“nuevos materiales con propiedades antifÚngicas para el …
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“NUEVOS MATERIALES CON
PROPIEDADES ANTIFÚNGICAS
PARA EL TRATAMIENTO
POSTCOSECHA DE CÍTRICOS”
Trabajo Fin de Máster en Química Sostenible
MARIA DEL MAR ORTIZ GIMENO TUTOR: ANTONIO EDUARDO PALOMARES GIMENO
DIRECTOR EXPERIMENTAL: ADRIÁN PLA HERNÁNDEZ VALENCIA, SEPTIEMBRE 2020
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Tecnología Postcosecha del I.V.I.A. por posibilitar la realización de este trabajo y a todos sus miembros que compartieron conmigo algún instante durante su
realización. Al Aula Cemex-Sostenibilidad por la ayuda concedida para la realización de TFM relacionados con la química sostenible.
RESUMEN
La presente tesis fin de máster del programa de Química Sostenible ha desarrollado el
tema de la búsqueda de nuevos materiales de origen natural con propiedades antifúngicas para
su aplicación como recubrimiento alimentario sobre frutos cítricos. Para ello se ha realizado en
primer lugar una búsqueda bibliográfica analizando los procesos alternativos al uso de fungicidas
tradicionales. Así se ha visto que estos procesos alternativos pueden ser físicos, biológicos o
químicos de bajo riesgo, siendo estos últimos los que tienen un mayor potencial de aplicación.
Entre ellos se ha observado que el empleo de sustancias naturales como extractos vegetales y
aceites esenciales es una buena alternativa debido a su baja toxicidad y actividad antibacteriana
y antifúngica. Sin embargo, el uso de estos materiales aplicados a la conservación de alimentos
presenta el problema de su rápida evaporación, consiguiendo una actividad puntual que no se
mantiene en el tiempo. Por ello, se ha propuesto trabajar con estructuras porosas (zeolitas y
arcillas) que contengan aceites esenciales (aceite esencial de tomillo), buscando que la
interacción soporte-aceite permita una difusión controlada del mismo, incrementando el tiempo
de liberación del fungicida (aceite de tomillo) y aumentando así su actividad biocida en el tiempo.
Este trabajo se ha desarrollado en colaboración con el AINIA donde se han realizado los ensayos
con fruta real, intentando determinar si el uso de estos nuevos materiales puede conseguir
retrasar la putrefacción de los cítricos y alagar su vida útil y periodo comercial.
Pese a solo poder haber sido posible realizar un grupo de ensayos por la alerta sanitaria
y las restricciones impuestas, los resultados obtenidos han mostrado la posibilidad de usar estas
técnicas para el control de los hongos en cítricos, observando que el resultado obtenido dependía
del tipo de soporte sobre el que se coloca el aceite esencial y del tipo de hongo sobre el que
actúa. Sin embargo, serían necesarios más ensayos para una aplicación óptima de estos
materiales.
Palabras clave: Postcosecha, cítricos, tratamientos antifúngicos, aceites esenciales,
materiales biocidas, recubrimientos comestibles.
ÍNDICE
1. Introducción ........................................................................................................... 6
1.1 Química verde y desarrollo sostenible ................................................................ 6
1.2 Industria agroalimentaria .................................................................................. 9
1.3 La industria citrícola .......................................................................................... 9
1.3.1 La recolección y el transporte de los cítricos .............................................. 10
1.3.2 Tratamiento de los cítricos recolectados .................................................... 12
1.3.3 Ceras y recubrimientos comestibles........................................................... 14
1.3.4 Seguridad y calidad alimentaria de cítricos en postcosecha ........................ 17
1.4 Enfermedades postcosecha ............................................................................. 18
1.4.1 Penicillium italicum y Penicillium digitatum ............................................... 20
1.4.2 Geotrichum citri-aurantii ........................................................................... 21
1.5 Tratamientos biocidas ..................................................................................... 22
1.5.1 Biocidas convencionales ............................................................................ 23
1.5.2 Estrategia CINCEP ..................................................................................... 26
2. Objetivos .............................................................................................................. 28
3. Análisis bibliográfico de procesos alternativos al uso de fungicidas tradicionales .... 29
3.1 Métodos físicos ............................................................................................... 29
3.1.1 Tratamientos con calor.............................................................................. 29
3.1.1.1 Tratamientos con aire caliente o curado .............................................. 30
3.1.1.2 Tratamientos con agua caliente........................................................... 30
3.1.2 Irradiaciones ............................................................................................. 30
3.1.2.1 Radiaciones ionizantes ........................................................................ 30
3.1.2.2 Radiaciones no ionizantes ................................................................... 32
3.1.3 Atmósferas controladas ............................................................................ 33
3.2 Métodos biológicos ......................................................................................... 34
3.3 Métodos químicos de bajo riesgo..................................................................... 37
3.3.1 Sales: Compuestos GRAS y aditivos alimentarios ........................................ 37
3.3.2 Sustancias inductoras de resistencia .......................................................... 39
3.3.3 Sustancias naturales.................................................................................. 43
3.3.3.1 Extractos vegetales ............................................................................. 43
3.3.3.2 Aceites esenciales ............................................................................... 44
3.3.4 Recubrimientos comestibles antifúngicos .................................................. 48
3.4 Combinación de métodos de control................................................................ 49
4. Preparación del material biocida ........................................................................... 51
4.1 Materiales....................................................................................................... 51
4.1.1 Sólidos ...................................................................................................... 51
4.1.2 Líquidos .................................................................................................... 51
4.1.3 Incorporación del aceite esencial............................................................... 52
4.2 Métodos de caracterización............................................................................. 52
4.2.1 Difracción de Rayos X ................................................................................ 52
4.2.2 Análisis textural ........................................................................................ 53
5. Evaluación de la actividad biocida ......................................................................... 54
5.1 Ensayo de fitotoxicidad.................................................................................... 55
5.2 Ensayos para determinar la actividad biocida ................................................... 55
6. Resultados y discusión .......................................................................................... 57
6.1 Caracterización de los materiales ..................................................................... 57
6.1.1 Zeolita LTA ................................................................................................ 57
6.1.2 Arcilla ....................................................................................................... 59
6.2 Estudios fungicidas .......................................................................................... 60
6.2.1 Determinación de la fitotoxicidad .............................................................. 60
6.2.2 Determinación de la actividad fungicida .................................................... 61
7. Conclusiones ........................................................................................................ 70
8. Bibliografía ........................................................................................................... 71
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1. INTRODUCCIÓN
El presente trabajo fin de máster trata sobre el desarrollo de nuevos materiales
de origen natural con propiedades antifúngicas, utilizando para ello estructuras porosas
y aceites esenciales. Estos materiales se utilizan para el tratamiento de cítricos,
buscando aumentar su tiempo de vida y disminuir de esta forma las pérdidas de
alimento. Este tema entra de lleno en el campo de la Química Verde y contribuye a los
objetivos de Desarrollo Sostenible tal como se pone de manifiesto e n esta introducción.
En la misma se analiza además el mercado citrícola, las enfermedades más importantes
producidas por hongos en este tipo de frutas y los materiales biocidas utilizados en la
actualidad para controlar los mismos.
1.1 Química verde y desarrollo sostenible
El término “Química” proviene de la palabra alquimia, entendido como el
conjunto de prácticas científicas donde están incluidas la metalurgia, la filosofía, la
astronomía o la medicina. La definición de la palabra química ha evolucionado mucho a
lo largo de los años, pero actualmente, según la Real Academia Española, se define como
la ciencia que estudia la estructura, las propiedades y las transformaciones de los
cuerpos a partir de su composición. [1]
La historia de la química abarca un periodo de tiempo muy amplio, comprendido
desde la prehistoria hasta el día de hoy. En este contexto, aparece en el siglo XIX la
industria química, la cual fue al principio muy bien recibida debido a todos los beneficios
que esta generaba, como la síntesis de fármacos y antibióticos, el desarrollo de nuevos
materiales, la generación de productos de consumo (perfumes, detergentes, pinturas,
aditivos…), tratamientos para cultivos, obtención de gas natural y petróleo, etc. Pero
esta perspectiva se ha visto alterada como consecuencia de la generación durante estos
procesos industriales, de productos tóxicos, dañinos tanto para el medio ambiente
(lluvia ácida, destrucción de la capa de ozono, efecto invernadero, etc.), como para el
ser humano. Además, cabe mencionar que en numerosos procesos químicos se generan
multitud de residuos. Así, por ejemplo, se calcula que muchos procesos de la industria
farmacéutica generan entre 25-100 kg de subproductos por cada kg de producto
deseado (factor E). [2] El factor E de diferentes procesos industriales aparecen en la Tabla
1.
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Tabla 1. Generación de residuos atendiendo el factor E según el tipo de
industria. [2]
INDUSTRIA TONELADAS DE
PRODUCCIÓN
FACTOR E (kg desechos/ kg
producto)
Refino de petróleo 106-108
<0,1
Industria Química 104-106 <1 - 5
Química Fina 102-104 5 - 50
Farmacéutica 10-103 25 - 100
Debido a las preocupaciones ambientales y con el objetivo de buscar nuevas
alternativas a la química tradicional que eliminen estos efectos perjudiciales o, al menos,
los minimice, surge el término de “Química Verde”. La Química Verde o Sostenible,
sinónimo de sostenibilidad ambiental y salud, consiste en el diseño de procesos y
productos químicos que reduzcan al mínimo la utilización y la generación de sustancias
peligrosas. Este concepto se aplica a todo el ciclo de vida de un producto químico, desde
su diseño, pasando por la fabricación, hasta llegar a su uso. A pesar de que la primera
vez que se emplearon las palabras Química Verde se atribuyeron a Paul Anastas
(miembro de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos) en 1991, este
término ya había sido empleado en anteriores ocasiones como por ejemplo en 1978 por
el investigador Trevor Kletz en uno de sus artículos donde hablaba de la búsqueda de
procesos sostenibles y el empleo, de forma responsable, de los procesos químicos. [3]
Según estos autores, el diseño de procesos y productos respetuosos con el medio
ambiente se debe basar en los 12 principios de la Química Verde, establecidos por Paul
Anastas y John Warner, en su libro “Green Chemistry: Theory and Practice" en 1998, los
cuales se enumeran en la Tabla 2.
Tabla 2. Enumeración de los 12 principios de la Química Verde. [4]
PRINCIPIOS DE LA QUÍMICA VERDE
1 Prevención 2 Economía atómica
3 Uso de metodologías seguras para generar productos de baja toxicidad 4 Diseño de productos químicos seguros
5 Reducir la utilización de sustancias auxiliares (disolventes) e intentar que sean inocuas 6 Eficacia energética 7 Uso de materias primas de fuentes renovables
8 Evitar los derivados 9 Fomentar la catálisis
10 Generar productos biodegradables 11 Evitar la contaminación a través de metodologías analíticas en tiempo real 12 Prevenir/reducir el riesgo de accidentes químicos
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La Química Verde está estrechamente relacionada con el Desarrollo Sostenible,
término surgido en el informe “Nuestro Futuro en Común” por la ONU en 1987 [5] que
se define como aquel progreso capaz de satisfacer las necesidades del presente sin
comprometer los recursos del futuro, buscando un equilibrio entre lo económico, lo
social y el medio ambiente. A raíz de esto, en 2015, se desarrolló la “Agenda 2030 para
el Desarrollo Sostenible” que comprende 17 objetivos, que persiguen la igualdad entre
las personas, la protección del planeta y asegurar la prosperidad. [6] Estos objetivos, como
se muestra en la Figura 1, son el fin de la pobreza, hambre cero, salud y bienestar,
educación de calidad, igualdad de género, agua limpia y saneamiento, energía asequible
y no contaminante, trabajo decente y crecimiento económico, industria e innovación,
reducción de las desigualdades, ciudades y comunidades sostenibles, producción y
consumo responsables, acción por el clima, vida submarina, vida de ecosistemas
terrestres, paz y justicia e instituciones sólidas y alianzas para lograr los objetivos.
Figura 1. Objetivos de Desarrollo Sostenible. [6]
El sector químico puede contribuir el logro de muchos de estos propósitos y, en
este contexto, siguiendo las bases de la Química Verde, el Desarrollo Sostenible y los
objetivos de la Agenda 2030, se propone el presente TFM que pretende el desarrollo y
uso de nuevos materiales con actividad biocida que sean capaces de alargar la vida útil
y de asegurar la calidad de los cítricos después de su recolección. Este estudio podría
contribuir a desarrollar los objetivos 2 (hambre cero) y 3 (salud y bienestar) de la Agenda
2030 para el Desarrollo Sostenible y suponer un avance en la industria agroalimentaria.
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1.2 Industria agroalimentaria
La industria agroalimentaria trabaja en la elaboración, transformación,
preparación y envasado de productos alimentarios para su posterior consumo. Esta
industria tiene contacto tanto con el sector primario, donde consigue las materias
primas, por ejemplo, la agricultura o la ganadería, como con el sector terciario, aquel a
donde van destinados los bienes finales obtenidos.
