o papel de altas concentraÇÕes de na+ e cl- na … · the only strain to present clinical gene...
TRANSCRIPT
CENTRO SETORIAL DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
O PAPEL DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE Na+ E Cl- NA
MODULAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA POR
Burkholderia cenocepacia
Amanda Ferreira Monteiro
Rio de Janeiro
2012
AMANDA FERREIRA MONTEIRO
Aluna do curso de Ciências Biológicas
Matrícula 0823800002
O PAPEL DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE Na+ E Cl- NA
MODULAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA POR
Burkholderia cenocepacia
Trabalho de conclusão de curso, TCC apresentado
ao Curso de graduação em Ciências Biológicas do
Centro Universitário Estadual da Zona Oeste como
parte dos requisitos necessários à obtenção do grau
de Bacharel em Biologia, sob orientação da Prof.ª
Maria Cristina de Assis.
Rio de Janeiro
Julho de 2012
M775 Monteiro, Amanda Ferreira O papel de altas concentrações de Na+ e Cl- na modulação de fatores de virulência por Burkholderia cenocepacia / Amanda Ferreira Monteiro. Rio de Janeiro, 2012.
viii, 42p.;
Trabalho de conclusão de curso (Ciências Biológicas)- Fundação Centro Universitário Estadual da Zona Oeste- UEZO, Rio de Janeiro, 2012.
Bibliografia: f. 36-42.
Orientadora: Profª Maria Cristina de Assis
1. Burkholderia cenocepacia, 2. Fatores de virulência, 3. Fibrose Cística, 4. NaCl. - Trabalho de Conclusão de Curso. I. Assis, Maria Cristina. II. Centro Universitário Estadual da Zona Oeste. III. O papel de altas concentrações de Na+ e Cl- na modulação de fatores de virulência por Burkholderia cenocepacia.
CDD 579.2
ii
O PAPEL DE ALTAS CONCENTRAÇÕES DE Na+ E Cl
- NA
MODULAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA POR
Burkholderia cenocepacia
Elaborado por Amanda Ferreira Monteiro
Aluna do curso de Ciências Biológicas da UEZO
Este trabalho de graduação foi analisado e aprovado com
Grau: 9.0
Rio de Janeiro, 17 de Julho de 2012
______________________________________________________
Profª Alessandra Mattos Saliba, Drª
______________________________________________________
Profª Amada Zambrana Coronado, Drª
______________________________________________________
Prof. João Bosco de Salles, Dr.
Suplente
______________________________________________________
Profª Maria Cristina de Assis, Dra
Presidente/Orientadora
Rio de Janeiro, RJ - Brasil
Julho de 2012
iii
Dedico este trabalho à minha mãe, que sempre
me incentivou, apoiou e ensinou a nunca desistir .
“Quem acredita sempre alcança...”
iv
Agradeço primeiramente a Deus, que renova
minhas forças todos os dias para continuar
lutando e superando todas as dificuldades,
fazendo de mim uma pessoa vitoriosa.
À minha mãe Shirley, por estar ao meu lado
em todos os momentos difíceis da minha vida,
segurando a minha mão e sempre me
incentivando a seguir em frente. Obrigada por
sempre acreditar que eu sou capaz.
À minha querida orientadora Maria Cristina,
pela paciência e atenção dedicadas por longos
meses de trabalho. Posso dizer que eu tive uma
grande sorte de encontrá-la na minha caminhada,
essa pessoa que é tão doce e que tem o incrível
dom de ensinar. Agradeço por todos os
conhecimentos transmitidos e pela orientação
segura. Esta tornou-se para mim um exemplo de
profissionalismo a ser seguido.
Às amigas Mayra e Raquel, agradeço pela
cumplicidade e pelas ajudas nos trabalhos e em
muitos problemas que a vida me impôs durante
os anos de faculdade.
A Profª Alessandra M. Saliba e Carolina
Diettrich pelos momentos de biologia molecular
no Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia da Faculdade de Ciências Médicas
da UERJ.
A todos os professores e amigos que
influenciaram direta ou indiretamente nessa
conquista.
v
Resumo
Burkholderia cenocepacia é um micro-organismo frequentemente associado a
infecções graves em pacientes portadores de Fibrose Cística, doença caracterizada pelo
defeito no transporte dos íons Na+ e Cl
-. Existem evidências de que infecções persistentes
possam ser decorrentes, em parte, da sua habilidade de ser um patógeno intracelular
facultativo, mas também pela presença de fatores de virulência como formação de
biofilme, adesinas como “cable pilus”, produção de exopolissacarídeos, além de outros
mecanismos de resistência. O aumento da concentração de NaCl (170mM), parece
favorecer a colonização de B. cenocepacia nas vias aéreas dos pacientes com FC. Estes
achados nos motivaram a investigar o papel dos altos níveis de Na+ e Cl
- na modulação de
fatores de virulência importantes na persistência das infecções. Utilizamos o clone
epidêmico ET-12 e quatro isolados clínicos (1664, 1634, 1652 e 2627) cultivados em meio
suplementado com 0,1M e 0,3M de NaCl para avaliar: i) a formação de biofilme realizada
pelo método de coloração com cristal violeta a 0,2%; ii) arquitetura dos biofilmes
formados por microscopia eletrônica de varredura; iii) a expressão do gene “cable pilus”
por RT-PCR. Nossos resultados demonstraram uma heterogeneidade na formação de
biofilme pelas diferentes cepas. As cepas 1664 e 2627 quando cultivadas em meio
suplementado com 0,3M de NaCl, apresentaram um aumento significativo no índice de
formação de biofilme. A cepa 1664 foi a única cepa clínica a apresentar o gene cblA, e a
ET-12 quando cultivada em 0,3M, apresentou um aumento na expressão deste gene.
Portanto, sugerimos que o aumento das concentrações de NaCl nas secreções pulmonares
na FC pode conferir maior virulência para cepas de B.cenocepacia.
Palavras-chave: Burkholderia cenocepacia, Fatores de virulência, Fibrose Cística, NaCl.
vi
Abstract
Burkholderia cenocepacia is a microorganism commonly associated with severe
infections in patients with cystic fibrosis, a disease characterized by defective transport of
Na+ and Cl
-. There is evidence that persistent infections may be due in part to its ability to
be a facultative intracellular pathogen, but also by the presence of virulence factors and
biofilm formation, adhesins as cable pili, production of exopolysaccharides and other
resistance mechanisms. Increasing concentrations of NaCl (170mM), seems to facilitate the
colonization of B. cenocepacia in the airways of CF patients. These findings motivated us
to investigate the role of high levels of Na+ and Cl
- in the modulation of virulence factors
important in persistence of infections. We used epidemic ET-12 strain and four clinical
isolates (1664, 1634, 1652 and 2627) grown in medium supplemented with 0.1M and
0.3M NaCl to assess: i) the formation of biofilm performed by staining with crystal violet
0.2%, ii) the architecture of biofilms by scanning electron microscopy, iii) gene expression
cable pili by RT-PCR. Our results demonstrate heterogeneity in biofilm formation by
different strains. Strains 1664 and 2627 when grown in medium supplemented with 0.3M
NaCl showed a significant increase in the rate of biofilm formation. The strain 1664 was
the only strain to present clinical gene cblA and ET-12 when grown in 0.3M showed an
increased expression of this gene. Therefore, we suggest that increased concentrations of
NaCl in the pulmonary secretions in CF may confer greater virulence strains
B.cenocepacia.
Keywords: Burkholderia cenocepacia, Virulence Factors, Cystic Fibrosis, NaCl
vii
SUMÁRIO
Página
Resumo...................................................................................................................................v
Abstract.................................................................................................................................vi
1. Introdução...........................................................................................................................1
1.1 Complexo Burkholderia cepacia..........................................................................1
1.2 Aplicação biotecnológica dos micro-organismos do CBc....................................3
1.3 Bactérias doCBc como patógenos oprtunistas.....................................................4
1.4 Burkholderia cenocepacia e fatores de virulência...............................................5
1.4.1 Biofilme.......................................................................................................6
1.4.1.1 A formação do biofilme......................................................................8
1.4.1.2 Fatores que influenciam na formação de biofilmes..........................12
1.4.1.3 Papel dos biofilmes na patogênese das infecções.............................13
1.5. Fibrose Cística...............................................................................................................16
1.6. A Fibrose Cística e B. cepacia.......................................................................................19
2. Justificativa.......................................................................................................................20
3. Objetivos..........................................................................................................................21
3.1 Geral...................................................................................................................21
3.2 Específicos..........................................................................................................21
4. Materiais e Métodos.........................................................................................................21
4.1 Amostras Bacterianas.........................................................................................21
4.2 Determinação da capacidade de formação de biofilme......................................22
4.3 Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV)...................................23
4.4 Análise da presença do gene cblA por PCR........................................................23
4.5 Análise da expressão do gene cblA por RT-PCR................................................25
4.6 Análise estatística...............................................................................................27
5. Resultados e discussão.....................................................................................................27
5.1 Determinação do índice de biofilme formado pelas diferentes cepas meio
viii
suplementado ou não com NaCl...............................................................................27
5.2 Análise da estrutura do biofilme por MEV.........................................................29
5.3 Análise da presença do gene “cable pilus” por PCR..........................................32
5.4 Análise da expressão do gene cblA por RT-PCR................................................33
6. Conclusões.......................................................................................................................34
7. Perspectivas......................................................................................................................36
8. Referências Bibliográficas...............................................................................................36
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Complexo Burkholderia cepacia
Burkholderia cepacia foi inicialmente descrita em 1950 como Pseudomonas
cepacia por Burkholder da Universidade de Cornell, como uma espécie fitopatogênica
responsável pelo apodrecimento de bulbos de cebola. Ironicamente, hoje em dia, B.
cepacia está sendo considerada por microbiologistas como um agente promotor do
crescimento de culturas agrícolas (GOVAN et al., 1996). Ainda em 1950, foi relatado como
um patógeno humano por ser agente etiológico de endocardite bacteriana. Em 1971, foi
identificada como um organismo do “pé podre” em tropas em formação no pântano dos
Estados Unidos, em exercício na Flórida (DAVIES & RUBIN, 2007). Mais tarde, essa
bactéria se mostrou muito versátil, com capacidade para várias interações complexas,
como degradação de complexos aromáticos e interação com humanos e animais, além de
poder metabolizar diversos substratos. Com a análise taxonômica molecular de isolados
dessa espécie de Pseudomonas, muitos foram transferidos para um novo gênero,
Burkholderia (TOMICH & MOHR, 2003)
As espécies de Burkholderia cepacia partilham características fenotípicas
semelhantes, porém genotípicas diferentes, sendo estas diferenças suficientes para permitir
subdivisões em variantes genômicas, e estas genovariantes formam o Complexo
Burkholderia cepacia (CBc). Atualmente são descritas pelo menos 17 espécies (tabela 1)
ou variantes genômicas no CBc (SOUZA et al., 2010), sendo que nove cepas de quatro
espécies do complexo já têm a sequência do seu genoma completo e disponível
publicamente, e outras nove estão com sequenciamento em andamento (LEITÃO et al.,
2010). O termo genomovar é comumente usado para denominar espécies que são
filogeneticamente distintas, mas que são fenotipicamente indistinguíveis quando realizados
testes bioquímicos rotineiros (LEITÃO et al., 2010)
Os micro-organismos desse complexo apresentam características comuns: são
bacilos Gram-negativos, aeróbios, não esporulados e móveis. Apresentam temperatura
ótima de crescimento entre 30º e 35ºC, e podem utilizar mais de 200 compostos como
2
fonte de carbono e energia (PALLERONI, 1984). Pertencem à família Pseudomonadaceae
(NASSER et al., 2004) e seus habitats primários incluem sedimentos dos rios, solo e
plantas, onde são abundantes na rizosfera do milho, do trigo e do arroz, constituindo um
importante indicador de alterações que ocorram nas comunidades microbianas resultantes
de práticas específicas na agricultura (BERRIATUA et al., 2001). Bactérias do CBc têm
suscitado interesse como ferramenta biotecnológica.
