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NUMERATON, ISOLEMENT ET IDENTIFICATION
DES BACTERIES
Fromageries BEL Maroc, TangerFormation assurée parProf. A. TANTAOUI ELARAKISeptembre 2006
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Numération, isolement et identification des bactéries
Objectifs
Améliorer les aptitudes des participants en matière de:
o Numération des micro-organismeso Isolement des souches microbienneso Identification des bactéries d’intérêt Améliorer la qualité et la fiabilité des
analyses microbiologiques
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Numération, isolement et identification des bactéries
ContenuGénéralités
1- Principes généraux de l'isolement, de la numération et de l'identification des bactéries
2- Cas particuliers de certains groupes bactériens
3- Autres aspects relatifs aux analyses bactériologiques
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Numération, isolement et identification des bactéries
Généralités- Culture microbienne
- Isolement des micro-organismes
- Numération des micro-organismes
- Identification des espèces
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Généralités
Culture microbienne
Définition: cultiver un micro-organisme, c’est le placer dans des conditions favorables à sa multiplication
Nécessite un milieu de culture approprié (eau, éléments nutritifs, pH, etc.)
Exige des conditions d’incubation favorables (température, durée, oxygénation, etc.)
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Généralités
Isolement des micro-organismes
Définition: obtention, à partir d’un mélange d’espèces microbiennes (dans un aliment par exemple), une espèce donnée en culture pure
Principes des techniques d’isolement: - Séparation physique des différentes espèces cultivées sur un milieu solide non sélectif
- Isolement de l’espèce ou du groupe recherché sur un milieu sélectif (où les espèces indésirables sont inhibées)
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Généralités
Numération des micro-organismes
Définition: détermination du nombre de représentants d’une espèce ou d’un groupe microbien dans 1g ou 1ml de produit
Principes des techniques de numération:- Culture sur milieu liquide en boîte de Petri de
dilutions appropriées de l’échantillon- Culture sur milieu liquide en tube (3 à 5
tubes par dilution) et estimation du nombre le plus probable grâce à la table de Mc Crady
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Généralités
Identification des espèces
Définition: déterminer l’espèce à laquelle appartient le micro-organisme étudié (l’identification peut s’arrêter au genre)
Nécessite, sur une culture pure, la détermination des caractéristiques:
- Morphologiques- Culturales- Biochimiques et physiologiques, - etc.
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Numération, isolement et identification des bactéries
1- Principes généraux … 1.1- Morphologie et structure
1.2- Choix des milieux 1.3- Choix des conditions d'incubation 1.4- Recherche de caractéristiques
biochimiques ou physiologiques supplémentaires
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1- Principes généraux
1.1- Morphologie et structure
1.1.1- Forme unitaire de la cellule1.1.2- Modes de groupement des
cellules1.1.3- Gram positivité et Gram
négativité1.1.4- Formation d’endospores 1.1.5- Récapitulation
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.1- Forme unitaire de la cellule Très variée
Formes dominantes:
ronde (sphérique à ovoïde): coccus (cocci)
bâtonnet (allongée): bacille, bacillus ou bacterium
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure1.1.1- Forme unitaire de la cellule (suite)
ciliature polaire monotriche
ciliature péritriche
ciliature polaire multitriche
ciliature amphi-triche multitriche
Salmonella
Yersinia ruckeri Présence éventuelle de flagelles
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.2- Modes de groupement des cellules Chez les cocci, groupements spécifiques:
- En chaînes: Streptococcus (et Lactococcus)
- En grappes de raisin: Staphylococcus
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure1.1.2- Modes de groupement des cellules (suite)
Chez les bâtonnets, moins importants Exemples:- Streptobacilles: chaînes de bacilles- Gerbes: bacille de Koch
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structureRécapitulatif
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.3- Gram positivité et Gram négativité
Bactéries généralement réparties en Gram positives et Gram négatives
- Technique de coloration- Résultats- Précautions- Explication: structure de la paroi
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Technique de colorationPhase Gram positive Gram négative
1- Coloration primaire (Violet de
gentiane)
Réalisée Réalisée
2- Fixation (lugol: I2/KI)
Réalisée Non réalisée
3- Décoloration (alcool/acétone)
4- Coloration secondaire (Fuchsine)
Résultat final
Non réalisée
Réalisée
Violet
Réalisée
Réalisée
Rose
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Résultats
Bâtonnets à Gram positif
Bâtonnets à Gram négatif & cocci à Gram positif
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Précautions
Respecter les principaux paramètres suivants:
- Concentration des solutions
- Durée de contact
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Explication: structure de la paroi
