montre une perte d’environ 4 % de la teneur en hélice α de HSA en présence des

composés INDs dû à un changement au voisinage du tryptophane provoquant une légère

modification de la structure secondaire de la protéine.

Tableau 5. Teneur en hélice α (en %)

Composés

[HSA]:[composé]

97 98 99 100

1:0 60.5 ± 1.4 60.3 ± 0.3 60.1 ± 0.5 59.3 ± 0.5

1:1 59.6 ± 2 59.3 ± 0.3 58.8 ± 0.5 57.8 ± 0.4

1:2 58.5 ± 2.2 58.4 ± 0.5 57.7 ± 0.7 56.8 ± 1.2

1:4 57.8 ± 2.2 57.3 ± 0.4 56.5 ± 0.9 56.4 ± 1.6

1:8 56.9 ± 1.6 56.9 ± 0.8 56.4 ± 0.5 55.3 ± 1.9

1.2. Le site de liaison des composés sur la protéine

Trois approches sont utilisées pour connaitre le site de liaison des composés sur l’albumine,

l’étude du changement de fluorescence de HSA (10 µM) en fonction de la concentration du

composé, la fluorescence synchrone et l’utilisation de marqueurs de sites.

1.2.1. Etude du changement de fluorescence

Le tryptophane Trp-214 seul est responsable de la fluorescence de HSA après une excitation à

293 nm et l’ensemble Trp-214 et les 18 tyrosines sont responsables de l’émission de

43

fluorescence à 280 nm. Les valeurs maximales d’émission de HSA sont 332 et 337 nm pour

une excitation à λ = 280 et 293 nm, respectivement. La figure 8 montre les courbes F/F0 en

fonction de [IND]/[HSA] pour les deux longueurs d’onde 280 et 293 nm où F0 et F sont les

intensités de fluorescence de HSA sans et avec l’IND, respectivement. Aucune différence

significative n’est observée entre les deux courbes obtenues pour les quatre INDs (Trynda-

Lemiesz, 2010) laissant penser que seul Trp-214 est responsable du quenching de

fluorescence et que les INDs se lient dans le domaine hydrophobe II où se situe cet acide

aminé (Martínez-Tomé, 2010).

Figure 8. Changement de fluorescence de l’albumine du sérum humain (10 µM) en fonction

de la concentration du composé 98 après excitation aux longueurs d’onde 280 et 293 nm ; T =

25 °C (même profil pour les autres composés, voir annexe 2, page 130)

1.2.2. Fluorescence synchrone

Cette étude permet de voir, à partir de la variation de l’émission, le changement de

l’environnement moléculaire autour des tyrosines et du tryptophane en traçant les spectres de

fluorescence synchrone aux intervalles Δλ fixes de 15 et 60 nm, respectivement (Figure 9)

(Miller, 1979 ; Dockal, 2000 ; Sahoo, 2009). Les intensités maximales d’émission ne se sont

pas décalées avec Δλ = 15 nm pour tous les composés sauf 98 qui montre un décalage vers le

bleu (300 à 296 nm) ; ainsi l’environnement autour des tyrosines ne change pas sauf pour 98.

Par contre, avec Δλ = 60 nm, des décalages sont observés, vers le rouge pour 97 (342 à 348

nm), 99 et 100 (341 à 343 nm) et vers le bleu pour 98 (341 à 338 nm), indiquant que la

polarité autour de Trp-214 change légèrement (Kragh-Hansen, 1981). L’hydrophobicité

diminue pour 97, 99 et 100 et augmente légèrement pour 98 qui a la plus grande valeur de

Log P (3,01). Ces résultats indiquent bien que les INDs se lient dans le domaine hydrophobe

II de HSA.

44

Figure 9. Spectres de fluorescence synchrone de l’albumine du sérum humain (10 µM) en

présence de différentes concentrations des 2-aryl-3H-indol-3-ones (0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25,

30, 35, 40, 45, 50, 60, 70 µM) ; T = 25 °C ; pH = 7,4 ; λ = 280 nm ; (A) 97 (B) 98 (C) 99 (D)

100

1.2.3. Etude du site de liaison à l’aide de marqueurs de sites

Les sites Sudlow I, II et III sont les principales sites de liaison hydrophobe des composés,

identifiables à l’aide des marqueurs warfarine (Sudlow, 1975 ; Petitpas, 2001), ibuprofène

(Liu, 2009) et digitoxine (Ganjali, 2010), respectivement. Nous avons utilisé la méthode de

Sudlow et al (Sudlow, 1976) : F2/F1 × 100% où F1 and F2 sont les intensités de fluorescence

du mélange HSA-IND, sans et avec le marqueur, respectivement (Figure 10).

La nette diminution de la courbe retrouvée seulement avec la warfarine indique qu’il y a

compétition entre ce marqueur de site et les composés. Ainsi, le site I localisé dans le sous-

domaine hydrophobe IIA de HSA est le site de liaison des composés INDs (Katrahalli,

2010).

1.3. Le mécanisme d’interaction entre les deux molécules : quenching et forces de

liaison

Le phénomène de quenching est la diminution de l’intensité de fluorescence provoquée par

les interactions moléculaires. Ces interactions peuvent être dues à des transferts d’énergie

45

entre molécules, des réarrangements moléculaires, un quenching statique ou encore un

quenching dynamique (Hu, 2006), les deux derniers mécanismes d’interaction étant les plus

importants. Le quenching statique est la formation d’un complexe fluorophore-composé non

fluorescent à l’état fondamental. Le quenching dynamique est la collision intermoléculaire à

l’état excité.

Figure 10. Effet des marqueurs de site sur la fluorescence de la solution albumine du sérum

humain/2-aryl-3H-indol-3-ones (2,5/10 µM) pour 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); T = 25

°C; pH = 7.4; λex = 280 nm (pour λ = 293 nm, voir annexe 3, page 131)

1.3.1. Etude par spectrométrie UV-visible

Cette méthode permet de voir le mécanisme d’interaction entre la molécule et la protéine et le

changement de conformation de la protéine (Chi, 2011). L’absorbance maximale de

l’albumine est à 280 nm. Sur la figure 11, on observe un effet hyperchromique. Cet effet est

faible avec les composés 98 et 100 qui n’absorbent pas à 280 nM. Leur interaction avec

l’albumine est donc faible. Par contre pour les composés 97 et 99, il est élevé. Comme ces

composés montrent une faible bande d’absorption à 280 nM, l’augmentation de l’intensité

retrouvée est peut-être due à l’interaction des deux produits et à la superposition de leur

spectre d’absorption. L’interaction entre les molécules et l’albumine pourrait être un

phénomène de quenching statique (Hu, 2005). Il est nécessaire de procéder à des études

d’interaction par des techniques de fluorescence pour confirmer cette théorie.

46

Figure 11. Spectre d’absorption des 2-aryl-3H-indol-3-ones (15 µM) avec l’albumine du

sérum humain (15 µM): (A) 97 (B) 98 (C) 99 (D) 100

1.3.2. Etude par spectroscopie de fluorescence

La figure 12 montre l’effet de quenching de la fluorescence de HSA (10 µM) provoqué par

l’ajout croissant des quenchers (de 0 à 70 µM), après une excitation à 280 et 293 nm. Un

même profil est obtenu pour les composés 97, 98 et 100 où l’intensité maximale d’émission

de HSA λmax= 333 nm diminue en fonction de la concentration de quencher et ne présente pas

de déplacement bathochrome (N’soukpoe-Kossi, 2007), indiquant que le tryptophane dans la

poche hydrophobe est de plus en plus caché (Holt, 2004). Pour l’IND 99, l’intensité de

fluorescence de HSA diminue fortement après addition de 10 µM laissant penser que le

tryptophane ne fluoresce plus, démasquant la fluorescence des tyrosines à 306 nm (Mathew,

1980).

Afin de connaitre le phénomène de quenching et les forces de liaison qui se produisent, les

méthodes d’analyse utilisés sont les analyses de Stern-Volmer, de Lineweaver-Burk, de Van’t

Hoff et de l’équilibre de liaison.

Analyse de Stern-Volmer. Cette méthode décrit le phénomène de quenching dynamique.

Afin d’éviter les effets de filtre interne dus, d’une part, à la compétition fluorophore/quencher

dans l’absorption de la lumière d’excitation et, d’autre part, à la réabsorption de l’émission de

HSA par le quencher, les constantes de liaison ont été calculées avec les faibles

47

concentrations du quencher et les données des courbes de Stern-Volmer (Figure 13) ont été

corrigées en utilisant l’équation 3 (Holt, 2004) :

Icor = Iobs∙10[(A1+A2)∙l/2]

(3)

où Icor et Iobs sont les intensités de fluorescence corrigées et observées, respectivement, A1 et

A2 sont les sommes d’absorbance du mélange HSA - IND aux longueurs d’onde d’excitation

(280 ou 293 nm) et d’émission (333 ou 337 nm), respectivement, l est la longueur de la cuve

traversée.

Figure 12. Spectre d’émission de l’albumine du sérum humain (10 µM) après une excitation à

280 nm en présence de différentes concentrations des 2-aryl-3H-indol-3-ones (0 à 70 µM

correspondant aux courbes de 1 à 13) ; T = 25 °C ; pH = 7,4 ; (A) 97 (B) 98 (C) 99 (D) 100

(pour λex = 293 nm, voir annexe 4, page 132)

La courbe de Stern-Volmer n’est plus linéaire (Figure 13) aux concentrations élevées des

composés, avec notamment une descente progressive pour l’interaction HSA-99, montrant un

processus de quenching combiné (à la fois statique et dynamique) (Lakowicz, 1999 ;

Lakowicz, 2006).

La constante de Stern-Volmer KSV (en M-1

) a été déterminée à partir de l’équation de Stern-

Volmer 4 (Eftink, 1981 ; Ganjali, 2010):

F0/F = 1 + KSV[Q] = 1 + Kqτ0[Q] (4)

48

où Kq est la constante de vitesse d’extinction bimoléculaire (M-1

s-1

), τ0 est la durée de vie de

fluorescence du fluorophore en l’absence du quencher (6,4 × 10-9

s pour HSA) (Abou-Zied,

2008), et [Q] est la concentration du quencher. Les résultats sont fournis dans le tableau 6.

Quand la température augmente, KSV diminue avec 99 et 100 indiquant un quenching statique

et augmente avec 97 et 98 indiquant un quenching dynamique (Vaughan, 1970). La valeur

maximale de Kq avec un biopolymère est autour de 2 × 1010

M-1

s-1

(Vaughan, 1970 ;

Lakowicz, 1999 ; Chen, 2008). Les INDs ont des valeurs de Kq élevés, de l’ordre de 1012

-

1013

M-1

s-1

indiquant un quenching statique (Singh, 2009). Toutefois, KSV et KLB (constante

de quenching statique) peuvent augmenter avec la température. Ce cas est retrouvé avec la

série des indolone-N-oxydes (Ibrahim, 2010). Le calcul de Kq est la méthode définitive pour

classifier le mécanisme de quenching (Lakowicz, 1999), ainsi nous pouvons conclure que

l’interaction HSA-IND est un quenching statique.

Figure 13. Courbe de Stern-Volmer du quenching de l’albumine du sérum humain (10 µM)

par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); T = 25 °C; pH = 7.4; λex = 280 nm (pour λex = 293 nm,

voir annexe 4, page 132).

Analyse de Lineweaver-Burk. Cette méthode décrit le phénomène de quenching statique. Les

constantes de quenching statique KLB (en M-1

) retrouvés dans le tableau 6 sont calculées à

partir de l’équation de Lineweaver-burk 5 (Cui, 2004) :

(F0 – F)-1

= F0-1

+ KLB-1

F0-1

[Q]-1

(5)

où KLB-1

F0-1

est la pente et F0-1

est l’interception des courbes de la figure 14.

49

Les constantes KSV et KLB de l’IND 99 sont les plus élevées par rapport à celles des autres

composés. Ceci s’explique par sa structure non-substituée qui lui permet d’entrer facilement

dans la poche hydrophobe de HSA et d’avoir une forte affinité de liaison (tableau 6). Le

tableau 4 montre que KLB augmente pour les composés 97, 98 et 100 indiquant que leur

réaction de liaison avec HSA est endothermique. Ce résultat est confirmé par la valeur

positive de la variation d’enthalpie calculée dans le prochain paragraphe. KLB diminue pour 99

indiquant une réaction exothermique (Zhang, 2008). Etant donné que le mécanisme de

quenching des composés sur HSA est statique, ces valeurs de KLB seront utilisées pour le

calcul des paramètres thermodynamiques (Zhang, 2008).

Figure 14. Courbes de Lineweaver-Burk du quenching de l’albumine du sérum humain (10

µM) par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); λex = 280 nm (pour λex = 293 nm, voir annexe 4,

page 133).

Thermodynamique. La liaison hydrogène, la force de Van der Waals, les liaisons

électrostatique et hydrophobe sont les quatre types d’interactions non-covalentes (Li, 2007).

L’équation de Van’t Hoff 6 permet de déterminer les variations d’entropie ΔS et d’enthalpie

ΔH à partir des courbes de la figure 15.

lnKLB = -ΔH/RT + ΔS/R (6)

où R est la constante des gaz parfaits (8,314 J.K-1

.mol-1

).

La variation d’énergie libre ΔG est calculée à partir de l’équation 7 et les valeurs sont données

dans le tableau 6.

50

ΔG = ΔH – TΔS (7)

Les valeurs de ΔG négatives et ΔS positives montrent que la liaison des composés avec

l’albumine est un processus spontané. Les valeurs positives de ΔH pour 97, 98 et 100

indiquent que la réaction est endothermique, ce qui n’est pas le cas pour 99. Pour 97, 98 et

100, les valeurs de ΔH et ΔS sont positives donc l’interaction est hydrophobe (Ross, 1981).

Pour 99, seul ΔS est positif indiquant des interactions hydrophobes et électrostatiques. La

valeur TΔS est plus grande que ΔH, ainsi la réaction est contrôlée par l’entropie.

Figure 15. Courbes de Van’t Hoff de l’interaction de 10 µM de l’albumine du sérum humain

avec les quatre composés étudiés; pH = 7.4; λex = 280 nm (pour λex = 293 nm, voir annexe 4,

page 133).

Analyse de l’équilibre de liaison. L’équation 8 aboutit aux courbes de la figure 16

permettant de déterminer la constante d’équilibre observé au site K entre les composés libres

et liés à HSA et le nombre de sites de liaison par HSA n (Barbosa, 2010).

Log (F0-F)/F = Log K + nLog[Q] (8)

Figure 16. Courbes de log(F0-F)/F en fonction de log[Q] de la liaison entre l’albumine du

sérum humain et les composés étudiés ; T = 25 °C ; pH = 7.4; λex = 280 nm (pour λex = 293

nm, voir annexe 4, page 133).

51

Les valeurs de n sont proches de 1, les composés se lient dans un seul site de liaison de

l’albumine, près du tryptophane Trp-214 (Hao, 2009). En se référant à la pamaquine (Naik,

1975) qui a une constante K de l’ordre de 105

- 107, les INDs se lient modéremment à

l’albumine. Le composé 99 a la constante la plus élevée avec 4,53 ×104 M

-1 à λex = 280 nm.

Les résultats obtenus avec λex égale à 293 nm sont similaires à ceux obtenus avec λex égale à

280 nm.

Tableau 6. Constantes de quenching, paramètres thermodynamiques de l’interaction entre les

quatre 2-aryl-3H-indol-3-ones avec l’albumine du sérum humain à différentes températures,

constante de liaison K et nombre de site de liaison n à 25 °C ; λex = 280 nm

Com

posé

T

(K)

KSV

(×104 M

-1)

Kq

(×1012

M-

1 s

-1)

KLB

(×104 M

-

1)

ΔH (J.mol-1

) ΔG

(J.mol-1

)

ΔS

(J.mol-1

K-1

)

K

(×104

M-1

)

n

97 288 1,49

(0,91)a

2,33

(1,42)

4,31

(4,77)

29375,86

(21159,96)

-25731,99

(-25881,05)

191,35

(163,34)

298 1,61

(1,53)

2,52

(2,39)

8,10

(7,11)

-27645,46

(-27514,42)

1,14

(0,49)

0,86

(0,79)

310 2,57

(2,55)

4,02

(3,98)

10,38

(8,96)

-29941,62

(-29474,46)

98 288 1,22

(1,44)

1,91

(2,25)

6,41

(7,36)

2116,49

(2301,07)

-26508,94

(-27833,64)

99,39

(101,12)

298 2,26

(3,06)

3,53

(4,78)

6,66

(7,50)

-27502,88

(-27054,82)

0,89

(1,49)

0,84

(0,87)

310 2,39

(3,24)

3,73

(5,06)

6,83

(7,88)

-28695,60

(-29407,95)

99 288 13,59

(20,24)

21,23

(31,62)

23,05

(34,05)

-7769,18

(-15797,43)

-29637,53

(-30534,20)

75,93

(51,17)

298 10,59

(16,00)

16,55

(25,00)

22,54

(28,43)

-30396,85

(-31045,90)

4,53

(4,75)

0,94

(0,93)

310 8,00

(10,80)

12,50

(16,87)

18,36

(21,35)

-31308,03

(-31659,93)

100 288 2,40

(2,27)

3,75

(3,55)

2,19

(3,01)

22604,93

(11788,42)

-23969,16

(-24733,85)

161,72

(126,81)

298 1,60

(1,65)

2,50

(2,58)

3,15

(3,73)

-25586,32

(-26001,98)

1,97

(1,17)

0,91

(0,85)

310 0,70

(1,31)

1,09

(2,05)

4,29

(4,28)

-27526,90

(-27523,75)

avaleurs entre parenthèses pour les donnés à λex = 293 nm

1.4. Effet des ions

Les ions métalliques sont présents en grande quantité (Ca2+

et K+) ou sous forme de traces

(Cu2+

, Zn2+

, Ni2+

, Co2+

et Fe3+

) dans l’organisme. Ils jouent des rôles importants dans la

structure 3D et le fonctionnement des protéines. Ils sont transportés dans le plasma en formant

des complexes avec l’albumine (Giroux, 1972 ; Liu, 2005), ce qui peut altérer la liaison des

52

médicaments avec l’albumine (Xiao, 2007). Nous avons ainsi regardé l’impact de ces ions sur

les valeurs des constantes K et le nombre de liaison n de l’interaction entre HSA et les

composés (Tableau 7).