El sector agroalimentario no ha parado de crecer en los últimos años. Según el
informe anual 2017-2018 de la industria alimentaria española realizado por el Ministerio
de Agricultura, Pesca y Alimentación, en la Unión Europea, la industria alimentaria es la
principal actividad de la industria manufacturera y en 2018 alcanzó un valor superior a
los 1.109.000 millones de euros de cifra de negocios, representando así el 13,8% del
consumo. Cuenta con 294.000 empresas y 4,57 millones de empleados. Las pequeñas y
medianas empresas representan el 48,1% del total de cifra de negocios del sector
alimentario y el 61,3% del conjunto de los puestos de trabajo que genera. La industria
alimentaria española ocupa el quinto puesto en valor de cifra de negocios con un 8,7%,
por detrás de Reino Unido (10,7%), Italia (12,0%), Alemania (15,4%) y Francia (16,2%).
En España, según la Estadística Estructural de Empresas del INE realizada en
2018, la industria agroalimentaria desempeña un papel fundamental dentro de la
economía, ocupando el primer puesto dentro del sector industrial, con un valor de
producción de 113.593 millones de euros y representando el 18% de las personas
ocupadas. El número de empresas de la industria de la alimentación es de 31.342,
representando así el 15,1% de toda la industria manufacturera. Dentro de este sector,
una de las industrias más importantes, es la relacionada con el mercado citrícola, que al
ser la industria que trata este TFM, se desarrollará más extensamente en el punto
siguiente.
1.3 La industria citrícola
Dentro del mercado de los cítricos, existen dos grupos claramente diferenciados,
el mercado de fruta fresca y el mercado de cítricos procesados. El primero, consiste en
vender la fruta en su estado natural, es decir, sin alterar su estado físico. El segundo,
compra la fruta fresca y realiza transformaciones y modificaciones hasta llegar a otro
subproducto, por ejemplo, el zumo o la mermelada. El consumo en fresco de los frutos
es una de las características que determinan la citricultura española.
España figura entre los 10 primeros productores mundiales de cítricos, frutas y
hortalizas. Ocupa la sexta potencia como productor de cítricos, y concretamente la sexta
posición como productor de naranjas (tras Brasil, China, India, Estados Unidos, y México)
y la segunda de mandarinas (tras China). La producción mundial de naranjas en la
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campaña 2018-2019 llegó a alcanzar los 54,3 millones de toneladas, aumentando 6,3
millones de toneladas respecto al año anterior, debido principalmente a las condiciones
meteorológicas muy favorables de los Estados Unidos y Brasil.
Atendiendo a la superficie citrícola cultivada en España, el naranjo supone un
48%, el mandarino un 38,1% y muy por detrás, estarían el limonero con un 12,6% y el
pomelo con el 0,6%.
Según la FAO, España es el principal exportador de cítricos del mundo. Las zonas
principales donde se concentra la producción son la Comunidad Valenciana, Andalucía
y la Región de Murcia. Aproximadamente, se destina un 60% de lo que se produce a los
mercados internacionales y del resto, el 20% se destina para consumo propio en fresco
y el otro 20% se dirige a la industria del zumo y otros. Concretamente, la Comunidad
Valenciana es la primera región española exportadora de cítricos, representando un 76%
del total de España y este porcentaje se incrementa para mandarinas hasta un 86% y
para naranjas en un 78%. En términos generales, el comercio internacional de las
naranjas gira en torno a tres exportadores principales que representan
aproximadamente el 60% de todo el comercio mundial, estos son España, Sudáfrica y
Egipto.
Atendiendo al Boletín de Comercio Exterior de Cítricos de la campaña 2018-2019
de la Dirección General de Producciones y Mercados Agrarios facilitada por el Ministerio
de Agricultura, Pesca y Alimentación, la cantidad de cítricos exportados por España fue
de 3.940.297 toneladas, con un valor de más de 3.000 millones de euros. El 91% de los
cítricos tuvieron como destino el mercado de la Unión Europea, siendo la naranja el
cítrico más exportado en volumen. En la Tabla 3 se puede apreciar la evolución del
comercio exterior de cítricos en España desde el año 2011 hasta 2018, haciendo
referencia tanto a exportaciones como importaciones.
Tabla 3. Comercio exterior de cítricos de España. [7]
CAMPAÑAS EXPORTACIONES (t) IMPORTACIONES (t)
2011-2012 4.003.143 184.248 2012-2013 4.009.499 193.449
2013-2014 3.874.665 161.233 2014-2015 4.292.591 192.698
2015-2016 3.646.174 272.930 2016-2017 3.627.201 278.620 2017-2018 3.940.297 209.617
1.3.1 La recolección y el transporte de los cítricos
El momento de la recolección es de vital importancia en la industria citrícola, ya
que afectará de forma crítica a la calidad final de la fruta. La mayor parte de los podridos
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visibles tanto en los almacenes citrícolas como de cara al consumidor, son debidos
mayoritariamente a los daños producidos durante la recolección, y es por ello por lo que
se deben disminuir estas lesiones.
La recolección de los cítricos se realiza a mano. En algunos países es muy común
realizarla a tirón, pero con esta técnica se suelen romper los tejidos, generando así un
punto de ataque para los hongos fitopatógenos. Por ello, se ha de realizar empleando
unos alicates específicos, con puntas curvadas y un realce en la contrahoja para que no
raspe la fruta, que cortan el pedúnculo lo más corto posible a ras del cáliz y de esta forma
se evita poder pinchar a otros frutos en el transporte.
Figura 2. Recolección de cítricos con un alicate específico para no dañar los frutos.
El trato del fruto debe ser cuidadoso para evitar producir golpes y lesiones que
deriven a corto plazo en heridas o roturas y a largo plazo en manchas, que más tarde se
convertirán en podredumbre por la acción de los hongos. Por este motivo, se debe evitar
tirar desde una cierta altura los frutos al recipiente de cosecha, volcar sin cuidado alguno
la fruta desde el recipiente de cosecha a las cajas de transporte y se debe procurar no
apretar demasiado la fruta durante la recolección.
Los frutos que están en el suelo no deben de ser recolectados, ya que aparte de
haber sufrido un impacto al caer del árbol y poseer ciertos tejidos más débiles también
han estado en contacto con los hongos del suelo y pueden contagiar así al resto de frutos
sanos.
La cosecha debe realizarse en el período adecuado y con la madurez suficiente,
este último parámetro se determina mediante el índice de madurez (IM) del fruto y es
uno de los aspectos más importantes en la recolección de críticos. [8] Los cítricos son
frutos no climatéricos, por tanto, cuando se separan del árbol no continúan madurando
y no pueden llegar a alcanzar el equilibrio entre la concentración de azúcares y acidez.
En muchas ocasiones, el consumidor asocia la madurez con el color, y por este motivo
se ha fijado un índice de color (IC) mínimo para cada variedad.
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Otro factor importante son las condiciones climáticas. Es importante que la
recolección no empiece hasta que la fruta esté completamente seca, [9] ya que sobre la
piel mojada o con rocío, el recolector puede llegar a dejar los dedos marcados. [10]
Además, el agua que haya absorbido la corteza hace que las glándulas oleíferas estén
más turgentes y, por tanto, cualquier roce durante la recolección puede provocar su
rotura y en consecuencia la salida de su aceite esencial, siendo este fitotóxico para el
propio fruto, produciendo una vía de entrada para los patógenos.
Una vez los cítricos han sido recolectados, deben ser transportados lo antes
posible al almacén atendiendo una serie de cuidados. Así, para evitar que se aplaste la
fruta, la altura de llenado de las cajas no debe superar la altura de esta y las cajas deben
estar bien sujetas. Además, el transportista debe llevar una velocidad adecuada para
evitar demasiados roces entre los frutos.
1.3.2 Tratamiento de los cítricos recolectados
Cualquier proceso al que se someta a la fruta una vez recolectada, ya sea físico o
químico, entre otros, se trata de un tratamiento postcosecha.
Los procesos productivos desarrollados en las centrales citrícolas difieren en
función de la especie, variedad, época de recolección, especificaciones del cliente y
destino comercial, aunque hay muchas etapas comunes desde que entra el producto
hasta que sale para su comercialización.
A continuación, se van a describir las etapas más importantes para el procesado
de los cítricos: [11]
I. Recepción de las materias primas
Se descarga la fruta del camión y se realiza un control inicial de la mercancía,
comprobando la procedencia y el código de trazabilidad. Además, también se realiza al
azar un control de calidad mediante una toma de muestra.
A continuación, los palés pasan por un dréncher para reducir al máximo los
problemas de contaminación y controlar el podrido minimizando la proliferación de
esporas de hongos. Se basa en un circuito cerrado de lavado que, aparte de agua y cloro,
también puede contener fungicidas.
Después, el producto puede ser directamente almacenado hasta su procesado
final o llevado a la cámara de desverdización, dependiendo de la época y estado de
maduración del fruto. En las salas de desverdizado se deben tener en cuenta diversos
parámetros, como la humedad relativa, la temperatura, la concentración de etileno y de
dióxido de carbono.
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II. Volcado y pre-selección
La primera operación realizada en la línea de confección es la despaletización y
una vez se vuelcan los frutos en la cinta transportadora, se realiza una primera tría. Se
eliminan los restos del campo, los frutos no aptos o que presenten defectos y
podredumbres y los frutos aún no maduros, que volverán de nuevo a ser desverdizados.
III. Lavado y pre-secado
Los cítricos son lavados y desinfectados con agua y agentes de limpieza mediante
balsas, duchas en cascada o duchas con difusores. Así se consigue eliminar al máximo la
suciedad y los residuos depositados sobre la piel de la fruta. Tras el lavado, la fruta pasa
por un túnel donde es pre-secada con aire a temperatura ambiente para eliminar así la
humedad.
IV. Encerado y secado
Como consecuencia del lavado, los cítricos han perdido parte de su cera natural
y es necesario su reposición para evitar que la fruta se deshidrate y pierda valor
comercial. Por tanto, después del pre-secado los frutos pasan a la zona de encerado,
donde son envueltos con ceras o recubrimientos comestibles, minimizando así la
transpiración y la deshidratación, aportando brillo, retrasando la senescencia y
preservando los frutos frente a los hongos y las bacterias.
Después de encerar, los frutos pasan al túnel de secado, dado que las
formulaciones céreas son emulsiones acuosas que tras su aplicación deben secarse para
evaporar el agua y conseguir que se forme adecuadamente la película.
V. Tría, calibrado y envasado
Una vez secados, los frutos considerados aptos en la mesa de tría son calibrados
y clasificados según volumen y diámetro. El envasado depende de la demanda de los
consumidores. Normalmente se tienen dos situaciones distintas: el envasado con mallas
o el envasado a granel.
Figura 3. Calibrador de rodillos. [11]
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VI. Refrigeración y expedición
Todos los productos confeccionados, son trasladados a una cámara de pre-
enfriamiento para que alcancen la temperatura de conservación y posteriormente se
almacenan en la cámara de conservación hasta su expedición.
1.3.3 Ceras y recubrimientos comestibles
Para conseguir aumentar el periodo de comercialización del cítrico recolectado
es fundamental la etapa de encerado mencionada en el apartado anterior.
El empleo de ceras se remonta al siglo XII-XIII, donde se sumergían los frutos en
cera fundida. Después, se pasó a formular ceras solventes que se acabaron prohibiendo
debido a sus problemas de aplicación. Finalmente se llegó a las ceras al agua, basadas,
en su mayoría, en combinaciones de emulsiones céreas y disoluciones de resina. Las
ceras son recubrimientos que se colocan en la superficie de las frutas con el objetivo de
reponer las propiedades barrera de las ceras naturales propias del fruto, perdidas en la
etapa de lavado, o de aumentarlas. Las ceras aportan brillo y tienen la función de
disminuir la intensidad respiratoria del fruto generando así una barrera al oxígeno y al
vapor de agua que evita la deshidratación.
Para la elaboración de ceras para cítricos y frutas en general se usan los aditivos
alimentarios incluidos en el Reglamento (CE) n° 1333/2008, donde aparecen las materias
primas que se pueden utilizar para recubrir las superficies de los cítricos y otro tipo de
frutas, los cuales se muestran en la Tabla 4. Hoy en día, las más empleadas son las
disoluciones de goma laca combinadas con emulsiones de polietileno, pero no son
aplicables en las líneas ecológicas al ser este último de origen sintético. Como
sustitución, se usan emulsiones a base de cera de carnauba que pueden estar
combinadas con disoluciones de goma laca.[12]
Tabla 4. Aditivos alimentarios autorizados en la UE para el tratamiento de la superficie
de los cítricos frescos sin pelar. [13]
NÚMERO DE ADITIVO DOSIS MÁXIMA LEGAL
(mg/l o mg/kg) DESCRIPCIÓN
E 200-203 20 Ácido sórbico y sorbatos
E 445 50 Ésteres glicéridos de colofonia de
madera E 901 Quantum satis Cera de abeja blanca y amarilla E 902 Quantum satis Cera candelilla
E 903 200 Cera carnauba E 904 Quantum satis Goma laca
E 912 Quantum satis Ésteres de ácido montánico E 914 Quantum satis Cera de polietileno oxidada
E 473-474 Quantum satis Sucroésteres de ácidos grasos y
sucroglicéridos
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Los recubrimientos comestibles (RC) se definen como una delgada capa de
material depositada alrededor del alimento a través de una pulverización o inmersión y
que pueden consumirse como parte del producto. Con ellos se crea una atmósfera
modificada en torno al fruto que proporciona una barrera semipermeable que tiene el
objetivo de mantener la calidad nutricional y prolongar su vida útil. [14] Los RC poseen
buenas propiedades barrera frente al agua, el oxígeno, el CO2, el etileno y la humedad.
Además, mejoran el aspecto visual, manteniendo la firmeza y el color de las frutas.