Gram positivité ou négativité selon structure de la paroi bactérienne
Bactéries à Gram négatif:- peptidoglycane: couche mince- « membrane externe »:complexes lipoprotéiqueset lipopolysaccharidiques
Bactéries à Gram positif:- peptidoglycane: couchetrès épaisse; seul constituant important
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.4- Formation d’endospores
Endospore: micro-cellule résistante formée par certaines bactéries (surtout genres Bacillus et Clostridium)
Formée dans la cellule végétative, qu’elle quitte à maturité
Spore déformante ou non déformante Spore centrale, terminale ou
subterminale
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure1.1.4- Formation d’endospores (suite)
A: ovale, terminale;
B: rectangulaire, terminale;
C: rectangulaire, subterminale;
D: rectangulaire, centrale;
E: circulaire, terminale;
F: circulaire, centrale,
G: spore déformante, terminale
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Endospores bactériennes
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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure
1.1.5- Récapitulation
Forme Bâtonnets Cocci
Gram Positif Négatif
Mobilité Immobile Mobile PéritricheMonotricheAmphitrichePolaire multitriche
Sporulation Non sporulée Sporulée DéformanteNon déformanteCentraleTerminaleSubterminale
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1- Principes généraux
1.2- Choix des milieux de cultureGénéralités1.2.1- Milieu minimum1.2.2- Milieu empirique1.2.3- Milieu sélectif1.2.4- Milieu enrichi1.2.5- Milieu ordinaire1.2.6- Milieu synthétique1.2.7- Milieu semi-synthétique
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
Généralités
milieu de culture: solution nutritive qui permet la culture des micro-organismes
doit contenir les composants nécessaires à la multiplication des micro-organismes: eau, éléments nutritifs (sources d’énergie, de
Carbone, d’Azote, minéraux et éventuellement facteurs de croissance)
pH ajusté au besoin
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de cultureGénéralités (suite)
Consistance des milieux:o Milieu liquide: « bouillon »o Milieu solide ou gélosé: « gélose »
(milieu liquide + Agar-agar: plus de 12g/l en général)
o Milieu semi-solide: « gélose molle » (7g/l d’Agar-agar au maximum) pour certains usages particuliers (mobilité, production de gaz)
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
1.2.1- Milieu minimum
Contient les composants et éléments strictement nécessaires à la croissance bactérienne
Suffisant pour les micro-organismes n’ayant pas d’exigences particulières
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture1.2.1- Milieu minimum- Composition
- Source de C et d’énergie- Source de K et de P- Source d’Azote et de S- Source de Mg- Source de Ca- Source de Fe- Sources d’oligoéléments- Source d’eau- Un tampon pH
Glucose (généralement)K2HPO4
(NH4)2SO4
MgCl2CaCl2Citrate de FeSels de Cu, Zn, Co, Ni, B, etc.Eau distilléeKH2PO4 (par exemple)
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
1.2.2- Milieu empirique
Milieu à base de produits naturels végétaux ou animaux
Composition exacte inconnue
Pas d’effet sélectif
Exemples: - Milieu Brain Heart (Cervelle Cœur)
- Milieu Viande Foie
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
1.2.3- Milieu sélectif Permet seulement la culture de certains
micro-organismes Contient des éléments inhibiteurs pour
les espèces indésirables Pour la culture d’un type de micro- organisme à partir d’un prélèvement polymicrobien
Exemples d’élémentsInhibiteurs:
- NaCl à forte concentration- Thiosulfate de sodium- Cristal violet- Azide de sodium
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
1.2.4- Milieu enrichi Contient, outre les composants de
base, des substances indispensables aux micro-organismes et que ceux-ci ne peuvent pas synthétiser
Utilisé pour micro-organismes exigeants
Exemple:Milieux au sang frais(sang riche en nutriments divers)
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
1.2.5- Milieu ordinaire Permet la culture de micro-
organismes sans exigence particulière Composition simple Sans aucun effet de sélection
Exemples:- Bouillon ordinaire- Gélose ordinaire- PCA (Plate Count Agar)
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
1.2.6- Milieu synthétique Composition chimique connue
exactement (quantitativement et qualitativement)
Couramment utilisés Utilisés pour la recherche d’une réaction ou d’un métabolisme précis
Exemple:Milieu au tryptophane pour recherche de tryptophanase(production d’indole)
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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture
1.2.7- Milieu semi-synthétique
Composition connue de manière précise pour certains composants seulement (substances ayant un intérêt comme les facteurs de croissance)
Les autres composants sont présents de manière empirique
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1- Principes généraux
1.3- Choix des conditions d’incubation
1.3.1- Température
1.3.2- Durée
1.3.3- Oxygénation
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1- Principes généraux 1.3- Choix des conditions d’incubation
1.3.1- Température
Différents cas: Optimale pour les espèces cultivées Exigée par la nature du groupe
recherché (psychrotrophes du lait: 7°C selon définition de la F.I.L.)