Tableau 7. Constantes K et nombre de liaison n de l’interaction entre l’albumine du sérum

humain et les 2-aryl-3H-indol-3-ones en présence d’ions métalliques à T = 25 °C ; λ = 280 nm

(pour λ = 293 nm, voir annexe 5, page 134).

Ions

HSA - 97 HSA - 98 HSA - 99 HSA - 100

K (×104 M

-1) n K (×10

4 M

-1) n K (×10

4 M

-1) n K (×10

4 M

-1) n

1.1421

± 0.19

0.8639

± 0.01

0.8886

± 0.23

0.8378

± 0.02

4.5300

± 2.18

0.9419

± 0.29

1.9692

± 2.66

0.9100

± 0.10

Ca2+

0.4130 0.7860

0.3076 0.7371

0.0296 0.4591

54.7898 1.1757

Co2+

0.3929 0.7852

0.6816 0.8106

0.0300 0.4570

6.7952 0.9774

Cu2+

0.7684 0.8604

0.3623 0.7659

0.0685 0.5286

17.2108 1.0807

Fe3+

0.3483 0.7775

0.2050 0.7027

0.0228 0.4350

180.3433 1.2423

K+ 0.5230 0.8003

0.5018 0.7887

0.0235 0.4367

95.3016 1.2218

Ni2+

0.5414 0.8236

0.5868 0.8158

0.0175 0.4023

4.0420 1.0065

Zn2+

0.8095 0.8666 1.4302 0.8822 0.0327 0.4641 69.9198 1.1937

En présence d’ions métalliques, les constantes de liaison K augmentent pour l’IND 100 et

diminuent pour les trois autres composés 97, 98 et 99. Seul l’IND 98 présente une

augmentation de la valeur de K en présence de l’ion Zn2+

. Un faible changement de la

constante de liaison est observé pour trois composés (entre 0,2 et 0,8 pour 97 et 98 et 4 pour

99). Le composé 100 présente un changement élevé de la constante de liaison K, plus de six

fois en présence de la plupart des ions métalliques. Ceci indique un changement de

conformation de la structure de HSA après sa liaison avec les ions rendant facile

l’accessibilité du composé à son site de liaison de HSA et augmentant son affinité (Barbosa,

2010). Les deux sites de liaison ne sont pas les mêmes pour les ions et les quatre molécules

étudiées (Liu, 2009). Pour le composé 100 qui a sa constante K augmentée, la demi-vie dans

le sang se prolonge et la concentration de composés libres diminue provoquant une activité

minimale du composé, contrairement aux trois autres composés. En comparant les deux séries

indolone-N-oxydes et 2-aryl-3H-indol-3-ones, et en prenant l’exemple du composé 98 et de

son homologue 74 qui est le hit in vitro, une grande différence est observée. En présence des

ions, les constantes de liaison avec HSA diminue pour 98 et augmente pour le composé 74

(Ibrahim, 2010).

53

1.5. Conclusion

Nous pouvons conclure que le site de liaison des composés INDs est le site I du sous-domaine

IIA de l’albumine qui contient le tryptophane. Les composés se lient à l’albumine par

interaction hydrophobe en provoquant un quenching statique de la fluorescence de la protéine.

Les composés 97, 98 et 100 interagissent avec l’albumine de la même façon. Le composé 99

qui est le moins actif (CI50 = 1327 nM) se lie fortement à l’albumine (K = 4,53 × 104 M

-1 avec

λex = 280 nm) et provoque une perte de la fluorescence tryptophanyle de HSA par quenching

à la concentration HSA/99 1/1.

De ces travaux, il ressort que les composés 97 et 98 pourraient être sélectionnés pour des

essais in vivo étant donné leur bonne activité in vitro (Tableau 4), leur interaction modérée

avec l’albumine et le faible effet de différents ions métalliques sur cette interaction (Tableau

7).

Ce travail a donné lieu à une publication (voir Annexe 6, page 141):

Rakotoarivelo NV, Perio P, Najahi E, Nepveu F. Interaction between antimalarial 2-aryl-3H-

indol-3-one derivatives and human serum albumin. J Phys Chem B. 2014;118(47):13477-85

54

2. Activités biologiques in vivo

Les composés 97 et 98 possèdent une bonne activité antiplasmodiale. Les études de

l’interaction des 2-aryl-3H-indol-3-ones avec l’albumine, menées précédemment, montrent

que ces deux composés se lient à l’albumine avec des constantes de liaison modérées et peu

variables en fonction de la présence ou non d’ions métalliques. Ces propriétés indiquent que

ce sont de bons candidats pour des essais in vivo. L’IND 97 a été choisi pour l’évaluation de

l’activité antipaludique in vivo. Ce composé a été testé à l’état pur (97) et formulé en

nanoparticules à base d’albumine (97-NPs).

- Stabilité des 2-aryl-3H-indol-3-ones

Des essais de stabilité métabolique des INDs ont été effectués sur des microsomes hépatiques

humains, de souris et de rats. Les résultats montrent que leur temps de demi-vie est supérieur

à 30 min‡. Ils sont ainsi plus stables que les INODs qui ont des temps de demi-vie d’environ 6

min sur microsomes hépatiques humains. L’IND 97 se métabolise rapidement dans les

globules rouges (15 et 40 % sont biotransformés après 30 et 120 min, respectivement).

- Formulation du composé 97 en nanoparticules à base d’albumine 97-NPs

Nous avons comparé les activités de l’IND, à l’état libre 97 et à l’état formulé en

nanoparticules à base d’albumine, 97-NPs avec l’INOD, tête de série, à l’état libre 62, et à

l’état formulé en nanoparticules, 62-NPs.

N+Cl

O-

O

O

O

Indolone-N-oxyde, 62

N

O

OO

2-aryl-3H-indol-3-one, 97

Les activités antipaludiques du composé 62 ont été rappelées en introduction de ce chapitre

(page 29). La formulation a permis d’améliorer la solubilité aqueuse, d’effectuer des essais in

vivo par voie iv (Ibrahim, 2014) et d’obtenir 99,1 % d’inhibition de parasitémie à la dose de

25 mg/kg/jour.

Pour la formulation en nanoparticules de l’IND 97, l’albumine a également été utilisée pour

obtenir une melleure solubilité aqueuse. La figure 17 montre qu’avant homogénéisation, trois

populations de particules existent : 56,6 ± 2,4, 432,5 ± 92,4 et 3376,5 ± 381,8. Après

homogénéisation, le diamètre moyen des nanoparticules est de 226 nm et l’indice de

‡ Valeur déterminée par l’Entreprise IDEALP’ PHARMA

55

polydispersité est de 0,231. Les nanoparticules obtenues après lyophilisation ont un diamètre

moyen de 350 nm et un indice de polydispersité de 0,223 montrant une bonne homogénéité (<

0,25), paramètres indispensables pour l’injection en iv. L’albumine jouant un rôle de

cryoprotecteur, aucun autre produit n’a été utilisé pour éviter l’agrégation des particules lors

de la lyophilisation.

Figure 17. Histogrammes de distribution de la taille du composé 97 formulé en

nanoparticules à base d’albumine

- Activités antipaludiques du composé pur 97 et des nanoparticules 97-NPs

Les essais ont été effectués sur des souris infectées par P. berghei. Les résultats sont

comparés avec ceux de la tête de la série INOD, 62, et sont résumés dans le tableau 8. Les

courbes dose-réponse ont été utilisées pour la détermination des doses effectives DE50 et DE90

de 97 (déterminées par L. Vivas et E. Thompson (LSHTM, Royaume-Uni)) et de 97-NPs

(figure 18). Le temps de survie des souris est indiqué sur la figure 19.

Le composé 97 à l’état libre est moins actif qu’à l’état formulé (97-NPs). En effet, les doses

efficaces DE50 et DE90 après administration en ip sont de 49,51 et 119,77 pour 97 et 7,3 et

51,4 pour 97-NPs. Le tableau 8 montre également que l’IND 97 est moins actif que l’INOD

62. Administré en ip à la même dose de 30 mg/kg/j, l’inhibition de parasitémie est de 19,1 %

seulement pour l’IND 97 contre 62,1 % pour l’INOD 62. Administré à la dose de 25 mg/kg en

iv, 97-NPs est moins actif (51,8 % d’inhibition de parasitémie) que 62-NPs (99,1 %).

56

Tableau 8. Activités antipaludiques in vivo du composé 97 à l’état pur et sous forme de

nanoparticules à base d’albumine (NPs) comparées à l’INOD 62

Composé Dose (mg/kg/j) Inhibition de

parasitémie (%)

DE50a

(mg/kg/j)

DE90b

(mg/kg/j) po ip iv

97 30 15,4 82,62 701,29

97 30 19,1 49,51 119,77

62c 30 62,1 - -

97-NPs 25 82,4 7,3 51,4

97-NPs 25 51,8 25,1 45

62-NPs c 25 99,1 - -

Artésunate 30 100 1,81 4,57

Artésunate 30 100 5,64 13,74

Chloroquine

1

10

99,9

100

-

-

-

-

adose efficace médiane ou dose requise pour avoir 50% de réponse ;

bdose requise pour avoir 90% de réponse ;

c(Ibrahim, 2014)

La figure 18 montre que l’inhibition maximale de la parasitémie (100%) est atteinte après

administration en ip de 97-NPs à la dose de 100 mg/kg/jour, une dose efficace 10 fois plus

élevée que la chloroquine administrée à la même voie (Tableau 8). 97-NPs est plus actif

administré en iv, 100 % d’inhibition de parasitémie à la dose de 50 mg/kg. Aux faibles doses

(5 et 25 mg/kg/jour), l’administration en ip est plus efficace qu’en iv. Cette différence peut

être due à la perte de produit lors de la filtration (5 µm) effectuée avant injection en iv, une

étape non indispensable en ip. Elle peut également être due à l’élimination rénale plus rapide

du composé après administration en iv et à sa libération prolongée grâce à sa liaison avec les

cellules de la cavité péritonéale liée à sa lipophilicité.

Figure 18. Courbes dose-réponse du composé 97 formulé en nanoparticules à base

d’albumine après administration en iv et en ip

57

Selon la figure 19, bien que l’inhibition de parasitémie soit plus élevée après administration

en ip aux faibles doses de 5 et 25 mg/kg/j, le temps de survie des souris est plus élevé après

administration en iv aux doses 5, 25 et 50 mg/kg. On observe qu’au bout de deux jours, les

groupes de souris traitées à la dose de 100 mg/kg/j en iv meurent. Des signes de

tremblements, confusion et agitation sont notés.

* chloroquine administrée en intrapéritonéale étant la référence et les souris non traités le contrôle

Figure 19. Temps de survie des souris infectées par P. berghei après un traitement avec le

composé 97 formulé en nanoparticules à base d’albumine en iv (A) et en ip (B)

- Résultat de l’étude de toxicité aiguë

La toxicité aiguë du composé 97 a été évaluée sur des groupes de souris en administrant par

voie orale les doses de 100 et 500 mg/kg et par voie intrapéritonéale la dose de 500 mg/kg.

Au bout de trois jours, aucun changement de comportement ni de mort n’a été noté dans

chaque groupe de souris. La DL50 (dose nécessaire pour tuer 50% d’un groupe) est donc

supérieure à 500 mg/kg, c’est-à dire 5 – 10 fois plus élevé que les doses de traitement.

Ce travail a donné lieu à une publication :

Rakotoarivelo NV, Ibrahim H, Ibrahim N, Cabour C, Vivas L, Thompson E, Nallet JP,

Nepveu F, Valentin A. Antimalarial activity of 2-Aryl-3H-indol-3-one formulated in albumin-

based nanosuspensions. (soumis)

N

OH3CO

OCH3N+

OH3CO

OCH3

O-

t1/2 (microsomes) < 1 min

Parasitemia inhibition (INOD/HSA NPs, 25

mg/kg/day, iv) = 99.1 %

t1/2 (microsomes) > 30 min

ED90 (IND/BSA NPs, iv) = 44.7 mg/kg/day

58

D. Conclusion

A l’issue de nouvelles étapes de pharmacomodulation sur la série indolone-N-oxyde, décrites

dans cette thèse, il ressort plusieurs observations et résultats. Il est possible de placer des

groupements volumineux en position 5 et 6 du noyau indolone-N-oxyde tout en conservant

l’activité antipaludique.

OH2N N+

O-

O

Cl

94

CI50 (FcB1) = 87,7 nM

H2N N+

O-

O

Cl

79

CI50 (FcB1) = 183 nM

Il a également été possible de positionner un bras espaceur en position 6. Bien que la synthèse

de dérivés fluorescents par fixation d’un fluorophore en position 6 n’ait pas aboutie, le

composé 94 demeure un outil moléculaire très intéressant pour de futures fonctionnalisations.

Une amélioration de la solubilité n’a pas pu être obtenue malgré l’introduction de

groupements amino à différentes positions et de différents types.

Afin de disposer de molécules présentant de meilleures biodisponibilité et stabilité in vivo, les

2-aryl-3H-indol-3-ones, forme réduite des indolone-N-oxydes, ont été étudiées, d’une part,

pour leur interaction avec l’albumine et, d’autre part, pour leurs activités antipaludiques in

vivo.

N+Cl

O-

O

O

O

Indolone-N-oxyde, 62

N

O

OO

2-aryl-3H-indol-3-one, 97

Inhibition de parasitémie (25 mg/k/j, iv) = 51,8 % Inhibition de parasitémie (25 mg/k/j, iv) = 99,1 %

Bien que présentant de bonnes activités in vivo, la série INDs demeure moins performante que

la série INODs.

Les perspectives de ce travail se placent ainsi sur la série INODs et de nouveaux composés

qui pourraient être générés à partir du composé 94.

60

A. Introduction

La médecine traditionnelle basée sur la guérison par les plantes et les animaux a été

longtemps utilisée pour les traitements primaires dans plusieurs pays. La médecine moderne

s’intéresse à ces ressources dans l’espoir de découvrir de nouveaux médicaments. Les

principes actifs non synthétiques ou semi-synthétiques actuels sont issus principalement des

plantes, suivis par les produits d’origine microbienne, animale et minérale (Alves, 2007). Les

médicaments antipaludiques d’origine naturelle connus sont la quinine et l’artémisinine,

produits issus des plantes. Dans ce travail, nous avons choisi deux sources de biodiversité, les

champignons et les plantes. Les études des activités antipaludiques ont été menées, d’une part,

sur les clitocybines issues de champignons du genre Clitocybe et, d’autre part, sur des extraits

issus de plantes malgaches.

B. Clitocybines et dérivés

1. Introduction

Les champignons sont utilisés dans le traitement de nombreuses maladies par la médecine

traditionnelle en Chine (Paterson, 2008), au Japon (Wu, 2013), en Europe de l’Est et en

Russie (Lemieszek, 2011). Ils sont également source de médicaments comme la pénicilline

qui est un antibiotique issu du champignon Penicillium. Bien qu’il n’y ait pas encore de

médicaments antipaludiques extraits de champignons, les recherches sont nombreuses, avec la

découverte de nouvelles molécules présentant des propriétés antiplasmodiales : sesquiterpènes

(Isaka, 2009), alcaloïdes (Kumarihamy, 2010), phénylalcaloïdes (Haritakun, 2010), acide

lactonique (Xu, 2010), strobilurines (Kornsakulkarn, 2010), naphthopyrones (Isaka, 2010),

lanostanes (Ma, 2015).

En 1945, A-Ch. Hollande a constaté qu’un champignon basidiomycète de la famille des

Agaricacées, le Clitocybe gigantea (Schéma 7), a été à l’origine de larges cercles appelées

« ronds de sourcières » dans les prairies alpines, tuant les herbes sans étape de putréfaction.

Cette conservation des herbes mortes démontraient que la terre a été pauvre en microbes

responsables de la putréfaction. Suite à des étapes d’extraction, il a ainsi découvert dans le

champignon, la présence d’un antibiotique puissant qu’il a nommé clitocybine (Hollande,

1945) qu’il a également retrouvé dans le Clitocybe candida (Schéma 7). Cet extrait agit sur

les bactéries Gram positif et Gram négatif (Hollande, 1945), sur les mycobactéries

(Hollande, 1947) et sur les virus (Rivière, 1947). Quelques années après, des études pour

extraire et identifier la molécule active ont été entreprises (Hollande, 1949 ; Rebert, 1949 ;

61

Rebert, 1956 ; Ringenbach, 1962). Des propriétés antimitotiques (Ringenbach, 1962) et des

activités antibiotiques de la clitocybine (Müller-Stoll, 1990) ont été rapportées.

Schéma 7. Photos des champignons à clitocybine

Récemment, les extraits obtenus à partir de la Clitocybe aurantiaca (Schéma 7) ont permis

l’isolement de deux molécules actives : l’isoindolinone clitocybine A qui possède des

propriétés antioxydantes (Kim, 2008) et antiprolifératives (Yoo, 2012) et l’isoindole

clitocybine D qui inhibe l’élastase neutrophile humaine (Kim, 2009). La clitocybine A et ses

dérivés synthétiques (clitocybine B et clitocybine C) sont des isoindolinones piégeurs de

radicaux libres inhibant la mort cellulaire par apoptose et le vieillissement (Moon, 2009).