Tabela 1- Tabela com as espécies que compõe o Complexo Burkholderia cepacia
Espécie CBc Genomovar
B. cepacia Genomovar I
B. multivorans Genomovar II
B. cenocepacia Genomovar III
B. stabilis Genomovar IV
B. vietnamiensis Genomovar V
B. dolosa Genomovar VI
B. ambifaria Genomovar VII
B. anthina Genomovar VIII
B. pyrrocinia Genomovar IX
B. ubonensis Genomovar X
B. latens Genomovar XI
B. diffusa Genomovar XII
B. arboris Genomovar XIII
B. seminalis Genomovar XIV
B. metallica Genomovar XV
B. contaminans Genomovar XVI
B. lata Genomovar XVII
(Adaptado de SOUSA et al., 2010)
3
1.2 - Aplicação biotecnológica dos micro-organismos do CBc
Bactérias do CBc têm suscitado grande interesse como biopesticida, atuando no
controle biológico de fungos e pragas que afetam plantas e culturas agrícolas de interesse
comercial, além de se mostrar como agente na biodegradação. Estes organismos
apresentam uma extraordinária versatilidade metabólica, podendo degradar substratos
aromáticos clorados, que são complexos compostos tóxicos de herbicidas e pesticidas,
alguns inclusive com alto potencial cancerígeno. Podem também degradar resíduos
industriais, utilizando-os como fonte de carbono e energia. Um dos compostos tóxicos de
grande importância que é degradado por B. cepacia é o ácido 2,4,5 - triclorofenoxiacético
(2,4,5-T), potente herbicida que não é facilmente biodegradado e persiste por longos
períodos no ambiente e foi o principal composto do conhecido agente laranja, muito usado
na guerra do Vietnã (SANGODKAR et al., 1988).
Também pode antagonizar e reprimir muitos fitopatógenos presentes no solo. Pode
impedir a senescência foliar e a podridão causada por fungos, por exemplo, agindo de
forma a inibir a germinação dos esporos. O mecanismo de controle biológico usado por
estes microrganismos envolve a síntese de substâncias antagonistas e de metabólitos
antifúngicos muito ativos contra um largo espectro de fungos, contrastando com as suas
potencialidades na agricultura, em que a proteção e promoção do crescimento/rendimento
de culturas agrícolas mundiais suscitam fortes interesses econômicos (MENDES, 2007).
Outros estudos mostraram que bactérias do gênero Burkholderia podem produzir ácido
indol acético (AIA), hormônio da classe das auxinas responsável pelo crescimento vegetal,
por várias vias de síntese independentes da adição de suplementos ao meio de cultura.
Estes estudos foram feitos em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e os resultados mostraram
que o gênero Burkholderia possui grande número de representantes potencialmente
benéficos para a promoção do crescimento e desenvolvimento vegetal, aumentando a
produtividade agrícola na cultura da cana-de-açúcar. O conhecimento destes processos
pode permitir a exploração desta interação micro-organismo-vegetal, visando à aplicação
biotecnológica, já que apresentam características importantes, tais como a fixação
biológica de N2, solubilização de fosfato inorgânico e síntese de auxinas (COSTA et al.,
4
2009).
As bactérias do complexo emergiram como oportunistas em IrAS (Infecções
relacionadas à Assistência à Saúde), principalmente associadas a infecções respiratórias em
pacientes com FC, criando crescentes preocupações sobre a eventual relação entre isolados
ambientais (ou lançados no ambiente) e clínicos, e os potenciais riscos de utilização desta
bactéria como agente de controle biológico (HOLMES, GOVAN & GOLDESTEIN, 1998).
1.3 - Bactérias do CBc como patógenos oportunistas
Espécies do CBc emergiram como patogênicas oportunistas importantes por sua
capacidade de causar infecções potencialmente letais em imunossuprimidos e pacientes
com Fibrose Cística. O progresso no estudo das bactérias desse complexo tem acontecido
principalmente por terem emergido na década de 80 como potencial causador de infecções
hospitalares, com aumento significativo de mortes particularmente associadas com
infecções pulmonares. Surtos hospitalares com pequenos focos envolvendo pacientes sem
fibrose cística (FC) foram registrados devido à contaminação de fontes comuns com
pacientes portadores da doença, tais como preparações desinfetantes ou soluções
intravenosas (HOLMES, GOVAN & GOLDESTEIN, 1998). Espécies do CBc emergiram
como patogênicas oportunistas importantes por sua capacidade de causar infecções
potencialmente letais em imunossuprimidos e pacientes com Fibrose Cística. Porém sua
patogenicidade não se limita a pacientes fibrocísticos, sendo agente etiológico importante
em granulomatose crônica, infecções em feridas, peritonites, artrites sépticas, por vezes
afetando indivíduos saudáveis (LEITÃO et al., 2010). A espécie mais prevalente nos
pacientes com fibrose cística é a B. cenocepacia, causadora de mais de 50% das infecções,
seguido da B. multivorans. A infecção pela B. cenocepacia está associada à maior
mortalidade entre os pacientes com fibrose cística (tabela 2), quando comparada às
infecções por P. aeruginosa e B. multivorans, e também é a espécie mais frequentemente
relacionada à Síndrome Cepacia (MAHENTHIRALINGAM et al., 2002).
5
Tabela 2 – Distribuição da frequência de aparecimento das espécies do Complexo Burkholderia cepacia em
uma população selecionada de pacientes com fibrose cística
(Adaptado Drevinek & Mahenthiralingam, 2010)
1.4 - Burkholderia cenocepacia e fatores de virulência
A identificação dos fatores de virulência envolvidos na patogenicidade das bactérias
do CBc é uma das áreas de investigação da maior importância. A avaliação de
características que conferem patogenicidade está, contudo, muito condicionada por
particularidades inerentes ao hospedeiro e resulta de uma combinação complexa de fatores
genéticos. Muitos dos fatores de virulência já conhecidos em outros micro-organismos
patogênicos foram também identificados em estirpes do CBc; no entanto, a sua
contribuição para a doença não foi ainda demonstrada. Entre esses fatores de virulência
encontram-se lipases, proteases, sideróforos, hemolisinas, “cable pilus”,
lipopolissacarídeos e exopolissacarídeos (EPS) (CUNHA et al., 2004).
Geralmente, os micro-organismos Gram-negativos são mais resistentes a agentes
microbianos do que os Gram-positivos, e esse potencial tem sido atribuído ao fato das
bactérias Gram-negativas possuírem uma membrana externa adicional, que atua como uma
barreira de permeabilidade extra. A presença de lipopolissacarídeos (LPS) impede o acesso
de moléculas hidrofílicas, isto inclui antibióticos e biocidas, para o interior da célula. Além
6
disso, há um grande número de proteínas de membrana externa que, embora funcionem
como responsáveis pela entrada de antimicrobianos hidrofóbicos na célula, estão
associados também à resistência bacteriana (FERREIRA et al., 2010).
Sabe-se que todas as espécies do CBc são potencialmente capazes de causar
infecção em seres humanos, entretanto, as espécies B. multivorans e B. cenocepacia têm
maior frequência de isolamento em contraste com as espécies B. anthina, B. estabilis e B.
anbifaria, que raramente são isoladas (CAMPANA et al., 2005).
Algumas linhagens do complexo possuem grande capacidade de transmissão, em
particular, a cepa ET-12 (eletrophoretic type 12) de Burkholderia cenocepacia, responsável
pela epidemia em pacientes com fibrose cística no Canadá e Reino Unido. Essa cepa
carrega o gene cblA, que codifica uma subunidade do “cable pilus”, estrutura chave que é
responsável pela aderência da bactéria na célula epitelial (CUNHA, et al., 2004)
Supõe-se ainda que algumas cepas sejam mais transmissíveis que outras, e dois
genes têm sido utilizados como marcadores de uma linhagem epidêmica do CBc: os genes
cblA, que codifica o “cable pilus” do complexo B. cepacia e esmR, que codifica uma
proteína reguladora de função ainda não completamente estabelecida. O “cable pilus” de
cepas isoladas de pacientes com fibrose cística atua na aderência da bactéria às
glicoproteínas do muco e também aumenta sua adesão às células epiteliais. Embora sejam
mais frequentemente identificados em cepas de B. cenocepacia, eles não são exclusivos
desta espécie, mas podem ser considerados marcadores de virulência ou de
transmissibilidade. Outros fatores de virulência são importantes na persistência das
infecções como a produção de biofilme e a resistência a antibióticos (DREVINEK &
MAHENTHIRALINGAM, 2010).
1.4.1- Biofilme
As bactérias em geral podem ser encontradas na natureza sob duas formas:
bactérias livres e flutuantes, denominadas planctônicas e as bactérias que estão firmemente
aderidas a uma superfície, denominadas sésseis, podendo formar biofilmes (DUNNE,
2002).
7
Os biofilmes são uma forma adaptativa do ciclo de vida procariota, funcionando
como a principal forma de sobrevivência e proliferação. São caracterizados
morfologicamente como um conjunto de bactérias agrupadas tridimensionalmente e
irreversivelmente a um substrato, interface (sólido-líquido) ou umas às outras, recobertas
por uma matriz extracelular autoproduzida composta por polissacarídeos, ácidos nucleicos
e proteínas. Apesar da grande complexidade das diferentes estruturas moleculares, os
biofilmes são formados predominantemente por água, em até 90% de seu volume total. A
porção sólida é constituída por células (15%) e matriz extracelular EPS (85%)
(COSTERTON et al., 1995).