Pour distinguer entre 2 ensembles d’un groupe microbien :fermentation du
lactose avec production de gaz - Coliformes totaux à 32°C en 48h - Coliformes fécaux à 44,5°C en 48h
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1- Principes généraux 1.3- Choix des conditions d’incubation
1.3.2- Durée Suffisante pour permettre:- Croissance des espèces voulues- Accomplissement des réactions
voulues Pas trop longue pour éviter:- Croissance d’espèces indésirables- Accomplissement de réactions non
souhaitées
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1- Principes généraux 1.3- Choix des conditions d’incubation
1.3.3- Oxygénation
Aérobies stricts: air libre (S/V élevé, agitation et aération, etc.)
Anaérobies stricts: gélose profonde, atmosphère dépourvue d’Oxygène
Microaérophiles: culture en double couche de gélose
Aéro-anaérobies facultatifs: variable selon les cas
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1- Principes généraux
1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.
1.4.1- Fermentation de sucres1.4.2- Production de gaz1.4.3- Activités enzymatiques
particulières1.4.3- Autres activités spécifiques
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.
1.4.1- Fermentation de sucres
Principe:- Milieu de culture avec le sucre étudié
comme seule source de Carbone- pH légèrement alcalin au départ- Indicateur coloré de pH ajouté- Mise en évidence de l’acidification
(effet de la fermentation des sucres) par virage de l’indicateur coloré)
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.1- Fermentation de sucres
Exemples Milieu Sucre(s) Bactéries Indicateur
Kligler Glucose + Lactose
Entérobacteries Rouge de phénol
Chapman Mannitol Staphylocoques Rouge de phénol
Gélose désoxycho-late lactose
Hugh et Leifson
Lysine fer
Lactose
Variable
Glucose
Coliformes
Gram négatifs
Entérobactéries
Rouge neutre
Bleu de bromothymol
Pourpre de bromocrésol
Exemples de milieux avec des indicateurs colorés de pH pourla mise en évidence de la fermentation des sucres
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.1- Fermentation de sucresExemples (Cas du milieu de Kligler)
1- Pas de pousse ou, s’il y a pousse, le métabolisme des acides aminés a alcalinisé le milieu
2- Fermentation du lactose et du glucose
3- Fermentation des 2 sucres avec production de gaz
4- Fermentation du glucose seulement (1g/l), l’utilisation des acides aminés a alcalinisé la tranche
5- Production de H2S
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.
1.4.2- Production de gaz
Résulte de certains métabolismes Généralement H2, CO2, H2S, etc. Permet de séparer des ensembles
appartenant à un même groupe:- Coliformes fécaux et totaux (voir plus haut)
- Lactobacilles homo- (gaz -) et hétérofermentaires (gaz +)
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gazTechniques
Technique Type de milieu
Bouchon de paraffine Liquide ou semi-solide
Cloche de Durham Liquide
Dislocation de la gélose
Solide
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gazTechniques (suite)
Technique du bouchon de paraffine
- Milieu liquide ou semi-solide- Bouchon poussé vers le haut: production de gaz
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gazTechniques (suite)
Cloche de Durham
Gaz
Technique de la cloche de Durham
- Milieu liquide- Cloche poussée vers le haut et contenant des gaz (1/3 de son volume au moins): production degaz
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gaz- Techniques
Gélose disloquée
- Milieu solide- Dislocation de la gélose par formation de poches de gaz
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.
1.4.3- Activités enzym. particul.
- Catalase: Staphylococcus
- Coagulase: Staphylocoque pathogène- Nitrate réductase
- Tryptophanase: production d’indole à partir du tryptophane
H2O2 H2O + ½ O2Catalase
NO3- NO2
- + ½ O2Nitrate
réductase
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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.