Pour ces raisons, nous nous sommes intéressés à la famille des isoindolinones pour vérifier si

Clitocybe candida ou Aspropaxillus

candidus ou Leucopaxillus candidus Source : base de données mycologiques MycoDB

(http://www.mycodb.fr/photos/Leucopaxillus_ca

ndidus_2013_jd_1.jpg)

Clitocybe aurantiaca ou Hygrophoropsis

aurantiaca Source : base de données mycologiques MycoDB

(http://www.mycodb.fr/photos/Hygrophoropsis_aurant

iaca_2010_rp_1.jpg)

Clitocybe gigantea ou Leucopaxillus

giganteus Source : base de données mycologiques MycoDB

(http://www.mycodb.fr/photos/Leucopaxillus_gi

ganteus_2007_jd_1.jpg)

62

elle possèdait des activités antimicrobiennes, notamment antimycobactériennes et également

antipaludiques. Dans ce travail, nous avons choisi de synthétiser des isoindolinones dérivées

de la clitocybine pour tester leur activité sur P. falciparum. Parallèlement, les activités

antimycobactériennes ont été testées par l’équipe du Dr M.R. Pasca de l’Université de Pavie

(Italie), et les activités antibactériennes et antifongiques par l’équipe du Pr M. Treilhou du

Centre Universitaire Jean-François Champollion à Albi (France).

N

O

OH

O

O

N

O

OH

O

HO

N

O

OH

OH

HO

N

OH

HO

O

OOH

Clitocybine A, 101 Clitocybine B, 102 Clitocybine C, 103 Clitocybine D, 104

2. Synthèse

La méthode développée par Yoo et al (Yoo, 2009) a été utilisée pour la synthèse des dérivés

isoindolinones (Schéma 8). Le méthyl 2-formyl-3,5-diméthoxybenzoate 105 réagit avec les

amines appropriées dans le méthanol à température ambiante. Après 1 h, le tétrahydruroborate

de sodium est ajoutée à la solution à 0 °C puis le mélange est agité à température ambiante

pendant la nuit pour obtenir l’isoindolinone correspondant.

Deux dérivés isoindolinotriazoles 116 et 117 ont été synthétisés à partir de la cycloaddition (3

+2) d’un 2-(méta- ou para-éthynylphényl)-4,6-diméthoxyisoindolin-1-ones (113 et 114) avec

l’azide 115 en présence de l’ascorbate de sodium et du sulfate de cuivre pentahydraté dans le

mélange de solvant THF/t-BuOH/H2O à température ambiante (Schéma 8).

La déméthylation des produits a également été effectuée suivant le protocole de Yoo et al

(Yoo, 2009) (Schéma 8). Les deux groupements méthoxy de la clitocybine C 103 sont

convertis en groupements hydroxyl par une réaction sous reflux en présence d’acide acétique

et d’acide bromhydrique. Les composés, clitocybine A 101, clitocybine B 102 et

isoindolinone 118 ont été obtenus. Ce troisième produit 118 est un nouveau isoindolinone

isolé qui est l’isomère de la clitocybine B 102. Ce composé 118 n’a pas été reporté

précédemment (Yoo, 2009) et a été découvert grâce aux spectres LC-MS qui montrent deux

pics à différents temps de rétention (9 et 9,5 min) et une masse de l’ion moléculaire [M + H]+

identique (Figure 20).

63

CHO

CO2Me

O

O

H2N R1N

O

OO

R1

N

O

OO

-N N+

NN

O

OO

NN

N

N

O

OO

OH N

OH

OO

OHN

O

HOO

OHN

OH

HOO

OH

105 103, 106 - 114

ix

113 - 114 116 - 117

x

Clitocybine A, 101 Clitocybine B, 102 118Clitocybine C, 103

xi

S

S

115

R1 :

(ix) NaBH4, MeOH, 0 °C – TA; (x) Na-ascorbate (0,45 eq), CuSO4.5H2O (0,1 eq), THF/t-BuOH/H2O (3 :1 :1,

v/v/v), TA ; (xi) 48 % HBr, AcOH, reflux

Schéma 8. Schéma de synthèse des dérivés isoindolinones

Les quinze isoindolinones synthétisées ont été caractérisées par leurs données

spectroscopiques (voir partie expérimentale, pages 83 - 87). Les spectres IR présentent des

bandes vers 1700 – 1680 cm-1

confirmant la présence de la fonction C=O. Les spectres RMN

du carbone 13 présentent deux signaux à δ égal à 166 – 168 ppm et 47,90 – 48,26 ppm

correspondant respectivement à la fonction C=O et au carbone secondaire confirmant la

formation du noyau isoindolinone. La formation du noyau triazole des isoindolinotriazoles a

été confirmée par la présence d’une bande d’absorption dans la région 3188 – 3105 cm-1

du

spectre IR correspondant à l’élongation de =C-H du noyau triazole. Le spectre RMN du

proton a présenté un singulet caractéristique du proton triazolyl vers δ = 7,64 – 8,71 ppm. Le

spectre RMN du carbone 13 a présenté un signal à δ égal à 119,1 – 121,3 ppm relatif au

carbone C-5 du noyau triazole. Les pics respectifs [M + H]+ des composés sont observés sur

le spectre de masse.

3. Activités antipaludiques

Les activités antiplasmodiales in vitro des isoindolinones synthétisés ont été évaluées sur les

formes érythrocytaires de la souche chloroquinorésistante P. falciparum FcB1 (Toulouse) et

sur les formes hépatocytaires de P. yoelii (effectués par l’équipe du Pr D. Mazier, Hopital de

Cl OH OMe OPh N N

F

O; ; ; ; ; ; ; ; ;

64

Pitié-Salpêtrière, Paris). Les essais de cytotoxicité sont effectués sur des cellules épithéliales

de singe Vero (Tableau 9).

Figure 20. Profil chromatographique et spectre de masse du mélange de la clitocybine B 102

et de son isomère 118. A: profils chromatographiques au détecteur à barrette de diode par

scan total (haut) et au détecteur de masse (bas); B: spectre de masse du pic au temps de

retention 8,80 – 8,95 correspondant au produit 118 ; C: spectre de masse du pic au temps de

retention 9,42 – 9,63 correspondant à la clitocybine B 102

Les clitocybines présentent une CI50 de l’ordre du µM sur la souche de Plasmodium FcB1. La

clitocybine A 101 a la meilleure activité avec une CI50 de 2 140 nM et un indice de sélectivité

Vero/FcB1 de 14. Les autres dérivés synthétisés 106 – 114 y compris les molécules hybrides

isoindolinotriazoles 116 et 117 ne sont pas actifs. Le composé 106 dont le phényl lié à l’azote

n’est pas substitué n’a pas d’activité. En le substituant en méta par un groupement indolone-

N-oxyde (119), une activité apparait (CI50 de 1 014,5 nM). Cette activité est probablement due

à ce deuxième noyau connu pour ses propriétés antipaludiques (Nepveu, 2010). Seuls deux

isoindolinones ont été testées sur le stade hépatocytaire du parasite, la clitocybine A 101 et la

clitocybine B 102. Aucune des deux n’est active. Les tests ont ainsi montré que les

isoindolinones n’ont pas d’activités antiplasmodiales. Les essais de pharmacomodulation

montrent que cette série ne présente pas d’intérêt car les produits les plus actifs (et très peu

actifs en fait) sont les moins fonctionnalisés.

A

B C

65

Tableau 9. Activités antiplasmodiales érythrocytaires et hépatocytaires et cytotoxicité des

isoindolinones

Composé Structure Log P

calca

CI50 (nM)

Souche FcB1

CC50

(µM)

Vero

IS CC50

Vero/ CI50

FcB1

Hépatocytes humains

infectés par P. yoelii

TC50b (µM) CI50 (µM)

101

�

1,20 2140 30 14 > 19,46 > 19,46

118 N

O

OH

OH

O�

1,65 10701 29 2,7 nd nd

102 N

O

OH

O

HO�

1,67 5535 18 3,25 > 18,45 > 18,45

103 N

O

OH

O

O�

2,47 > 35088 17,5 > 0,5 nd nd

106 N

O

OO �

2,34 inactif > 37 - nd nd

107 N

O

OO �


108 N

O

OO

Cl

�


109 N

O

OO

O

�

2,51 inactif 33 - nd nd

110 N

O

OO

O

�


111 N

O

OO

N

�


112 N

O

OO

N O

F �

2,54 nd nd - nd nd

113 N

O

OO �


114 N

O

OO �


119c

N

O

OO

N+

O-

O

�

2,33 1014,5 16,91 16,7 nd nd

116 N

O

OO

N N

N S

�


117 N

O

OO

NN

N S

�


aLog P calculé avec VCCLAB (http://www.vcclab.org/lab/alogps/start.html); bconcentration induisant 50% de mort cellulaire ; csynthétisé

par Dr E. Najahi

66

4. Activités antimicrobiennes

La litératture a rapporté les activités antimicrobiennes des extraits de clitocybines (voir

l’introduction de cette partie, pages 59 - 60). Nous avons ainsi voulu tester les molécules

pures sur différentes microbes. Les activités antibactériennes des isoindolinones ont été

évaluées sur cinq souches bactériennes, bactéries Gram positif (Staphylococcus aureus,

Enterococcus hirae), bactéries Gram négatif (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli) par

l’équipe du M. Treilhou du Centre Universitaire Jean-François Champollion d’Albi, et

mycobactéries (Mycobacterium tuberculosis) par l’équipe du Dr M.R. Pasca de l’Université

de Pavie. Les essais ont montré que cette série de molécules ne possède pas d’activités

antibactériennes. Seule la souche M. tuberculosis présente une sensibilité aux

hydroxyisoindolinones (Tableau 10). Les isoindolinones ayant une valeur de Log P faible

(entre 1,20 et 1,67) sont plus actifs (Concentration Minimale Inhibitrice, MIC, entre 18,45 et

36,9 µM). Cependant, ces produits sont également cytotoxiques. Leur indice de sélectivité

Vero/H37Rv est faible (< 2) et dans le cas de la clitocybine B 102 et de la clitocybine C 103,

l’indice de sélectivité est inférieure à 1 indiquant que le produit est toxique avant d’être actif.

Les activités fongiques ont été estimées par l’équipe du Pr M. Treilhou du Centre

Universitaire Jean-François Champollion d’Albi (France) sur deux souches de champignons

(Aspergillus niger et Candida albicans) qui n’ont pas été sensibles aux isoindolinones.

Tableau 10. Activité antituberculeuse des isoindolinones

Composé Structure Log P calcb

MIC (µM) M.

tuberculosis H37Rv

CC50 (µM)

Vero

IS

Vero/H37Rv

101

�

1,20 19,45 30 1,54

118 N

O

OH

OH

O�

1,65 18,45 29 1,57

102 N

O

OH

O

HO�

1,67 18,45- 36,9b 18 0,97 - 0,49

103 N

O

OH

O

O�

2,47 70,17 17.5 0,25

Autres dérivés - inactifs - -

Ciprofloxacine -0,57 2,5 c nd -

aLog P est calculé avec VCCLAB (http://www.vcclab.org/lab/alogps/start.html); bplusieurs essais effectués ; c(Ibrahim H, 2012)

Ce travail a donné lieu à 2 publications :

- Rakotoarivelo NV, Najahi E, Perio P, Hollande E, Pasca MR, Nepveu F. Clitocybins and

2-substituted-isoindolin-1-ones: synthesis and in vitro antimycobacterial activities.

(soumis)

OH

H3CO

N

O

OH

OH

HO

N

O

OH

MIC = 18.45 µMCC50 = 29 µM

MIC = 19.45 µMCC50 = 30 µM

- Rakotoarivelo NV, Najahi E, Perio P, Hollande E, Nepveu F. Isoindolinotriazole

derivatives: synthesis by the azide-alkyne cycloaddition click chemistry. JAC 2014, 10,

2937-2943 (Voir Annexe 6, page 150)

OCH3

H3CO

N

O

OCH3

H3CO

N

O

NN

N

R2

N3 R2+

click chemistry

67

5. Conclusion

Lors de la synthèse des trois clitocybines 101, 102 et 103, l’isomère 118 a été découvert.

Onze nouveaux dérivés ont également été synthétisés. Ces isoindolinones ne possèdent pas

d’activités antiplasmodiales ni au stade hépatocytaire ni au stade érythrocytaire. La meilleure

activité in vitro sur la souche FcB1 est de l’ordre du µM (CI50 de 2,14 µM pour la clitocybine

A 101). Les hydroxyisoindolinones présentent une bonne MIC sur M. tuberculosis mais sont

très cytotoxiques. Les tests sur d’autres souches bactériennes et fongiques ont donné un

résultat négatif. Les molécules isolées ne sont pas actives à l’inverse des extraits issus des

champignons à clitocybines. Des cas similaires ne sont pas rares lors des études d’extraction

et d’isolement moléculaire.

C. Extraits issus de plantes malgaches

1. Introduction

Madagascar est un des pays où la médecine traditionnelle basée sur les plantes occupe une

place importante. Cette île possède une grande diversité d’espèces végétales endémiques. Les

populations locales en font usage pour se soigner, surtout dans les régions rurales n’ayant pas

accès aux médicaments. Plusieurs plantes médicinales antipaludiques ont été recensées à

l’aide des tradipraticiens, des gardiens de forêts, de la population locale (Rasoanaivo, 1992 ;

Randrianarivelojosia, 2003) et de criblage (Rasoanaivo, 1999 ; Rasoanaivo, 2004). Au sein

de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA), deux plantes ont fait l’objet

d’études plus poussées ces 20 dernières années, Strychnos sp et Strychnopsis thouarsii.

Après un criblage d’extraits de 50 plantes malgaches pour l’activité antiplasmodiale in vitro et

l’activité modulatrice de la chloroquine, 12 plantes ont montré une activité antiplasmodiale

significative et seul l’extrait alcaloïdique de Strychnos sp et ses constituants isolés agissent en

synergie lorsqu’ils sont combinés à la chloroquine (Rasoanaivo, 1999). Les alcaloïdes issus

de l’écorce de la tige de Strychnos sp étudiés (Loganiacée) qui sont la strychnobrasiline 120 et

la malagashanine 121 sont dépourvus d’activité antipaludique mais potentialisent l’action de

la chloroquine in vitro et in vivo (Rasoanaivo, 1994 ; Rasoanaivo, 1996). Des dérivés

indolines de la strychnobrasiline 120 plus potentiateurs de la chloroquine ont été synthétisés

(Trigalo, 1999 ; Razafimahefa, 2005). La malagashanine 121 seule ou associée à la

chloroquine ne présente pas de toxicité (Ramanitrahasimbola, 1999). La malagashanine 121

agit sur la forme trophozoite agée de Pf (Rafatro, 2000) en stimulant l’accumulation de la

68

chloroquine et en empêchant sa sortie (Ramanitrahasimbola, 2006). Elle réduit l’activité de

la glutathione transférase (PfGST) (Mangoyi, 2010). Des analogues de ce produit ont été

synthétisés à partir de la strychnobrasiline (Trigalo, 2004). Sa synthèse totale sera effectuée

par Simon Blackey (Blakey, 2014). Des essais cliniques ont été conduits pour les extraits de

Strychnos myrtoides sur des populations présentant une résistance à la chloroquine, des essais

similaires doivent encore être entrepris (Willcox, 2008).

H

HH

HO

OH

OH

HNH

O

HOH

HH

HO

OH

OH

HN

O

HO

Tazopsine, 122 NPC-tazopsine, 123Malagashine, 121Strychnobrasiline, 120

N O

O

CO2Me

HH

N HH

N O

O

HH

HO N

Parmi les plantes médicinales recensées par Rasoanaivo et al (Rasoanaivo, 1992), la

décoction de l’écorce de la tige de Strychnopsis thouarsii (Menispermacée) est un remède

largement réputé à Madagascar pour protéger contre le paludisme et a fait l’objet d’une étude

en 2006. Un alcaloïde dérivé de la morphine, la tazopsine 122, est extrait de cette plante. Elle

est active contre les formes hépatocytaires et érythrocytaires de Plasmodium. Son dérivé

semi-synthétique, la N-cyclopentyl-tazopsine (NCP-tazopsine) 123, est moins toxique mais

seulement actif contre les formes hépatocytaires (Carraz, 2006). C’est un excellent candidat

pour le développement de traitement prophylactique du paludisme (Flemming, 2007).

D’autres dérivés de la tazopsine ont été étudiés (Carraz, 2012).

Outre les alcaloïdes, d’autres composés issus des plantes ont également des activités

antiplasmodiales. C’est le cas des sesquiterpènes lactoniques (Ramanandraibe, 2005), des

composés phénoliques (Ramanandraibe, 2008) ou encore des triterpénoïdes pentacycliques

(Ruphin, 2013). Il reste encore plusieurs plantes à étudier pour rechercher de nouveaux

archétypes structuraux actifs. Dans ce travail de thèse, trois plantes utilisées par la population

locale malgache pour traiter le paludisme et possédant une activité antiplasmodiale in vitro

ont été sélectionnées pour l’étude. Etant donné que les études sur ces plantes ne sont pas

complètement terminées, elles sont codées 28 PE (Myrsinacée, plante entière), 255 FT

(Astéracée, feuilles et tiges étudiées) et 15 FT (Ménispermacée, feuilles et tiges étudiées) afin

de permettre leur valorisation potentielle. Cette partie des travaux a été effectuée pendant les

six mois de séjour de recherche à l’Institut Malgache de Recherches Appliquées.

69

2. Extraits et substances naturelles isolés

2.1. Criblage et extraction des trois plantes

Les manipulations ont été effectuées avec l’encadrement de la Professeure Voahangy

RAMANANDRAIBE VESTALYS, dans le Laboratoire de Pharmacognosie Appliquée (LPA)

dirigé par le Dr D. Ramanitrahasimbola.

Les échantillons utilisés pour les études sont trois extraits de la plante 28 PE (extrait aqueux,

extrait acétate d’éthyle et extrait dichlorométhane), un extrait éthanolique de la plante 255 FT

et un broyat de feuilles et de tiges de la plante 15 FT. Les extraits sont criblés pour leurs

activités antiplasmodiales in vivo.