Biofilmes microbianos ocorrem naturalmente nos mais variados tipos de ambientes,
sejam eles bióticos, como tecidos vegetais e animais, ou abióticos, como rochas, metais e
polímeros diversos. A formação de biofilme é benéfico ao micro-organismo pois gera
micro-habitats, que oferecem proteção aos indivíduos que fazem parte dele contra as
intempéries e os estresses do meio ambiente. Eles podem ser monoespécie, quando sua
formação diz respeito a apenas um tipo de micro-organismo, ou multiespécie, quando é
encontrada mais que uma espécie na comunidade, mas sempre interagindo
cooperativamente (BOARI, 2008). É extremamente vantajosa para todas as espécies de
micro-organismos a organização em forma de biofilme em relação às bactérias que se
encontram em modo de vida livre, pois dessa forma estão mais protegidos da ação de
agentes químicos e físicos, tendo menor possibilidade de sofrer agressões ambientais como
exposição a raios ultravioleta, toxicidade por metais, garantindo maior proteção contra a
desidratação, vento e variações de pH e osmolaridade, além de conferir certa estabilidade
para seu crescimento com possibilidade de interação e cooperação com outras células que
estão em sua proximidade (HALL-STOODLEY, COSTERTON & STOODLEY, 2004). O
estado de sobrevivência em forma de biofilme garante proteção, principalmente contra o
sistema imunológico do hospedeiro ou de microrganismos predadores existentes no meio
ambiente (BEHLAU & GILMORE, 2010), tornando dessa forma os biofilmes bastante
difíceis de serem erradicados.
Um gradiente de nutrientes e oxigênio é observável a partir do topo do biofilme à
sua base onde há um microambiente anaeróbico. Esta observação reforça a idéia de que o
8
estado metabólico de bactérias dentro de um biofilme depende da sua localização dentro da
estrutura. Esses biofilmes espessos possuem uma arquitetura complexa no qual podem
existir microcolônias em pilares distintos ou estruturas em forma de haste ou pedúnculo,
através do qual se constitui uma rede intrínseca de canais altamente permeáveis, que
permitem o acesso aos nutrientes e oxigênio mesmo nas áreas mais profundas (DONLAN,
2002).
É possível descrever algumas diferenças básicas entre bactérias em estado de vida
livre e vivendo em forma de biofilme. Estas diferenças estão listadas na tabela 3.
Tabela 3 – Diferenças básicas entre bactérias em forma de vida livre e vivendo em biofilmes
Bactérias Planctônicas Bactérias em biofilmes
Células isoladas e em suspensão Células formando agregados, aderidas umas
às outras e a um substrato
Ligeira matriz capsular Embebidas em uma matriz de
exopolissacarídeos (EPS)
Fisiologicamente homogêneas e ativas Fisiologicamente heterogêneas
Sinalização intracelular, não essencial
para divisão celular
Sinalização celular fundamental para o
crescimento e desenvolvimento de uma
arquitetura organizada
Células ativas fisiologicamente
suscetíveis aos antimicrobianos
Extremamente mais resistente a drogas
antimicrobianas
Células individuais reconhecidas e bem
orientadas pela resposta imune do
hospedeiro
Células embebidas na matriz de EPS são
inacessíveis para a resposta do hospedeiro e
resistentes às drogas antimicrobianas (Adaptado de Behlau & Gilmore, 2010)
1.4.1.1- A formação do biofilme
A formação do biofilme é uma estratégia de sobrevivência de micro-organismos em
um ambiente com condições adversas o que provoca uma alteração fenotípica de células de
vida livre para a forma séssil. Células crescidas em biofilme expressam propriedades
distintas das células planctônicas, uma das quais é o aumento na resistência aos biocidas e
agentes antimicrobianos (MOSTELLER & BISHOP, 1993; CABEÇA, 2006). Os biofilmes
9
têm se revelado como estruturas dinâmicas e altamente organizadas, compostas por
unidades estruturais e funcionais básicas, as microcolônias, que podem variar desde uma
camada única a uma espessa comunidade de células rodeadas por uma matriz heterogênea
de EPS (COSTERTON, 1995). Essa matriz de EPS é fundamental para a arquitetura e
estabilidade estrutural do biofilme, proporcionando maior durabilidade e proteção ao
biofilme. A quantidade de EPS produzida pode variar de um micro-organismo para o outro
e tende a aumentar com a maturidade do biofilme. Costerton et al., 2003, constatou em sua
primeira observação direta envolvendo biofilmes microbianos, que essas populações
aderentes geralmente continham muito mais células do que as populações planctônicas do
ecossistema que estava sendo estudado.
Existem várias teorias propostas para formação de biofilmes. A primeira teoria foi
descrita por MARSHALL et al., 1971, que relata ser um processo que inicia com a adesão
que ocorre em duas fases: na primeira o processo é ainda reversível, em função da adesão
do micro-organismo a superfície ocorrer por forças de Van der Walls e atração eletrostática.
Na segunda fase, ocorre a interação física da célula com a superfície por meio de material
extracelular de natureza polissacarídica ou proteica, produzida pela bactéria, que é
denominada de glicocálix, que suporta a formação de biofilmes (MELO, 2008). Outra
teoria sugere que a formação de biofilmes depende de uma série coordenada de eventos
moleculares, que podem ser colocadas resumidamente em cinco etapas: I)
condicionamento da superfície pela adsorção de material orgânico; II) transporte de células
e nutrientes para o sítio de aderência; III) inicia-se o processo de adesão bacteriana, ainda
reversível, por atração eletrostática; IV) crescimento celular, adesão irreversível e
formação de microcolônias; V) o biofilme está maduro e apresenta alta atividade
metabólica com liberação de células localizadas na periferia (Figura 1) (RICKARD et al.
2002).
10
Figura 1- Etapas de formação do biofilme
(Adaptado de Rickard et al., 2003)
Inicialmente ocorre a fixação microbiana à superfície, na qual os organismos
denominados colonizadores primários aderem a um substrato, que pode ser biótico ou
abiótico, sendo esta fixação denominada como ligação reversível, e ocorre em função das
forças de “Van der Walls” e da ação eletrostática. Nesta fase bactérias apresentam
comportamentos característicos de cada espécie, que incluem rolamento (rolling),
deslizamento (gliding), entre outros antes de se estabelecer num local e começarem a
iniciar o processo de adesão irreversível. Posteriormente ocorre a interação física das
células aderidas com a superfície, onde as células passam a proliferar e desenvolver-se,
originando microcolônias que autossintetizam uma matriz exopolissacarídica (EPS) de
natureza polissacarídica ou proteica, resultando em ligações irreversíveis. Essas matrizes
passam a atuar como substratos para a aderência de micro-organismos denominados
colonizadores secundários, que podem se aderir diretamente aos primários formando os
agregados e levando à maturação do biofilme. Dessa forma, a adesão é uma importante
etapa neste processo descrito por (MARSHAL et al., 1971), pois o glicocálix é produzido
após o processo de adesão superficial. A quantidade de EPS produzido varia de acordo
com o micro-organismo e aumenta com o tempo de formação, podendo associar-se a íons
metálicos, cátions bivalentes e outras macromoléculas (DNA, lipídeos, etc.) (RICKARD et
al., 2003).
11
A formação da matriz de polímeros extracelulares de natureza polissacarídica ou
proteica, também conhecida como glicocálix, que se expõe exteriormente à membrana
externa das células Gram-negativas é fundamental e funciona como base para formação do
biofilme. O pili e flagelos, além de promoverem a adesão à superfície, permitem a
formação e a ampliação das microcolônias, pois se movem longitudinalmente. A
motilidade flagelar favorece a interação inicial da bactéria com a superfície, permitindo
que a bactéria vença as forças de repulsão, aumentando assim a probabilidade de
abordagem de fixação na superfície (WILLIAMS & FLETCHER et al., 1996). No quarto
estágio, ocorre a maturação da arquitetura do biofilme, com a formação de canais de água
que dividem a comunidade microbiana, através dos quais ocorre a comunicação inter e
intracelular (DONLAN, 2002).
Estudos com Vibrio cholerae e Escherichia coli indicaram que a produção de EPS é
essencial para o desenvolvimento de biofilme porque estabiliza a sua arquitetura
tridimensional, favorecendo sua maturação. Em caso de mudanças ambientais, a
sobrevivência em forma de biofilme pode dificultar sua adaptação e assim, a bactéria deve
ser capaz de detectar e responder às condições ambientais desfavoráveis, retornando ao
modo planctônico da existência. Esta última etapa é conhecida como dispersão ou
desadesão do biofilme e parece ser um processo altamente regulado, embora, pouco se
conheça sobre seus mecanismos que incluem: i) síntese de enzimas que degradam adesinas
e o EPS; ii) retorno a motilidade; iii) produção de substâncias surfactantes e lise celular,
além de poder ser causado for força física de organismos ou objetos exteriores. O
desprendimento de células bacterianas do biofilme é de fundamental importância, é uma
maneira de perpetuar a espécie e de colonizar novos ambientes. É possível identificar três
tipos de diferentes de estratégias de dispersão de um biofilme: i) dispersão de células que
vão sendo libertadas, individualmente, das microcolônias; ii) os agregados de células são
espalhados em forma de massa compacta; iii) dispersão de superfície, sob a qual as células
do biofilme vão se movendo superficialmente. O processo de maturação do biofilme pode
durar de 3 a 6 dias (HALL-STOODLEY et al., 2004).
12
1.4.1.2 - Fatores que influenciam na formação de biofilmes
Cada biofilme é considerado único, pois a formação e composição de sua estrutura
são influenciadas por diversos fatores. A formação de um biofilme é guiada por numerosos
sinais ambientais, que em sua maioria ainda não foram identificados. As bactérias podem
responder de várias formas às condições ambientais. Algumas respondem com a formação
de biofilme de acordo com o tipo e a quantidade de nutrientes disponíveis no ambiente,
formando biofilme de múltiplas camadas, como por exemplo, a Salmonella enterica
sorovar e Typhimurium, que respondem dessa forma quando há limitação de nutrientes
(GERSTEL & ROMLING, 2001). Os principais fatores que influenciam na formação de
biofilmes são: as propriedades do substrato e da interface onde ocorrerá a adesão
(hidrofobicidade, rugosidade e propriedades eletroquímicas: pH, osmolaridade,
concentração de eletrólitos, temperatura); a hidrodinâmica do local ou tensão de corte
(tensão dos meios que fluem rapidamente), quando o ambiente for de baixa tensão de corte,
os biofilmes apresentam uma baixa resistência à tração e quebram facilmente. No entanto,
quando são formados em ambientes de elevada tensão de corte, os biofilmes apresentam-se
bastante fortes e resistentes a quebras mecânicas, ou seja, ao atrito; a diversidade ecológica
da comunidade microbiana pode favorecer a resistência a antimicrobianos por mutação
espontânea ou através da aquisição de informação genética de outras bactérias,
influenciando assim a formação do biofilme (apud Stoodley et al., 1997).
O chamado Quorum Sensing (QS), mecanismo de sinalização celular que atua
através de um sistema de comunicação célula-célula entre bactérias de um biofilme através
de sinais químicos e que depende da densidade celular, também é um fator importante na
formação de biofilmes. Através deste mecanismo que as bactérias regulam expressão de
conjuntos de genes especializados em resposta a densidade celular, muitos destes genes
associados à formação de biofilmes e produção de fatores de virulência (SIMÕES et al.,
2010).
A formação de biofilmes tem sido considerada uma resposta ao mecanismo de QS.
13
Uma série de outras atividades microbianas importantes estão também associadas e este
mecanismo, incluindo: biossíntese de enzimas extracelulares, biossíntese de
antimicrobianos, produção de biossurfactantes, transferência de plasmídeos por meio de
conjugação, síntese de EPS e fatores de virulência extracelulares em bactérias Gram-
negativas como a B. cenocepacia (SIMÕES, SIMÕES & VIEIRA, 2010).