Estos recubrimientos comestibles son de origen natural y poseen un grupo
hidrofóbico (lípidos, ceras…) o un grupo hidrofílico (polisacáridos, proteínas…),
pudiendo tener para mejorar su función, una combinación de ambos. [15] Además, se les
suelen añadir otros dos componentes importantes, los emulsificantes y plastificantes.
Los plastificantes se añaden para mejorar la flexibilidad y la funcionabilidad de los
recubrimientos, mientras que los emulsificantes se usan para favorecer la dispersión de
los componentes en la matriz y reducir la actividad de agua en la superficie. Los
recubrimientos comestibles se dividen principalmente en 3 tipos:
A. Hidrocoloides
Los hidrocoloides son polímeros hidrofílicos de origen animal, vegetal o sintético.
Por lo general, se disuelven parcial o totalmente en agua y aumentan la viscosidad de la
fase acuosa, actuando como estabilizador.[16] Se dividen en dos clases, hidrocoloides a
base de polisacáridos e hidrocoloides a base de proteínas.
- A base de polisacáridos
Estas cadenas de polímeros poseen excelentes propiedades de barrera gaseosa,
pero malas propiedades frente a la humedad, ya que son solubles en agua. Dentro de
este grupo se encuentran:
1. Derivados de celulosa: metil celulosa, hidroxipropil celulosa (HPC), hidroxipropil metil
celulosa (HPMC), metil etil celulosa (MEC) y carboximetil celulosa (CMC), entre otros.
2. Almidón y derivados: el almidón es una macromolécula formada por dos polímeros
distintos, la amilosa (25%) y la amilopectina (75%), cuya estructura molecular se puede
observar en la Figura 4. Se obtiene a partir de cereales como el trigo, el maíz y el arroz,
a partir de tubérculos como la patata o a través de las legumbres.
3. Quitosano: es un biopolímero de aminopolisacáridos que posee excelentes
propiedades mecánicas y elevada viscosidad. Se elabora de forma comercial mediante
la desacetilación parcial de la quitina, un elemento estructural que forma parte del
exoesqueleto de los crustáceos (cangrejos, gambas, langostas , etc.) y de insectos.
4. Gomas: pueden ser extraídas a partir de vegetales terrestres o marinos y o de
microorganismos y poseen la capacidad de incrementar la viscosidad en solución. Se
clasifican de la siguiente manera:
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o Gomas extraídas de plantas marinas, como el alginato, la goma agar, la goma
carragenana.
o Gomas extraídas de semillas de plantas terrestres, como la goma aguar.
o Gomas obtenidas como exudados de plantas terrestres, como la goma arábica.
o Gomas obtenidas a partir de procesos microbiológicos como la goma xantana.
o Gomas obtenidas por modificación química de productos vegetales como las
pectinas.
Figura 4. Estructura molecular de la amilosa y la amilopectina.
- A base de proteínas
El RC a base de proteínas posee excelentes propiedades frente al oxígeno y
aromas, pero no es una buena barrera para el vapor de agua, debido a su naturaleza
hidrofílica. Dentro de este grupo se encuentran por un lado las proteínas vegetales como
son la zeína del maíz, el gluten del trigo y la proteína de la soja y por otro lado las
proteínas animales como las proteínas del suero, la ovoalbúmina, el colágeno, etc. [16]
B. Lípidos
Los lípidos se caracterizan por ser no poliméricos e hidrofóbicos, con muy buenas
propiedades barrera frente al agua, pero malas propiedades mecánicas, debido a su
falta de cohesividad e integridad estructural que dan lugar a películas quebradizas.
Entre los materiales empleados para la formación de recubrimientos a base de
lípidos están las ceras (abejas, carnauba y candelilla), las resinas, los monoglicéridos, los
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diglicéridos y los ácidos grasos (ácido esteárico, palmítico, láurico y oleico, entre
otros).[17]
C. Combinaciones
Los revestimientos multicomponentes contienen una combinación de
polisacáridos, proteínas y lípidos, con la finalidad de mejorar las propiedades mecánicas
y barrera tanto al O2 como al vapor de agua. Estos compuestos se pueden dividir en
compuestos bicapa y en conglomerados. Los compuestos bicapa se basan en la
combinación de dos capas de materiales iguales o diferentes (proteína/proteína,
lípidos/lípidos, polisacáridos/proteína, lípidos/polisacáridos, etc.) y los conglomerados
en la unión de más de dos componentes de diferente naturaleza. [18]
Tanto en ceras como en recubrimientos, existe la posibilidad de incorporar
aditivos alimentarios como agentes antimicrobianos y antioxidantes para evitar el
crecimiento microbiano, retrasar el pardeamiento enzimático o la aparición de
desórdenes fisiológicos.
1.3.4 Seguridad y calidad alimentaria de cítricos en postcosecha
La demanda por parte de consumidores y de instituciones de alimentos seguros
y libres de contaminaciones obliga a tener un control exhaustivo de calidad y seguridad
alimentaria. Respecto al concepto de calidad, hay una vinculación de los sistemas de
gestión de calidad empresarial con los programas de calidad del producto. [19]
La calidad en la gestión empresarial viene dada por las normas de la serie ISO,
destacando la ISO 9001:2000 y la ISO 14001:2004 de Gestión Medioambiental. También
es posible que se rija por la implementación de un sistema de autocontrol por parte de
la empresa para detectar los puntos críticos respecto a sanidad e higiene del proceso de
producción de los productos. Asimismo, los programas de calidad del producto están
regidos por organismos tanto públicos como privados. Por un lado, está la
Reglamentación de la Unión Europea, que ha establecido una serie de principios de
carácter obligatorio para poder llegar a su propio mercado. A continuación, se van a
enumerar algunos de ellos extraídos de AECOSAN, la Agencia Española de Consumo,
Seguridad Alimentaria y Nutrición:
A. El Reglamento (CE) n° 852/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo del 29 de abril
de 2004 relativo a la higiene de los productos alimenticios. Este reglamento y sus
anexos definen una serie de objetivos de seguridad alimentaria que deben cumplir
las empresas alimentarias. Mediante este, la Unión Europea (UE) pretende garantizar
la higiene de los alimentos en todas las fases del proceso de producción, desde la fase
de producción primaria, incluyendo también el transporte, la manipulación y el
almacenamiento, hasta el consumidor final. Además, también se incluye la obligación
por parte de los operadores de la empresa alimentaria de crear, aplicar y mantener
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un procedimiento permanente basado en los principios del plan APPCC (Análisis de
Peligros y Puntos Críticos de Control) del Codex Alimentarius, basado en prevenir
posibles riesgos químicos, físicos o biológicos en toda la cadena de suministro.
B. El Reglamento (CE) n° 178/2002 del Parlamento Europeo y del Consejo del 28 de
enero de 2002 por el que se establecen los principios y los requisitos generales de la
legislación alimentaria, se crea la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA)
y se fijan los procedimientos relativos a la seguridad alimentaria. Es conocido como
el Reglamento sobre la legislación alimentaria general y hace hincapié en la
trazabilidad, tanto de alimentos importados a la UE o exportados desde ella. Se
entiende por trazabilidad a la posibilidad de encontrar y seguir el rastro, a través de
todas las etapas de producción, transformación y distribución de un alimento.
C. El Reglamento (CE) n° 2536/98 de la Comisión de las Comunidades Europeas de 26
de noviembre de 1998 que modifica el Reglamento (CEE) n° 920/89 por el que se
establecen normas de calidad para las zanahorias, los cítricos, las manzanas y peras
de mesa. Respecto a los cítricos, se establece una definición del producto, las
disposiciones relativas a la calidad (requisitos mínimos visuales, requisitos de
madurez y clasificación), disposiciones relativas al calibrado (peso mínimo y
homogeneidad), disposiciones relativas a la tolerancia (tolerancias de calidad y de
calibre), disposiciones relativas a la presentación (homogeneidad y
acondicionamiento) y disposiciones relativas al marcado del producto (identificación,
naturaleza del producto, origen, características comerciales y marca oficial de
control).
Por otro lado, están los estándares de calidad de organismos privados y, entre
estos protocolos usados como certificaciones de calidad, destacan la norma IFS
(International Featured Standard) creada por distribuidores alemanes, franceses e
italianos; la norma BRC (British Retail Consortium) desarrollada por los británicos y
GLOBALG.A.P. (Good Agricultural Practices).
1.4 Enfermedades postcosecha
Uno de los principales problemas que afectan a la industria citrícola son las
enfermedades postcosecha de los productos que van a ser comercializados. Las
infecciones de los frutos pueden ocurrir en cualquier etapa de su vida útil, antes de su
cosecha, durante su cosecha o en postcosecha. Pero, en el caso de los cítricos,
predominan los problemas desde que son recolectados hasta que llegan al consumidor,
destacando las enfermedades causadas por hongos filamentosos patógenos que derivan
en podredumbres. Así pues, conviene controlar en la medida de lo posible las
condiciones del fruto en todo su ciclo y sobre todo en postcosecha para minimizar las
pérdidas económicas. Los factores que determinan la incidencia de la enfermedad son
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el microorganismo patógeno, el huésped y las condiciones del ambiente, que es lo que
se conoce como triángulo de la enfermedad (Figura 5).
Figura 5. Triángulo de la enfermedad.[20]
Las enfermedades de postcosecha en cítricos que causan podredumbres se
clasifican en dos grupos atendiendo al momento de la infección. Por un lado, están las
infecciones precosecha causadas mayoritariamente por los llamados patógenos latentes
o quiescentes. Estos patógenos infectan el fruto en el campo, pero por diferentes
razones, permanecen inactivos hasta después de la recolección, causando e ntonces la
pudrición. Este conjunto engloba la podredumbre gris (Botrytis cinerea), la marrón
(Phytophthora citrophthora), la negra (Alternaria citri), la antracnosis (Colletotrichum
gloesporioides) y la podredumbre peduncular causada por los hongos Lasiodiplodia
theobroamae y Phomopsis citri. Por otro lado, se tienen las infecciones postcosecha
causadas por los patógenos de herida, donde la contaminación del fruto tiene lugar a
través de microheridas o heridas producidas en la corteza. Por lo general, estas heridas
tienen lugar durante la cosecha y posterior manipulación de la fruta, aunque también
pueden ocurrir antes de la cosecha por acción de los insectos u otras causas abióticas.
Dentro de este grupo se encuentra la podredumbre verde (Penicillium digitatum), la azul
(Penicillium italicum), la amarga (Geotrichum citri-aurantii) y la podredumbre causada
por el género Rhizopus (Rhizopus stolonifer).[21]
El problema de la podredumbre comienza al diseminarse las esporas de los
hongos. Estas se pueden encontrar tanto en el suelo del huerto como en las cámaras de
almacenaje y pueden ser transportadas por corrientes de aire hasta llegar a contaminar
a los frutos adyacentes. Si la corteza está intacta sin heridas, la infección no tendrá lugar,
pero si posee lesiones y las condiciones ambientales son las idóneas, si qué se producirá
Huésped susceptible
ENFERMEDAD
Patógeno infeccioso Ambiente favorable
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la infestación hasta colonizar los tejidos del fruto generando finalmente los síntomas de
podredumbre.[21]
Este trabajo se centra en combatir los patógenos de herida, concretamente los
causantes de la podredumbre azul, verde y amarga.
1.4.1 Penicillium italicum y Penicillium digitatum
Las condiciones ambientales de España, con clima mediterráneo y donde son
habituales los veranos poco lluviosos, favorecen las pérdidas producidas por los
patógenos Penicillium digitatum y Penicillum italicum, que causan respectivamente la
podredumbre verde y azul (Figura 6), siendo el primero el patógeno más común y de
mayor actividad reproductiva. La incidencia de ambas podredumbres es bastante
elevada ya que generan aproximadamente un 80% del total de las pérdidas por
podrido.[22]
Figura 6. Podredumbre verde (izquierda) y podredumbre azul (derecha) en
ensayos in vivo.
Se trata de hongos mesófilos que crecen en forma de filamentos y se reproducen
asexualmente por conidias, llegando a generar en una sola fruta hasta 1-2 millones de
estas. El aparato conidial que poseen es altamente frágil y suele deshacerse en bastantes
elementos celulares, dispersándose así fácilmente por el aire. [23]
El Penicillium digitatum fue descrito y clasificado en 1881 por Pier Andrea
Saccardo. Es capaz de germinar en los medios artificiales de agar extracto de malta
(MEA) y agar dextrosa de patata (PDA), y las colonias que se forman son planas con el
anverso de color verde oliva y el reverso de color amarillo opaco, como se puede
apreciar en la Figura 7. Se puede desarrollar fácilmente a 20 °C y humedad relativa alta.
El Penicillum italicum fue descrito por Carl Friedrich Wilhelm Wehmer en 1894.
Puede crecer entre 3 y 32 °C, aunque se desarrolla con más facilidad a 24 °C y humedad
relativa alta. Hay que mencionar que, este hongo, además de poder crecer en MEA y
PDA, también puede desarrollarse en agar de Czapek, aunque de forma más limitada.
Las colonias que se producen son de color azul o gris verdoso, planas y con frecuencia
de aspecto granular, visible en la Figura 7.