Sur l’extrait éthanolique de la plante 255 FT, un partage eau – acétate d’éthyle a été effectué

après dégraissage à l’hexane. Les extraits hexanique et acétate d’éthyle ont été testés. Après

évaporation de la phase aqueuse, aucun extrait n’a été obtenu. Ceci indique l’absence de

produits hydrosolubles dans l’extrait éthanolique.

Le broyat des feuilles et des tiges de la plante 15 FT a été macéré pour extraire des alcaloïdes

totaux qui seront criblés. Les alcaloïdes ont été recherchés car ce sont des composés

organiques d’origine naturelle, azotés, possédant des propriétés pharmacologiques,

intéressants par leur grande diversité structurale et par leurs activités thérapeutiques

répandues. De plus, d’après la chimiotaxonomie, la plante 15 FT est une plante à alcaloïdes.

La présence de cette famille de composé dans la plante a été vérifiée par la formation d’un

précipité après ajout de quelques gouttes de réactif de Valser-Mayer, le tétraiodomercurate de

potassium, dans la poudre humectée d’une solution d’acide chlorhydrique.

Une extraction alcaloïdique en milieu acide a été effectuée en épuisant les feuilles et les tiges

broyées par une solution d’acide acétique 1,8 %. Le filtrat de la macération a été ensuite

alcalinisé avant d’extraire les alcaloïdes avec le dichlorométhane. L’extrait d’alcaloïdes totaux

qui en résulte est ensuite testé. Le rendement obtenu par rapport à la quantité des feuilles et

des tiges utilisés est faible (< 1%).

2.2. Fractionnement et isolement

La plante choisie pour l’étude chimique plus approfondie est 15 FT. Le fractionnement et

l’isolement de produits actifs ont été effectués suivant l’organigramme ci-dessous (Schéma

9).

70

Protocole de fractionnement et d’isolement des produits actifs de 15 FT

Schéma 9. Protocole de fractionnement et d’isolement des produits actifs de la plante 15 FT

Huit fractions ont été obtenues après une séparation grossière par colonne chromatographique

des alcaloïdes totaux. Les quatre premières fractions F1, F2, F3 et F4 n’ont pas réagi au

réactif de Dragendorff, réactif spécifique des alcaloïdes contenant de l’iodobismuthate de

potassium après analyse chromatographique sur couche mince (CCM). Ceci indique l’absence

d’alcaloïdes dans ces fractions. Quant aux quatre fractions F5, F6, F7 et F8, elles ont montré

des résultats positifs et contiennent par conséquent des alcaloïdes, majoritairement retrouvés

dans la fraction F5 (Figure 21). Trois produits sont isolés de cette fraction après une

séparation par chromatographie sur colonne suivie d’une chromatographie préparative sur

plaques, mais les quantités obtenues sont très faibles pour permettre de continuer l’étude : de

confirmer leurs activités antipaludiques par les essais in vivo et d’identifier leur structure par

les méthodes spectroscopiques. Ainsi, il est nécessaire de procéder à de nouvelles extractions

sur la plante 15 FT.

La figure 22 montre les résultats de l’analyse LC-MS du produit isolé F5 P2. Le

chromatogramme obtenu par détection à barrette de diodes montre deux pics aux temps de

rétention 5,40 et 5,53 min. L’absorbance obtenu est très faible même après augmentation de la

concentration de l’échantillon analysé. Le spectre de masse montre un seul pic correspondant

à une masse [M+H]+ de 563. En tenant compte du premier chromatogramme, il est évident

que le produit isolé F5 P2 n’est pas pur.

Alcaloïdes totaux 15 FT

(1 g)

15 FT F5

(453 mg)

15 FT F6

(122 mg)

15 FT F7

(228 mg)

15 FT F8

(164 mg)

C.C de gel de silice : CH2Cl2/MeOH en gradient

95/5 à 75/25

15 FT F1

(128 mg)

15 FT F2

(52 mg)

15 FT F3

(77 mg)

15 FT F4

(46 mg)

F5 P1

(<1 mg)

F5 P2

(9 mg)

F5 P3

(<1 mg)

C.C. de gel de silice : CH2Cl2/MeOH 93/7

C. préparative sur plaques : AcOEt/MeOH 70/30

71

*extrait d’alcaloïdes totaux (noté 15 FT) étant la référence ; taches d’alcaloïdes révélées au réactif de

Dragendorff

Figure 21. Chromatographie sur couche mince des quatre fractions F5, F6, F7 et F8 : l’éluant

étant un mélange dichlorométhane/méthanol 90/10 (plaque de gauche) et 80/20 (plaque de

droite)

Figure 22. Profils chromatographiques au détecteur à barrette de diodes par scan total (en

haut) et au détecteur de masse (en bas) du produit F5 P2

72

3. Activité antipaludique in vivo

Les activités antiplasmodiales des extraits ont été évaluées sur des souris impaludées par P.

yoelii dans le Laboratoire d’Evaluation Pharmaco-Clinique (LEPC) dirigé par le Pr Rafatro.

Les résultats sont donnés dans le tableau 11. Un extrait d’alcaloïdes totaux de Cinchona

dissous dans de l’acide acétique/eau est utilisé comme produit de référence lors des essais in

vivo. Les extraits sont solubilisés dans le mélange DMSO/eau.

Tableau 11. Activités antiplasmodiales in vivo des extraits et fractions naturels issus des trois

plantes

Extraits Dose (mg/kg/j/s) % d’inhibition de

parasitémie

28 PE

Phase AcOEt 500 Non actifs

Phase H2O 500 Non actifs

Phase CH2Cl2 500 Toxiques

200 Toxiques

255 FT

Phase EtOH 500 44 %

Phase hexane 400 0 %

Phase AcOEt 400 6 %

15 FT Alcaloïdes totaux

100 Non actifs

200 7 %

500 94 %

Cinchona Alcaloïdes totaux 100 61 %

Les extraits acétate d’éthyle et eau de la plante 28 PE sont inactifs. La phase dichlorométhane

a été toxique provoquant la mort des souris après le premier traitement à la dose de 500

mg/kg/j/s. En diminuant la dose à 200 mg/kg/j/s, la mort des souris était survenue après le

deuxième traitement. Leur autopsie révèle des lésions au niveau du foie. La plante 28 PE n’a

donc pas été exploitée.

L’extrait éthanolique de la plante 255 FT possède une bonne activité avec 44% d’inhibition de

parasitémie. Après son dégraissage avec l’hexane et son partage avec l’eau et l’acétate

d’éthyle, les phases obtenues ne sont pas actives. Cette perte d’activité nous a poussés à ne

pas sélectionner cette plante pour des études plus approfondies. Des cas similaires ne sont pas

rares lors des études phytochimiques. Il peut arriver également que les produits isolés sont

moins actifs que l’extrait de la plante entière à cause des effets synergiques (Rasoanaivo,

2011).

73

Les études de fractionnement et d’isolement de molécules ont été effectués avec la plante 15

FT car l’extrait d’alcaloïdes totaux issu de cette plante a montré une très bonne activité à la

dose de 500 mg/kg/j avec un pourcentage d’inhibtion de parasitémie de 94%. Nous avons été

confrontés à un problème de solubilité de l’extrait dans le DMSO durant les tests. Ce qui

pourrait expliquer la forte dose active enregistrée (500 mg/kg/j/s). Les alcaloïdes devraient

être dissous dans de l’eau acidifiée par de l’acide acétique. Les fractions non alcaloïdiques F1,

F2, F3 et F4 obtenus après fractionnement des alcaloïdes totaux de 15 FT par colonne de

silice n’ont pas été testés, ainsi que la fraction F5 contenant les alcaloïdes majoritaires. Les

résultats des tests antipaludiques in vivo des fractions F6, F7, F8 sont très variables que l’on

ne peut pas tirer de conclusions significatives. Ces tests devront être refaits.

4. Conclusion

Trois plantes appartenant à trois familles différentes ont été étudiées. La plante 28 PE de la

famille des Myrsinacées contenait des extraits toxiques ou inactifs. Concernant la plante 255

FT de la famille des Astéracées, l’activité antiplasmodiale de son extrait éthanolique est

perdue après partage. La plante 15 FT de la famille des Ménispermacées contient des

alcaloïdes dont l’extrait total est très actif avec un pourcentage d’inhibiton de parasitémie de

94%. Parmi les trois espèces de plantes étudiées, la plante 15 FT a donc été retenue pour

l’isolement et l’identification de composés actifs. Le fractionnement et l’isolement de 15 FT a

permis d’obtenir trois produits alcaloïdiques encore non identifiés et leur activité

antipaludique n’est pas encore confirmée.

D. Conclusion du chapitre des produits naturels antipaludiques

La recherche de nouveaux archétypes structuraux à partir de la biodiversité est complexe. La

série des isoindolinones découverte à partir des champignons basidiomycètes du genre

Clitocybe dont les extraits étaient connus pour leur forte activité antimycobactérienne a

suscitée des études plus approfondies sur leur pharmacomodulation et leurs activités

antimicrobiennes. Cependant, les résultats obtenus se sont révélés négatifs impliquant l’arrêt

des études sur cette série. Le criblage d’extraits issus de trois plantes médicinales pour leur

activité antiplasmodiale in vivo a montré que l’extrait d’alcaloïdes totaux de la plante 15 FT

est actif. Son fractionnement n’a pas permis d’obtenir des produits isolés purs pour le moment

et le rendement est très faible. Les travaux doivent être poursuivis pour pouvoir accumuler les

produits isolés.

75

Bien que d’énormes progrès aient été effectués ces dernières années pour lutter contre le

paludisme, cette maladie reste une cause de mortalité et de morbidité importante notamment

en Afrique chez les femmes enceintes et les enfants de moins de 5 ans. Pour lutter contre

l’émergence de résistances aux médicaments d’usage actuels, de nouvelles molécules

antipaludiques présentant de nouveaux mécanismes d’action font l’objet de recherches pour

un éventuel développement.

Les indolone-N-oxydes (INODs), série antipaludique prometteuse, a subi plusieurs étapes de

pharmacomodulation afin d’améliorer ses propriétés biologiques, notamment sa solubilité et

sa stabilité. L’amélioration de la solubilité a été obtenue pour les aminoindolone-N-oxydes

synthétisées sous forme chlorhydrate. Un résultat majeur est la conservation de l’activité

antiplasmodiale lorsque des modifications sont effectuées en position 5 et 6 du noyau

indolone-N-oxyde y compris la substitution en position 6 par un groupement NH2 (CI50 égale

à 183 nM pour le composé 79, 6-Amino-2-(4-chloro-phenyl)-1-oxy-indol-3-one) ou un

groupement à longue chaine aminopropoxyle (CI50 égale à 87,7 nM pour le composé 94, 6-(3-

amino-propoxy)-2-(4-chloro-phényl)-1-oxy-indol-3-one). Deux directions de modulation

chimique ont été choisies afin de rendre la fonction nitrone (ON=C) moins facilement

réductible pour améliorer la stabilité et la biodisponibilité des composés in vivo: i) en plaçant

un groupement encombrant en position 7 du noyau phénylindolone ; ii) en synthétisant une

nouvelle série à fonction nitrone partiellement réduite (N=C). La deuxième voie a permis

l’obtention d’une nouvelle série, 2-aryl-3H-indol-3-ones, et de mener des études d’interaction

avec l’albumine et des essais in vivo. L’IND 97, 5-méthoxy-2-(4-méthoxyphényl)-3H-indol-

3-one, a une bonne stabilité (t1/2 = 30 min sur microsomes hépatiques) et formulé en

nanoparticules à base d’albumine, il présente une bonne activité antipaludique avec une

inhibition de parasitémie de 100 % à la dose de 50 mg/kg administré en iv.

Les clitocybines, identifiées originellement dans les champignons Clitocybes, et leurs dérivés

isoindolinones de synthèse ont été étudiés et n’ont présenté aucune activité antipaludique.

Contrairement aux extraits, les molécules pures de clitocybines possèdent une faible activité

antituberculeuse, une forte cytotoxicité et aucune autre activité antimicrobienne. Des

composés naturels ont été recherchés dans trois plantes malgaches en procédant à des

extractions. Un extrait d’alcaloides totaux d’une plante malgache codé 15 FT présente 94 %

d’inhibition de parasitémie, administré à 500 mg/kg/jour chez des souris infectés par P. yoelii.

Des alcaloïdes ont été isolés mais leur faible quantité n’a pas permis d’aller plus en avant dans

les études. Ainsi les perspectives de ce travail se placent sur de nouvelles étapes de

pharmacomodulation de la série INOD à partir du composé 94, et sur l’identificaion des

substances actives de l’extrait de la plante « 15 FT ».

77

A. Matériel

1. Appareillages

- La pureté des produits a été déterminée en utilisant un système LC-PDA-MS (Thermo

Electron Corporation) couplé au détecteur photodiode (Spectra Système UV6000LP), cette

pureté étant toujours dans l’intervalle 96 - 99%. Les spectres de masse ont été enregistrés sur

un spectromètre Finnigan LCQ Deca XP Max. La méthode d’ionisation utilisée est

l’électrospray (ESI).

- Les températures de fusion des échantillons ont été mesurées sur un appareil Electrothermal

9300 en utilisant des capillaires et ne sont pas corrigées.

- Les spectres RMN 1H et

13C ont été réalisés sur un spectromètre AC Bruker fonctionnant à

des fréquences de 300 et 75 MHz respectivement pour des composés dissous dans le DMSO

ou le chloroforme deutéré. Les déplacements chimiques (δ) sont indiqués en parties par

million (ppm), calculés par rapport au tétraméthylsilane (TMS), composé pris comme

référence. Les constantes de couplage J sont exprimées en Hertz (Hz). Pour les données de

RMN 1H, les caractérisations sont écrites de la manière suivante : δ : déplacement chimique

en ppm (multiplicité, nombre de protons, attribution). La multiplicité des signaux est donnée

par les abréviations suivantes : s (singulet), sl (singulet large), d (doublet), dd (doublé

dédoublé), t (triplet) ou m (multiplet). Les carbones quaternaires sont précisés par

l’abréviation Cq.

- Les mesures infrarouges (IR) ont été effectuées sur des composés purs en dispersion dans

des pastilles de KBr en utilisant un spectromètre de type Perkin-Elmer PARAGON 1000

FT-IR. Les positions des bandes d’absorption sont données en cm-1

.

- Les spectres de masse haute résolution (HRMS) ont été enregistrés sur un spectromètre

Bruker Maxis (Service Commun Toulouse, France).

- Les radiations émises par les rayonnements β de [3H]-hypoxanthine incorporé dans les

cellules sont mesurées par un compteur 1450-Microbeta Trilux de Wallac-PerkinElmer.

- L’homogénéisation afin d’avoir des nanoparticules est effectuée sur un homogénéisateur

haute pression Emulsiflex-C3(SODEXIM S.A.S., France). La lyophilisation est effectuée

avec un lyophilisateur Labconco. La mesure de la taille de particules est faite sur un

analyseur de particules DelsaNano C (Beckman Coulter, France).

- Le système de purification Milli Q® (Millipore, St. Quentin, France) est utilisé pour avoir de

l’eau distillée de très haute pureté. Le bain à ultrason (Elma, Allemagne) est utilisé pour

mieux solubiliser les solutions de produits.

78

2. Chromatographies

Un gel de silice Merck de 60 Å de taille de pores (70-230 mesh) a été utilisé pour les

chromatographies sur colonne pour purifier les produits de synthèse. L’évolution des

réactions a été suivie en effectuant des chromatographies sur couche mince (CCM) sur des

plaques de gel de silice de type 60 F254 (Merck Kieselgel 60 F-254) avec détection par une

lampe UV (254 nm). Deux gels de silice Merck de 60 Å de taille de pores (0,063 – 0,200 mm

et 0,015 – 0,040 mm) ont été utilisés pour les chromatographies sur colonne afin de

fractionner les extraits de produits naturels.

3. Réactifs

L’origine des produits et des réactifs utilisés dans ce travail sont indiqués ci-dessous.

- Quatre 2-aryl-3H-indol-3-ones étaient disponibles au laboratoire et ont été synthétisés selon

le protocole décrit par Najahi E et al (Najahi, 2014a) : 5-méthoxy-2-(4-méthoxyphényl)-

3H-indol-3-one 97 (MM = 267,3 g/mol; ε298 K, λ = 281 nm, ACN = 31 100 ± 436 L/mol/cm; log P

= 2,64, calculé avec VCCLAB (http://www.virtuallaboratory.org/lab/alogps/start.html) ; 2-

(4-(diméthylamino)phényl)-5-méthoxy-3H-indol-3-one 98 (MM = 280,3 g/mol ; ε298 K, λ = 302

nm, ACN = 18 700 ± 173 L/mol/cm ; log Pcalc = 3,01) ; 2-phényl-3H-indol-3-one 99 (MM =

207,2 g/mol ; ε298 K, λ = 263 nm, ACN = 25 267 ± 153 L/mol/cm ; log Pcalc = 2,94) ; et 2-(4-

hydroxyphényl)-5-méthoxy-3H-indol-3-one 100 (MM = 253,3 g/mol ;ε298 K, λ = 292 nm, ACN =

17 200 ± 173 L/mol/cm ; log Pcalc =2,70)

- MDPI (Postfach 4005 Basel, Suisse) : indolone-N-oxydes 6-éthoxycarbonyl-1-oxy-2-

phénylindol-3-one et 5-(2-chloro-2-phénylvinyl)-6-nitro-1-oxy-2-phénylindol-3-one

- Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France) : alcynes 64, 2-halonitroaryles 63, 6-

carboxyfluoresceine 88, FITC 89, sel de chloroquine diphosphate (MM = 515,86 g/mol),

albumine du sérum humain (HSA) (MM = 66 478 g/mol), albumine du sérum bovin (MM =

~66 000 g/mol), tablettes de tampon phosphate salin (PBS), ibuprofène (MM = 206,29

g/mol), digitoxine (MM = 764,94 g/mol), warfarine (MM = 308,33 g/mol),

diméthylsulfoxyde (DMSO, grade spectroscopie UV), acétone (grade HPLC)

- Fischer Scientific (Illkirch, France) : acétonitrile (ACN, grade HPLC)

- Cambrex (Belgique) : milieu RPMI 1640 contenant L-glutamine et 25 mM de tampon

HEPES, artésunate de sodium

- Perkin-Elmer (Courtaboeuf, France) : [3H]-hypoxanthine

- TPP (Suisse) : flacon de culture de 25 cm2.