1.4.1.3 - Papel dos biofilmes na patogênese das infecções
Os biofilmes desempenham um papel fundamental em determinados processos
biotecnológicos como na biodegradação de poluentes ambientais ou no equilíbrio
microbiano dentro de um organismo. No entanto, na maioria das vezes os biofilmes não
são desejados e causam sérios problemas em diversas áreas, que incluem setores industriais
e médicos, podendo levar ao aumento dos custos de produção e manutenção, assim como à
saúde pública e aos impactos e preocupações ambientais (FERREIRA et al., 2010).
A formação de biofilmes está associada à cronicidade das infecções e a sua inerente
resistência a ações terapêuticas de erradicação que levam extensos períodos de tratamento
e não garantem sua total erradicação; além da sua difícil detecção em diagnósticos de
rotina. Sendo assim, os biofilmes apresentam papel significativo no aparecimento de
doenças infecciosas (DONLAN, 2002).
Estudos estimam que cerca de 65% das infecções bacterianas (tabela 4)
desenvolvidas em humanos pressuponham a formação de biofilmes, daí a grande
importância em se estudar esse tipo de organização celular.
14
Tabela 4 – Lista de algumas infecções humanas que envolvem biofilmes
Doença/Infecção Espécies bacterianas envolvidas
Cáries dentárias Cocos Gram-positivos acidogênicos,
Streptococcus sp.
Periodontite Bactérias orais anaeróbicas Gram-negativas
Otite média Haemophilus influenzae
Amigdalite crônica Várias espécies
Pneumonia/Fibrose Cística Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia
cepacia
Endocardite Streptococcus grupo Viridans, Staphylococcus
Fascite necrosante Streptococcus grupo A
Infecções musculoesqueléticas Cocos Gram-positivos
Osteomielite Várias espécies
Infecções do trato biliar Bactérias entéricas
Pedra nos rins infecciosa Bacilos Gram-negativos
Prostatite bacteriana E. coli e outras Gram-negativas
(Adaptado de FUX et al., 2005)
Biofilmes possuem um potencial patológico associado a infecções oportunistas,
principalmente em pacientes fibrocísticos. Cepas do CBc possuem a capacidade de formar
biofilmes, o que pode favorecer a persistência das infecções, visto que o biofilme impede o
acesso dos antimicrobianos à superfície da célula bacteriana (CUNHA, 2004).
Diversos pesquisadores propuseram hipóteses para explicar a resistência a
antimicrobianos, que incluem permeabilidade seletiva na parede celular, alteração de alvos
intracelulares das drogas, degradação enzimática ou inativação de drogas ou o efluxo ativo
de antibióticos. Costerton et al., (1999) e Prakash et al., (2003) sugeriram os seguintes
mecanismos: o primeiro sugere que esta resistência se deve à presença de EPS, constituinte
15
da matriz exopolissacarídica do biofilme, pode atuar como uma barreira física/química
retardando a difusão do antibiótico e diminuindo a taxa de difusão de outros solutos,
suficientes para induzir a expressão de genes dentro do biofilme que medeiam a
resistência.
As bactérias do CBc são resistentes aos aminoglicosídeos, quinolonas, polimixinas,
devido ao incomum componente lipopolissacarídeo de suas membranas celulares e a β-
lactâmicos devido à produção de betalactamases. Estes componentes são produzidos em
resposta à exposição a antibióticos, podendo levar a ligação e/ou desativação de moléculas
de antibióticos que estão tentando alcançar as células que compõem o biofilme. O
tratamento de indivíduos com infecções por bactérias do CBc geralmente incluem a
combinação de dois ou três antibióticos com atividade sinérgica como β-lactâmico
(meropenem ou ceftazidima), a ciprofloxacilina, a tobramicina, o cloranfenicol, a
minociclina ou a rifampicina. Contudo, estas combinações não levam a erradicação total do
micro-organismo (LACY et al., 1993).
Uma segunda hipótese gira em torno do fato de algumas células do biofilme
sofrerem um período de limitação de nutrientes levando a um crescimento lento ou mesmo
estagnação, a chamada fase estacionária que se assemelha a dormência, podendo contribuir
para a expressão da resistência generalizada ou tolerância a antibióticos (COSTERTON et
al., 1999). Outra hipótese sugere que o agente antimicrobiano é desativado por oxidantes
reativos nas camadas mais externas do biofilme, mais rapidamente do que se difunde
(PRAKASH et al., 2003).
Os biofilmes podem proporcionar um ambiente ideal para a troca de DNA
extracromossômico responsável pela resistência aos antibióticos, fatores de virulência e
capacidade de sobrevivência ambiental, tornando assim um meio perfeito para a resistência
(KARATAN, 2009)
16
1.5 - Fibrose Cística
A fibrose cística é uma doença hereditária autossômica recessiva, cujo gene está
localizado no braço longo do cromossomo 7, no lócus q31. Este gene é formado por 250kb
de ácido desoxirribonucleico (DNA), com 27 éxons e tem a propriedade de codificar um
ácido ribonucleico mensageiro (RNAm) de 6,5Kb que transcreve uma proteína
transmembrana, reguladora de transporte iônico, composta de 1.480 aminoácidos,
conhecida como cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), também
chamada de canal de cloro. Esta proteína é sintetizada no núcleo, sofre maturação em
organelas citoplasmáticas (fosforização e glicosilação), localizando-se na membrana apical
das células. A CFTR é essencial para o transporte de íons pela membrana celular, estando
envolvida na regulação do fluxo de cloro, sódio e água (Figura 2). Esta doença pode ser
detectada no teste do pezinho logo ao nascimento do bebê (RIBEIRO, RIBEIRO &
RIBEIRO, 2005).
Figura 2- Estrutura da CFTR (canal de cloro) que pode estar ausente, deficiente ou em menor quantidade nas
células de vários órgãos do corpo humano
(Adaptado de Ribeiro, Ribeiro & Ribeiro, 2005)
A FC foi descrita por Andersen em 1938 como “fibrose cística do pâncreas” e o
prognóstico da doença era fatal nos primeiros anos de vida. Ao longo dos anos, o avanço
17
no conhecimento sobre a fisiopatologia da doença tornou cada vez maior a sobrevivência
dos pacientes e dados do registro norte-americano mostram que a idade mediana de
sobrevida é de 36,5 anos atualmente (DALCIN & ABREU E SILVA, 2008).
As mutações no gene da fibrose cística, causadas pela presença de dois alelos,
provocam ausência de atividade ou funcionamento parcial da CFTR, provocando uma
redução na excreção de cloro, aumentando dessa forma a eletronegatividade intracelular,
resultando em maior fluxo de entrada de sódio para preservar o equilíbrio eletroquímico e
secundariamente de água para dentro da célula por ação osmótica. As mutações I, II e III
conferem formas clínicas mais graves e as mutações IV e V conferem manifestações
clínicas mais leves. Nas vias aéreas ocorrem alterações no líquido de superfície com
desidratação das secreções mucosas e aumento da viscosidade, favorecendo a obstrução
ductular, que se acompanha de reação inflamatória e posterior processo de fibrose
(KNOWLES et al., 1986). E como ela é uma doença multissistêmica, vai causar danos no
trato respiratório, mas também em órgãos como pâncreas, intestinos, fígado e sistema
reprodutor (Figura 3).
Figura 3- Fisiopatogenia da fibrose cística
(Adaptado de Ribeiro, Ribeiro, Ribeiro, 2005)
18
Mais de mil mutações já foram descritas no gene da fibrose cística, porém a mais
frequente delas (ΔF508) ocorre devido a uma deleção de três pares de bases, que acarreta
na perda de um aminoácido chamado fenilalanina, na posição 508 da proteína CFTR, o que
impedirá seu funcionamento adequado. Aproximadamente 70% dos cromossomos de
fibrose cística, no norte da Europa, têm a mutação ΔF508, cuja incidência diminui para o
centro e sul da Europa (RIBEIRO et al., 2005)
A incidência da fibrose cística é variável de acordo com as etnias, oscilando de 1
fibrocístico para cada 2.000 a 5.000 caucasianos nascidos vivos na Europa, Estados Unidos
e Canadá; 1 para cada 15.000 negros americanos, e 1 para 40.000 na Finlândia
(LASSERSON, 2002). No Brasil, a incidência da FC varia entre as diferentes regiões
devido à heterogeneidade da população. No Rio Grande do Sul, a estimativa da incidência
da FC é de 1 em 1.587 indivíduos, sendo semelhante à encontrada no sul da Europa
(RASKIN et al., 2008).
Atualmente não existe um tratamento específico para a alteração genética que causa
a fibrose cística. Apesar dos avanços no conhecimento da doença, o tratamento definitivo
ainda é uma perspectiva para o futuro. Por enquanto tenta-se minimizar as consequências
da ausência ou defeito da proteína CFTR (canal de cloro). Como a fibrose cística acomete
vários órgãos e apresenta curso crônico, o tratamento deve ser realizado em centros de
referência que permitam abordagem multidisciplinar (RIBEIRO et al., 2005)
Os objetivos básicos do tratamento consistem em: prevenir a infecção pulmonar por
maior tempo possível, minimizar o declínio da função pulmonar e manter bom estado
nutricional. Nos centros especializados, pacientes que mantenham boa frequência durante o
tratamento, apresentam sobrevida média que vem aumentando ao longo dos anos, passando
de 2 anos em 1950 para 30 a 40 anos atualmente. Deve-se estabelecer um programa de
tratamento vigoroso e contínuo, visando à profilaxia das infecções e das complicações.
Segundo estudos, é necessário utilizar no mínimo um conjunto de 2 antibióticos para
combater a infecção, e isso se deve a grande resistência a antimicrobianos. O tratamento
deve ser iniciado o mais precoce possível e ser individualizado, levando-se em conta a
gravidade e os órgãos acometidos. O início precoce retarda a progressão das lesões
pulmonares, melhora o prognóstico e aumenta a sobrevida do paciente (CYSTIC
19
FIBROSIS FOUNDATION, 1997).
1.6 - A Fibrose Cística e B. cepacia
A infecção por Burkholderia cepacia em pacientes fibrocísticos está associada com
doença pulmonar avançada e uma síndrome clínica denominada “síndrome cepacia”, que é
caracterizada por uma pneumonia necrosante e sepse. A infecção inicia com a colonização
do trato respiratório superior, que evolui para o trato inferior, onde ocorrem alterações no
líquido de superfície com desidratação das secreções mucosas e aumento da viscosidade,
favorecendo a obstrução ductular, que é acompanhada de reação inflamatória e posterior
processo de fibrose. Quadro clínico que leva a uma falência aguda da função pulmonar,
apresentando uma pneumonia fulminante em aproximadamente 20% dos pacientes com
fibrose cística. Nessa condição, outros organismos invadem sistemicamente o indivíduo,
causando choque endotóxico, insuficiência de múltiplos órgãos e em muitos casos, morte
(CUNHA et al., 2004).