1.4.4- Autres activités spécifiques
Exemples o Production de H2S (anaérobies
sulfitoréducteurs, Enterobacteriaceae sur milieu de Kligler)
o Réduction du TTC: formation du tiphénylformazan, rouge et insoluble
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Numération, isolement et identification des bactéries
2- Cas particuliers … 2.1- Coliformes 2.2- Lactobacilles 2.3- Streptocoques du groupe D
2.4- Sulfitoréducteurs et butyriques
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2- Cas particuliers …
2.1- Coliformes
2.1.1- Généralités sur les Coliformes
2.1.2- Numération sur gélose VRBL
2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol 7 et TTC
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes
2.1.1- Généralités sur les Coliformes Bactéries en bâtonnets à Gram
négatif, non sporulées, aéro-anaérobies facultatives, fermentant le lactose avec production de gaz
Appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae
Plus de 20 espèces, réparties en 5 genres: Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Hafnia, Citrobacter
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.1- Généralités sur les Coliformes (suite)
On distingue les Coliformes fécaux et les Coliformes totaux
- Coliformes fécaux: fermentent le lactose
avec production de gaz à 44,5 °C en 48h
- Coliformes totaux: (fécaux + non fécaux): fermentent le lactose avec production de gaz à 32 °C en 48h
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.1- Généralités sur les Coliformes (suite)
- Bons témoins de contamination fécale ou d’origine fécale
- Témoins de mauvaises pratiques d’hygiène - Sensibles à la chaleur (moyen de contrôle
de la pasteurisation)
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.1- Généralités sur les Coliformes (suite)
- Les coliformes sont peu exigeants du point de vue nutritif.
- Ils ont une vitesse de croissance très élevée: danger de prolifération abondante dans les aliments
Exemple: Escherichia coli se divise toutes les 20 min dans les conditions optimales de croissance:
en une heure, l’effectif de la population se multiplie par 8.
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.1- Généralités sur les Coliformes (suite)
Conséquences possibles:
- Altération de certains produits: cas du gonflement précoce de certains fromages (lait trop chargé en Coliformes, surtout en cas de mauvais développement des bactéries lactiques, à cause des antibiotiques par exemple)
- Possibilité de pathogenèse de certaines souches
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes
2.1.2- Numération sur VRBL
Objet Composition Rôle de chaque constituant Mode d’emploi Lecture Contrôle de qualité
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.2- Numération sur VRBL
Objet
Mise en évidence des bactéries Coliformes (dont Escherichia coli) dans l’eau, le lait et les produits laitiers, la viande et d’autres produits alimentaires
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.2- Numération sur VRBL
Composition
Composants nutritifs
Peptone de viandeExtrait de levureLactose
7g/l 3g/l10g/l
Agents sélectifs
Mélange de sels biliairesCristal violetNaCl
1,5g/l0,002g/l
5g/l
Indicateur Rouge neutre 0,03g/l
Gélifiant Agar-agar 13g/l
pH 7,4 + 0,2
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.2- Numération sur VRBL
Rôle de chaque constituant Cristal violet et sels biliaires: inhibent
la flore secondaire à Gram positif NaCl: inhibe les germes sensibles au
sel La fermentation du lactose en acides
est révélée par:- Le virage au rouge de l’indicateur de
pH (rouge neutre)- La précipitation des sels biliaires
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.2- Numération sur VRBL
Mode d’emploi
Inoculation selon la méthode de la boîte coulée
Incubation 24h + 2h; 30°C + 1°C
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.2- Numération sur VRBL
LectureTypes de colonies Interprétation
Colonies rouges avec un halo de précipité rougeâtre (Ø 1-2 mm)
Enterobacteriaceae lactose positives (Coliformes, E. coli)
Colonies en « tête d’épingle » roses
Entérocoques, éventuellement Klebsiella
Colonies incolores Enterobacteriaceae lactose négatives
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.2- Numération sur VRBL
Contrôle de qualité
Souche test Croissance Couleur
Salmonella typhimurium CIP 6062 (équivalent ATCC
14028)Bonne Beige
Escherichia coli ATCC 25922
Bonne Rouge
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Nulle -
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes
2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC
Objet Composition Préparation Rôle des constituants Mode d’emploi Lecture
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC
Objet
Dénombrement des Coliformes, notamment dans l’eau par la méthode de filtration sur membrane
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC
Composition
Composants nutritifs
PeptoneExtrait de viande Extrait de levureLactose
10g/l 5g/l
6g/l20g/l
Agent sélectif Tergitol 0,01g/l
Indicateurs Bleu de bromothymolTTC
0,05g/l0,025g/l
Gélifiant Agar-agar 13g/l
pH 7,2 + 0,2
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC
Préparation Dans un litre d’eau distillée, ajouter
51,54g de milieu déshydraté Stériliser à l’autoclave Ajouter dans le milieu en surfusion (à
45°C): 50 ml d’une solution stérile de TTC à
0,05% 50 ml d’une solution de Tergitol 7 à
0,2%
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC
Rôle des constituants
- Le Tergitol 7 empêche l’envahissement par Proteus
CH3
H3C CH3
CH3
O=S-O-
ONa+
Tergitol 7 (Heptadecyl sulfate de Sodium)
- Excellent détergent- Excellentes propriétés mouillantes- Agent antimicrobien sélectif- pH (à 1% dans l’eau): 6
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTCRôle des constituants (suite)
Le TTC (C19H15ClN4) sert à montrer l’effet réducteur: sa réduction aboutit au Triphénylformazan, rouge et insoluble
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTCRôle des constituants (suite)
La fermentation du lactose donne une
acidification qui se traduit par le virage au jaune du bleu de bromothymol
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC
Mode d’emploi Ensemencement par étalement d’un
petit volume d’échantillon, ou
En déposant une membrane Millipore après filtration d’un volume donné d’eau
Incubation 21h + 3h à 30°C + 2°C
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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC
LectureTypes de colonies
Fermentation du lactose
Réduction du TTC
Interprétation
Jaunes+ - Escherichia coli,
Enterobacter
Rose rouge avec halo
jaune
+ + Autres Coliformes
Bleues ou vertes
- - Autres espèces
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2- Cas particuliers …
2.2- Lactobacilles
2.2.1- Généralités sur les Lactobacilles
2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
2.2.3- Lactobacilles hétérofermentaires sur MRS liquide
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles
2.2.1- Généralités sur les Lactobacilles
Bactéries en bâtonnet à Gram positif, non sporulées
Isolées des produits laitiers et d’autres produits (végétaux surtout)
Très exigeantes sur le plan nutritionnel (vitamines, peptides, acides aminés, etc.); ne poussent pas sur les milieux ordinaires
Acidophiles: pH optimum autour de 6; poussent encore bien à des pH inférieurs
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.1- Généralités (suite)
N’utilisent pas l’O2; une atmosphère enrichie en CO2 (ou même anaérobiose) leur est favorable
Fermentent les sucres (dont lactose); acide lactique comme produit final principal:
• Lactobacilles homofermentaires: acide lactique = 90% des produits de fermentation
• Lactobacilles hétérofermentaires: acide lactique = 50% des produits (+ autres produits dont gaz)
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles
2.2.2- Lactob. homoferm. sur gélose Rogosa
Objet Composition Préparation Rôle des constituants Utilisation Lecture Contrôle de qualité Précautions
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
Objet
Milieu sélectif pour Lactobacilles seuls si pH ajusté autour de 5,4
Peut servir à la culture de toutes les
bactéries lactiques avec un pH autour de 6,2
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
Composition
Composants nutritifs
TryptoneExtrait de levureGlucoseDihydrogénophosphate de KCitrate d’ammoniumSulfate de MagnésiumSulfate de ManganèseSulfate ferreux
10g/l 5g/l
20g/l6g/l2g/l
0,575g/l0,12g/l
0,034g/l
Agents sélectifs
Acétate de sodiumAcide acétique glacialTween 80
25g/l1,32g/l
1g/l
Gélifiant Agar-agar 20g/l
pH 5,4 + 0,2
80
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
Préparation
- Peser les ingrédients (ou le milieu déshydraté du commerce: 82g pour un litre) sans l’acide acétique glacial
- Dissoudre dans un litre d’eau distillée et porter à l’ébullition jusqu’à dissolution complète
- Ajouter l’acide acétique glacial (1,32g) et mélanger soigneusement
- Chauffer 2 à 3 min à 90-100°C en agitant souvent- Répartir sans autoclaver
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
Rôle des constituants Composants nutritifs: satisfaction des