79

B. Méthodes

1. Synthèse organique

Ces paragraphes décrivent les protocoles de synthèse des dérivés indolone-N-oxydes et de

leurs intermédiaires de synthèse, et des dérivés isoindolinones.

1.1. Synthèse des aminoindolone-N-oxydes

1.1.1. Couplage de Sonogashira : synthèse des intermédiaires o-

alcynylnitrobenzènes

Un alcyne 64 (1 mmol) et un 2-halonitroaryle 63 (1,2 mmol) sont dissous ensemble dans un

mélange de 20 mL de triéthylamine distillée et de 10 mL de DMF. Le catalyseur Pd(PPh3)2Cl2

(0,1 mmol) est ajouté et le mélange est agité sous atmosphère d’argon pendant 30 minutes. Le

catalyseur CuI (0,2 mmol) est ensuite ajouté. Après 6 heures d’agitation à température

ambiante et sous atmosphère d’argon, le mélange réactionnel est partitionné entre l’acétate

d’éthyle et l’eau. La phase organique obtenue est lavée avec de l’eau saturée en NaCl, séchée

avec Na2SO4, filtrée puis évaporée sous vide donnant un résidu. L’intermédiaire o-

alcynylnitrobenzène 65 - 73 est obtenu après purification du résidu par chromatographie sur

colonne de silice, élué par un mélange acétate d’éthyle et éther de pétrole.

(2-nitro-phényléthynyl)-phénylamine (65).

Solide jaune, Rdt: 78%, p.f 108-110 °C; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6)

δ: 4.12 (s, 2H, NH2), 7.59-7.67 (m, 2H, Ar-H), 7.71-7.76 (m, 3H, Ar-H),

8.17-8.30 (m, 3H, Ar-H); RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 89.4 (C≡C),

95.1 (C≡C), 117 (C), 122.8 (2 CH), 125 (CH), 128.4 (C), 129.7 (C),

130.9 (CH), 133 (2 CH), 134.3 (CH), 135.5 (CH), 149.7 (C); IR (KBr, cm-1

): 3473, 3377,

3019, 2412, 1605, 1579, 1523, 1465, 1345.

Butyl-(4-(5-méthoxy-2-nitro-phényléthynyl)-phényl)-amine (66).

Le composé 4-(5-méthoxy-2-nitro-phényléthynyl)-phénylamine 73 (Nepveu, 2010) (0,54 g, 2

mmol), 1-bromobutane (0,4 g, 3 mmol), K2CO3 (1,1 g, 8

mmol), et KI (100 mg) dans le DMF (10 mL) donne 66 (0,11 g,

17%) (Lu, 2011). Solide pourpre, Rdt 17%, p.f 123-125 °C;

RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ: 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3H,

CH3), 1.40-1.48 (m, 2H, CH2), 1.57-1.65 (m, 2H, CH2), 3.15-3.22 (m, 2H, CH2), 3.90 (s, 3H,

OCH3), 4.23 (s, 1H, NH), 6.55 (d, J = 9 Hz, 2H, Ar-H), 6.85 (dd, J = 3, J = 9.3 Hz, 1H, Ar-

H), 7.08 (d, J = 3 Hz, 1H, Ar-H), 7.44 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Ar-H), 8.11 (d, J = 9 Hz, 1H, Ar-

NO2

NH2

NO2

HN

O

80

H); IR (KBr) cm-1

: 3360, 3054, 2936, 1653, 1610, 1578, 1520, 1477, 1447, 1385, 1357, 1220,

895, 780, 756.

4-(4-diméthylamino-phényléthynyl)-3-nitro-phénylamine (67).

Solide rouge, Rdt 93%, p.f 148-150 °C; RMN 1H (300 MHz, DMSO-

d6) δ: 3.11 (s, 6H, 2CH3), 5.57 (s, 2H, NH2), 6.38-7.01 (m, 3H, Ar-

H), 7.72-7.78 (m, 1H, Ar-H), 7.95-8.00 (m, 2H, Ar-H); IR (KBr) cm-

1: 3440, 3332, 3019, 2936, 2400, 1720, 1609, 1600, 1564, 1520,

1467, 1346, 1295, 1220, 1110, 1022, 833, 756.

4-(4-chloro-phényléthynyl)-3-nitro-phénylamine (68).

Solide rouge, Rdt 74%, p.f 113-115 °C; RMN 1H (300 MHz, DMSO-

d6) δ: 6,01 (s, 2H, NH2), 6.62-6.93 (m, 2H, Ar-H), 7.41-7.57 (m, 3H,

Ar-H), 8.31-8.39 (m, 2H, Ar-H); IR (KBr) cm-1

: 3420, 3342, 3054,

2938, 1654, 1612, 1580, 1520, 1479, 1447, 1385, 1357, 1268, 895,

780, 756.

4-(4-méthoxy-phényléthynyl)-3-nitro-phénylamine (69).

Solide orange, Rdt 83%, p.f 134-136 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 3.87 (s, 3H, CH3), 5.84 (s, 2H, NH2), 6.27-6.87 (m,

4H, Ar-H), 7.79-7.81 (m, 1H, Ar-H), 7.96-8.00 (m, 2H, Ar-H); IR

(KBr) cm-1

: 3414, 3361, 3020, 2960, 2402, 1605, 1570, 1528, 1478,

1348, 1395, 1217, 1105, 1022, 835, 755.

4-(6-méthoxy-naphthalèn-2-yléthynyl)-3-nitro-phénylamine (70).

Solide orange, Rdt 74%, p.f 147-149 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 3.90 (s, 3H, OCH3), 6.10 (s, 2H, NH2), 6.85-7.61

(m, 5H, Ar-H), 7.98-8.57 (m, 3H, Ar-H), 8.97 (m, 1H, Ar-H); IR

(KBr) cm-1

: 3435, 3380, 2987, 2400, 1608, 1596, 1447, 1373,

1278, 1217, 1001, 759.

2-[5-(4-amino-2-nitro-phényl)-pent-4-ynyl]-isoindole-1,3-dione (71).

Solide jaune, Rdt 61%, p.f 101-103 °C, RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 1.36-184 (m, 4H, 2 CH2), 3.51 (m, 2H, CH2),

6.17-6.50 (m, 3H, Ar-H + NH2), 7.36-7.77 (m, 3H, Ar-H), 9.39

(s, 1H, Ar-H); IR (KBr) cm-1

: 3430, 3368, 2936, 2400, 1720, 1705, 1611, 1600, 1567, 1523,

1468, 1425, 1347, 1287, 1252, 1082, 1029, 756.

NO2

N

H2N

NO2

Cl

H2N

NO2

O

H2N

NO2H2N

O

NO2H2N

O

O

81

1.1.2. Cycloisomérisation: Synthèse des aminoindolone-N-oxydes

L’o-alcynylnitrobenzène 65 - 73 (0,5 mmol) est dissous dans 15 mL d’acétonitrile dans lequel

le catalyseur Pd(CH3CN)2Cl2 (0,025 mmol, 6,5 mg, 5 mol-%) est ensuite ajouté. Le mélange

est porté sous reflux et sous atmosphère d’argon pendant 1 heure. Le milieu réactionnel subit

ensuite une évaporation sous vide, donnant un résidu qui sera purifié par chromatographie sur

colonne de silice, avec le mélange acétate d’éthyle et éther de pétrole comme éluant. On

obtient ainsi l’indolone-N-oxyde pure.

2-(4-amino-phényl)-1-oxy-indol-3-one (76).

Solide violet, Rdt: 55%, p.f 161-163 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6): δ: 6.09 (sl, 2H, NH2), 6.68 (d, J = 9Hz, 2H), 7.50-7.60

(m, 3H), 7.71-7.77 (m, 1H), 8.47 (d, J = 9Hz, 2H); RMN 13

C (75

MHz, DMSO-d6) δ: 113.1 (x2), 113.2, 121.2, 122.6, 129.0 (x2),

129.3, 130.2, 131.6, 135.2, 147.7, 151.5, 187.6 (C=O); IR (KBr, cm-1

): 3473, 3377, 1703,

1621, 1598, 1534, 1492, 1459, 1379, 1301, 1281, 1178, 1139, 1073, 875, 835, 785. HRMS

(DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour C14H11N2O2: 239.0821, trouvé: 239.0826.

2-(4-butylamino-phényl)-5-méthoxy-1-oxy-indol-3-one (77).

Solide pourpre, Rdt 53%, p.f 187-189 °C; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ: 1.00 (t, J = 7.2 Hz,

3H, CH3), 1.26-1.32 (m, 2H, CH2), 1.37-1.50 (m, 2H,

CH2), 3.19 (t, 2H, CH2), 3.87 (s, 3H, OCH3), 4.15 (sl,

1H, NH), 6.65 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.01-7.09 (m, 2H), 7.49

(d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.61 (d, J = 9 Hz, 2H); RMN 13

C (75

MHz, CDCl3) δ: 13.1 (CH3), 19.8 (CH2), 32.4 (CH2), 43.1 (CH2), 56 (CH3), 107.8, 110.3 (x2),

114,7, 115,1, 117.9, 124.7, 128.6 (x2), 131.9, 141.5, 151.1, 162.1, 187.8 (C=O); IR (KBr) cm-

1: 3360, 3052, 2986, 1711, 1608, 1532, 1467, 1420, 1374, 1265, 1178, 1046, 1030, 757.

HRMS (DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour C19H21N2O3: 325.1552, trouvé: 325.1541.

6-amino-2-(4-diméthyaminophényl)-1-oxy-indol-3-one (78).

Solide jaune, Rdt 85%, p.f 197-199 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 3.09 (s, 6H, 2 CH3), 6.12 (sl, 2H, NH2), 6.32 (d,

J = 3 Hz, 1H), 6.82-6.88 (m, 3H), 7.72 (dd, J = 9 Hz, J = 1 Hz,

1H), 8.07 (d, J = 9 Hz, 2H); RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ:

40.1 (2 CH3), 85.6, 111.5 (x2), 116.8, 122.0, 123.3, 125.4, 132.6 (x2), 150.8, 154.3, 159.0,

160.0, 187.6 (C=O); IR (KBr) cm-1

: 3434, 3343, 1702, 1644, 1583, 1378, 1287, 1195, 1141,

N+

O

O-

NH2

N+

O

O-

O

NH

N+

O

O-

N

H2N

82

1064, 820, 740. HRMS (DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour C16H16N3O2: 282.1243, trouvé:

282.1242.

6-amino-2-(4-chloro-phényl)-1-oxy-indol-3-one (79).

Solide marron, Rdt 81%, p.f 169-171 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 6.56 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz, 1H, Ar-H), 6.92 (sl,

2H, NH2), 7.35 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.58-7.74 (m, 3H), 8.60 (d, J

= 9 Hz, 2H); RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 100.1, 108.7,

112.9, 124.9, 125.7, 129.1 (x2), 129.4 (x2), 135.1, 151.4, 154.5, 156.8, 184.3 (C=O); IR

(KBr) cm-1

: 3423, 3349, 1706, 1649, 1584, 1521, 1474, 1375, 1300, 1268, 1011, 818, 729.

HRMS (DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour C14H10ClN2O2: 273.0431, trouvé: 273.0443.

6-amino-2-(4-méthoxy-phenyl)-1-oxy-indol-3-one (80).

Solide rouge, Rdt 65%, p.f 228-230 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 3.86 (s, 3H, CH3), 6.12 (sl, 2H, NH2), 6.35 (s,

1H), 6.82-6.89 (m, 3H), 7.46-7.51 (m, 1H), 8.05-8.08 (m, 2H);

RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 55.3 (CH3), 108.6, 114.2 (x2), 118.8, 122.0, 122.8, 124.8,

129.7 (x2), 134.8, 154.0, 159.1, 161.3, 187.4 (C=O); IR (KBr) cm-1

: 3414, 3350, 1698, 1644,

1583, 1530, 1487, 1382, 1253, 1181, 1017, 835. HRMS (DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour

C15H13N2O3: 269.0926, trouvé: 269.0922.

6-amino-2-(6-méthoxy-naphthalèn-2-yl)-1-oxy-indol-3-one (81).

Solide rouge, Rdt 92%, p.f 165-167 °C, RMN 1H (300

MHz, DMSO-d6) δ: 3.91 (s, 3H, CH3), 6.56 (d, J = 9 Hz,

1H), 6.90 (sl, 2H, NH2), 7.21 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz, 1H),

7.36 (m, 2H), 7.90 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 9 Hz, 1H),

8.32 (s, 1H), 8.60 (d, J = 9 Hz, 1H), 9.21 (s, 1H); RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 55.8

(CH3), 99.2, 106.5, 108.8, 112.6, 119.8, 122.2, 124.76, 124.82, 127.1, 128.1, 128.2, 131.2,

132.4, 135.4, 151.6, 156.8, 159.3, 187.9 (C=O); IR (KBr) cm-1

: 3437, 3352, 1699, 1650,

1625, 1587, 1521, 1495, 1469, 1370, 1330, 1264, 1228, 1124, 1017, 851. HRMS (DCI, CH4)

m/z [M+H]+ calc. pour C19H15N2O3: 319.1083, trouvé: 319.1091.

2-(3-(6-amino-3-oxo-1-oxy-3H-indol-2-yl)-propyl)-isoindole-1,3-dione (82).

Solide rouge, Rdt 82 %, p.f 166-168 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 1.18 (t, J = 6 Hz, 2H, CH2), 1.91 (m, 2H, CH2),

3.60 (t, J = 6 Hz, 2H, CH2), 6.47 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz, 1H),

6.72 (d, J = 3Hz, 1H), 6.79 (sl, 2H, NH2), 7.18 (d, J = 9 Hz,

N+

O

O-

Cl

H2N

N+

O

O-

O

H2N

N+

O

O-

O

H2N

N+

O

O-H2N

NO

O

83

1H), 7.81-7.83 (m, 4H); RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 19.3 (CH2), 23.9 (CH2), 37.7

(CH2), 99.2, 108.9, 112.0, 123.4, 124.4, 132.0, 134.8, 138.7, 151.0, 156.3, 168.3, 184,4

(C=O); IR (KBr) cm-1

: 3449, 3355, 2929, 1706, 1643, 1583, 1541, 1501, 1398, 1367, 1260,

1109, 1016, 721. HRMS (DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour C19H16N3O4: 350.1141, trouvé:

350.1152.

6-(3-amino-propoxy)-2-(4-chloro-phényl)-1-oxy-indol-3-one (94).

Solide rouge, Rdt 23%, p.f 235-236 °C; RMN 1H (300

MHz, DMSO) δ: 0,84 – 1,39 (m, 4H, CH2), 2.56 (s,

2H, NH2), 3.02-3.09 (m, 2H, CH2), 6.91 (dd, J = 9 Hz,

J = 3 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 3 Hz, 1H), 7.65 (m, 3H, Ar-

H), 8.58 (m, 2H, Ar-H).

1.1.3. Préparation des hydrochlorures d’indolone-N-oxyde

L’indolone-N-oxyde (72 ou 73) (1 mmol) est solubilisé dans 20 mL de 1,4-dioxane. Une

solution de chlorure d’hydrogène (4 M dans le dioxane) (6 mmol) est ajoutée à cette solution.

La réaction est agitée pendant 1 heure à temperature ambiante et vérifiée par CCM. Le

mélange réactionnel est filtré. Les hydrochlorures d’indolone-N-oxyde (84 ou 83)

respectivement sont ensuite obtenus après lavage avec 1,4-dioxane du solide obtenu après

filtration.

Hydrochlorure de 2-(4-Aminophényl)-5-méthoxy-1-oxy-indol-3-one (83).

Solide rouge, Rdt 93%, p.f 216-218 °C; RMN 1H (300

MHz, DMSO-d6) δ: 3.87 (s, 3H, CH3), 6.24 (sl, 3H,

NH3), 6.76 (d, J = 8.1 Hz, 2H,), 7.16-7.21 (m, 2H), 7.49

(d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.41 (d, J = 9 Hz, 2H). HRMS

(DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour C15H13N2O2: 269.0926, trouvé: 269.0915.

Hydrochlorure de 2-(4-diméthylamino-phényl)-5-méthoxy-1-oxy-indol-3-one (84).

Solide rouge brique, Rdt 74%, p.f 183-185 °C; RMN 1H

(300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.03 (s, 6H, 2 CH3), 3.87 (s, 3H,

CH3), 4.02 (sl, 1H, NH), 6.92 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz,

2H), 7.16 (d, J = 3 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz,

1H), 7.49 (d, J = 9 Hz, 1H), 8.51 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz, 2H); RMN

13C (75 MHz, DMSO-d6)

δ: 40.3 (2 CH3), 56.7 (CH3), 108.4, 112.4 (x2), 114.6, 115.0, 118.8, 122.4, 124.9, 128.8 (x2),

141.0, 151.0, 161.7, 187.5 (C=O). HRMS (DCI, CH4) m/z [M+H]+ calc. pour C17H17N2O3:

297.1239, trouvé: 297.1256.

OH2N N+

O-

O

Cl

N+

O

O-

NH3+

O

Cl-

N+

O

O-

NH+O

Cl-

84

1.2. Synthèse des isoindolinones

Ces paragraphes décrivent les protocoles de synthèse des dérivés diméthoxyisoindolinones, de

leur déméthylation et de leur hybridation avec un noyau triazole pour former les

isoindolinotriazoles.