Estudos epidemiológicos demonstram que a transmissão dos micro-organismos do
CBc ocorre por contato social, podendo acontecer de pacientes hospitalizados sem fibrose
cística abrigarem o micro-organismo e ser uma ameaça de infecção para pacientes
vulneráveis com fibrose cística. Também foi demonstrado que cepas virulentas e muito
transmissivas de Burkholderia cenocepacia podem substituir outras variantes genômicas
durante a infecção, como a Burkholderia multivorans, sugerindo a importância do
isolamento dos pacientes infectados (COURTNEY et al., 2004).
A realização de exame bacteriológico do material respiratório de indivíduos com
Fibrose Cística é extremamente relevante como apoio no diagnóstico e tratamento da
doença infecciosa dos pacientes fibrocísticos. Os micro-organismos que infectam o
paciente fibrocístico irão determinar o tratamento, a qualidade de vida, as perspectivas para
o transplante e a sua sobrevida global. A exata identificação de patógenos respiratórios é
essencial para o tratamento da infecção, seja como guia para o uso adequado de
antibióticos por longos períodos para os pacientes com infecção bacteriana crônica, bem
como para a aplicação adequada de medidas de controle de infecção (LUTZ et al., 2011).
20
Micro-organismos do CBc são nutricionalmente muito versáteis, o que proporciona
a estas bactérias uma variedade de ambientes para sua proliferação. Devido a esta
versatilidade e pela sua resistência à ação de alguns antissépticos e desinfetantes, espécies
de Burkholderia tem sido implicadas em surtos resultantes de contaminação em géis de
ultrassom, hidratantes e antissépticos bucais. Todas as espécies do CBc podem ser isoladas
como patógenos em seres humanos ou simplesmente isoladas no meio ambiente sem
estarem envolvidas em infecções e algumas são transmissíveis entre pacientes com FC,
sendo capazes de causar surtos epidêmicos. As espécies B. cenocepacia e B. multivorans
predominam entre pacientes com FC. Estas duas espécies em conjunto representam
aproximadamente 85-97% de todas as infecções por CBc na FC. Por isso, a partir de 1990
a maioria dos estudos se focaram na B. cenocepacia. Uma das cepas mais estudadas e
descrita como altamente transmissível é conhecida como ET-12, é uma genovariante IIIA
que causou infecções devastadoras no Canadá, Reino Unido e populações europeias de
pacientes com FC (LUTZ et al., 2011).
2. JUSTIFICATIVA
Estudos sugerem que portadores de fibrose cística possuem concentrações de Na+
e
Cl- aumentadas em suas secreções, favorecendo a colonização de B. cenocepacia nas vias
áreas (TOMICH & MOHR, 2004).
Estudos realizados em nosso laboratório (dados ainda não publicados) a fim de
avaliar o papel do aumento das concentrações de Na+ e Cl
- no crescimento de Burkholderia
cenocepacia, demonstraram que o cultivo da cepa ET-12 em meio LB suplementado com
0,3M de NaCl a 37ºC induziu o aumento no índice de formação de biofilme em 408.9%
136.5 com características de um biofilme maduro (denso e estratificado) em apenas 24
horas de cultivo .
Estes achados nos motivaram a realizar o presente estudo com outras cepas do
subgrupo IIIA, conhecido por ser o subgrupo frequentemente associado à presença de
marcadores de virulência como B. cepacia epidemic Marker (BCESM) e B. cenocepacia
island (CCI) (BALDWIN et al., 2004). Por isso, investigamos o papel dos altos níveis de
21
Na+ e Cl
- na formação de biofilme por cepas clínicas de B. cenocepacia, para determinar se
este é um fator de virulência característico da espécie, pois cepas CBc de uma mesma
espécie podem apresentar comportamentos distintos. Além disso, o fato da adesão ser um
fator importante na etapa inicial da formação de biofilme nos levou a investigar a
expressão da adesina “cable pilus” por B. cenocepacia.
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Avaliar o papel de diferentes concentrações de Na+ e Cl
- na modulação de fatores
de virulência pelo clone epidêmico ET-12 e quatro isolados clínicos de Burkholderia
cenocepacia.
3.2 Específicos
3.2.1 Avaliar a formação de biofilme por diferentes cepas clínicas de
Burkholderia cenocepacia cultivadas em meio suplementado com 0,1M e 0,3M de NaCl.
3.2.2 Avaliar a modulação das altas concentrações de Na+ e Cl
- na expressão
de “cable pilus” pelo clone epidêmico ET-12 e as diferentes cepas clínicas em estudo.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Amostras Bacterianas
Na realização dos nossos experimentos foi utilizada a cepa ET-12 de B.
cenocepacia (amostra J2315), gentilmente cedida pelo Dr. Mustapha Si-Tahar (Unité de
22
Defense Inée et Inflamation, Instituto Pasteur, Paris França), e quatro isolados clínicos de
B. cenocepacia procedentes de pacientes com FC atendidos no Hospital Universitário
Pedro Ernesto (HUPE) e no Instituto Fernandes Figueira (IFF-Fiocruz) com evolução
clínica diferente da síndrome cepacia, gentilmente fornecidas pela Dr. Elizabeth de
Andrade Marques (Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da UERJ).
4.2 - Determinação do índice de formação de biofilme
A formação de biofilme foi determinada pelo método descrito por O’Toole and
Kolter (1998). As cepas clínicas (1664, 2627, 1652 e 1634) foram cultivadas em meio
caldo Luria Bertanni (LB) na ausência e na presença de diferentes concentrações de NaCl
(0,1M e 0,3M) a 30ºC sob agitação de 150rpm por um período de 16 a 18 horas no
equipamento Shaker orbital - Nova Ética. Após este tempo, foi feita uma centrifugação das
culturas a 2608g (centrífuga Eppendorf) por 10 minutos para obtenção do “pellet” e
preparo das suspensões bacterianas. As culturas foram diluídas em meio LB suplementado
e não suplentado com 0,1M e 0,3M de NaCl, até a obtenção de suspensões bacterianas com
DO680nm=0.2. Quando então, 200µl destas suspensões foram inoculadas em uma placa de
96 poços. Controles negativos foram realizados, colocando apenas 200µl de meio estéril na
ausência de NaCl. A placa foi cultivada a 37ºC por 24 horas. O crescimento bacteriano foi
determinado pela absorbância dos poços a 540nm no espectrofotômetro de placa
(Termoplate). Para a quantificação do biofilme, o meio de cultura e as bactérias não
aderidas foram removidos por duas lavagens com 200µl de Tampão fosfato-salino (PBS)
0,1M (pH 7,2). As bactérias aderidas foram coradas com 200µl de cristal violeta a 0,2%
por 10 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, as culturas foram lavadas com 200µl
água destilada e o corante associado às bactérias aderidas, foi solubilizado com 200µl de
uma solução de álcool e acetona na proporção 4:1. Foram transferidos 100µl de cada poço
para uma nova placa e as absorbâncias foram determinadas a 540nm. O índice de formação
de biofilme foi determinado pela fórmula (0,2/OD crescimento) x OD cristal violeta, pois a
taxa de crescimento das culturas será menor na presença de NaCl (O’TOOLE & KOLTER,
23
1998).
4.3 - Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) da arquitetura
do biofilme formado pelas diferentes cepas de B. cenocepacia.
A análise da arquitetura dos biofilmes formados foi realizada por microscopia
eletrônica de varredura. Suspensões bacterianas das cepas em estudo foram preparadas em
meio LB suplementado ou não por 0,1M e 0,3M de NaCl de modo a obter uma
DO680nm=0.2. Quando então, 200µl desta suspensão foi inoculada em uma placa de 96
poços. As amostras foram cultivadas por 24 horas a 37ºC e estes poços foram recobertos
por uma tampa contendo espículas de poliestireno (pegs lids-TSP Nunc). Após o período
de incubação, as espículas contendo o crescimento bacteriano foram submetidas ao
tratamento segundo Marques et al., 2007 para posterior análise por MEV. Este tratamento
consiste de uma etapa inicial de fixação com uma solução de Karnovsky (paraformaldeído
a 4%, glutaraldeído a 25% em 0,1M de tampão cacodilato (CACO), em seguida as
espículas foram lavadas por duas vezes com 200µl de PBS 0,1M (pH 7.2) por 10 minutos.
As espículas foram então pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio a 1% por 40
minutos. Na etapa seguinte foi realizada a desidratação, que iniciou com duas lavagens
com PBS 0,1M (pH7.2) por 10 minutos, depois as espículas foram colocadas em 200µl de
diferentes concentrações de álcool etílico (40%, 50%, 70%, 90%, 100%) por 12 minutos
para cada concentração. Após a desidratação, as espículas foram submetidas a uma
secagem ao ponto crítico com CO2 por um período de aproximadamente 3 horas, seguindo-
se da etapa de metalização no qual as espículas foram banhadas com precipitado de ouro e
em seguida foi feita a análise no M.E.V. modelo Jeol 6490 LV, através de detector para
elétron secundário.
4.4 - Análise da presença do gene “cable pilus” por PCR
A adesão às superfícies é um processo importante na formação do biofilme. A
adesina “cable pilus” parece ter importante papel na adesão às superfícies pela cepa ET-12
24
de B.cenocepacia. Nesta etapa do trabalho, investigamos se os isolados clínicos também
apresentam o gene cblA. Para isso, os quatro isolados clínicos de B. cenocepacia (1664,
1634, 1652 e 2627) e o clone epidêmico ET-12, foram cultivadas em caldo LB por 16 a 18
horas sob agitação de 150 rpm e temperatura de 30ºC. Com alças descartáveis estéreis,
uma placa de Petri com meio CLED foi semeada, por esgotamento, para cada uma das
cepas para obtenção de colônias isoladas, e foram incubadas a 37ºC. Recolheu-se cerca de
duas colônias isoladas de cada placa e inoculou-se em um novo tubo contendo caldo LB.
Estes tubos foram incubados a 30ºC a 150rpm no Shaker Orbital por 16 a 18 horas.
Após esta etapa, realizamos uma lise térmica para recuperação do DNA bacteriano.
Para tal, preparamos suspensões bacterianas diluídas em água ultrapura MilliQ (1/10),
cujas densidades óticas foram determinadas a 590nm. As massas bacterianas foram
padronizadas e as suspensões foram transferidas para um microtubo estéril. As culturas
foram centrifugadas a 20.817g por 2 minutos e os sobrenadantes descartados. Os “pellets”
foram congelados à -20ºC por 15 minutos, quando então foram acrescentados ao “pellet”
congelado 90µl de água ultrapura MilliQ estéril, em seguida foram fervidos por 10 minutos
e centrifugados novamente a 20.817g por 10 segundos.