exigences nutritionnelles importantes Acétate de sodium à concentration élevée:
inhibe de nombreuses bactéries lactiques L’acide acétique renforce cet effet inhibiteur
(action antimicrobienne et pH) pH 5,4 très sélectif pour Lactobacilles (sans
acide acétique; pH 6,2, toutes bactéries lactiques poussent)
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose RogosaRôle des constituants (suite)
Tween: inhibiteur
HO(CH2CH2O)w (OCH2CH2O)xOH
(OCH2CH2O)yOH
(OCH2CH2O)z O
O
C17H33
Tween 80 (Polysorbate 80): w+x+y+z = 20Émulsifiant et antimicrobien
O
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
Utilisation Pour Lactobacilles, recommandé:- Incubation 3j à 37°C ou 5j à 30°C- De préférence, atmosphère à 95%
d’H2 et 5% de CO2
- Sinon, recouvrir la gélose d’une 2ème couche
Avantages de l’incubation sous atmosphère contrôlée:
- Évite l’évaporation de l’eau- Fournit des conditions depotentiel Redox favorables - Le CO2 stimule la croissance
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2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose RogosaUtilisation (suite)
Pour les bactéries lactiques thermophiles: incubation à 42°C; 48h
Pour les Leuconostoc: incubation à 25°C; 3j
85
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
LecturepH
initialTypes de colonies Interprétation
5,4 + 0,2Petite (0,5-2,5 mm), blanc grisâtre, plate ou bombée, lisse ou rugueuse
Lactobacilles
6,2 + 0,2
Petite (0,5-2,5 mm), blanc grisâtre, plate ou bombée, lisse ou rugueuse
Diamètre O,5-1 mm« Slime » à 25°C
Toutes bactéries lactiques
Entérocoques et PédiocoquesLeuconostoc
86
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
Contrôle de qualité
Souche test Résultat
Lactobacillus acidophilus ATCC 19992
Croissance
Staphylococcus aureus ATTC 25923
Pas de croissance
87
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa
Précautions
Lactobacillus carnis ne pousse pas sur ce milieu
Avant de poursuivre l’identification, effectuer sur les souches isolées:
- la coloration de Gram- le test de la catalase
88
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles
2.2.3- Lactob. hétérof. sur MRS liquide
Objet
Composition Rôle des constituants
Préparation, utilisation et lecture
89
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.3- Lactobacilles hétérofermentaires sur MRS liquide
Objet Le milieu MRS est un milieu
d’isolement sélectif et enrichi pour Lactobacilles
Le MRS liquide permet de distinguer les Lactobacilles hétérofermentaires à l’aide de la cloche de Durham qui révèle la production de gaz
90
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.3- Lactobacilles hétérofermentaires sur MRS liquide
Composition
Composants nutritifs
Peptone trypsique de caséineMacération de viandeExtrait de levureGlucosePhosphate bipotassiqueSulfate de MagnésiumSulfate de ManganèseCitrate d’ammonium
15g/l 500ml/l
5g/l20g/l
2,4g/l0,2g/l
0,05g/l2g/l
Agents sélectifs
Acétate de sodiumTween 80
5g/l1g/l
pH 5,4 + 0,2
91
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.3- Lactobacilles hétérofermentaires sur MRS liquide
Rôle des constituants Composants nutritifs: satisfaction des
besoins nutritionnels importants Citrate d’ammonium: source de
citrate pour mise en évidence de la production de diacétyl
Acétate de sodium: inhibiteur pour de nombreuses bactéries, notamment les bactéries lactiques
Tween 80: inhibiteur d’autres espèces
92
2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.3- Lactobacilles hétérofermentaires sur MRS liquide
Préparation, utilisation et lecture Milieu préparé et réparti en tubes,
avec cloches de Durham, et autoclavé Incubation à 30°C; 48h Si cloche remplie de gaz à raison du
1/3 de son volume au moins: Lactobacille hétérofermentaire
Autre technique de mise en évidence de la production de gaz: milieu MRS en gélose molle ou milieu semi-gélosé (7g d’agar -agar par litre) avec bouchon de paraffine
93
2- Cas particuliers …2- Cas particuliers …
2.3- Streptocoques du groupe D2.3- Streptocoques du groupe D
2.3.1- Généralités sur les 2.3.1- Généralités sur les Streptocoques du groupe DStreptocoques du groupe D
2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC
2.3.3- Culture sur milieu BioKar 2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016016
94
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D
2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. Do Bactéries en cocci à Gram positif o De 0,5 à 1 µm de diamètre o Groupement typique en chaînetteso Immobileso Dépourvues de spores o Rarement capsulées o A catalase variable o Aéro-anaérobies facultatives
95