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Figura 7. Penicillium digitatum (1) e italicum (2) en cultivo in vitro con agar PDA
después de 10 días de incubación. [24]
En cuanto a la sintomatología de ambos patógenos, la infección suele ser
percibida a simple vista pasadas unas 48 h. [25] El área circular que rodea a la herida de
la corteza del fruto adquiere una decoloración más oscura y se puede hundir fácilmente
con la presión del dedo, debido a que estos hongos liberan enzimas hidrolíticas (sobre
todo poligalacturonasas y celulasas) que degradan la lignina reblandeciendo así los
tejidos. [26]
Respecto a la esporulación, dependiendo de la carga microbiana, tiene lugar
aproximadamente después de 3-5 días a temperaturas de incubación de 15-28 °C y se
expande radialmente generando una capa coloreada de textura aterciopelada. El P.
digitatum da una coloración verde oliva, rodeada por una banda ancha de micelio blanco
y denso. El P. italicum, tiene un área de esporulación de un tono azul o azul verdoso y
está rodeada por una banda fina de micelio blanco. Estas características se pueden
apreciar claramente en la Figura 6.
Se ha demostrado que los compuestos volátiles y no volátiles de la piel de los
cítricos estimulan la germinación y el crecimiento de P. digitatum y P. italicum. [25]
1.4.2 Geotrichum citri-aurantii
Otra podredumbre de herida que ocasionalmente puede ser importante es la
podredumbre amarga, causada por Geotrichum citri-aurantii. La temperatura para su
óptimo desarrollo es de 28 °C aproximadamente y también necesita una humedad
relativa de entre 80-90%. La patogenicidad de Geotrichum citri-aurantii implica la
secreción de endo-poligalacturonasas extracelulares (PG) que ayudan a la rápida
descomposición de los tejidos infectados, facilitando la enfermedad y produciendo un
reblandecimiento de la fruta. [27] El hongo se expande de forma radial y únicamente
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adquiere un color marrón oscuro la zona que está más en contacto con la herida y no se
produce ningún tipo de esporulación, como se observa en la Figura 8.
Figura 8. Geotrichum citri-aurantii en ensayos in vivo después de 7 días de
incubación a 28 °C (elaboración propia).
1.5 Tratamientos biocidas
Con el fin de minimizar las enfermedades postcosecha mencionadas en el punto
anterior, la industria citrícola emplea distintos tratamientos biocidas.
Se entiende por biocida cualquier sustancia o preparado que contenga una o más
sustancias activas, destinadas a destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir la acción o
ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo nocivo por medios químicos
o biológicos. [1] Según el Ministerio para la Transición Ecológica y el Reto Demográfico,
estos materiales están divididos en 22 tipos de productos basados en su uso, que se
pueden clasificar en cuatro grandes grupos (desinfectantes, plaguicidas, conservantes y
otros biocidas). Estas sustancias, antes de ser admitidas en el mercado y con
independencia del uso que se les vaya a dar, deben someterse a un proceso de
evaluación para su registro, autorización y comercialización. [28]
En el Reglamento (UE) n° 528/2012 relativo a la comercialización y uso de
biocidas, se presenta una lista exhaustiva de los tipos de biocida con una descripción de
cada uno de ellos y su respectiva aplicación. Por lo general, un buen biocida debe tener
las siguientes características: amplio rango de actividad (hogos, bacterias y virus), ser
muy efectivos incluso en bajas cantidades, alta persistencia, fácil de neutralizar, efectivo
a un amplio rango de pH, económico y de buena calidad, compatible con otras especies
químicas en el medio, poca toxicidad humana y solubilidad en agua. [29]
El uso de biocidas es esencial en la industria alimentaria. Según informes de la
FAO, aproximadamente un tercio de todos los alimentos producidos a nivel mundial se
pierden o se desperdician. Esto significa que 100 kg/año y 680 mil millones de dólares
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se tiran en países industrializados. Las frutas, las verduras, las raíces y los tubérculos
son los alimentos que presentan las tasas más altas de pérdidas, estimadas en torno al
45% en 2018, y la parte principal de estas pérdidas se produce desde que se cosechan
hasta que llegan al mercado. Los cambios fisiológicos y bioquímicos en los productos
básicos, así como las posibles lesiones físicas en la cosecha y durante el almacenamiento
prolongado, pueden favorecer el desarrollo de patógenos causantes de enfermedades,
siendo esta una de las causas más importantes de pérdidas a través de la cadena de
suministro.
La meta 12.3 de La Agenda 2030 para el Desarrollo Sostenible, pretende reducir
a la mitad para 2030 el desperdicio de alimentos por cápita a nivel minorista y de
consumo; y también reducir las pérdidas de alimentos a lo largo de las cadenas
productivas y de suministro, incluidas las pérdidas posteriores a la cosecha. Por ello, es
fundamental investigar en nuevos tratamientos biocidas sostenibles que consigan
aumentar el tiempo de vida del alimento recolectado.
1.5.1 Biocidas convencionales
Durante muchos años, las enfermedades postcosecha en todo el mundo han sido
controladas mediante la aplicación de fungicidas químicos sintéticos después de la
recolección. Cuando la fruta es tratada con este tipo de fungicidas, las pérdidas varían
entre el 2 y el 4 %, mientras que cuando no se realiza el tratamiento postcosecha o
únicamente se almacena en refrigeración, las pérdidas se pueden llegar a incrementar
hasta un 15 o 30 % del total de la fruta cosechada. [30] Estos materiales pueden tener
diferentes funciones: proporcionar un efecto rehabilitador contra infecciones
preexistentes, un efecto preventivo contra posibles nuevas infecciones o bien
proporcionar una inhibición de la esporulación que genera la ruptura de los ciclos de
infección. [21]
La eficacia de un fungicida viene dada por el tiempo y modo de aplicación en el
fruto (ducha, inmersión o aerosol), su composición y concentración, su pH y
temperatura en el momento de usarlo, así como la especie y la variedad de la fruta sobre
la cual se va a aplicar. [31]
Los fungicidas autorizados en la UE están regulados por el Reglamento (CE)
1107/2009, que deroga las Directivas 79/117/CEE y 91/414/CEE. La aprobación de un
producto fungicida supone la realización de una estricta evaluación de riesgos. [32]
Actualmente, los límites máximos de residuos (LMR) plaguicidas de todos los países de
la UE están en armonía, estableciendo el Reglamento 396/2005 referido a los límites
máximos de plaguicidas en alimentos y piensos de origen animal y vegetal. Su anejo II
recoge los LMR’s ya establecidos y armonizados, mientras que el anejo III recoge los
LMR’s temporales de aquellos que todavía no están armonizados. [33] En la Tabla 5, se
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puede observar la situación actual de los fungicidas que se pueden usar y comercializar
en la postcosecha de cítricos en la Unión Europea y en la Tabla 6, se pueden apreciar los
límites máximos de residuos (LMR) correspondientes a cada fungicida expresados como
mg/kg o ppm, tanto en la UE como en países terceros.
Tabla 5. Estado actual de los fungicidas en postcosecha de cítricos en la UE. [34]
FUNGICIDA INCLUSIÓN CADUCIDAD Fludioxonil 1/11/2008 31/10/2020
Fosetil-Al 1/05/2007 30/04/2021 Imazalil 1/01/2012 31/12/2024
Metil-tiofanato 1/03/2006 No definida la inclusión Ortofenilfenol 1/01/2010 31/12/2021 Pirimetanil 1/06/2007 30/04/2021
Propiconazol 1/06/2004 No renovación Tebuconazol 1/09/2009 30/06/2020
Tiabendazol 1/04/2017 31/03/2032
Estos fungicidas, por lo general, se aplican en las centrales citrícolas como
disoluciones acuosas mediante un sistema de ducha dréncher tras la recepción de la
materia prima del campo o también a través de balsas o duchas en la línea de
confección, como se ha mencionado en el apartado anterior. Sin embargo, el
ortofenilfenol, el imazalil y el tiabendazol también se pueden aplicar en las líneas de
confección, recubriendo la fruta al incorporarlos a las ceras, siguiendo el Reglamento
(CE) 1107/2009. Además, el imazalil puede aplicarse en forma gaseosa mediante botes
fumígenos. [32]
Tabla 6. Límites máximos de residuos fungicidas en postcosecha de cítricos (mg/kg) . [35]
PLAGUICIDA UE PAÍSES TERCEROS
Establecido Temporal SUIZA USA CANADÁ Fludioxonil 10 10 10 10 NML
Fosetil-Al 75 (1) 75 (1) 9 9 NML Imazalil 5 5 10 5 Metil-tiofanato 6 NMLP (2) 6 (2) - 10 (3)
Ortofenilfenol 10 5 10 10 Pirimetanil 8 8 10 10 NML
Propiconazol 9 N/5MLP 6 8 8 NML Tebuconazol 0,9 N/5MLP - 1N 1NM
Tiabendazol 7 5 10 10
(1) Suma de fosetil, ácido fosfónico y sus sales, expresado como fosetil.
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(2) Puede dar como metabolito carbendazima, que tiene un LMR de 0.2 en naranjas (N) y pomelos (P), y 0.7 en mandarinas (M) y limones (L), tanto en la UE como en Suiza. No se tolera en USA en frutos cítricos.
(3) Conjuntamente residuos de metil tiofanato y carbendazima.
Para luchar contra la podredumbre verde y azul, tradicionalmente se han
empleado los fungicidas de síntesis química como el imazalil o el tiabendazol. [36]
Recientemente, se ha incluido como parte de fungicidas autorizados el pirimetanil, [37]
aunque, han empezado a aparecer cepas resistentes a ambos compuestos. Así, se ha
detectado en los últimos años, que un porcentaje aproximado del 30% de P. digitatum
aislados son resistentes al imazalil y en Cataluña también se han identificado varias
cepas aisladas de ambas especies resistentes al tiabendazol. [38]
El tratamiento tradicional para el control de Geotrichum citri-aurantii hasta el día
de hoy se ha basado también en los fungicidas sintéticos. En este caso, a diferencia del
género Penicillium, el tiabendazol y el imazalil no sirven para combatir la podredumbre
amarga, dado que muchas cepas son resistentes a varios ingredientes activos de su
composición. [39] También se ha detectado que el o-fenilfenato de sodio y la guazatina
tienen efecto sobre la enfermedad, pero su uso se encuentra restringido por presentar
riesgo de fitotoxicidad y ser un peligro para la seguridad humana. [40,41] Por último, el
propiconazol, era el único fungicida en activo contra esta infección, pero a partir del 19
de marzo del 2020 se ha prohibido su uso en los países de la Unión Europea debido a un
estudio realizado por “European Food Safety Authority”, lo que supone una desventaja
respecto a otras citriculturas en las cuales sí puede utilizarse este compuesto activo. [41]
Así pues, en la actualidad, no se dispone de ningún fungicida específico, válido y eficaz
contra Geotrichum citri-aurantii.
Sin embargo, la aplicación de forma continuada de fungicidas da lugar a la
generación de un exceso de residuos químicos, obliga al tratamiento de los caldos
residuales para evitar la liberación de dichos residuos químicos al medioambiente y
puede dar lugar al desarrollo de cepas patogénicas resistentes a los tratamientos. Esto
ha generado mucha preocupación en la población y por este motivo, se ha establecido
a nivel legislativo la Directiva 2009/128/CE relativa al uso sostenible de los plaguicidas.
Según esta Directiva, los Estados miembros han de adoptar Planes de Acción Nacionales,
PAN, mediante los cuales se reducen los posibles riesgos y efectos sobre el
medioambiente y la salud humana. La Directiva también obliga a la Gestión Integrada
de Plagas, GIP. Esta estrategia de control consiste básicamente en la aplicación racional
de unas medidas biológicas, químicas, biotecnológicas, de cultivo o de selección de
cultivo, intentando minimizar el uso de fitosanitarios. [42]
El empleo de fungicidas convencionales también se ve influenciado por una
continua alteración en la tendencia de la comercialización de productos hortofrutícolas.
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Por una parte, el volumen de productos ecológicos y orgánicos en el mercado ha
aumentado considerablemente y en ellos se exige la ausencia total de residuos químicos
en el producto final, lo que impide el uso de fungicidas químicos. Por otra parte, algunos
supermercados y cadenas alimentarias establecen LMR’s más restrictivos que los
establecidos por la legislación. Según el supermercado, se establece un máximo de entre
3 y 5 sustancias activas en la fruta, incluyendo aquí los posibles residuos fitosanitarios
aplicados en el campo, lo que dificulta el uso de fungicidas convencionales. [42]
Por último, cabe mencionar otro aspecto importante que afecta a los fungicidas
químicos de postcosecha. Su síntesis requiere un largo período de tiempo y es un
proceso costoso, por tanto, a las empresas que los fabrican les resulta poco rentable.