Foram utilizadas para a reação de PCR as seguintes sequências do primer cbl:
Foward - cbl1 5’ –AATGGCAGATGTGCAGCAG– 3’ / Reverse - cbl2 5’ –
CGCGATGTCCATCACATAC– 3’ (TOMICH & MOHR, 2003). Para a reação foi
preparado um MIX com os seguintes reagentes: água ultrapura MilliQ – 15,75µl; 10X Taq
Buffer NH4SO4 - 2,5µl; 25mM MgCl2 - 2,0µl; Primer Foward 10pmol/µl – 0,5µl; Primer
Reverse 10pmol/µl - 0,5µl; dNTP mix a 10mM – 0.5µl; Taq DNA polimerase 5U/µl-
0,25µl. Para cada cepa foi utilizado um microtubo com 22 µl do Mix e 3µl do DNA, um
microtubo para o controle negativo e outro para o marcador de peso molecular. A reação de
PCR foi realizada no termociclador (Eppendorf Mastercycler Personal) com o seguinte
protocolo de amplificação do DNA: desnaturação inicial – 95ºC por 2 minutos;
desnaturação – 95ºC por 45 segundos; anelamento – 53ºC por 45 segundos; extensão –
72ºC por 1 minuto; extensão final – 72ºC por 5 minutos; total de 35 ciclos. Em seguida, foi
preparado gel de agarose a 1%, no qual foi utilizado 0,5g de agarose em 50 ml de TBE 1%
e foi acrescentado ao gel 3µl do SYBR Safe DNA gel stain 10.000X (Invitrogen). O
25
marcador de peso de molecular foi preparado utilizando-se 10µl do Marcador de peso
molecular 1Kb plus DNA ladder (Invitrogen) e 2µl do Tampão de amostra (TBE 1X,
Glicerol 50%, Azul de Bromofenol 0,1%, água deionizada). Foram aplicados 4µl do
amplicon de cada amostra no gel; no poço correspondente ao marcador de peso molecular
foi aplicado 2µl do MPM e no controle negativo 3µl de água ultrapura MilliQ. A
eletroforese foi realizada à 100V por 50 minutos.
O gel foi observado em uma câmara com luz ultravioleta e as imagens das bandas
foram adquiridas pelo sistema foto-documentação 1D Image Analysis software, versão
2.0.3 (KD, Kodak Digital Science).
4.5 - Análise da expressão do gene cblA por RT-PCR pelas cepas clínicas e pelo
clone epidêmico ET-12 de B. cenocepacia cultivadas em meio suplementado ou não
com 0,1M e 0,3M de NaCl
Este estudo foi realizado apenas com as cepas 1664 e ET-12, pois foram as únicas a
apresentar o gene cblA. Para tal, as cepas foram cultivadas em caldo LB na ausência e na
presença de 0,1M e 0,3M de NaCl, por 16 a 18 horas sob agitação de 150 rpm e
temperatura de 30ºC. Decorrido este tempo, os tubos contendo as culturas foram
centrifugados a 2608g (centrífuga Eppendorf) por 10 minutos para obtenção do “pellet”
bacteriano. O sobrenadante foi desprezado e a partir deste “pellet” obtido foram feitos 3ml
de suspensões bacterianas com D.O680nm=0,8. Os tubos com as suspensões foram
novamente centrifugados por 10 minutos e 2608g. O sobrenadante foi desprezado e o
“pellet” foi ressuspenso em 100µL de TE Buffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0)
contendo 0,2mg/ml de lisozima. Foi misturado vigorosamente, seguido de uma incubação
por 10 minutos a 37º C em banho-maria (Nova Ética). Em seguida, foi feita a extração dos
RNAs mensageiros totais conforme descrito pelo fabricante do Kit GE Healthcare illustra
RNAspin Mini. Alíquotas de 3l e 97l foram conservadas em microtubos sob temperatura
de -70ºC até a realização dos ensaios de conversão a cDNA e PCR.
Para a determinação da concentração de RNA total extraído, amostras de 3µL do
RNA total foram utilizadas para quantificação no equipamento NanoVue em triplicata e os
26
resultados expressos em µg/µL. A partir da menor concentração, foi determinada a diluição
a ser utilizada na síntese de cDNA.
A síntese de cDNA, empregando-se o kit SuperScript III First-Strand Synthesis
System for RT-PCR (Invitrogen). As amostras de RNA foram acrescidas de 1µL Ramdom
hexamers 50ng/µl e 1µL da mistura de desoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTP mix) a
10mM, incubadas no termociclador a 65°C, por 5 minutos e, então, mantidas em gelo por 1
minuto. Em seguida, as amostras foram acrescidas do Mix de síntese de cDNA preparado
na seguinte ordem: 2µl de tampão para a enzima RT Buffer 10X + 4µl MgCl2 a 25mM +
2µl dithiothreitol (DTT) a 0,1M + 1µl de inibidor de RNase a 40U/µl + 1µL da enzima
transcriptase reversa SuperScript III RT a 200U/µl; e e incubadas durante 10 minutos, a
25°C, seguido de 50 minutos a 50ºC. A reação foi finalizada por incubação a 85°C, por 5
minutos, e resfriada em gelo. Seguiu-se adição de 1µl de RNase H a 2U/µl e incubação por
20 minutos, a 37°C. Em seguida, as amostras de cDNA foram diluídas 1/50 e armazenadas
a -20ºC até serem usadas.
A expressão do gene cblA foi determinada por reação de RT-PCR onde 5 µL da
amostra foram utilizadas e a reação ocorreu conforme descrito no item 7.4.
Foi utilizado como gene controle de expressão constante o BCAL1861 (phaC) que
codifica a acetoacetil redutase -CoA (DREVINEK et al., 2008). Os “primes” utilizados
foram: phaC Foward 5' -AGA CGG CTT CAA GGT GGT- 3' e o phaC Reverse 5' -ACA
CGG TGT TGA CCG TCA- 3' (Invitrogen). A reação de PCR foi realizada segundo o
seguinte protocolo: desnaturação inicial – 95ºC por 2 minutos; desnaturação – 95ºC por 45
segundos; anelamento – 53ºC por 45 segundos; extensão – 72ºC por 45 segundos; extensão
final – 72ºC por 5 minutos; 30 ciclos. Aplicou-se no gel 14µl do amplicon de cada amostra,
que foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1% à 100V por 50 minutos.
O gel foi observado em uma câmara com luz ultravioleta e as imagens das bandas
foram adquiridas pelo sistema de foto-documentação 1D Image Analysis software, versão
2.0.3 (KD, Kodak Digital Science).
A quantificação da expressão do gene foi feita com auxílio do software LabImage e
expressa em unidades arbitrárias.
27
4.6 - Análise estatística
Para as análises estatísticas e construção dos gráficos foi utilizado o software
GraphPad Prism 5. Os resultados foram expressos como médias ± erros padrões (SEM) dos
valores obtidos. Diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas através da
análise de variância (ANOVA) seguida pelos testes de comparação de significância de
Bonferroni.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de altas concentrações de NaCl (0,1M
e 0,3M) na modulação de fatores de virulência por B. cenocepacia. Para tal, foram
utilizados quatro isolados clínicos de B. cenocepacia procedentes de pacientes com FC de
evolução benigna definida neste estudo como ausência de síndrome cepacia e os
resultados foram comparados com estudos anteriores de nosso grupo que utilizou a cepa
J2315 da linhagem ET-12 de B. cenocepacia, potencialmente virulenta descrita como
agente etiológico associado à síndrome cepacia.
5.1 – Determinação do índice de formação de biofilme pelas diferentes cepas
clínicas de B. cenocepacia cultivadas em meio LB suplementado ou não com 0,1M e
0,3M de NaCl a 37ºC por 24 horas
A capacidade de formação de biofilme foi determinada pelo método de coloração
com cristal violeta como descrito por O'Toole and Kolter (1998).
Os quatros isolados clínicos de B. cenocepacia utilizados neste estudo foram
1664, 1634, 1652 e 2627.
As diferentes cepas foram cultivadas em placa de 96 poços em meio LB
suplementado ou não com 0,1M e 0,3M de NaCl a 37⁰C por 24 horas. Os resultados
obtidos estão representados na Figura 6, e mostram diferenças na formação de biofilme
28
embora pertençam ao mesmo subgrupo. As cepas 1664 e 2627, quando cultivadas em meio
suplementado com 0,3M de NaCl apresentaram aumento significativo (p<0,05 e p<0,01,
respectivamente) no índice de formação de biofilme quando comparado ao índice obtido
em culturas não suplementadas, enquanto que em 1634, este índice não sofreu alterações
decorrentes dos diferentes tratamentos. Curiosamente, a cepa 1652 apresentou um índice
de formação de biofilme significativamente superior quando foi cultivada na ausência de
NaCl, sugerindo que o aumento das concentrações de NaCl levou a uma inibição na
formação de biofilme.
Figura 6 – Capacidade de formação de biofilme pelas diferentes cepas clínicas de B. cenocepacia, cultivadas
em meio LB suplementado ou não com 0.1M e 0.3M de NaCl. Os resultados representam médias ±erro da
média de nove experimentos realizados, em sua maioria, em octuplicata. **p<0,01 e *p<0,05 quando o
índice de formação de biofilme de cepas cultivadas em meio LB suplementado com NaCl foi comparado com
o índice de formação de cepas cultivadas na ausência de NaCl
Diferentes estudos sobre a influência da osmolaridade na regulação da formação do
biofilme, relataram que variações de osmolaridade podem induzir comportamentos
diferentes entre as espécies bacterianas. Em muitos casos, a osmolaridade inibe a formação
de biofilme, embora este efeito dependa do tipo de osmólito no meio ambiente. Por
exemplo, Pseudomonas fluorescens na formação do biofilme é inibida em ambientes de
alta osmolaridade pela adição de NaCl e/ou sacarose (O’TOOLE & KOLTER, 1998). Em
Salmonela typhimurium o crescimento em meio contendo altas concentrações de NaCl
29
suprime a transcrição do genes csgD, um regulador central de formação do biofilme
(ROMLING, 1998). Da mesma forma, quando a Escherichia coli é cultivada em meio
contendo 100mM de NaCl, a transcrição dos genes curli é reprimida pela transcrição do
fator CpxR (JUBELIN, 2005). Curiosamente, quando E. Coli é cultivada em 200mM de
NaCl ativa transcrição do operon PGA, que codifica proteínas necessárias para a síntese do
polímero que faz parte da estrutura do biofilme poli-N-acetilglicosamina (PNAG)
(GOLLER, 2006). Em diferentes condições ambientais, V. cholerae, uma bactéria
halofílica aquática, forma biofilme quando cultivada em alta osmolaridade (KARATAN,
DUNCAN & WATNICK, 2005). Portanto, o aumento da osmolaridade no meio pode
promover a formação do biofilme ou sua inibição.
Estes estudos corroboram com os nossos resultados que embora as diferentes cepas
pertençam a mesma genovariante apresentam comportamentos distintos quando cultivadas
em altas concentrações de NaCl.
Na etapa seguinte de nosso estudo avaliamos a arquitetura dos biofilmes formados
pelas diferentes cepas por microscopia eletrônica de varredura.
5.2 - Análise da arquitetura do biofilme formado pelas diferentes cepas de B.
cenocepacia por microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Uma mesma cepa bacteriana pode formar diferentes estruturas de biofilmes em
decorrência das diferentes condições ambientais (KARATAN & WATNICK, 2009).