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. D (suite)
o Métabolisme fermentatif o Produisent acide lactique et/ou acide
acétique, acide formique, éthanol et CO2, à partir des glucides
96
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. D (suite)
o Appartiennent à la famille des Streptococcaceae
o Les Streptocoques fécaux (Entérocoques) forment le groupe sérologique D de Lancefield, qui comprend 5 espèces
97
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. D (suite)
1er sous-groupe:Entérocoques Vrais
Enterococcus feacalis var. zymogenes var. liquefaciensE. faeciumE. durans
2ème sous-groupe
Enterococcus bovisE. equinus
98
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. D (suite)
o Plus résistants aux traitements thermiques que les Coliformes (ex: 63°C, 30 min)
o Cultivent bien en présence de 6,5% de NaCl, et 0,2% d’azide de sodium
99
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. D (suite)
o Bons indices de contamination fécale
o Présence sans Coliformes: contamination fécale ancienne ou produit ayant subi un chauffage
o Peuvent contribuer à l’altération des aliments
100
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D
2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC
Objet Composition Préparation Rôle des constituants Lecture
101
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC
Objet Milieu Kenner Fecal au TTC pour
Streptocoques Milieu rendu sélectif pour les
Streptocoques fécaux (du groupe D) ou Entérocoques (+ Streptococcus avium du groupe Q)
Pour dénombrement classique ou après filtration (eaux)
102
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC
Composition
Composants nutritifs
PeptoneExtrait de levureLactoseMaltose Glycérophosphate de Na
10g/l 10g/l1g/l
20g/10g/l
Agents sélectifs
Azide de sodiumChlorure de sodium
0,4g/l5g/l
Indicateurs Pourpre de bromocrésolTTC
0,015g/l0,1g/l
Gélifiant Agar-agar 15g/l
pH 7,2 + 0,2
103
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC
Préparation Peser 71,4g de milieu déshydraté (si
gélosé). Ajuster le pH Autoclaver 10 min à 115-121°C (ou
laisser bouillir 5 min si pouvoir sélectif total non requis)
Ajouter 10 ml d’une solution stérile de TTC à 1%
Répartir
104
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC
Rôle des constituants L’azide de sodium et le sel (5%)
inhibent de nombreuses espèces, rendant le milieu sélectif pour les Streptocoques du groupe D
Le pourpre de bromocrésol montre (virage au jaune) l’acidification du milieu
Le TTC montre l’effet réducteur (triphénylformazan, précipité rouge)
105
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC
Lecture Les colonies de Streptocoques fécaux
sont: rouge ou marron (réduction du TTC) avec un halo jaune (virage du
pourpre de bromocrésol suite à la fermentation des sucres et à la libération d’acides organiques)
106
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D
2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016
Objet Composition Préparation Rôle des constituants Lecture
107
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016
Objet
Milieu sélectif pour l’isolement et le dénombrement des Streptocoques fécaux dans les produits alimentaires et pharmaceutiques
108
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016
CompositionComposants
nutritifsTryptonePeptone pepsique de viande Extrait de levureCitrate de sodium
17g/l 3g/l5g/l1g/l
Agents sélectifs
Azide de sodiumChlorure de sodiumBile de boeuf
0,25g/l5g/l
10g/l
Indicateurs EsculineCitrate de fer ammoniacal
1g/l0,5g/l
Gélifiant Agar-agar 13,5g/l
pH (à 25°C) 7,1 + 0,2
109
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016
Préparation
- Dissoudre 56,2g de milieu déshydraté dans 1l d’eau distillée
- Autoclaver 15 min à 120°C
- Après ensemencement, incuber 24 à 72h à 37°C
110
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016
Rôle des constituants Agents sélectifs:
- Bile de bœuf (bactéries vivant dans l’intestin)
- Chlorure de sodium (5%)
- Azide de sodium
111
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016Rôle des constituants (suite)
Indicateurs Esculine: décomposée par les Streptocoques en glucose et esculéine
Citrate de fer ammoniacal: fournit le révélateur: esculéine + Fe3+ précipité noir
112
2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016
Lecture
Colonies de Streptocoques fécaux: typiquement noires (hydrolyse de l’esculine et formation du complexe esculéine-fer noir)
Remarque: les autres Streptococcaceae et les Pseudomonaceae hydrolysent l’esculine, mais sont inhibées dans ce milieu
113