1.2.1. Synthèse des dérivés diméthoxyisoindolinones

A la solution de méthyl 2-formyl-3,5-diméthoxybenzoate 105 (2,5 mmol) dans 20 mL de

méthanol est ajoutée 2,5 mmol de l’amine appropriée. Le mélange est agité à température

ambiante jusqu’à l’apparition d’une suspension puis refroidi à 0 °C pour y ajouter 4 mmol de

NaBH4. La réaction se poursuit sous agitation à température ambiante pendant 20 h. Le

précipité qui se forme est filtré pour obtenir les diméthoxyisoindolinones 103, 106 – 114.

4,6-diméthoxy-2-phénylisoindolin-1-one (106).

Solide blanc, Rdt 62%, p.f 181-183 °C; RMN 1H (300 MHz,

DMSO-d6) δ: 3.86 (s, 3H, CH3), 3,90 (s, 3H, CH3), 4.86 (s, 2H,

CH2), 6.83 (d, J = 3 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 3 Hz, 1H), 7.15-7.20 (m,

1H), 7.40-7.46 (m, 2H), 7.90-7.93 (m, 2H); RMN 13

C (75 MHz,

DMSO-d6) δ: 48.4 (CH2), 56.19 (CH3), 56.23 (CH3), 98.4 (CH), 103.5 (CH), 119.8 (2 CH),

121.8 (C), 124.5 (CH), 129.4 (2 CH), 135.0 (C), 139.9 (C), 155.5 (C), 162.0 (C), 167.0

(C=O); IR (KBr) cm-1

: 3067, 2910, 2836, 1692 (C=O), 1617, 1596, 1501, 1451, 1383, 1328,

1211, 1141, 1115, 1056, 948, 816, 758, 693, 632, 520, 505. HRMS-ESI m/z [M+H]+ calc.

pour C16H16NO3: 270.1130, trouvé: 270.1133

2-(4-tert-butylphényl)-4,6-diméthoxyisoindolin-1-one (107).


DMSO-d6) δ: 1.30 (s, 9H, 3 CH3), 3.85 (s, 3H, CH3), 3.90 (s,

3H, CH3), 4.82 (s, 2H, CH2), 6.82 (d, J = 3 Hz, 1H), 6.86 (d, J

= 3 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.81 (d, J = 9 Hz, 2H) ;

RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 31.6 (3 CH3), 34.5 (C), 48.4 (CH2), 56.16 (CH3), 56.22

(CH3), 98.4 (CH), 103.3 (CH), 119.6 (2 CH), 121.8 (C), 126.0 (2 CH), 135.1 (C), 137.4 (C),

147.0 (C), 155.4 (C), 162.0 (C), 166.8 (C); IR (KBr) cm-1

: 2965, 2945, 2904, 2866, 1695

(C=O), 1627, 1615, 1522, 1503, 1452, 1384, 1336, 1263, 1238, 1208, 1147, 1108, 1051, 949,

842, 819, 764, 558, 518. HRMS-ESI m/z [M+H]+ calc. pour C20H24NO3: 326.1756, trouvé:

326.1760

N

O

OO

N

O

OO

85

2-(4-chlorophényl)-4,6-diméthoxyisoindolin-1-one (108).


DMSO-d6) δ: 3.85 (s, 3H, CH3), 3.90 (s, 3H, CH3), 4.84 (s, 2H,

CH2), 6.83 (d, J = 3 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 3 Hz, 1H), 7.46-7.49

(m, 2H), 7.94-7.96 (m, 2H) ; RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ:

47.9 (CH2), 55.71 (CH3), 55.74 (CH3), 97.9 (CH), 103.2 (CH),

120.7 (2 CH), 121.3 (C), 127.8 (C), 128.7 (2 CH), 134.2 (C), 138.4 (C), 154.9 (C), 161.5 (C),

166.6 (C); IR (KBr) cm-1

: 2975, 2911, 2840, 1698 (C=O), 1632 1610, 1505, 1494, 1456,

1381, 1364, 1320, 1211, 1144, 1114, 1049, 935, 821, 798, 762, 626, 505. MS-(+)ESI m/z: 304

([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z [M+H]

+ calc. pour C16H15ClNO3: 304.0740, trouvé:

304.0735

4,6-diméthoxy-2-(4-méthoxyphényl)isoindolin-1-one (109).


DMSO-d6) δ: 3.77 (s, 3H, CH3), 3.85 (s, 3H, CH3), 3.89 (s, 3H,

CH3), 4.80 (s, 2H, CH2), 6.80 (d, J = 3 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 3

Hz, 1H), 6.98-7.01 (m, 2H), 7.77-7.80 (m, 2H) ; RMN 13

C (75

MHz, DMSO-d6) δ: 48.7 (CH2), 55.7 (CH3), 56.15 (CH3), 56.21

(CH3), 98.4 (CH), 103.2 (CH), 114.5 (2 CH), 121.67 (C), 121.70 (2 CH), 133.1 (C), 135.1

(C), 155.4 (C), 156.4 (C), 162.0 (C), 166.5 (C) ; IR (KBr) cm-1

: 3076, 3001, 2918, 2836, 1679

(C=O), 1615, 1513, 1505, 1451, 1385, 1327, 1211, 1144, 1110, 1055, 949, 814, 767, 586,

511. MS-(+)ESI m/z: 300 ([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z [M+H]

+ calc. pour C17H18NO4:

300.1236, trouvé: 300.1231

4,6-diméthoxy-2-(4-phénoxyphényl)isoindolin-1-one (110).

Solide blanc, Rdt 51%, p.f 149-151 °C; RMN 1H (300

MHz, DMSO-d6) δ: 3.86 (s, 3H, CH3), 3.90 (s, 3H, CH3),

4.84 (s, 2H, CH2), 6.82 (d, J = 3 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 3 Hz,

1H), 7.00-7.04 (m, 2H), 7.08-7.11(m, 2H), 7.13-7.16 (m,

1H), 7.37-7.42 (m, 2H), 7.91-7.94 (m, 2H) ; RMN 13

C (75

MHz, DMSO-d6) δ: 48.6 (CH2), 56.18 (CH3), 56.23 (CH3), 98.4 (CH), 103.4 (CH), 118.6 (2

CH), 119.8 (2 CH), 121.6 (2 CH), 121.8 (C), 123.7 (CH), 130.5 (2 CH), 134.9 (C), 135.8 (C),

153.1 (C), 155.4 (C), 157.6 (C), 162.0 (C), 166.8 (C) ; IR (KBr) cm-1

: 3005, 2963, 2932,

2840, 1685 (C=O), 1627, 1506, 1488, 1451, 1385, 1363, 1336, 1237, 1207, 1146, 1118, 1051,

1043, 934, 835, 781, 696, 560, 518 . MS-(+)ESI m/z: 362 ([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z

[M+H]+ calc. pour C22H20NO4: 362.1392, trouvé: 362.1385

N

O

OO

Cl

N

O

OO

O

N

O

OO

O

86

2-(4-(diméthylamino)phényl)-4,6-diméthoxyisoindolin-1-one (111).

Solide blanc, Rdt 64%, p.f 152-153 °C; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ: 2.89 (s, 6H, CH3),

3.84 (s, 3H, CH3), 3.88 (s, 3H, CH3), 4.74 (s, 2H, CH2), 6.76-

6.79 (m, 3H), 6.83 (d, J = 3 Hz, 1H), 7.64-7.67 (m, 2H) ; RMN

13C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 40.8 (2 CH3), 48.8 (CH2), 56.1

(CH3), 56.2 (CH3), 98.3 (CH), 102.9 (CH), 113.1 (2 CH), 121.5

(C), 121.6 (2 CH), 129.6 (C), 135.4 (C), 148.1 (C), 155.4 (C), 161.9 (C), 166.3 (C) ; IR (KBr)

cm-1

: 1692, 1683 (C=O), 1614, 1522, 1326, 1270, 1207, 1146, 1110, 1050, 944, 808. MS-

(+)ESI m/z: 313 ([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z [M+H]

+ calc. pour C18H21N2O3: 313.1552,

trouvé: 313.1551

2-(3-fluoro-4-morpholinophényl)-4,6-diméthoxyisoindolin-1-one (112).

Solide blanc, Rdt 79%, p.f 204-205 °C; RMN 1H (300

MHz, CDCl3) δ: 3.10 (t, J = 3 Hz, 4H, CH2), 3.88 (t, J = 3

Hz, 4H, CH2), 3.89 (s, 3H, CH3), 3.90 (s, 3H, CH3), 4.67

(s, 2H, CH2), 6.64 (d, J = 3 Hz, 1H), 6.95-7.01 (m, 2H),

7.48 (dd, J = 3, 9 Hz,1H), 7.79 (dd, J = 3, 9 Hz, 1H) ; RMN 13

C (75 MHz, CDCl3) δ: 48.4

(CH2), 51.03 ( CH2), 51.07 ( CH2), 55.6 (CH3), 55.9 (CH3), 67.0 (2 CH2), 97.9 (CH), 103.0

(CH), 108.4 (CH), 114.7 (CH), 118.8 (CH), 121.1 (C), 135.1 (C), 136.4 (C), 153.9 (C), 155.1

(C), 157.1 (C), 162.0 (C), 167.3 (C) ; IR (KBr) cm-1

: 2949, 2840, 1688 (C=O), 1627, 1512,

1363, 1328, 1270, 1204, 1146, 1129, 1118, 1054, 1042, 935, 824. MS-(+)ESI m/z: 373

([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z [M+H]

+ calc. pour C20H22FN2O4: 373.1564, trouvé:

373.1555

2-(4-éthynylphényl)-4,6-diméthoxyisoindolin-1-one (113).


DMSO-d6) δ: 3.85 (s, 3H, CH3), 3,89 (s, 3H, CH3), 4.15 (s,

1H, CH), 4.84 (s, 2H, CH2), 6.82-6.83 (d, J= 3 Hz, 1H), 6.86-

6.87 (d, J= 3 Hz, 1H), 7.51-7.54 (m, 2H), 7.93-7.96 (m, 2H) ;

RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 48.3 (CH2), 56.2 (CH3), 56.2 (CH3), 80.8 (CH), 83.8 (C),

98.4 (CH), 103.7 (CH), 117.3 (C), 119.3 (2 CH), 121.88 (C), 132.9 (2 CH), 134.7 (C), 140.4

(C), 155.4 (C), 162.0 (C); 167.2 (C); IR (KBr) cm-1

: 3271 (C≡H), 2915, 2834, 1697 (C=O),

1627, 1607, 1504, 1448, 1384, 1362, 1320, 1294, 1201, 1141, 1118, 1048, 934, 830, 762, 635,

518. MS-(+)ESI m/z: 294 ([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z [M+H]

+ calc. pour C18H16NO3 :

294.1130, trouvé: 294.1137

N

O

OO

N

N

O

OO

N O

F

N

O

OO

87

2-(3-éthynylphényl)-4,6-diméthoxyisoindolin-1-one (114).

Solide blanc, Rdt 59%, p.f 191-193 °C; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.85 (s, 3H, CH3),

3,90 (s, 3H, CH3), 4.24 (s, 1H, CH), 4.87 (s, 2H, CH2), 6.83-6.84

(d, J= 3 Hz, 1H), 6.87-6.88 (d, J= 3 Hz, 1H), 7.26-7.29 (m, 1H),

7.41-7.47 (t, J= 9 Hz, 1H), 7.90-7.94 (m, 1H), 8.08-8.09 (t, J= 3

Hz, 1H) ; RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 48.3 (CH2), 56.2

(CH3), 56.2 (CH3), 81.4 (CH), 83.8 (C), 98.4 (CH), 103.7 (CH), 120.2 (CH), 121.9 (C), 122.5

(CH), 122.7 (C), 127.6 (CH), 129.8 (CH), 134.7 (C), 140.2 (C), 155.5 (C), 162.0 (C); 167.2

(C) ; IR (KBr) cm-1

: 3240 (C≡H), 2960, 2833, 1686 (C=O), 1615, 1577, 1504, 1429, 1384,

1329, 1239, 1208, 1140, 1120, 1061, 945, 815, 788, 682. MS-(+)ESI m/z: 294 ([M+H]+,

100%). HRMS-ESI m/z [M+H]+ calc. pour C18H16NO3 : 294.1130, trouvé: 294.1139

1.2.2. Synthèse des isoindolinotriazoles

Dans le mélange de solvants THF/t-BuOH/H2O (3:1:1, v/v/v, 6/2/2 mL) sont introduits

l’alcyne 113 ou 114 (1 mmol) et l’azide 115 (1 mmol). Sont ensuite ajoutés l’ascorbate de

sodium (89 mg, 0,45 eq) et CuSO4.5H2O (16 mg, 0,1 eq). Le mélange est agité pendant deux

jours jusqu’à ce que la réaction soit complète. Il est évaporé sous vide pour donner un résidu

qui va être traîté avec 50 mL d’eau. Les composés organiques sont extraits avec 3 x 15 mL de

dichlorométhane, séchés avec Na2SO4 anhydre, filtrés puis évaporés sous vide pour donner un

produit brut. Ce dernier est purifié par colonne chromatographique avec, comme éluant, le

système acétate d’éthyl/dichlorométhane (Najahi, 2011).

4,6-diméthoxy-2-(4-(1-(phénylthiométhyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)phényl)isoindolin-1-one

(116). Solide blanc, Rdt 70%, p.f 194-196 °C; RMN 1H

(300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.86 (s, 3H, CH3), 3,90 (s, 3H,

CH3), 4.87 (s, 2H, CH2), 6.00 (s, 2H, CH2), 6.82-6.83 (d,

J= 3 Hz, 1H), 6.87-6.88 (d, J= 3 Hz, 1H), 7.30-7.39 (m,

2H), 7.44-7.47 (m, 3H), 7.86-7.89 (m, 2H) 7.98-8.01 (m,

2H), 8.55 (s, 1H, CHtriazole) ; RMN 13

C (75 MHz, DMSO-d6) δ: 48.4 (CH2), 52.41 (CH2), 56.2

(CH3), 56.2 (CH3), 98.4 (CH), 103.6 (CH), 119.8 (2 CH), 121.1 (CHtriazole), 121.8 (C), 126.2

(2 CH), 126.5 (C), 128.2 (CH), 129.8 (2 CH), 131.1 (2 CH), 132.9 (C), 134.9 (C), 139.7 (C),

146.8 (Cq triazole), 155.5 (C), 162.0 (C); 167.0 (C) ; IR (KBr) cm-1

: 3140, 3055, 2942, 2841,

1688 (C=O), 1629, 1612, 1502, 1453, 1384, 1361, 1322, 1267, 1202, 1145, 1120, 1074, 1041,

972, 929, 832, 802, 764, 738, 689, 515, 472. MS-(+)ESI m/z: 459 ([M+H]+, 100%). HRMS-

ESI m/z [M+H]+ calc. pour C25H23N4O3S : 459.1491, trouvé: 459.1490

N

O

OO

N

O

OO

N N

N

S

88

4,6-diméthoxy-2-(3-(1-(phénylthiométhyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)phényl)isoindolin-1-one

(117). Solide blanc, Rdt 80%, p.f 179-181 °C; RMN 1H (300

MHz, DMSO-d6) δ: 3.86 (s, 3H, CH3), 3.91 (s, 3H, CH3),

4.91 (s, 2H, CH2), 6.01 (s, 2H, CH2), 6.83-6.84 (d, J= 3 Hz,

1H), 6.88-6.89 (d, J= 3 Hz, 1H), 7.33-7.37 (m, 3H), 7.44-

7.48 (m, 3H), 7.62-7.65 (m, 1H), 7.97-8.01 (m, 1H), 8.26-

8.28 (t, J = 3 Hz, 1H), 8.67 (s, 1H, CHtriazole) ; RMN 13

C (75

MHz, DMSO-d6) δ: 48.5 (CH2), 52.5 (CH2), 56.2 (CH3), 56.2

(CH3), 98.4 (CH), 103.6 (CH), 116.3 (CH), 119.3 (CH), 121.3 (CHtriazole), 121.8 (CH), 121.9

(C), 128.3 (CH), 129.8 (2 CH), 130.0 (CH), 131.1 (2 CH), 131.6 (C), 132.8 (C), 134.9 (C),

140.6 (C), 147.0 (Cq triazole), 155.5 (C), 162.0 (C), 167.1 (C) ; IR (KBr) cm-1

: 3145, 2965,

2945, 2843, 1713 (C=O), 1624, 1611, 1578, 1506, 1491, 1436, 1371, 1359, 1345, 1301, 1210,

1148, 1111, 1073, 1046, 1006, 932, 844, 815, 789, 753, 690, 634, 490. MS-(+)ESI m/z: 459

([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z [M+H]

+ calc. pour C25H23N4O3S : 459.1491, trouvé:

459.1483

1.2.3. Déméthylation de la diméthoxyisoindolinone, clitocybine C

Dans un ballon contenant 2 g de la clitocybine C 103 (7 mmol) sont ajoutés 10 mL d’acide

bromhydrique à 48 % et 20 mL d’acide acétique. Le milieu réactionnel est agité sous reflux.

Après 18 h, de l’eau glacée puis de l’acétate d’éthyl sont ajoutés. La phase organique formée

est lavée avec de l’eau, séchée avec Na2SO4 anhydre, filtrée, évaporée sous vide puis purifiée

à l’aide d’une colonne chromatographique. L’éluant est le système dichlorométhane/méthanol

10/1). La clitocybine A 101 et le mélange de la clitocybine B 102 et de son isomère 118 ont

été récupérés. Ces deux derniers produits ont été séparés par HPLC préparative.