A análise por MEV foi realizada a partir de culturas das diferentes cepas em meio
suplementado ou não com NaCl na superfície abiótica de espículas de poliestireno (TSP-
NUNC) (Figura 7). As imagens obtidas das diferentes cepas estão em acordo com os
resultados representados na figura 6. As cepas 1664 e 2627 quando cultivadas em meio
suplementado com 0,3M de NaCl apresentam um biofilme denso com espessa camada que
sugere ser decorrente de uma produção abundante de exopolissacarídeo.
A cepa 1652 apresentou a formação de diversos agregados caracterizando um
biofilme imaturo, no entanto, não observarmos diferenças no número de agregados ou de
tamanhos entre os tratamentos.
30
As imagens obtidas com a cepa 1634 demonstraram algumas bactérias isoladas
aderidas à superfície das espículas, não formando biofilme em nossas condições
experimentais.
Os isolados clínicos 1664 e 2627 não apresentaram biofilmes tão densos e com alto
grau de maturidade quanto os apresentados pelo clone epidêmico ET-12. Estes resultados
nos levam a sugerir que a estratificação observada nas estruturas formadas pela cepa ET-12
pode estar relacionada à maior produção de exopolissacarídeo (EPS) e/ou presença de
“cable pilus”. Estudos realizados por Cunha et al. (2004) reforçam esta hipótese; os
autores demonstraram a formação de biofilme na ausência de EPS, pois utilizaram cepas de
B. cepacia deficientes na produção de EPS, no entanto, os biofilmes formados eram
imaturos, pouco densos, basicamente apresentando uma estrutura primária.
A presença de adesinas assim como flagelos, podem favorecer a formação de um
biofilme maduro (KARATAN & WATNICK, 2009). O clone epidêmico ET-12 expressa a
adesina “cable pilus”, o que pode explicar a formação de biofilmes densos e estratificados.
Quanto às cepas clínicas, precisamos investigar a presença do gene “cable pilus”.
31
32
5.3 - Análise da presença do gene cblA por PCR
Entre as cepas clínicas testadas, a cepa 1664 foi a única a apresentar o gene cblA
que codifica a proteína “cable pilus”, como pode ser visto na figura 8. A cepa ET-12 foi
utilizada como controle positivo. Ambas apresentaram bandas em torno de 800pb. Para
avaliarmos se as condições de hiperosmolaridade induziram uma maior expressão do gene
cblA nas diferentes cepas, extraímos o RNA total das cepas nos diferentes tratamentos e
avaliamos sua expressão por RT-PCR.
Figura 8 - Presença do gene “cable pilus” por PCR. Coluna (1) Padrão de peso molecular; (2) Cepa 1634; (3)
Cepa 1652; (4) Cepa 1664; (5) Cepa 2627; (6) Cepa ET-12; (7) Controle negativo
800pb
33
5.4 - Análise da expressão do gene cblA por RT-PCR no clone epidêmico ET-12
e isolado clínico 1664 de B. cenocepacia
A cepa ET-12 apresentou aumento na expressão do gene cblA em 30% quando foi
cultivada em meio suplementado com 0,3M de NaCl a 37ºC por 24 horas (Figura 9 A e B).
A cepa 1664 embora apresentasse o gene cblA, este não foi expresso em nossas condições
experimentais.
ET.LB ET.0,1M ET.0,3M0
1
2
3
4
5
Cepa ET-12
Un
idad
es a
rbri
tári
as
Figura 9- (A) Perfil eletroforético em gel de agarose dos produtos amplificados obtidos a partir de
oligonucleotídeos específicos para amplificar o mRNA da cepa ET-12 de B. cenocepacia cultivadas em meio
suplementado ou não com NaCl a 37⁰C por 24 horas. (B) Gráfico representativo da normalização (cblA/
PhaC ) das densitometrias obtidas pelas bandas da figura A com resultados expressos em unidades arbitrárias
Em face aos resultados acima descritos podemos especular que a presença do
“cable pilus” pode ser um fator importante para a maturação do biofilme, mas não
determinante para sua formação, visto que as cepas 1664, 1652 e 2627 não expressam a
proteína “cable pilus” mas produzem biofilme. Em acordo com esta observação, estudos
A
B
400bp 400bp
800bp
34
realizados por Thomas et al., (2006) demonstraram que a motilidade da E. coli foi
importante para maturação e organização da arquitetura do biofilme mas não para sua
formação.
Outro fator importante na formação de biofilme a ser investigado seria a produção
de exopolissacarídeo.
A análise dos resultados mostrou uma heterogeneidade de respostas, embora todas
as cepas pertençam ao grupo ou genovariante IIIA, possuem diferenças de comportamento
.provavelmente,o, em decorrência da presença de múltiplos cromossomos e ampla variação
no tamanho do genoma que pode variar de 5 a 9Mb. Estas bactérias abrigam, ainda, um
extenso conjunto de sequências de inserção (elementos IS) que são capazes de promover
rearranjos gênicos e aumentar a expressão de genes vizinhos a eles (LESSIE et al., 1996).
Esses elementos contribuem significativamente para a plasticidade genômica dos membros
do Complexo B. cepacia
O aumento das concentrações dos íons Na+ e Cl
- nas secreções de FCs, que podem
variar de 150mM a 200mM, duas vezes maior que as encontradas nos fluidos de pulmões
de indivíduos sadios, leva ao aumento da osmolaridade deste microambiente, condição
descrita como favorecedora para o desenvolvimento e alterações na expressão de genes de
diferentes micro-organismos como bactérias do complexo Burkholderia cepacia (BHATT,
2008).
As secreções pulmonares com elevadas concentrações de NaCl em pacientes
fibrocísticos, poderia explicar a maior persistência e severidade das infecções por B.
cenocepacia, principalmente para infecções pela cepa J2315 da linhagem ET-12.
6. CONCLUSÕES
Verificamos que as cepas 1664 e 2627 cultivadas em meio suplementado com 0,3M
de NaCl, apresentaram um índice de formação de biofilme significativamente
superior às culturas não suplementadas;
A cepa 1634 em nossas condições experimentais não formou biofilme;
35
As cepas 1664 e 2627 em 0,3M de NaCl apresentaram formação de biofilme, mas o
biofilme formado não é tão denso e estratificado como da cepa ET-12;
As cepas 1664 e ET-12 possuem o gene cblA, porém a cepa 1664 não apresentou
níveis de mRNA nas condições experimentais analisadas.
7. PERSPECTIVAS
Quantificar a massa de exopolissacarídeos produzidos pelas cepas de B.
cenocepacia cultivadas em meio suplementado com 0,1M e 0,3M de NaCl, visto
que esta é responsável pela estrutura secundária do biofilme;
Avaliar a resistência das diferentes cepas de B. cenocepacia a antibióticos na
presença de altas concentrações de NaCl, determinando a Concentração Inibitória
Mínima (MIC) em cultivos planctônicos e a Concentração Inibitória em Biofilme
(BIC) em cultivos sésseis.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BALDWIN, A.; SOKOL, P.A.; PARKHILL, J.; MAHENTHIRALINGAM, E. The
Burkholderia cepacia Epidemic Strain Marker Is Part of a Novel Genomic Island Encoding
Both Virulence and Metabolism-Associated Genes in Burkholderia cenocepacia. Infect.
Immun. March 2004 vol. 72 No.3 1537-1547.
BEHLAU, I. AND GILMORE, M.S (2010). Microbial Biofilms in Ophthalmology and
Infectious Disease. Archives of Ophthalmology, 126 (11), pp. 1572-1581.
BERRIATUA, E.; ZILUAGA, I.; MIGUEL-VIRTO, C.; URIBARREN, P.; JUSTE, R.;
LAEVENS, S.; VANDAMME, P.; GOVAN, J. R. W. Outbreak of subclinical mastitis in a
flock of dairy sheep associated with Burkholderia cepacia Complex infection. Journal of
Clinical Microbiology, Washington, v. 39, n. 3, p. 990-994, Mar. 2001.
BHATT S., WEINGART CL. Identification of sodium chloride-regulated genes in
BOARI, C. A. Formação de biofilme em aço inoxidável por Aeromonas hydrophila e
Staphylococcus aureus sob diferentes condições de cultivo. 2008. 80 f. Tese (Doutorado
em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2008.
36
BRADORD MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of proteins utilizing the principle of protein- dye binding. Analytical
Biochemistry.2008; 56: 418-422.
CABEÇA, T. K. Suscetibilidade de microrganismos relacionados com a contaminação
de alimentos em biofilme artificial e em suspensão frente a desinfetantes. 2006. 105 f.
Dissertação (Mestrado em Análises Clínicas) – Faculdade de Farmácia, Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara, 2006.
CAMPANA S, TACCETTII G , TAVENNI N, FAVARI F, SCIACCA A, SAVOIA D, et al.
Transmission of Burkholderia cepacia complex: evidence for new epidemic clones
infecting cystic fibrosis patients in Italy. J Clin Microbiol. 2005;43(10):5136-42.
CARVALHO, V.J. O papel de altas concentrações de Na+ e Cl- na formação de
biofilme por Burkholderia cenocepacia. 2011. Trabalho de Conclusão de Curso. Centro
Universitário Estadual da Zona Oeste. Rio de Janeiro, 2011.
COSTA, D.P.; KUKLINSKY-SOBRAL, J.; FREIRE, F.J.; SILVA, M.O.; BARBOSA,
M.V.; SILVA, M.C.B.; ANDRADE, P.A.M. Isolamento e Potencial biotecnológico de
bactérias endofíticas de cana-de-açúcar. 2009
COSTERTON JW, LEWANDOWSKI Z, CALDWELL DE, KORBER DR,
LAPPINGSCOTT HM. Microbial biofilms. Annual Rev Microbiol, 1995; 49:711-745.
COSTERTON JW, VEEH R, SHIRTILIFF M, PASMORE M, POST C, EHRLICH G. The
application of biofilm science to the study of and control of chronic bacterial infections. J
Clin Invest, 2003; 112:1446-1477.
COURTNEY, J. M.; DUNBAR, K. E.; MCDOWELL, K.; MOORE, J. E.; WARK, T. J.;
STEVENSON, M.; ELBORN, J. S. Clinical outcome of Burkholderia cepacia Complex
infection in cystic fibrosis adults. Journal of Cystic Fibrosis, New York, v. 3, n. 2, p. 93-
98, June 2004.
CUNHA, M. V.; SOUSA, S. A.; LEITÃO, J. H.; MOREIRA, L. M.; VIDEIRA, P.A.; SA-
CORREIA, I. Studies on the involvement of the exopolysaccharide produced by cystic
fibrosis-associated isolates of the Burkholderia cepacia Complex in biofilm formation and
in persistent of respiratory infections. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.
42, n. 07, p. 3052-3058, July 2004.
CYSTIC FIBROSIS FOUNDATION. Clinical Practice Guidelines for Cystic Fibrosis.
Bethesda, MD: Cystic Fibrosis Foundation, 1997. p. 1-54.
37
DALCIN PTR AND ABREU E SILVA FA (2008) Fibrose cística no adulto: aspectos
diagnósticos e terapêuticos. J Bras Pneumol 34(2):107-117.