1.5.2 Estrategia CINCEP
Los inconvenientes descritos en el apartado anterior respecto a los controles
químicos convencionales muestran la necesidad de encontrar nuevas opciones para el
control de enfermedades postcosecha de cítricos, es por ello por lo que desde hace ya
unos cuantos años, muchas empresas privadas y centros de investigación se han puesto
manos a la obra para dar con tratamientos antifúngicos sustitutivos. Estos nuevos
agentes deben ser poco tóxicos, no contaminantes y presentar una actividad
fungistática, es decir, suspender el crecimiento y desarrollo de los hongos o la
germinación de sus esporas, a diferencia de los fungicidas tradicionales que matan a los
fitopatógenos. No obstante, hay que tener en cuenta que su capacidad de actuación
puede verse alterada por factores externos, lo cual supone una dificultad para su uso
comercial debido a la alta variación de su respuesta. Atendiendo su mecanismo de
acción pueden ser o bien curativos para controlar infecciones fúngicas ya existentes o
bien preventivos para proteger al fruto y según su naturaleza pueden ser físicos,
químicos o biológicos. [42]
Han aparecido investigaciones sobre estos nuevos agentes, pero estos han
mostrado que la persistencia, el espectro de acción o la efectividad, tanto de forma
unitaria como combinada, son menores a los ofrecidos por los fungicidas
convencionales. Por ello, el control adecuado de las enfermedades no puede centrarse
únicamente en la aplicación de estos tratamientos antifúngicos después de la cosecha,
sino que debe basarse en una táctica de control más amplia. De aquí nace la estrategia
CINCEP, Control Integrado No Contaminante de Enfermedades de Postcosecha. Esta
estrategia se basa en el entendimiento de la epidemiología de los patógenos y de los
factores que determinan su incidencia en precosecha (cultivo, condiciones
climatológicas y de parcela, manejo en campo…), cosecha (momento, modo…) y
postcosecha (higienización de centrales, diseño de instalaciones, manejo en las líneas
de confección, condiciones de conservación y comercialización, mercado de destino…)
para incidir de forma conjunta sobre el problema, actuando en el momento adecuado
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sobre cada uno de estos factores con el objetivo de minimizar las pérdidas económicas.
Esto requiere grandes esfuerzos y la apertura de muchos frentes de investigación, tanto
de carácter general como particular, con el objetivo de innovar y crear nuevos
conocimientos. Con la estrategia CINCEP se obtendrían productos hortofrutícolas con
los sellos de calidad de “Residuo Cero” y también sería aplicable a sistemas de
producción ecológica. [37] El trabajo de este TFM pretende contribuir al desarrollo de esta
estrategia.
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2. OBJETIVOS
En base a la situación descrita y a los problemas planteados, el objetivo principal
de este proyecto es el desarrollo de materiales con actividad biocida basados en
componentes de origen natural y su posterior aplicación en cítricos, con la finalidad de
controlar el crecimiento de los hongos y conseguir así retrasar su putrefacción y alargar
la vida útil. Para ello, se plantean los siguientes objetivos específicos:
− Hacer un estudio bibliográfico exhaustivo de las posibilidades de uso de
procedimientos alternativos a fungicidas convencionales.
− Sintetizar y caracterizar diversas sustancias biocidas basadas en aceite esencial
de tomillo soportado sobre materiales zeolíticos y arcillosos.
− Preparar recubrimientos alimentarios a los que se incorpora dicho soporte
impregnado.
− Aplicar y estudiar in vivo la actividad de las sustancias biocidas incorporadas en
recubrimientos alimentarios en mandarinas contra los hongos fitopatógenos
más comunes que se desarrollan en cítricos (Penicillium digitatum, Penicillum
italicum, Geotrichum citri-aurantii).
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3. ANÁLISIS BIBLIOGRÁFICO DE PROCESOS ALTERNATIVOS AL USO DE
FUNGICIDAS TRADICIONALES
La finalidad de este TFM es estudiar el uso de nuevos materiales con actividad
fungicida que constituyan una alternativa a los procesos químicos utilizados
actualmente. Por ello, el primer objetivo de este trabajo es realizar un estudio
bibliográfico exhaustivo de los procedimientos alternativos a los fungicidas
convencionales aplicado a cítricos.
Esta línea de investigación es considerada en todo el mundo como una estrategia
CINCEP y busca desarrollar tratamientos postcosecha antifúngicos y no contaminantes
alternativos a los fungicidas de uso convencional. Estos procedimientos se pueden
clasificar según su naturaleza en físicos, biológicos y químicos de bajo riesgo.
3.1 Métodos físicos
El uso de tratamientos físicos no deja ningún tipo de residuo en los frutos
tratados y tiene un impacto minúsculo para el medio ambiente. Dentro de estos
procedimientos despuntan los tratamientos por calor como el curado y el empleo de
agua caliente, las radiaciones ionizantes y no-ionizantes y las atmósferas controladas
(convencionales, hipobáricas y ozonizadas) y modificadas. [43]
Los tratamientos por calor o las irradiaciones tienen la finalidad de reducir la
incidencia de podredumbres, en cambio, la conservación frigorífica con atmósferas
controladas únicamente ejerce una acción fungistática de inhibición o retraso de
crecimiento de los patógenos, es decir, no tienen actividad fungicida siendo así
tratamientos complementarios. [44]
3.1.1 Tratamientos con calor
La inmersión en agua caliente y los tratamientos con aire caliente a temperaturas
superiores a 40 °C e inferiores a 60 °C, de unos segundos a varias horas, han ofrecido
resultados prometedores para controlar patógenos en diversas frutas, como manzanas,
peras, cítricos, melones, plátanos y bayas. [45] Los efectos que poseen estos tratamientos
pueden ser de carácter directo e indirecto. Los efectos directos, pueden producir la
elongación del tubo germinativo de los conidios o la inhibición de la germinación de las
esporas y damnificación de las hifas fúngicas en crecimiento. Los efectos indirectos
hacen referencia a la estimulación de resistencia del fruto huésped hacia la infección
problema, [46] mediante la formación de sustancias como la escoparona y la esopoletina
de carácter bacteriostático y farmacológico, [47] proteínas como la quitinasa o la β-1,3-
glucanasa relacionadas con la patogénesis [48] o la inhibición de la síntesis de enzimas
hidrolíticas de la pared celular como las poligalacturonasas. [46]
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3.1.1.1 Tratamientos con aire caliente o curado
Se trata de un método por el cual, una vez llegados los frutos a la central citrícola
tras la recolección, se almacenan a una humedad relativa superior al 90% y una
temperatura mayor de 30 °C, en períodos de 1 a 3 días. Esta técnica no se está
empleando mucho a nivel comercial dado su elevado coste y, además, puede tener
efectos adversos sobre la fruta, disminuyendo su calidad debido a un exceso de calor
que genera fitotoxicidades o pérdidas de peso. [49]
3.1.1.2 Tratamientos con agua caliente
En cítricos, los tratamientos con agua caliente se pueden aplicar durante la
postcosecha, ya sea sumergiendo el fruto en agua caliente o rociándolos con agua
caliente mientras se mueven en la línea transportadora. Con esta metodología se
pueden lograr los efectos beneficiosos ofrecidos por el curado de forma más barata y
simple. El tiempo de aplicación del tratamiento térmico depende de la temperatura del
agua, usándose en cítricos temperaturas del agua que van desde 40 °C a 65 °C. [50]
A pesar de ser tratamientos efectivos tanto para la podredumbre verde como
azul, tienen poca persistencia y hay poco margen de actuación entre las temperaturas
óptimas y las que pueden causar daños definitivos en la superficie. Por ejemplo,
temperaturas superiores a 53 °C pueden resultar fitotóxicas y por este motivo, deben
realizarse experimentos de optimización para determinar la temperatura del agua y el
período de tratamiento. [51]
3.1.2 Irradiaciones
Varios estudios han señalado que la aplicación tanto de irradiaciones no
ionizantes (UV-C, UV-B, luz azul) como ionizantes (rayos gamma, β y X) tienen el
potencial de reducir la cantidad de enfermedades fúngicas en los cítricos, dependiendo
esto del tipo de irradiación y de su capacidad de penetración. [52]
3.1.2.1 Radiaciones ionizantes
Las radiaciones ionizantes, pueden ser obtenidas a partir de fuentes radioactivas
que emiten dichas radiaciones de forma espontánea (rayos gamma) o a través de
generadores artificiales (generadores de rayos X) o aceleradores de partículas (rayos β
o electrones acelerados).
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- Rayos Gamma
Hasta la fecha de hoy, los irradiadores gamma utilizan el cobalto-60 o el cesio-
137 como fuentes radiactivas, siendo el cobalto-60 el más usado. A bajas dosis es capaz
de retardar la maduración del fruto inhibiendo la producción de etileno y la tasa de
respiración y es un tratamiento prometedor para reducir la decadencia de cítricos
postcosecha gracias a sus efectos perjudiciales sobre la fisiología fúngica y su capacidad
de penetración. [53] La eficiencia de este método está vinculada a la radiosensibilidad de
cada patógeno. Se ha investigado recientemente el efecto de la irradiación gamma en
el crecimiento del moho verde en cítricos y se ha encontrado que el crecimiento fúngico
era inhibido, pero este dependía de la dosis aplicada. Aunque una dosis de 1 kGy puede
inhibir perfectamente el crecimiento de P. digitatum, no es posible su aplicación, dado
que genera fitotoxicidad causando manchas y daños en la superficie de los cítricos. [52]
Así pues, este método no se ha generalizado como técnica de control de
enfermedades dado que, a dosis no fitotóxicas, es decir, inferiores a 1 kGy, su poder de
penetración y su efectividad en el fruto son limitados y no se compensa el elevado coste
de las instalaciones. [54] Como alternativa se propone utilizar dosis de menor cantidad,
como por ejemplo de 0,25-0,50 kGy, en combinación con otros tratamientos
complementarios. [49]
- Rayos X
Los rayos X son radiaciones electromagnéticas de menor energía que los rayos
gamma, con frecuencias de 1016-1019 Hz. [55] Se han realizado algunos estudios que
investigan el efecto de la irradiación de rayos X en el control de mohos verdes y azules
en cítricos. Concretamente, un estudio demostró que la irradiación con rayos X (510 y
875 Gy) en mandarinas intactas aumenta la biosíntesis en la corteza de fitoalexina
escoparona y escopoletina, ambas sustancias relacionadas con la resistencia que ofrece
el fruto al ataque de un patógeno. Se inoculó Penicillium digitatum en clementinas y se
irradiaron con 510 Gy y se observaron mayores niveles de escoparona y escopoletina
que en los frutos no irradiados y además se inhibió el moho verde. Por el contrario, un
tratamiento de irradiación a 875 Gy presentó fitotoxicidad y no indujo la producción de
fitoalexinas ni previno el moho verde en las heridas de la corteza. [56]
- Haces de electrones de alta energía
Los haces de electrones se generan a partir de fuentes mecánicas como un
acelerador lineal o un generador Van de Graaff a velocidad próxima a la luz, pero debido
a la pequeña cantidad de electrones generados, estos no pueden penetrar
profundamente en un producto. Sin embargo, los aceleradores de electrones parecen
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ser más usados que los rayos gamma debido a que no requieren reabastecimiento de la
fuente radioactiva, no generan residuos radiactivos y presentan una aplicabilidad en la
irradiación de alto flujo y dosis altas. Así y todo, tienen algunas desventajas, como que
la profundidad de penetración es solo superficial. [55] Algunos científicos han llevado a
cabo estudios recientemente para evaluar el efecto de la irradiación por haz de
electrones en la calidad de las mandarinas. En un estudio concreto, se determinaron las
cualidades microbiológicas y fisicoquímicas de mandarinas irradiadas con un haz
electrónico de 0.4 y 1 kGy y ambas cifras resultaron ser óptimas para controlar la
proliferación microbiana (bacterias aerobias totales, levaduras y mohos), pero el
tratamiento con 1 kGy disminuía la calidad del fruto. [57]
Sin embargo, antes de que estos métodos se apliquen comercialmente, debe
superarse la desconfianza de los consumidores con respecto a los alimentos irradiados.
3.1.2.2 Radiaciones no ionizantes
- Irradiación UV
La luz ultravioleta es un tipo de radiación electromagnética dividida en UV-C
(100-280 nm), UV-B (280-315 nm) y UV-A (315-400 nm) y es percibida fácilmente por los
fotoreceptores de los tejidos vegetativos, regulando así las vías metabólicas. Los cítricos
se tratan poniéndolos debajo de una lámpara UV durante un tiempo específico, desde
segundos hasta horas. [58] La intensidad UV que alcanza la superficie del fruto depende
de la distancia que haya entre la lámpara UV y la fruta, así como del tiempo que la
lámpara está encendida. [59]
Tanto la irradiación UV-C como la UV-B han sido ampliamente estudiadas para la
prevención de podredumbres cítricas, y la eficacia del tratamiento UV depende de
múltiples factores como pueden ser el período de cosecha, la fase de madurez del fruto,
la profundidad de infección en la piel, el tipo e intensidad de irradiación, la temperatura
de almacenamiento durante las primeras 24 horas después del tratamiento UV, etc. [60]
Se ha informado que la irradiación UV-C a 8 KJ/m2 reduce significativamente la
descomposición causada por mohos verdes y azules en naranjas, pero a mayores
intensidades afecta negativamente a la calidad del fruto. [59]
También se ha publicado que la irradiación UV-B en limones genera un
engrosamiento de las paredes celulares creando una barrera para el patógeno y
adicionalmente, se acumulan metabolitos secundarios en el flavedo de la fruta con
actividades antifúngicas, como polifenoles y fitolexinas. [58] Además, se han evaluado con
el mismo propósito otro tipo de irradiaciones, como son la radiofrecuencia, las ondas
microondas y los pulsos de luz. El tratamiento con luz pulsada consiste en aplicar pulsos
sucesivos de luz de 325 μs, utilizando un espectro de luz emitida que va desde el
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ultravioleta (200 nm) hasta el infrarrojo próximo (1000 nm). La eficacia y la cinética de
inactivación microbiana de este método es mayor que la ofrecida utilizando luz
ultravioleta en continuo. [61]
- Luz azul
La luz azul pertenece a la parte del espectro visible (400-500 nm) y regula varios
procesos metabólicos en tejidos. Varios estudios han mencionado que la luz azul podría
aplicarse para el control de P. digitatum y P. italicum. [62,63]
Aunque el mecanismo exacto de acción biocida de la luz azul todavía no se ha
aclarado completamente, se podría suponer que la luz azul tiene un efecto directo en la
fisiología fúngica y/o un efecto indirecto sobre la resistencia del fruto a los hongos
produciendo metabolitos secundarios en el flavedo de los cítricos. [63]
3.1.3 Atmósferas controladas
Las atmósferas controladas son sistemas físicos complementarios al
mantenimiento frigorífico. Consisten en cambiar la atmósfera de gases que rodea al
producto. Mientras que el frío ralentiza la actividad metabólica del fruto y retrasa su
entrada en la senescencia manteniendo así la resistencia natural que posee el fruto a la
infección, las atmósferas controladas ejercen una actividad fungistática de inhibición o
retraso del crecimiento de los hongos patógenos.