4-hydroxy-2-(4-hydroxyphényl)-6-méthoxy-isoindol-1-one (118)


CDCl3) δ: 3.90 (s, 3H), 4.64 (s, 2H, CH2), 6.65-6.74 (m, 4H),

7.61 (d, J = 9 Hz, 2H), 9.38 (s, 1H) ; RMN 13

C (75 MHz,

CDCl3) δ: 48.6 (CH2), 55.7 (CH3), 100.6 (CH), 103.1 (2 CH),

115.0 (CH), 120.4 (C), 121.7 (2 CH), 133.1 (C), 135.0 (C), 154.5 (C), 158.8 (C), 161.5 (C),

166.3 (C) ; IR (KBr) cm-1

: 3398, 2928, 2840, 1685 (C=O), 1616, 1512, 1431, 1374, 1319,

1268, 1228, 1146, 1069, 1042. MS-(+)ESI m/z: 272 ([M+H]+, 100%). HRMS-ESI m/z

[M+H]+ calc. pour C15H14NO4 : 272.0923, trouvé: 272.0952.

2. Activités biologiques

N

OH

OO

OH

N

O

OO

NN

N

S

89

Les paragraphes suivants décrivent les protocoles utilisés pour évaluer l’activité biologique

des différents composés (antiplasmodiales, antipaludiques, cytotoxicité et toxicité aigue).

2.1. Essais in vitro

2.1.1. Culture in vitro de Plasmodium falciparum et évaluation de l’activité

antiplasmodiale

Culture des parasites : La souche FcB1 de Plasmodium falciparum, souche chloroquino-

résistante, est cultivée in vitro dans 10 mL de milieu de RPMI contenant 10 % de sérum

humain. Ce dernier est fourni par l’Etablissement Français du Sang de Toulouse,

décomplémenté avant usage en le chauffant à 56 °C. La culture est entretenue

quotidiennement à 2 % d’hématocrite et 2 % de parasitémie. Pour cela, des érythrocytes

humains appartenant au groupe O± sont utilisés après les avoir lavés trois fois avec du milieu

RPMI pour enlever les globules blancs et le plasma. La culture se fait dans une atmosphère

contrôlée à 37 °C contenant 5 % de CO2 et 100 % d’humidité relative. La taille des parasites

est contrôlée par synchronisation tous les 48 heures pour éliminer les formes âgées de Pf en

faisant agir pendant environ 7 minutes 5 % de D-sorbitol correspondant à 10 fois le volume

du culot de milieu biologique.

Test de l’activité antiplasmodiale : Les molécules de référence utilisées pour les essais sont la

chloroquine et l’artésunate de sodium. Ces produits sont stockés à une concentration de 10

mg/mL dans le milieu RPMI. Une solution stock de 0,5 mg/mL de produit testé est préparée

en ajoutant dans une solution de 1 mg/mL de BSA dans du RPMI une solution de 1 mg/mL du

produit dissous dans du DMSO. Pour faire le test, une série de dilutions de produits, pour

avoir des concentrations finales allant de 10 µg/mL à 1 pg/mL, est appliquée dans les milieux

biologiques de culture qui sont distribués dans une plaque à 96 puits. Les cultures sont

laissées à incuber pendant 24 heures. 25 µL d’une solution de 1 µL de [3H]-hypoxanthine

dans 100 µL de RPMI contenant 10 % de sérum humain est ensuite ajoutée. A la fin de

l’incubation, soit 48 heures, les plaques sont congelées. Le jour de la lecture de

l’incorporation de [3H]-Hypoxanthine, elles sont décongelées. Les puits sont ensuite récoltés

sur un papier filtre en fibre de verre qui sera imbibé de liquide de scintillation pour la mesure

sur compteur béta. Le pourcentage d’inhibition de la croissance des parasites est ensuite tracé

comme une fonction semilogarythmique en fonction de la concentration des produits. La

valeur de la CI50 est ensuite déterminée par analyse de régression linéaire sur les segments

linéaires de la courbe. Dans chaque essai, les produits sont testés trois fois et les tests sont

90

répétés trois fois. Les contrôles négatifs (globules rouges non parasités) et positifs (croissance

des parasites sans traitement) sont effectués.

2.1.2. Test de cytotoxicité

Des cellules tumorales mammaires MCF7 sont cultivées dans du milieu RPMI avec 10 % de

sérum de veau fœtal provenant de Cambrex. Après trypsinisation en laissant agir 5 minutes du

trypsine-EDTA à 37 °C, 5 % CO2, les cellules sont distribuées dans des plaques 96 puits à 2 x

104 cellules par puits dans 100 µL de milieu de culture. Après 24 heures d’incubation, 100 µL

de milieur de culture contenant des concentrations différentes de produits testés sont ajoutés.

Les concentrations finales dans les puits sont 1, 10 et 100 µg/mL. 48 heures après, 50 µL de

milieu est remplacé par une solution de XTT dans l’eau de concentration 0,5 mg/mL. Les

tests sont répétés trois fois et les doses de produits sont effectuées trois fois dans un test.

2.1.3. Indice de sélectivité (IS)

L’indice de sélectivité correspond au ratio entre la toxicité sur les cellules MCF7 et l’activité

antipaludique suivant la formule: IS FcB1 = CC50 (MCF7)/CI50 (FcB1).

2.2. Essais in vivo

2.2.1. Préparation des nanoparticules du composé 97 et caractérisation

Les nanoparticules contiennent un ratio composé/BSA 1/10 (m/m). Les nanosuspensions sont

d’une concentration de 1 mg/mL. BSA est dissous dans 0,01 M de PBS à la concentration de

10 mg/mL. Dans cette solution agitée est additionnée goutte à goutte le composé dissous dans

l’acétone à la concentration de 3,5 mg/mL (1 mL/min). L’acétone est enlevée par évaporation

sous pression réduite, à la température de 35 °C pendant 15 min. La suspension est

homogénéisée en 13 cycles à 25 000 psi. Les nanosuspensions sont congelées à -80 °C avant

la lyophilisation (72 h à -55 °C, 6 µm Hg). Les poudres de nanoparticules obtenus sont

stockées à 4 °C jusqu’à utilisation. Elles sont remises en suspensions dans 10 mL d’eau

distillée pure.

La taille des particules est vérifiée à 25 °C trois fois à partir de l’homogénéisation. Lors des

mesures, la concentration de la nanosuspension doit être convenable (faire une dilution dans

l’eau Milli Q 1:100). L’angle de diffusion est 165 °. La taille des particules est caractérisée

par le diamètre moyen, exprimé en nanomètres et par l’indice de polydispersité (IP).

2.2.2. Tests antipaludiques sur souris

Les tests ont été effectués au Laboratoire LEPC, IMRA, Madagascar pour les produits

d’origine naturelle, au London School of Hygiene and Tropical Medicine (LSHTM),

91

Royaume-Uni pour l’IND non formulé et à l’Université de Toulouse, France pour l’IND

formulé.

Les souches de parasites utilisées sont Plasmodium yoelii sbsp nigeriensis pour le test des

produits d’origine naturelle et Plasmodium berghei ANKA pour les 2-aryl-3H-indol-3-ones.

Produits à tester : Les extraits alcaloïdiques de plante sont solubilisés dans une faible quantité

d’acide acétique puis la solution est diluée avec de l’eau distillée. Les traitements d’extraits se

font par gavage. L’IND 97 non formulé est suspendu dans une solution standard contenant 0,5

% de carboxyméthylcellulose de sodium, 0,5 % de benzyl alcool, 0,4 % de Tween 80 et 0,9 %

de NaCl pour l’administration po et est dissous dans 0,05 % Tween 80 pour l’administration

en iv. Les nanoparticules lyophilisées sont dissous dans une solution saline physiologique

stérile. Les nanosuspensions sont ensuite filtrées avec un filtre de 5 µm de pores. Les souris

sont traitées par voie intraveineuse et par voie intrpéritonéale pour le test des nanoparticules.

Animaux utilisés et conditions : Des souris OF1 mâles et femelles pesant entre 18 et 22 g sont

utilisées pour les essais antipaludiques des produits d’origine naturelle. Des souris Swiss

mâles CD-1 pesant en moyenne 20 g et des souris femelles BALB/c pesant en moyenne 30 g

sont utilisées pour les tests des INDs 97 non formulés et formulés, respectivement. Les souris

BALB/c subissent 4 jours au moins avant les tests une chirurgie qui consiste à anesthésier les

souris avec de l’isoflurane-oxygène, à introduire un cathéter dans la veine fémorale gauche, le

faire passer sous la peau et le sortir à l’arrière du cou (Cabou, 2008). Les souris sont

partagées en groupes de 5. Les animaux sont mis dans des conditions sans agents pathogènes

et nourris ad libitum.

Test de suppression de parasitémie en 4 jours de Peters :

- Essai sur l’IND 97, non formulé

Les souris sont infectées par la veine de la queue avec 106 de globules rouges infectés par P.

berghei ANKA à J-0. Pour la détermination des doses efficaces, le composé est administré

aux doses de 100, 30, 10 et 3 mg/kg/j. L’artésunate est utilisé comme référence aux doses de

30, 10, 3 et 1 mg/kg/j. La moitié des doses est administrée à 8h du matin et 6h du soir. Le

traitement oral par gavage est effectué 3h après infection puis à J + 1, J + 2 et J + 3.

- Essais sur l’IND 97 formulé et les produits naturels

A J-0, les globules rouges parasités sont extraits à partir de souris donneuses et dilués à une

concentration de 5 x 107 globules rouges parasités/mL dans une solution physiologique saline.

Une suspension de 0,2 mL est inoculée par souris par voie intraveineuse et par voie

92

intrapéritonéale pour l’infestation de P. yoelii et P. berghei respectivement. Après 2 heures

d’infection, les groupes de souris sont traités.

Pour le test des extraits naturels, les souris sont traitées par voie orale avec 0,5 mL de

produits. Deux groupes de contrôles sont utilisés, un groupe traité avec des extraits

alcaloïdiques bruts de Cinchona à 100 mg/kg et un autre non traité.

Pour l’essai du composé 97 formulé en nanoparticules à base d’albumine, les groupes de

souris sont traités par voie iv et par voie ip avec 0,1 mL de nanosuspensions à différentes

doses : 5, 25, 50 et 100 mg/kg de souris. Le groupe contrôle négatif reçoit en iv 0,1 mL de

solution NaCl 0,9% et les groupes contrôles positifs sont traités par ip avec 0,2 mL de

chloroquine à la dose de 1 ou 10 mg/kg.

A J + 1, J + 2 et J + 3, les souris sont retraitées avec les mêmes doses et par la même voie

d’administration qu’à J-0. A J + 4, des frottis sanguins sont préparés à partir de la veine de la

queue pour toutes les souris, fixés au méthanol et colorés à l’éosine et au bleu de méthylène,

puis examinés au microscope.

Comptage :

Pour le test des extraits, la parasitémie est déterminée en comptant le nombre de globules

rouges parasités par 2000 à 6000 érythrocytes si la parasitémie est faible (≤ 1 %) et plus de

1000 érythrocytes dans le cas d’une parasitémie élevée.

Pour le test des composés formulés en nanoparticules, elle est déterminée en comptant par

10000 et 3000 érythrocytes pour une parasitémie inférieure et supérieure à 1 %,

respectivement. Les frottis sont effectués quotidiennement après les 4 jours de test de Peters

et les souris sont surveillées pour distinguer des signes cliniques et des pertes de poids.

Le pourcentage d’inhibition de la parasitémie est calculé par rapport à la parasitémie des

témoins non traités suivant la formule suivante : [(parasitémie contrôle – parasitémie des

souris traités avec le produit)/parasitémie contrôle] x 100

Pour l’essai du composé 97 non formulé, la parasitémie est déterminée par examination au

microscope de frottis sanguins effectués à J + 4. Le comptage pour chaque souris est exporté

sur Microsoft Excel spreadsheet (Microsoft Corp.). Les courbes dose-réponse sont obtenus

après calcul du pourcentage d’inhibition de parasitémie et les doses efficaces DE50 et DE90

sont calculés en utilisant le logiciel XLFit version 4 (ID Business Solutions Ltd., UK).

2.2.3. Evaluation de la toxicité aigüe du composé 97 formulé et de BSA

Les souris femelles BALB/c sont classées en groupe de 6. Le traitement est effectué pour un

seul jour. 2 doses différentes du composé sous forme de nanoparticules (100 et 500 mg/kg)

sont administrées per os chez 2 groupes de souris. Un troisième groupe est traité avec 100

93

mg/kg par voie intrapéritonéale. Un quatrième groupe est traité per os avec 5000 mg/kg de

BSA (étant donné que le ratio IND/BSA des nanoparticules du composé 97 est 1/10). Les

souris sont surveillées pendant les 2 premières heures, puis pendant 7 jours en notant la

mortalité des animaux, le poids corporel et les changements de comportement.

3. Etudes des interactions 2-aryl-3H-indol-3-ones / albumine sérique

3.1. Préparation des solutions

L’eau distillée utilisée est l’eau Milli Q. Pour les mesures en UV-visible et en dichroïsme

circulaire (CD), les produits sont solubilisés dans l’ACN pour avoir des solutions stocks à 9

mM et pour les mesures de fluorescence, le solvant utilisé est le DMSO pour des solutions

stocks de 6 mM. Des solutions de HSA (albumine du sérum humain) sont préparées avec du

PBS (0,01 M PBS, 0,1 M NaCl, pH = 7,4) et stockées à l’abri de la lumière à 4 °C. Les

solutions stocks de marqueurs de site sont préparées avec du DMSO et celles des ions avec de

l’eau milliQ.

3.2. UV-Visible

Les spectres d’absorption en UV-visible sont enregistrés à température ambiante (25 °C) et à

des longueurs d’onde allant de 250 à 400 nm. Le volume de solution dans la cuve est de 3

mL. Les mesures sont effectuées pour une solution de HSA à 15 µM seule, une solution de 2-

aryl-3H-indol-3-one à 15 µM seule et le mélange des deux solutions.

3.3. Fluorescence

Les échantillons sont excités à 280 et 293 nm, et l’émission est suivie dans l’intervalle de

longueurs d’onde de 300 à 400 nm. Les INDs ne sont pas fluorescentes aux longueurs d’onde

d’étude. Les mesures sont effectuées en triplicat à des températures différentes (15, 25 et 37

°C). En s’inspirant du protocole d’Ibrahim N et al (Ibrahim, 2010), un titrage de 3 mL d’une

solution de 10 µM de HSA par ajout de 2,5 µL d’une solution de 6 mM des dérivés INDs a

donné les échantillons mesurés de concentrations finales allant de 5 à 70 µM. Les volumes

d’INDs ajoutés sont négligés. Après excitation à 280 et 293 nm, les émissions maximales sont

à 333 et 337 nm, respectivement.

Les mesures de fluorescence synchrone sont effectuées aux solutions préparées ci-dessus à 25

°C et entre l’intervalle 250 – 320 nm pour ∆λ = 15 et 60 nm.

3.4. Dichroisme circulaire

Les mesures sont faites en 3 scans à 25 °C entre les longueurs d’onde 205 et 250 nm, avec une

vitesse de balayage de 50 nm/min à 0,2 nm d’intervalles. Les échantillons constituent 3 mL

94

d’HSA de concentration 0,5 µM avec une solution d’IND de concentration finale 0, 0,5, 1, 2

et 4 µM obtenu par titrage.

3.5. Equilibre de liaison et effet des ions

10 µL des solutions stocks d’ions K+, Cu

2+, Ca

2+, Zn

2+, Ni

2+, Co

2+ et Fe

3+ de concentration 50

mM dans l’eau milliQ sont mélangées avec 10 mL de solution de HSA à 5 µM pour obtenir le

ratio ion/HSA 10/1. 3 mL de ce mélange est ensuite titré avec des concentrations successives

de 2,5 µL de composés pour avoir les concentrations finales allant de 5 à 30 µM. Les spectres

de fluorescence sont enregistrées à 25 °C après excitation des échantillons à 280 et 293 nm.

3.6. Identification des sites d’interaction à l’aide de marqueurs

Afin de déterminer les sites de liaison des INDs sur HSA, l’IND du mélange composé/HSA

4/1 est mis en compétition avec différentes concentrations des marqueurs spécifiques de

liaison. Les spectres de fluorescence sont enregistrés avec les longueurs d’onde d’excitation

280 et 293 nm pour le mélange INOD/HSA 4/1 avec une concentration de 2,5 µM de HSA.

Les marqueurs de concentration initiale de 3 mM sont ajoutés en petite quantité dans le

mélange INOD/HSA pour avoir des concentrations finales de 2,5, 5, 10, 15, 20 et 25 µM.

4. Extraction phytochimique

Les travaux d’extraction phytochimique (IMRA, Pr. V. RAMANDRAIBE VESTALYS) ont

inclus les étapes suivantes.

4.1. Partage de l’extrait éthanolique 255 FT

Un dégraissage a été effectué en lavant 5 fois l’extrait de 4 g suspendu dans 100 mL d’eau

avec de l’hexane. On remarque que le produit est insoluble dans l’eau, le dégraissage a pu être

fait en appliquant fortement sur l’extrait pateux suspendu dans l’eau. L’ensemble des phases

hexane subit une évaporation sous vide pour obtenir 790 mg d’extraits. Dans le reste est

ajouté de l’acétate d’éthyle. Les phases aqueuses et organiques sont séparées dans une

ampoule à décanter. Après évaporation, on remarque que la phase aqueuse ne contient pas de

produits. La phase organique est séchée avec du chlorure de calcium anhydre, filtrée puis

évaporée sous vide pour obtenir 3,5 g d’extraits.

4.2. Protocole d’extraction alcaloïdique

L’extraction des alcaloïdes a été effectuée en milieu acide. Un échantillon broyé de 375 g de

feuilles et de tiges de la plante 15 FT est macéré dans 3 L d’une solution d’acide acétique 1,8

% pendant une nuit puis filtré pour récupérer une solution orange. Deux autres macérations

sont effectuées dans 2,5 L puis 2 L d’acide acétique à 1,8 %. L’ensemble des filtrats obtenus

95

est évaporé sous vide puis alcalinisé jusqu’à pH 9. Les alcaloïdes totaux sont ensuite extraits

avec 3 x 250 mL de dichlorométhane. La phase organique est séchée avec le chlorure de

calcium anhydre, filtrée puis évaporée sous vide pour obtenir 1,8 g d’alcaloïdes totaux.