DAVIES, J. C.; RUBIN, B. K. Emerging and unusual gram-negative infections in cystic
fibrosis. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine, New York, v. 28, n. 3, p.
312-321, July 2007.
DONLAN, R. M. Biofilms: Microbial Life on Surfaces. Emerging Infectious Diseases,
vol.8, No 9, September 2002.
DONLAN, R.M.; COSTERTON, W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically
Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, apr. 2002, Vol. 15, No.2,
p.167-193.
DREVINEK P., HOLDEN MTG., GE Z., JONES AM., KETCHEL I., GILLRT.,
MATHENTHIRALINGAM E. Gene expression changes linked to antimicrobial resistance,
oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia
cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum. BMC Infectious Diseases. 2008; 8:121.
DREVINEK P. AND MATHENTHIRALINGAM E. Burkholderia cenocepacia in cystic
fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. European Society of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Volume 16 Number 7, July 2010.
DUNNE, W.M. Bacterial Adhesion: Seen Any Good Biofilms Lately? Clinical
Microbiology Reviews. April 2002, Vol. 15, No. 2, p. 155-166.
FERREIRA, C.; PEREIRA, A.M.; MELO, L.F. AND SIMÕES, M. (2010). Advances in
industrial biofilm control with micro-nanotecnology. In: Méndez-Vilas, A. Current
Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial
Biotechnology. Formatex Research Center, pp. 845-854.
FUX, C.A.; COSTERTON, J.W.; STEWART, P.S.; STOODLEY, P.; Survival strategies of
Infectious Biofilms. Trends in Microbiology. 2005.
GERSTEL, U. AND ROMLING, U. Oxygen tension and nutrient starvation are major
signals that regulate agfD promoter activity and expression of the multicellular
morphotype in Salmonella typhimurium. Environ. Microbiol. 3:638-648 2001.
GOLLER, C., X. WANG, Y. ITOH, AND T. ROMEO. The cation-responsive protein NhaR
of Escherichia coli activates pgaABCD transcription, required for production of the biofilm
adhesin poly-beta-1,6-N-acetyl-D-glucosamine. J. Bacteriol. 2006; 188:8022–8032.
38
GOVAN, J.R.W.; HUGHES, J. E.; VANDAMME, P. Burkholderia cepacia: medical,
taxonomic and ecological issues. J. Med. Microbiol. Vol.45- 1996, 395-407.
GOVAN, J.R., BROWN, A.R., JONES, A.M. Evolving epidemiology of Pseudomonas
aeruginosa and Burkholderia cepacia Complex in cystic fibrosis lung infection. Future
Microbiol 2:153–164 (2007).
HALL-STOODLEY L, COSTERTON JW, STOODLEY P. Bacterial biofilms: from the
natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol 2004; 2(2):95-108.
HOLMES, A., GOVAN, J., GOLDSTEIN, R. Agriculture use of Burkholderia
(Pseudomonas) cepacia: A threat to Human health? Emerging Infectious Diseases. 1998;4:
221-227.
JUBELIN, G., A. VIANNEY, C. BELOIN, J. M. GHIGO, J. C. LAZZARONI, P.
LEJEUNE., C. DOREL. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expressionin response
to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 2005;187:2038–2049.
KARATAN, E., T. R. DUNCAN, AND P. I. WATNICK. NspS, a predicted polyamine
sensor, mediates activation of Vibrio cholerae biofilm formation by norspermidine. J.
Bacteriol. 2005;187:7434–7443.
KARATAN, E.; WATNICK, P. Signals, Regulatory Networks, and Materials That Build
and Break Bacterial Biofilms. Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol.73 No. 2 June 2009.
KNOWLES, M. R.; STUTTS, M. J.; YANKASKAS, J. R. Abnormal respiratory epithelial
ion transport in cystic fibrosis. Clin. Chest. Med., v. 7, p. 285, 1986.
KUSS, A. V.; KUSS, V. V.; LOVATO, T; FLÔRES, M. L. 2007. Fixação de nitrogênio e
produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesq.
agropec. bras., Brasília, v.42, n.10, p.1459-1465.
LACY DE, SPENCER DA, GOLDSTEIN A, WELLER PH, DARBYSHIRE P. Chronic
granulomatous disease presenting in childhood with Pseudomonas capacious septicaemia.
J Inject 1993; 27: 301 -304.
LASSERSON, T.; HOLT, K.; EVANS, D.; GREEN STONE, M. Anticholinergic therapy
for bronchiectasis (Cochrane review). In: The Cochrane Library. Oxford: Update
Software, 2002. issue 4.
LEITÃO, J.H., SOUZA, S.A., FERREIRA, A.S., RAMOS, C.G., SILVA, I.N., MOREIRA,
L.M. Pathogenicity, virulence factors, and strategies to fight against Burkholderia cepacia
complex pathogens and related species. Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:31–40.
39
LESSIE, T.G., HENDRICKSON, W., MANNING, B.D., DEVERUEX, R. Genomic
complexity and plasticity of Burkholderia cepacia. FEMS Microbiology Letters.
1996;144, 117 128.
LUTZ, L.; DE-PARIS, F.; VIEIRA, M.I; MARQUES, E.A.; BARTH, A.L. Bacteriologia
da Fibrose Cística. Rev HCPA 2011;31(2):168-184
MAH TC, O’TOOLE GA. Mechanisms of biofilms resistance to antimicrobial agents.
Trends in Microbiology 2001; 9(1):34-39.
MAHENTHIRALINGAM E, BALDWIN A, VANDAMME P. Burkholderia cepacia
complex infection in patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 2002;51:533-8.
MAHENTHIRALINGAM, E.; BALDWIN, A.; DOWSON, C. G. Burkholderia cepacia
Complex bacteria: opportunistic pathogens with important natural biology. Journal
Applied Microbiology, [s.l.], v. 104, n. 6, p. 1539-1551, Jan. 2008.
MARQUES, SC., REZENDE, JGOS., ALVES., LAF., SILVA, BC., ALVES, E., ABREU,
LR., PICCOLI, RH. Formation of biofilms by Staphylococcus aureus on stainless steel and
glass surfaces and its resistance to some selected chemical sanitizers. Bras J Microbiol.
2007;38:538-543.
MARSHALL,K.C; STOUT, R; MITCHELL, R. Mechanism of the initial events in the
sorpion of marine bacteria to surfaces. Jornal of General Microbiology, reading v68;
p.337-348. 1971.
MENDES, R.; PIZZIRANI-KLEINER, A.A.; ARAUJO, W.L.; RAAIJMAKERS, J.M.
2007. Diversity of cultivated endophytic bacteria from sugarcane: Genetic and biochemical
characterization of Burkholderia cepacia complex isolates. Applied and Environmental
Microbiology, 73: 7259-7267.
MOSTELLER, T. M., BISHOP, J. R., Sanitizer efficacy against attached bacteria in a milk
biofilm. Journal of Food Protection, Des Moines, v.56, n.1, p.34-41, 1993.
NASSER, R. M.; RAHI, A. C.; HADDAD, M. F.; DAOUD, Z.; IRANI-HAKIME, N.;
ALMAWI, W. Y. Outbreak of Burkholderia cepacia bacteremia traced to contamined
hospital water used for diluition of an alcohol skin antiseptic. Infectious Control and
Hospital Epidemiology, Chicago, v. 25, n. 3, p. 231-239, Mar. 2004.
O”TOOLE GA., KOLTER R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens
WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol
40
Microbiol 1998; 28:449-461;
O'TOOLE, G.A., KOLTER, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens
WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol
Microbiol 1998;28:449-461.
PALLERONI NJ. Genus I. Pseudomonas. In: Krieg NR, Holt JG (eds) Bergey’s Manual
of systemic bacteriology, vol 1. Baltimore, Williams and Wilkins Co. 1984: 14 1 – 159
PIZZOLITTO, E. L.; PIZZOLITTO, A. C.; POZETTI, G. L. Chemical and microbiological
evaluation of the internal surfaces of aluminum tubes both unlined and lined with epoxi
resin by means of the stereoscope and scanning electron microscope. Brazilian Journal of
Microbiology, São Paulo, v.32, n.4, p.340-344, 2001.
RASKIN S.; PEREIRA-FERRARI L.; CALDEIRA REIS F.; ABREU F.; MAROSTICA P.;
ROZOV T.; CARDIERI J.; LUDWING N.; VALENTIN L; ROSARIO-FILHO N.A. et al.
(2008) Incidence of cystic fibrosis in five different states of Brazil as determined by
screening of p.F508del, mutation at the CFTR gene in newborns and patients. J Cyst
Fibros 7:15-22
RIBEIRO, A.F; RIBEIRO, J.D.; RIBEIRO, M.A.G.O. Fibrose Cística. Tratado de Clínica
Médica, Seção 13. 2005
RICKARD, A.H.; LEACH, S.A.; HALL, L.S.; BUSWELL, C.M.; HIGH, N.J.;
HANDLEY, P. S. Phylogenetic relationships and coaggregation ability of freshwater
biofilm bacteria. Appl. Environ. Microbiol.68, 3644–3650. 2002
RICKARD, A.H.; GILBERT, P.; HIGH, N.J.; KOLENBRANDER, P. E.; HANDLEY, P. S.
Bacterial coaggregation: an integral process in the development of multi-species biofilms.
TRENDS in Microbiology. Vol. 11 No.2 February 2003
SANGODKAR, U.; CHAPMAN, P.; CHAKRABARTY, A. Cloning, physical mapping
and expression of chromosomal genes specifying degradation of the herbicide 2,4,5-T by
Pseudomonas cepacia AC1100. Gene 1988;71:267-77
SIMÕES, M.; SIMÕES, L.C. AND VIEIRA, M.J. (2010). A review of current and
emergent biofilm control strategies. LWT – Food Science and Tecnology, 43, pp. 573-
583.
SOUSA, S. A.; RAMOS, C.G.; LEITÃO, J.H. Burkholderia cepacia Complex: Emerging
Multihost Pathogens Equipped with a Wide Range of Virulence Factors and Determinants.
International Journal of Microbiology.2010
STOODLEY, P.; BOYLE, J.D; DODDS, I. AND LAPPIN-SCOTT, H.M. (1997).
41
Consensus Model of Biofilm Structure. “Biofilms: Community Interactions and Control”
3rd
meeting of the Biofilm Club.
STOODLEY, P.; SAUER, K.; DAVIES, D.G. AND COSTERTON, J.W. (2002). Biofilms
as Complex Differentiated Communities. Annual Review of Microbiology, 56, pp. 187-
209.
THOMAS KW., BARRIOS AFG., HERZBERG M., LEE J. Motility influences biofilm
architecture in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2006;72:361-367.
TOMICH, M., MOHR, CD. Transcriptional and posttranscriptional control of cable pilus
gene expression in Burkholderia cenocepacia. J Bacteriol 2004;186:1009-1020.
WILLIAMS, V.; FLETCHER, M. Pseudomonas fluorescens Adhesion and Transport
through Porous Media Are Affected by Lipopolysaccharide Composition. Apllied and
Environmental Microbiology, Jan. 1996, p. 100-104, Vol. 62, No. 1.