- Atmósferas controladas convencionales
Este tipo de conservación frigorífica se realiza en una atmósfera con un 5-10% de
oxígeno y un 0-5% de dióxido de carbono en naranjas y no se ha diversificado su uso
dado que no está igualado el coste de las instalaciones con los beneficios que aporta
respecto al alargamiento de la vida fisiológica del fruto.
- Atmósferas controladas hipobáricas o de baja presión
Este método trabaja a presiones situadas entre 75 y 175 mmHg y no difiere
mucho en las ventajas aportadas por la técnica anterior. [64]
- Atmósferas controladas ozonizadas
Esta técnica es de gran interés, no genera un coste adicional excesivo y emplea
ozono (O3) como gas altamente oxidante. Este gas puede resultar dañino para el ser
humano, corrosivo para muchos materiales y fitotóxico para los frutos y es por ello, que
es muy importante vigilar las concentraciones de gas generadas dentro de las cámaras
frigoríficas, así como adoptar todas las medidas de seguridad necesarias.
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Se ha demostrado que no es capaz de controlar las infecciones provocadas por
Penicillium spp. y, por tanto, no puede ser una forma de sustituir a los fungicidas
tradicionales en las líneas de confección o en el dréncher. Pero, la ozonización
intermitente o continua en las cámaras frigoríficas puede inhibir el crecimiento del
micelio y la esporulación reduciendo así la carga de inóculo fúngico, aunque este efecto
cesa cuando el ozono deja de estar presente en el ambiente. [65] También hay que tener
en cuenta que el ozono gaseoso no puede traspasar ni los plásticos y/o los cartones por
lo que los frutos deben estar almacenados en envases de gran superficie abierta como
cajas o contenedores de campo. [66]
3.2 Métodos biológicos
El control biológico de enfermedades vegetales es una alternativa prometedora
al uso de los fungicidas convencionales y su uso ha ido en aumento en la última década.
[67] Se basa en la utilización controlada de microorganismos que antagonizan con los
microorganismos patógenos y, por tanto, en este grupo no se incluyen ni la obtención
de cultivares del huésped resistentes a las enfermedades ni el uso de sustancias
naturales derivadas de plantas o animales. Por lo general, los organismos antagonistas
se fijan sobre los frutos como suspensiones acuosas a través de inmersiones en baño o
dréncher.
El modo de acción de estos competidores consiste en competir por los nutrientes
y/o el espacio, [68] secretar antibióticos, [69] inducir una serie de defensas relacionadas
con la actividad enzimática que pueden activar los mecanismos de protección dentro
del huésped y contribuir a la biosíntesis de los compuestos antimicrobianos [70] o bien
puede ser parasitismo directo. [71]
La relación biológica existente entre los antagonistas y los patógenos es,
normalmente, bastante específica y por esto, este tipo de método muestra ventajas
importantes respecto a los sistemas físicos y químicos. La supervivencia y efectividad
tanto en condiciones ambientales como en cámaras frigoríficas y la capacidad de
colonizar las heridas de la piel, son varios de los factores que determinan la posibilidad
de usar un antagonista contra un patógeno. Un microorganismo como antagonista debe
cumplir como mínimo con unas pautas: ser eficaz a bajas concentraciones,
genéticamente estable, compatible con procesos comerciales como el encerado, no ser
ni él ni sus metabolitos perjudiciales para el hombre y no ser un patógeno en la fruta. [72]
Se están realizando avances significativos en la exploración de microorganismos
antagónicos como agentes potenciales de control biológico (ACB). Se ha notificado el
uso de varias levaduras como ACB contra patógenos en post-recolección como se
aprecia en la Tabla 7 y también se han comercializado varios productos visibles en la
Tabla 8.
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Tabla 7. Algunas levaduras antagonistas probadas. [73]
LEVADURAS ANTAGÓNICAS PATÓGENOS DIANA
Pichia caribbica Penicillium expansum
Pichia guilliemondii Botitrys cinerea
Metschnikowia fructicola, Candida oleophila
y Cystofilobasidium infirmominiatum PL1
Penicillium digitatum, Penicillium expansum
Rhodosporidium kratochvilovae, Cryptococcus laurentii y Rhodotorula glutinis
Botitrys cinerea
Candida sake Penicillium expansum, Botitrys cinerea
Tabla 8. Productos de biocontrol basados en microbios comercializados con sus
respectivos patógenos específicos. [73]
PRODUCTO DE CONTROL BIOLÓGICO
MICROORGANISMO BASE
CULTIVO DIANA PATÓGENO DIANA
Aspire Candida oleophila Cítricos B. cinerea, Penicillium spp.
Shemer Metschnikowia fructicola
Uva de mesa, fresa B. cinerea, Penicillium spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp.
BOTRY-Zen Ulocladium Uvas, grosellas negras, kiwis
Botrytis cinerea
Pomavita Pantoea agglomerans Manzanas, peras Erwinia amylovora BlossomBless Pantoea agglomerans Manzanas, peras Erwinia amylovora
Biosave 100/110 Pseudomonas syringae Van Hall
Manzanas, cítricos B. cinerea, Penicillium spp., Mucor spp.
Yieldplus Cryptococcus albidus Manzanas, peras B. cinerea, Penicillium spp, Mucor spp.
Nexy C. oleophila Frutas pomáceas B. cinerea, Penicillium spp.
BoniProtect Aureobasidium pullulans
Frutas pomáceas B. cinerea, Penicillium spp., Monilinia spp.
A continuación, se van a enumerar algunos ejemplos de estudios realizados
recientemente para el control de las podredumbres más comunes en cítricos mediante
métodos biológicos.
Se ha realizado un estudio para evaluar la eficacia del microorganismo Yarrowia
lipolytica contra la podredumbre verde y azul en mandarinas. Los resultaros mostraron
que esta levadura es capaz de inhibir el crecimiento de P. digitatum y P. italicum, ya que
disminuye la incidencia y el diámetro de lesión de las mandarinas de acuerdo con la dosis
empleada. Las pruebas in vitro demostraron que la levadura inhibió la germinación de
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esporas y la longitud del tubo germinal de ambos hongos. También se apreció mayor
actividad de polifenol oxidasa, peroxidasa, catalasa, fenilalanina amoniaco liasa, y
aumentó el contenido de compuestos flavonoides y fenoles totales, que activaron los
mecanismos de defensa de las mandarinas. El tratamiento no tuvo efectos secundarios
sobre los parámetros de calidad de las mandarinas y, por tanto, esta levadura podría ser
una antagonista prometedora para controlar este tipo de podredumbres. [74]
Otro estudio llevado a cabo analiza los mecanismos de acción y biocontrol de
Bacillus spp. w176 contra el moho verde. Se demostró que podía reducir eficazmente la
incidencia de la enfermedad en un 89,3% y el diámetro de la lesión. Además, el efecto
de inhibición generado era comparable con el fungicida prochloraz después de tres
meses de almacenamiento. [75] Contra Penicillium digitatum también se han realizado
ensayos con limones empleando la cepa 146 de la levadura Clavispora lusitaniae y los
resultados mostraron la capacidad de dicha levadura para colonizar las heridas en los
limones e inhibir la germinación de las esporas. [76]
Para combatir la podredumbre ácida, se ha realizado un estudio empleando la
cepa FL01 de la levadura Metschnikowia citriensis. Se llegó a la conclusión de que podría
utilizarse como alternativa potencial a fungicidas convencionales para controlar dicha
enfermedad, dado que M. citriensis podía inhibir el crecimiento micelial y la germinación
de esporas de Geotrichum citriaurantii, inducir la resistencia de la fruta y además
colonizar rápidamente las heridas y adherirse fácilmente a la superficie para competir
por el espacio y la nutrición. [77]
No obstante, se ha descrito que los microorganismos antagónicos también
presentan desventajas para el control de enfermedades postcosecha. Así, se ha
observado una alta variabilidad en los resultados de los estudios realizados, una baja
actividad curativa y está comprobado que el desarrollo de formulaciones que puedan
ser comercializadas es complicado. Para intentar solucionar algunos de estos problemas,
se está investigando la posibilidad de usar mezclas de antagonistas [78] o generar
antagonistas que han sido manipulados genéticamente o producidos en medios
enriquecidos. Al presentar una buena actividad preventiva, se pueden emplear como
tratamientos complementarios a otros sistemas alternativos. [42]
Se han encontrado y patentado algunas levaduras, bacterias y hongos
filamentosos con capacidad antagónica contra podredumbres de postcosecha, pero, la
existencia en el mercado de microorganismos antagónicos es escasa debido a que los
fungicidas convencionales son más efectivos, baratos y consistentes. Además, algunos
países, como EE. UU., disponen de normativas específicas para el registro de este tipo
de productos biológicos, mientras que, en otras zonas productoras como la Unión
Europea, no se disponen de dichos reglamentos y el registro se ve obstruido por la
necesidad de realizar análisis toxicológicos costosos y de larga duración, no comparables
con los exigidos para los fungicidas de síntesis.
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3.3 Métodos químicos de bajo riesgo
Los productos químicos alternativos a los fungicidas convencionales empleados
deben ser sustancias naturales o sintéticas que presenten efectos toxicológicos
conocidos y muy bajos tanto en animales como en personas y que tengan efectos
residuales mínimos en el medio ambiente. En este grupo estarían los aditivos
alimentarios, los compuestos GRAS (“Generally Recognized as Safe”) y las sustancias
naturales extraídas de plantas, microorganismos o animales. También entrarían aquí
otro grupo que engloba las sustancias que promueven una actividad inductora de
resistencia, en el fruto huésped, hacia las enfermedades postcosecha. Estos productos
pueden aplicarse directamente o adicionados a recubrimientos.
3.3.1 Sales: Compuestos GRAS y aditivos alimentarios
Las sales orgánicas e inorgánicas de baja toxicidad pueden pertenecer tanto al
grupo de aditivos alimentarios como al de sustancias clasificadas como GRAS. El término
“GRAS” es un acrónimo de la frase en inglés “Generally Regarded as Safe”. Por otro lado,
según los artículos 201 (s) y 409 de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y
Cosméticos de EE. UU., cualquier sustancia que se agrega intencionadamente a los
alimentos es un aditivo alimentario (sustancias con número E). Estas sustancias están
sujetas a revisión y aprobación previa de la FDA (“Food and Drugs Administration”), a no
ser que la sustancia haya sido previamente reconocida por expertos cualificados como
segura en las condiciones de su uso, o que el uso de esta sustancia esté excluido de la
definición de aditivo alimentario. [79] El principal interés para el uso de estas sustancias
en fruta fresca radica en que no tienen un límite máximo de residuos (LMR), por lo que
no están sujetos a esta legislación.