4.3. Fractionnement des alcaloïdes totaux

1 g d’alcaloïdes totaux est fractionné grossièrement sur une colonne chromatographique

ouverte en utilisant de la silice de taille de partidules 0,063 – 0,200 mm. Le système de

solvant utilisé est dichlorométhane/méthanol en gradient 95/5 à 75/25. 8 fractions sont

récupérées. Les 4 fractions F5, F6, F7 et F8 contiennent des alcaloïdes révélés au Dragendorff

sur une plaque CCM.

La totalité de la fraction F5 obtenue (453 mg) contient visuellement sur plaque CCM plus de

2 alcaloïdes. Ces alcaloïdes vont être isolés par chromatographie sur colonne de gel de silice

de taille 0,015 – 0,040 mm. Le système de solvant utilisé est le dichlorométhane/méthanol en

gradient 93/7. Les fractions majoritaires obtenues sont purifiées par chromatographie

préparative sur plaques en utilisant comme éluent acétate d’éthyle/méthanol 70/30 pour

obtenir trois produits F5 P1 et F5 P3 de masse inférieur à 1 mg et F5 P2 de 9 mg.

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123

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Cycle de Plasmodium chez l’homme ....................................................................... 6

Figure 2. Chronologie de la découverte des médicaments antipaludiques majeurs ................ 7

Figure 3. Portefeuille des antipaludiques gérés par MMV en 2015 montrant les

composés en développement ................................................................................ 14

Figure 4. Mécanisme d’action des 1,4-naphthoquinones ........................................................ 24

Figure 5. Cibles des médicaments antipaludiques, des molécules en développement et

en recherche et quelques cibles potentielles .......................................................... 26

Figure 6. Structure des indolone-N-oxydes ............................................................................. 28


présence du composé 98 à différentes concentrations (0, 0,5, 1, 2, 4 µM)

correspondant aux courbes 1 à 5 ; T = 25 °C ; pH = 7,4 ....................................... 42

Figure 8. Changement de fluorescence de l’albumine du sérum humain (10 µM) en

fonction de la concentration du composé 98 après excitation aux longueurs

d’onde 280 et 293 nm ; T = 25 °C ......................................................................... 43

Figure 9. Spectres de fluorescence synchrone de l’albumine du sérum humain (10 µM)

en présence de différentes concentrations des 2-aryl-3H-indol-3-ones (A) 97

(B) 98 (C) 99 (D) 100 ; T = 25 °C ; pH = 7,4 ; λ = 280 nm .................................. 44

Figure 10. Effet des marqueurs de site sur la fluorescence de la solution albumine du

sérum humain/2-aryl-3H-indol-3-one (2,5/10 µM) pour 97 (A), 98 (B), 99

(C) et 100 (D) ; T = 25 °C; pH = 7.4; λex = 280 nm .............................................. 45

Figure 11. Spectre d’absorption des 2-aryl-3H-indol-3-ones (15 µM) avec l’albumine

du sérum humain (15 µM): (A) 97 (B) 98 (C) 99 (D) 100 .................................... 46

Figure 12. Spectre d’émission de l’albumine du sérum humain (10 µM) après une

excitation à 280 nm en présence de différentes concentrations d’INDs (0 à

70 µM correspondant aux courbes de 1 à 13) ; T = 25 °C ; pH = 7,4 ; (A) 97

(B) 98 (C) 99 (D) 100 ............................................................................................ 47

Figure 13. Courbe de Stern-Volmer du quenching de l’albumine du sérum humain (10

µM) par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); T = 25 °C; pH = 7.4; λex = 280

nm .......................................................................................................................... 48

124

Figure 14. Courbes de Lineweaver-Burk du quenching de l’albumine du sérum humain

(10 µM) par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); λex = 280 nm ............................... 49

Figure 15. Courbes de Van’t Hoff de l’interaction de 10 µM de l’albumine du sérum

humain avec les quatre composés étudiés; pH = 7.4; λex = 280 nm ...................... 50

Figure 16. Courbes de log(F0-F)/F en function de log[Q] de la liaison entre l’albumine

du sérum humain et les composés étudiés ; T = 25 °C ; pH = 7.4; λex = 280

nm .......................................................................................................................... 50

Figure 17. Histogrammes de distribution de la taille du composé 97 formulé en

nanoparticules à base d’albumine .......................................................................... 55

Figure 18. Courbes dose-réponse du composé 97 formulé en nanoparticules à base

d’albumine après administration en iv et en ip ...................................................... 56

Figure 19. Temps de survie des souris infectées par P. berghei après un traitement avec

le composé 97 formulé en nanoparticules à base d’albumine en iv (A) et en

ip (B) ...................................................................................................................... 57

Figure 20. Profil chromatographique et spectre de masse du mélange de la clitocybine

B 102 et de son isomère 118 ................................................................................. 64

Figure 21. Chromatographie sur couche mince des quatre fractions F5, F6, F7 et F8 ........... 71

Figure 22. Profils chromatographiques au détecteur à barrette de diode par scan total

(en haut) et au détecteur de masse (en bas) du produit F5 P2 ............................... 71

Figure 23. Spectres de dichroisme circulaire de l’albumine du sérum humain (0,5 µM)

en présence de différentes concentrations des composés 97 (A), 98 (B), 99

(C) et 100 (D) (0, 0,5, 1, 2, 4 µM) correspondant aux courbes 1 à 5 ; T = 25

°C ; pH = 7,4 ......................................................................................................... 129

Figure 24. Changement de fluorescence de l’albumine du sérum humain (10 µM) en

fonction de la concentration des composés 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D)

après excitation aux longueurs d’onde 280 et 293 nm ; T = 25 °C; pH = 7,4 ....... 130

Figure 25. Effet des marqueurs de site sur la fluorescence de la solution albumine du

sérum humain/2-aryl-3H-indol-3-one (2,5/10 µM) pour 97 (A), 98 (B), 99

(C) et 100 (D); T = 25 °C; pH = 7.4; λex = 293 nm .............................................. 131

125

Figure 26. Spectre d’émission de l’albumine du sérum humain (10 µM) après une

excitation à 293 nm en présence de différentes concentrations des 2-aryl-

3H-indol-3-ones (0 à 70 µM correspondant aux courbes de 1 à 13) ; T = 25

°C ; pH = 7,4 ; (A) 97 (B) 98 (C) 99 (D) 100 ........................................................ 132

Figure 27. Courbe de Stern-Volmer du quenching de l’albumine du sérum humain (10

µM) par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); T = 25 °C; pH = 7.4; λex = 293

nm .......................................................................................................................... 132

Figure 28. Courbes de Lineweaver-Burk du quenching de l’albumine du sérum humain

(10 µM) par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D) ; λex = 293 nm .............................. 133

Figure 29. Courbes de Van’t Hoff de l’interaction de 10 µM de l’albumine du sérum

humain avec les quatre composés étudiés; pH = 7.4; λex = 293 nm ...................... 133

Figure 30. Courbes de log(F0-F)/F en function de log[Q] de la liaison entre l’albumine

du sérum humain et les composés étudiés ; T = 25 °C ; pH = 7.4; λex = 293

nm .......................................................................................................................... 133

126

LISTE DES SCHEMAS

Schéma 1. Biotransformation du composé 62 en métabolite réduit dans le globule rouge ..... 30

Schéma 2. Réduction du composé 62 ...................................................................................... 30

Schéma 3. Schéma de synthèse des indolone-N-oxydes ......................................................... 33

Schéma 4. Fonctionnalisation de l’aminoindolone-N-oxyde 79 avec la 6-

carboxyfluoresceine ............................................................................................... 38

Schéma 5. Schéma de synthèse du composé 94 ...................................................................... 38

Schéma 6. Fonctionnalisation de l’aminoindolone-N-oxyde 94 avec l’isothiocyanate de

fluorescéine ........................................................................................................... 39

Schéma 7. Photos des champignons à clitocybine .................................................................. 61

Schéma 8. Schéma de synthèse des dérivés isoindolinones .................................................... 63

Schéma 9. Protocole de fractionnement et d’isolement des produits actifs de la plante

15 FT ..................................................................................................................... 70

127

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Propriétés physicochimiques et biologiques du composé 62, tête de série ........... 29

Tableau 2. Bilan des qualités et des défauts de la série des indolone-N-oxydes .................... 31

Tableau 3. Activités antiplasmodiales et cytotoxicité des indolone-N-oxydes ....................... 35

Tableau 4. Activités antiplasmodiales et cytotoxicité de quatre dérivés 2-aryl-3H-indol-

3-ones .................................................................................................................... 40

Tableau 5. Teneur en hélice α (en %) ..................................................................................... 42

Tableau 6. Constantes de quenching, paramètres thermodynamiques de l’interaction

entre les quatre 2-aryl-3H-indol-3-ones avec l’albumine du sérum humain à

différentes températures, constante de liaison K et nombre de site de liaison

n à 25 °C ; λex = 280 nm ........................................................................................ 51

Tableau 7. Constantes K et nombre de liaison n de l’interaction entre l’albumine du

sérum humain et les 2-aryl-3H-indol-3-ones en présence des ions

métalliques à T = 25 °C ; λ = 280 nm ................................................................... 52

Tableau 8. Activité antipaludique in vivo des nanoparticules du composé 97 comparé à

la chloroquine ........................................................................................................ 56

Tableau 9. Activités antiplasmodiales érythrocytaires et hépatocytaires et cytotoxicité

des isoindolinones ................................................................................................. 65

Tableau 10. Activité antituberculeuse des isoindolinones ...................................................... 66

Tableau 11. Activités antiplasmodiales in vivo des extraits et fractions naturels issus

des trois plantes ..................................................................................................... 72

Tableau 12. Constantes K et nombre de liaison n de l’interaction entre l’albumine du

sérum humain et les composés en présence des ions métalliques à T = 25

°C ; λ = 293 nm ............................................................................................................... 134

129

Annexe 1. Dichroisme circulaire (Chapitre « Indolone-N-oxydes, séries dérivés et activités

antipaludiques », Partie « Interactions des 2-aryl-3H-indol-3-ones avec l’albumine »)

Les spectres de dichroisme circulaire de l’albumine obtenus en présence des quatre composés

sont décrits dans la figure ci-dessous en complément de la figure 7, page 42.


présence de différentes concentrations des composés 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D) (0, 0,5,

1, 2, 4 µM) correspondant aux courbes 1 à 5 ; T = 25 °C ; pH = 7,4.

130

Annexe 2. Etude du changement de fluorescence (Chapitre « Indolone-N-oxydes, séries

dérivés et activités antipaludiques », Partie « Interactions des 2-aryl-3H-indol-3-ones avec

l’albumine »)

Les courbes F/F0 en fonction de [IND/[HSA] aux deux longueurs d’onde 280 et 293 nm sont

présentées sur la figure suivante pour les quatre composés en complément de la figure 8, page

43.

Figure 24. Changement de fluorescence de l’albumine du sérum humain (10 µM) en fonction

de la concentration des composés 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D) après excitation aux

longueurs d’onde 280 et 293 nm ; T = 25 °C; pH = 7,4

131

Annexe 3. Etude du site de liaison à l’aide des marqueurs de sites (Chapitre « Indolone-N-

oxydes, séries dérivés et activités antipaludiques », Partie « Interactions des 2-aryl-3H-indol-

3-ones avec l’albumine »)

Les courbes F2/F1 x 100 en fonction de [marqueur]/[HSA] sont données sur la figure suivante

pour une longueur d’onde d’excitation de 293 nm (λex = 280 nm donné à la figure 10, page

45).

Figure 25. Effet des marqueurs de site sur la fluorescence de la solution albumine du sérum

humain/2-aryl-3H-indol-3-ones (2,5/10 µM) pour 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); T = 25

°C; pH = 7.4; λex = 293 nm

132

Annexe 4. Etude par spectroscopie de fluorescence (Chapitre « Indolone-N-oxydes, séries

dérivés et activités antipaludiques », Partie « Interactions des 2-aryl-3H-indol-3-ones avec

l’albumine »)

Les cinq figures suivantes montrent les courbes après une stimulation à la longueur d’onde

293 nm.

Figure 26. Spectre d’émission de l’albumine du sérum humain (10 µM) après une excitation à

293 nm en présence de différentes concentrations des 2-aryl-3H-indol-3-ones (0 à 70 µM

correspondant aux courbes de 1 à 13) ; T = 25 °C ; pH = 7,4 ; (A) 97 (B) 98 (C) 99 (D) 100

(Figure 12 pour 280 nm, page 47)

Figure 27. Courbe de Stern-Volmer du quenching de l’albumine du sérum humain (10 µM)

par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D); T = 25 °C; pH = 7.4; λex = 293 nm (Figure 13 pour 280

nm, page 48).

133

Figure 28. Courbes de Lineweaver-Burk du quenching de l’albumine du sérum humain (10

µM) par 97 (A), 98 (B), 99 (C) et 100 (D) ; λex = 293 nm (Figure 14 pour 280 nm, 48).

Figure 29. Courbes de Van’t Hoff de l’interaction de 10 µM de l’albumine du sérum humain

avec les quatre composés étudiés; pH = 7.4; λex = 293 nm (Figure 15 pour 280 nm, page 50).

Figure 30. Courbes de log(F0-F)/F en function de log[Q] de la liaison entre l’albumine du

sérum humain et les composés étudiés ; T = 25 °C ; pH = 7.4; λex = 293 nm (Figure 16 pour

280 nm, page 50).

134

Annexe 5. Effet des ions (Chapitre « Indolone-N-oxydes, séries dérivés et activités

antipaludiques », Partie « Interactions des 2-aryl-3H-indol-3-ones avec l’albumine »)

L’impact des ions sur les constantes K et le nombre de liaison n de l’interaction entre HSA et

les composés avec la longueur d’excitation de 293 nm est décrit dans le tableau ci-dessous, les

valeurs à λex = 280 nm étant données dans le tableau 7, page 52.

Tableau 12. Constantes K et nombre de liaison n de l’interaction entre l’albumine du sérum

humain et les composés en présence des ions métalliques à T = 25 °C ; λ = 293 nm.

Metal

ions

HSA - 97 HSA - 98 HSA - 99 HSA - 100

K (×104 M

-1) n K (×10

4 M

-1) n K (×10

4 M

-1) n K (×10

4 M

-1) n

0,4857 0,7940

1,4914 0,8745

4,7490 0,9275

1,1735 0,8534

Ca2+

0,2104 0,7399

0,3841 0,7469

0,0219 0,4181

28,0931 1,1230

Co2+

0,2127 0,7452

0,8640 0,8251

0,0195 0,4054

2,4429 0,8950

Cu2+

0,2067 0,7495

0,8196 0,8304

0,0491 0,4817

7,9799 1,0255

Fe3+

0,2139 0,7515

0,4176 0,7580

0,0174 0,3971

145,3115 1,2352

K+ 0,2968 0,7637

0,6533 0,8051

0,0225 0,4187

31,9595 1,1285

Ni2+

0,3795 0,8041

0,8945 0,8435

0,0125 0,3585

3,2479 0,9317

Zn2+

0,4508 0,8283 1,8967 0,9023 0,0212 0,4110 70,8595 1,2031

Annexe 6. Publications

Auteur : Nambinina Vololomiarana RAKOTOARIVELO

Titre : Activités antipaludiques de séries chimiques à noyau indole et d’extraits naturels

Directrices de Thèse : Pr Françoise NEPVEU et Pr Voahangy RAMANANDRAIBE

VESTALYS

Lieu et date de soutenance : Université d’Antananarivo, le 23 septembre 2015

Résumé

Le phénomène de résistance de Plasmodium falciparum aux antipaludiques actuels mis sur le

marché oblige à une recherche continue de nouvelles molécules. Dans cette thèse, des travaux

de pharmacomodulation ont été menés sur des séries d’indolones et des recherches de

nouvelles structures actives ont été conduites à partir d’extraits naturels actifs. Les variations

structurales entreprises sur la série des indolone-N-oxydes (INOD) ont permis une faible

amélioration de la solubilité par introduction de groupement aminochlorhydrate, une activité

antiplasmodiale maintenue par introduction de groupements encombrants en position 6 et une

conservation de l’activité antipaludique lorsque la fonction nitrone (O-N=C) est réduite

(N=C) conduisant à la nouvelle série des 2-aryl-3H-indol-3-ones (IND). Les essais in vivo

menés sur cette nouvelle série aboutissent à des activités comparables à ceux de la série

INOD. Le composé 6-(4-chlorophényl)-7H-[1,3]dioxolo[4,5-f]indol-7-one-5-oxyde demeure

le meilleur candidat actuellement. Les perspectives d’amélioration de la stabilité et de la

biodisponibilité nécessitent désormais d’introduire un groupement encombrant en position 7

afin de ralentir la bioréductibilité des INOD in vivo. Les isoindolinones (clitocybines) ne

présentent pas d’activités antipaludiques (ni antituberculeuses) et sont fortement cytotoxiques.

Des extraits d’une plante malgache présentent des activités antipaludiques in vivo et

encouragent l’isolement des alcaloïdes actifs.

Mots clés : paludisme, activités biologiques, indolone-N-oxydes, interaction avec l’albumine,

isoindolinones (clitocybines), extraits, alcaloïdes.

Disciplines : Chimie – Biologie – Santé,

Chimie appliquée – Pharmacologie - Physiologie

Intitulé et adresse des laboratoires :

- Laboratoire de Pharmacochimie et Pharmacologie pour le Développement PHARMA-DEV,

UMR 152 IRD-UPS, Faculté de Pharmacie, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse, France

- Institut Malgache de Recherches Appliquées IMRA, Lot AVB 76 Avarabohitra Itaosy,

Antananarivo 102, Madagascar

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Documents

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