2- Cas particuliers …
2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques
2.4.1- Généralités
2.4.2- Principes généraux de la culture des anaérobies
2.4.3- Milieu VF au sulfite et à l’alun de fer
114
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques
2.4.1- Généralités Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs Bâtonnets à Gram positif Anaérobies stricts Sporulés (thermorésistants) Réduisent les sulfites (libération de H2S) Souvent gazogènes (H2, CO2 notamment)
Genre Clostridium
115
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.1- Généralités (suite)
Les butyriques: Espèces du genre Clostridium qui
conduisent une fermentation butyrique (acides, en particulier acide butyrique, gaz: CO2 et H2)
Espèces: C. sporogenes, C. butyricum, C. tyrobutyricuim
Responsables de gonflements tardifs dans les fromages
116
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques
2.4.2- Principes généraux de la culture des anaérobies Milieu riche en matière organique,
surtout protéines (capacité d’équilibre Redox)
Régénération avant usage: ébullition pour chasser l’O2 dissous
Refroidissement rapide du milieu sans réintroduction d’O2 (sous courant d’eau froide; ne pas agiter)
117
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.2- Principes généraux de la culture des anaérobies (suite)
Après inoculation, éviter de réintroduire de l’O2 (dans les milieux gélosés en tube, mouvement de rotation de la main autour de l’épaule)
Incuber à l’abri de l’O2; exemples:- dans une jarre à anaérobies- sous un bouchon de paraffine- en gélose profonde
118
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques
2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs
Objet Composition Préparation Rôle des constituants Utilisation Lecture
119
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs
Objet Milieu pour isolement et numération
des anaérobies sulfitoréducteurs
Pour la recherche des anaérobies sporulés sulfitoréducteurs, nécessité de détruire les formes végétatives par un traitement thermique (ce choc thermique favorise, la germination des spores bactériennes survivantes)
120
2- Cas particuliers … 2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs
Composition
Composants nutritifs
Extrait de viande - foieGlucoseAmidon
30g/l2g/l2g/
Indicateurs Sulfite de sodiumCitrate de fer ammoniacal
0,5g/l0,5g/l
Gélifiant Agar-agar 12g/l
pH 7,6 + 0,2
121
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs
Préparation Milieu de base:- Peser 46g de milieu déshydraté (sans
les indicateurs) - Dissoudre dans 1l d’eau distillée - Ajuster le pH- Répartir dans des tubes (20 ml) - Autoclaver: 20 min; 115°C
122
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteursPréparation (suite)
Les indicateurs- Préparer une solution de sulfite de
Sodium (A) et une solution de citrate de fer ammoniacal (B) à 5% chacune
- Stériliser les 2 solutions par filtration ou par ébullition (10 min)
- Ajouter dans chaque tube de milieu de base 0,5 ml de A et 4 gouttes de B (les 2 solutions doivent être fraîches)
123
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs
Rôle des constituants Les extraits de viande et de foie,
riches en protéines, fixent l’O2 et le rendent indisponibles pour les bactéries
Le sulfite de Sodium est source de sulfite pour la mise en évidence de la réduction des sulfites en H2S
124
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteursRôle des constituants (suite)
Le citrate de fer ammoniacal apporte le fer pour révéler la présence de H2S par formation
d’un précipité noir de FeS
H2S + Fe2+ FeS + 2H+
Remarque: le Fer peut être remplacé par le Plomb (exemple: sous-acétate de plomb):
formation d’un précipité de PbS noir
125
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs
Utilisation
• Chauffer l’échantillon (80°C; 5 à 10 min) pour tuer les formes végétatives et favoriser la germination des spores (choc thermique)
• Régénérer le milieu de base
• Ajouter les indicateurs
126
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteursUtilisation (suite)
• Inoculer 1ml de l’échantillon ou d’une dilution de l’échantillon
• Homogénéiser sans introduire d’Oxygène
• Incuber en anaérobiose (37 ou 43°C; 24h)
127
2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs
Lecture
• Celles qui réduisent les sulfites ont des colonies noires (coloration nette ou diffuse)
Les bactéries anaérobies
strictes sporulées sulfitoréductrices
correspondent pratiquement
au genre Clostridium
• Les anaérobies poussent dans ce milieu qui est favorable aux bactéries anaérobies en général