Varios aditivos alimentarios o compuestos GRAS han sido utilizados para el
control de descomposición cítrica en términos generales y en particular en la causada
por P. italicum, P. digitatum y G. citri-aurantii. En los siguientes párrafos se describen los
principales materiales utilizados:
- Las sales de ácido sórbico son conocidas por su actividad antimicótica contra mohos y
levaduras y curiosamente, no sólo ejercen una compatibilidad con los fungicidas
convencionales como imazalil, fludioxonil o tiabendazol, sino que también aumentan su
capacidad contra los hongos P. digitatum y G. citri-aurantii. [80]
- Se ha estudiado también la eficacia del bicarbonato de sodio, carbonato de sodio,
silicato de sodio, bicarbonato de potasio, carbonato de potasio, sorbato de potasio,
cloruro y quelato cálcicos contra la decadencia natural de la postcosecha sobre
clementinas y naranjas en diferentes momentos de aplicación: antes de la cosecha,
después de la cosecha, y tanto en la precosecha como en la postcosecha. Se concluyó
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que el tiempo de aplicación es un factor crucial dado que las sales aplicadas en el campo
antes de la cosecha tienen más tiempo disponible para interactuar con el patógeno y
alterar así el inóculo.[81] Otras investigaciones también han demostrado la eficacia del
carbonato de sodio o bicarbonato de sodio como agente de control antifúngico en la
postcosecha de P. digitatum en naranjas. [82]
- Otros estudios han investigado la actividad antifúngica curativa de los tratamientos
postcosecha con etilparabeno sódico (Figura 9) contra el moho azul y el moho verde
mediante ensayos in vivo y se concluyó que esta sal podría considerarse una alternativa
de control no contaminante. [83]
Figura 9. Estructura química del etilparabeno sódico. [83]
- Una investigación sugirió la utilización de hidrosulfuro de sodio como compuesto
innovador para ser utilizado contra P. italicum en cítricos y el resultado fue óptimo,
reduciendo el crecimiento de dicho hongo en la superficie de la fruta tratada. [84]
- Se ha evaluado el efecto de dehidroacetato de sodio, un conservante alimentario
común y seguro, para el control de G. citri-aurantii después de la cosecha a través de
ensayos in vitro e in vivo. [85]
- Un estudio in vivo sobre cítricos demostró que el aditivo alimentario benzoato de sodio,
utilizado comúnmente como conservante, era la sal más eficaz para actuar como agente
antifúngico contra el moho verde y el moho azul. [86]
A pesar de los óptimos resultados obtenidos en experimentos a peque ña escala
en los laboratorios, el uso de sales presenta algunas limitaciones como actividad y
persistencia limitada, eficacia no equiparable a la de los fungicidas convencionales,
riesgo de lesión de frutas y falta de efecto preventivo. [81] Es por esto por lo que se han
realizado ensayos para mejorar el rendimiento de las sales, combinándolas con otros
sistemas como son los microorganismos antagonistas, el calor, fungicidas químicos a
bajas dosis y recubrimientos de ceras. Sin embargo, la combinación implica
complicaciones operacionales y costos adicionales de mano de obra, equipo y
energía.[87]
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3.3.2 Sustancias inductoras de resistencia
La resistencia inducida se entiende como un aumento de la expresión de los
mecanismos naturales de defensa de las plantas contra diferentes patógenos, y esta
resistencia inducida puede deberse a factores físicos, biológicos y químicos. Así pues, las
sustancias inductoras de resistencia son las que estimulan respuestas protectoras y
según su naturaleza química pueden ser proteínas, glicoproteínas, polipéptidos,
polisacáridos, compuestos con lípidos, u otras sustancias. [88] Existen dos tipos principales
de resistencia inducida, resistencia sistémica adquirida (SAR) y resistencia sistémica
inducida (ISR). La resistencia sistémica adquirida tiene lugar cuando se crea una herida
localizada en la planta y la resistencia se estimula al aplicar un tratamiento diseñado en
el lugar donde el patógeno ha invadido la planta. Este tratamiento desencadena así una
respuesta sistémica en la planta. La resistencia sistémica inducida aparece cuando las
raíces de las plantas son colonizadas por rizobacterias promotoras del crecimiento de
las plantas, bacterias del suelo que influyen de forma directa e indirecta en el
crecimiento de las plantas. Cuando estas bacterias detectan una modificación de la
planta, se desencadena una respuesta fisiológica.
Los inductores químicos de resistencia deben poseer un amplio espectro de
defensa a bajas concentraciones, no ser tóxicos ni para plantas ni para animales, no
tener efectos negativos sobre el crecimiento y el desarrollo de las plantas, proporcionar
una protección duradera, ser de bajo coste y no presentar toxicidad directa contra el
microorganismo patógeno. [89]
Aunque la mayoría de las investigaciones se han enfocado a enfermedades
precosecha, algunos inductores químicos han mostrado inducción de respuestas de
defensa en enfermedades postcosecha en distintos cultivos hortofrutícolas. Ciertos
reguladores del crecimiento como el ácido salicílico, el ácido acetil salicílico, el ácido
jasmónico, el benzotiadiazol (BTH), el ácido dicloro isonicotínico (INA) y el ácido β -
aminobutírico (BABA), entre algunos otros, han sido probados en frutos cítricos como
tratamientos postcosecha para inducir o aumentar su resistencia natural a
enfermedades postcosecha, especialmente hacia las podredumbres azul y verde.
También se han realizado ensayos con silicio en forma de silicato sódico, considerada
como una sal GRAS y con otros compuestos como la proteína Harpin aislada de la
bacteria patógena Erwinia amylovora. [90]
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− Ácido salicílico
El ácido salicílico (AS) forma parte de un amplio grupo de compuestos
sintetizados en plantas denominados fenólicos, los cuales poseen en su estructura
química un grupo hidroxilo unido a un anillo aromático y participan en muchas funciones
metabólicas en plantas, como son la síntesis de lignina y, en algunos casos, en la
biosíntesis de compuestos relacionados con la defensa como las fitoalexinas. Participa
en procesos como la germinación de semillas, crecimiento celular, respiración,
expresión de genes asociados a senescencia, repuesta a estrés abiótico y de forma
esencial en la termogénesis, así como en la resistencia a enfermedades. También, se ha
descrito que en algunos casos puede actuar de forma indirecta, alterando la síntesis y/o
señalización de otras hormonas que incluyen la vía del ácido jasmónico (AJ), el etileno,
y las auxinas.[91]
En comparación con otros tratamientos, el tratamiento con ácido salicílico puede
ser más eficiente en postcosecha de cítricos, ya que está directamente implicado en la
acción de defensa. [92] Un estudio demostró que concentraciones de 8 y 10 mM de AS
redujeron significativamente la podredumbre verde en naranjas inoculadas
artificialmente. [88] Del mismo modo, otro grupo de investigación estudió la actividad
antifúngica del ácido salicílico contra P. digitatum en naranjas empleando tratamientos
a diferentes concentraciones, y se obtuvieron buenos resultados contra la
descomposición al igual que se manifestó un fuerte impacto en la mejora de los factores
de calidad del fruto (sólidos solubles totales, acidez, contenido antioxidante,
antocianina, etc.). [93]
Un trabajo más reciente, ha ofrecido información bastante relevante sobre el
tratamiento empleando AS. En él, se ha analizado exhaustivamente los efectos del ácido
salicílico sobre la capacidad de almacenamiento de la mandarina Satsuma, aplicando
tratamientos de 2mM. Los resultados mostraron que pasados 50 y 120 días, la tasa de
pudrición disminuyó en un 57% y 65% respecto a la muestra control respectivamente,
lo que sugiere que el tratamiento de AS puede reducir significativamente la tasa de
putrefacción de los cítricos postcosecha. El análisis de calidad del fruto reveló que el
tratamiento puede mantener la firmeza de la fruta sin afectar a la calidad comercial.
Además, el contenido de H2O2 y algunos metabolitos relacionados con la defensa, como
la ornitina y la treonina, aumentaron significativamente. También se acumularon en los
frutos flavonas polioxiladas lipofílicas que pueden inhibir directamente el desarrollo de
patógenos. [94]
− Benzotiadiazol (BTH)
Es un compuesto sintético análogo al ácido salicílico y fue desarrollado como
potente activador de SAR (Resistencia Sistémica Adquirida) en plantas. Es capaz de
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inducir resistencia a enfermedades fúngicas, víricas y bacterianas en un gran número de
especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. [95]
El BTH ha mostrado resultados prometedores para controlar enfermedades de
campo como la sarna (Elsinoe fawcettii), la mancha negra (Alternaria alternata) o la
melanosis en cítricos (Diaporthe citri). [96]
Un estudio más reciente, empleó tratamientos con BTH a concentraciones de 0,9
mM, y estas aplicaciones no mostraron una actividad preventiva contra los mohos verde
y azul en naranjas “Lanelate”. [90] Este resultado obtenido concuerda con otro estudio
realizado en manzanas infectadas con Penicillium expansum, donde el BTH tampoco
mostró ninguna inducción de resistencia a la enfermedad. [97]
− Ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA)
Este ácido induce genes de expresión de resistencia sistemática adquirida, tanto
antes de la inoculación del patógeno como después del ataque del patógeno. [95]
Se ha realizado un experimento donde la incidencia de moho verde y azul se
redujo significativamente en 25% y 17% y 60 y 53%, respectivamente, mediante
tratamientos de INA a 0,03 y 0,3 mM. [90]
− Ácido -aminobutírico (BABA)
El BABA es un aminoácido no proteico que se ha llegado a considerar un
tratamiento alternativo prometedor debido a su inducción de respuestas de defensa en
tejidos de distintas plantas, su carácter natural [98] y su actividad contra hongos,
bacterias, virus y nematodos. [99]
Un estudio sobre la naranja dulce almacenada a 5 °C mostró una reducción de la
incidencia, así como de los diámetros de lesión de la podredumbre azul. [100] En otro
ensayo posterior realizado en naranjas tipo Valencia, los tratamientos de BABA no
redujeron la incidencia o gravedad del hongo verde, pero sí que redujeron
significativamente la incidencia del hongo azul al aplicar concentraciones de 0,3 y 3 mM
y las reducciones fueron del 39% y del 26% respectivamente, en comparación con frutas
control tratadas con agua. [90]
− Silicio
El silicio es un elemento que desempeña un papel en el refuerzo de las paredes
celulares de las plantas. Atendiendo a diversas investigaciones sobre el mecanismo de
acción del silicio, se ha deducido que puede tener un efecto directo sobre el patógeno
o un efecto indirecto sobre la fruta hospedadora, formando barreras físicas y mecánicas
a nivel de la pared celular o bien generando una inducción bioquímica de defensas
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acumulando, por ejemplo, lignina, compuestos fenólicos o proteínas relacionadas con la
patogénesis. [101]
Algunos estudios han demostrado la eficacia de este inductor para reducir
significativamente tanto la incidencia de la podredumbre verde como azul en frutos
cítricos, concretamente mandarinas y naranjas. [81] Liu et. al. (2010) observaron que el
silicato de sodio era capaz de dañar la membrana plasmática de las esporas de P.
digitatum, así como inhibir la germinación de esporas e impedir el crecimiento micelial
y del tubo germinativo. [102] Con una concentración de silicato sódico de 1000 mM se
reduce significativamente la incidencia en naranjas del moho verde y moho azul en un
89% y 71% respectivamente, aunque este tratamiento produce fitotoxicidad en el
fruto.[90]
− Proteína Harpin
Se trata de una proteína no tóxica y natural, aislada de la bacteria Erwinia
amylovora, agente causal del fuego bacteriano en manzanas, peras y otras rosáceas. Es
un elicitor de respuesta bacteriana hipersensible, termostable y rica en glicerina. [103]
Tratamientos postcosecha con Harpin a diferentes concentraciones en manzanas
indujeron resistencia al moho azul. [104] Otro estudio realizó ensayos postcosecha con
Harpin en naranjas para combatir la mancha negra causada por Guignardia citricarpa
(Figura 10).[105]
Figura 10. Enfermedad de la mancha negra en cítricos.
En general, debido a que la resistencia a patógenos en los tejidos vegetales de
los frutos puede inducirse más fácilmente cuando éstos se encuentran en plena
actividad metabólica, la aplicación de estas sustancias durante las etapas de desarrollo
del fruto en el campo puede ser una propuesta prometedora. Sin embargo, hasta estos
momentos los resultados obtenidos no son lo suficientemente buenos como para tener
un impacto comercial ni justificar su coste.
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3.3.3 Sustancias naturales
3.3.3.1 Extractos vegetales
Los extractos vegetales son considerados fungicidas potenciales, tanto de forma
individual como en combinación con otras medidas de control, debido a que poseen una
baja toxicidad ambiental, un modo de acción sistémico, baja fitotoxicidad y actividad
antifúngica. Los extractos vegetales que proceden sobre todo de las plantas medicinales
y aromáticas se han aplicado como métodos preventivos en cítricos contra el desarrollo
de podredumbres postcosecha, mostrando resultados alentadores, tanto en los ensayos
in vitro como in vivo.
El extracto natural “ideal” que actúa como agente antimicótico debe cumplir una
serie de características y tiene unos modos de acción requeridos. Por un lado, el
compuesto debe ser eficaz a corto plazo, los parámetros del fruto no deben verse
afectados de forma negativa, la dosis efectiva utilizada debe ser lo más baja posible, la
eficacia del producto natural aplicado no debe verse influenciada por condiciones
fisiológicas del fruto o ambientales, el extracto no debe de ser tóxico para la salud
humana, ha de presentar baja actividad residual y su acción debe de ser específica frente
a un determinado patógeno. Por otro lado, respecto a los modos de acción, el producto
ha de estimular respuestas defensivas en el fruto, inhibir la biosíntesis del ácido
nucleico, modificar la estructura celular patógena, inhibir la respiración celular, iniciar
síndromes de estrés oxidativo, inhibir el metabolismo de producción de energía,
inactivar las enzimas esenciales, reaccionar con las proteínas de la membrana celular y
alterar la función del material genético. [106]
Diversos estudios sugieren la capacidad de extractos de diferentes plantas para
controlar la podredumbre cítrica causada por P. italicum y P. digitatum debido a su
contenido en metabolitos secundarios como flavonoides, quinonas, taninos, terpenos,
alcaloides, saponinas, esteroles, fenilpropanoides, acetaldehído, benzaldehído, alcohol
bencílico, etanol, salicilato de metilo, benzoato de etilo, formato etílico, hexanal, (E) - 2-
hexanal, lipoxigenasas, jasmonatos, glucosinolatos o isotiocianatos. [107,108]
Un estudio evaluó, tanto in vitro como in vivo en naranjas y limones, siete
extractos de plantas y sus fracciones líquidas frente a cuatro cultivos aislados de
Penicillium italicum. Estos compuestos fueron extraídos de semillas de alholva
(Trigonella foenumgraecum L.), semillas de harmal (Peganum harmala L.), dientes de ajo
(Allium sativum L.), corteza de canela (Cinnamomum cassia L.), hojas fleabanas
pegajosas (Inula viscosa L.) y hojas de sombra y frutos (Solanrum). [109]
Muchos estudios han atribuido la actividad antifúngica de extractos de plantas a
la presencia de polifenoles. En otro trabajo, se informó que compuestos fenólicos como
la quercetina, escopoletina y escoparona ejercieron actividad antifúngica hacia P.
digitatum en naranjas. [110]
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El extracto de la cáscara de granada (Figura 11), debido a su actividad
antioxidante y su capacidad antimicrobiana correlacionada con una alta concentración
de fenoles, ha sido considerado como una alternativa sostenible a los fungicidas
químicos. Diversas investigaciones han llegado a la conclusión de que los extractos
fenólicos de la cáscara de granada inhiben la germinación de los conidios de P. digitatum
y P. italicum, retrasan la decadencia general tanto en los pomelos como en los limones
inoculados y los tratamientos no generan fitotoxicidad. [107,111]
Figura 11. Extracto de cáscara de granada.
3.3.3.2 Aceites esenciales
Los aceites esenciales (EOs) son un grupo de sustancias naturales que tienen
extensos antecedentes de uso en alimentos debido a sus propiedades antibacterianas,
antifúngicas, antivirales, insecticidas, antioxidantes y medicinales. [112] Presentan un
carácter lipofílico y pueden ser identificados en varios componentes de las hojas,
cortezas, tallos, raíces, flores y frutas de las plantas. Los EOs, normalmente, son mezclas
altamente complejas de cientos de compuestos aromáticos individuales y suelen
prepararse mediante técnicas de extracción de fragancias, como la destilación, el
prensado en frío o la extracción. [113]
La actividad biológica de los aceites esenciales está directamente relacionada
con la presencia de componentes volátiles bioactivos. La composición de los EOs puede
depender de la parte de la planta que se utiliza [114] y de otros muchos parámetros, como
los métodos de secado o los procesos de extracción, que afectan a su rendimiento y
composición química. [115] Químicamente, consisten en compuestos terpénicos (mono-,
sesqui- y diterpenos), alcoholes, ésteres, epóxidos, ácidos, aldehídos, aminas, cetonas y
sulfuros. [116]
Los efectos antimicrobianos de los aceites esenciales se han analizado con una
amplia gama de microorganismos y en diferentes productos a lo largo de los años, pero
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su mecanismo de acción todavía no se entiende por completo. Además, al estar
formados por varios componentes, su actividad antimicrobiana no puede ser explicada
basándose únicamente en la acción de uno de los componentes. [117] Varios estudios,
han propuesto que la acción antimicrobiana de los EOs puede deberse a su capacidad
de penetrar a través de las membranas de los microorganismos e inhibir así las
propiedades funcionales bacterianas. [117,118] Los mecanismos de acción pueden estar
relacionados con la capacidad de los compuestos fenólicos para alterar la permeabilidad
de las células microbianas, dañar las membranas citoplasmáticas, interferir con el
sistema de generación de energía celular e interrumpir la fuerza motriz de los protones,
lo cual puede provocar la muerte celular. [117,119]
Generalmente, se ha creído que los EOs deberían ser más eficaces contra
bacterias Gram-positivas debido a la interacción directa que existe entre las membrana
celular y los componentes hidrofóbicos de los aceites esenciales [120,121] y así pues, las
Gram-negativas debían ser más resistentes a los EOs por poseer una pared de células
hidrofílicas que ayudan a prevenir la penetración de los compuestos hidrofóbicos. Un
estudio realizado en 1987 concluyó que las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
eran igualmente sensibles a los aceites esenciales cítricos y sus componentes [122] pero,
sin embargo, otra investigación empleando carvacrol y timol, mostró una diferente
forma de actuar contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Estos aceites
esenciales lograron la desintegración de la membrana externa de las Gram-negativas,
liberando así lipopolisacáridos y aumentando la permeabilidad de la membrana
citoplasmática. [123]
La alta biodegradabilidad y la naturaleza volátil que presentan los EOs los hace
eficaces como agentes antifúngicos postcosecha para el tratamiento de cítricos
generando bajos niveles de residuos. [112] Este hecho ha sido demostrado, como se
puede observar en la Tabla 9, con diversas especies cítricas como la mandarina Satsuma,
la naranja y el limón.
En el trabajo de Boubaker et al. (2016), se investigaron las actividades
antifúngicas de aceites esenciales de cuatro especies de Thymus (Figura 12), extraídos
por hidrodestilación de las partes aéreas, contra las enfermedades postcosecha
causadas por Penicillium digitatum, Penicillium italicum y Geotrichum citri-aurantii. Los
diferentes aceites esenciales mostraron ser eficaces, aunque cada uno en diferente
medida. [124]
Otro trabajo, también evaluó en Citrus sinensis el efecto del extracto de Thymus
capitatus sobre el hongo fitopatógeno P. italicum. La inhibición del crecimiento micelial
fue del 100% y este hecho se correlacionó con la composición rica en carvacrol, de más
del 69% de este EO.[125]
Un estudio, para combatir la podredumbre amarga, realizó ensayos con
diferentes aceites esenciales (Thymus vulgaris, Citrus aurantium var. amara,
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Cymbopogon citratus, Cymbopogon martinii, Origanumvulgare, Geranium graveolens
roseum Bourbon). De todos ellos, C. citratus resultó ser la opción más rentable contra G.
citri-aurantii. Posteriormente, dado que estudios comerciales anteriores habían
indicado las propiedades del aceite esencial de Mentha spicata contra Penicillium
digitatum, se decidió elaborar un producto de protección multiobjetivo con ambos
aceites esenciales. Con esta mezcla de EOs, se controlaban totalmente los dos
patógenos, además de P. italicum. [126]
Figura 12. Planta silvestre de Thymus vulgaris o tomillo.
Varios aceites esenciales derivados de la hierba de limón, eucalipto y clavo han
sido probados en la superficie de mandarinas para inhibir el crecimiento fúngico de
mohos verdes y azules. Aunque todos ellos fueron capaces de inhibir la germinación y el
crecimiento de conidios de ambos mohos, el EO de hierba de limón resultó ejercer el
efecto más beneficioso. [127]
El control, tanto in vitro como in vivo de Phyllosticta citricarpa, causante de la
mancha negra en cítricos, se ha evaluado en naranjas de Valencia y limones utilizando
14 aceites esenciales. Los EOs destacables fueron los de Chenopodium ambrosioides
(76% de compuestos monoterpénicos) y Conyza bonaerensis (17% de monoterpenos y
10% de sesquiterpenos), que inhibieron completamente el crecimiento fúngico. [128]
Se ha examinado y evaluado el efecto de aceites esenciales de Mentha arvensis,
Ocimum canum y Zingiber officinale en la postcosecha de cítricos. Todos ellos
presentaron aptitud para controlar las infecciones del moho azul tanto en naranjas
como en limones, extendiendo así su vida comercial. [129]
Otro trabajo, quiso destacar la importancia de los aceites esenciales contra P.
italicum y P. digitatum dependiendo de la zona de la naranja agria (Citrus aurantium L.)
de donde era extraído (piel, hoja o flor). Dependiendo de la zona de extracción, los
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compuestos dominantes de los EO cambian: en la flor predomina el linalool, en la piel el
limoneno y en las hojas el acetato de linalilo. Los resultados de los ensayos in vivo
demostraron la capacidad de los EOs derivados tanto de las hojas como de flores para
reducir el crecimiento de ambos patógenos, pero, por el contrario, el EO de la piel fue
ineficaz. [130]
Tabla 9. Recopilatorio de estudios con aceites esenciales contra P. italicum, P.
digitacum. [106]
FRUTA ACEITE ESENCIAL PATÓGENO DIANA
Naranjas, limones Mentha arvensis, Ocimum canum,
zingiber officinale P. italicum
Naranjas Cinnamomum zeylanicum P. italicum, P. digitacum
Mandarinas Satsuma Octanal P. digitatum
Naranjas Citrus aurantium P. italicum, P. digitacum
Mandarinas Satsuma Aceite de clavo P. digitatum
Naranja cv. Thompson, Naranja cv. Valencia Thymus vulgaris, Eugenia
caryophyllata Thunb P. italicum, P. digitacum
Naranja cv. Salustiana, Naranja cv. Valencia Thymus vulgaris, Cinnamonum
zeylanicum Breyn P. italicum, P. digitacum
Naranja cv. Tomago Mentha spicata, Lippia scaberrima P. digitatum
Naranja cv. Navel Powell Bergamota, tomillo, árbol del té P. italicum
Lemon cv. fino Carvacrol, Timol P. italicum, P. digitacum
Naranjas Thymus capitatus P. italicum
Se han encontrado combinaciones de diferentes aceites esenciales con efectos
sinérgicos para combatir el hongo Penicillium crhysogenum: aceite de orégano y aceite
de canela, aceite de té con aceite de tomillo y aceite de menta, aceite de menta y aceite
de tomillo. [131] Siguiendo este enfoque, recientemente se ha investigado la combinación
de cinamaldehído y cintronella para el control de P. digitatum. Se observó que la mezcla
de ambos aceites exhibió una acción sinérgica en comparación con los compuestos
individuales en el crecimiento micelial de dicho hongo y en la germinación de esporas,
con una concentración inhibitoria y fungicida mínima (MIC, MFC) de 0.4 mL/L-1. Además,
también se pudo ver que la combinación de ambos EOs aceleraba el daño de la pared y
membranas celulares del fitopatógeno. [132]
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Después de evaluar la actividad antifúngica global de los aceites esenciales
contra P. digitatum y P. italicum, se puede sugerir que los EOs son candidatos
prometedores hacia la búsqueda de soluciones alternativas al fungicida químico
convencional. Los EOS se consideran sustancias GRAS y su aplicación comercial puede
minimizar los riesgos para la salud causados por el amplio uso de otros compuestos
químicos por la industria de los cítricos. No obstante, se debe tener un control estricto
de estos EOs debido a los posibles problemas que pueden aparecer relacionados con la
fitotoxicidad u olores desagradables. [42]
3.3.4 Recubrimientos comestibles antifúngicos
En la postcosecha de cítricos, los recubrimientos comestibles (RCs) con
compuestos antifúngicos surgen con la finalidad de reemplazar a las ceras
convencionales formuladas con fungicidas sintéticos como el imazalil o el tiabendazol.
En los últimos años esta línea de investigación ha adquirido un gran interés, dado que
este tipo de tratamientos pueden ofrecer una doble o triple funcionalidad. Por un lado,
puede ejercer una función patológica de reducción de podredumbres y por otro lado
una función fisiológica que regula el intercambio de gases entre el fruto y el entorno
retrasando la senescencia. Además, también tiene una función estética por aportar
firmeza y brillo.
Cómo se ha visto en el apartado de “Ceras y recubrimientos comestibles”, los
principales componentes que forman los RCs son los hidrocoloides (polisacáridos o
proteínas de diversos orígenes) y los lípidos (resinas, ácidos grasos, acilgliceroles, etc.) y
además también se añaden plastificantes (sacarosa, glicerol, sorbitol, propilenglicol,
etc.) y emulsificantes (lecitina, polisorbatos, monoestearatos, etc.) para mejorar las
propiedades mecánicas y facilitar la dispersión entre la fase acuosa y la fase lipídica de
los recubrimientos compuestos, los que en su matriz combinan lípidos e hidrocoloides.
A la matriz formada, se le pueden añadir otros ingredientes para mejorar su
comportamiento general (sabor, textura, color). Si estos ingredientes son capaces de
retardar o inhibir el crecimiento de los microorganismos patógenos se habla de
recubrimientos comestibles antimicrobianos y si estos microorganismos son hongos, se
habla de recubrimientos comestibles antifúngicos. [133]
Los compuestos con carácter antifúngico utilizados para la formulación de
revestimientos se pueden clasificar según su naturaleza en las tres categorías descritas
anteriormente. La primera formada por conservantes alimentarios sintéticos o
compuestos GRAS, donde se incluyen tanto sales orgánicas como inorgánicas, por
ejemplo, carbonatos, sorbatos, parabenos o benzoato, entre otros. En la segunda
categoría se encuentran los compuestos naturales como los aceites esenciales, las
proteínas y péptidos producidos por plantas, animales o microorganismos y los
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extractos naturales de plantas. Por último, están los microorganismos antagónicos de
control biológico (bacterias, levaduras e incluso algunos hongos filamentosos). [134]
3.4 Combinación de métodos de control
Por desgracia, los sistemas alternativos descritos difícilmente logran por sí solos
los niveles de efectividad y persistencia de los fungicidas sintéticos tradicionales. Siendo
este último punto la debilidad más importante de estos tratamientos, sería necesario
compatibilizar dos o más sistemas intentando alcanzar los siguientes objetivos [135]:
I. Conseguir un efecto aditivo o sinérgico para que el tratamiento combinado sea
más persistente y eficaz que el tratamiento individual.
II. Alcanzar un efecto complementario de forma que el tratamiento combinado tenga
por un lado un efecto curativo permitiendo controlar las infecciones producidas
con antelación y por otro lado un efecto preventivo para aquellas infecciones que
se produzcan después de la aplicación de este.
III. Posibilitar el empleo comercial de tratamientos que por sí solos no tienen una
adecuada relación entre costes y efectividad, que muestran un riesgo elevado de
generación de fitotoxicidad o que manifiestan efectos desfavorables en la calidad
del fruto tratado.
Algunos ejemplos de estudios realizados combinando métodos de control son,
por ejemplo:
− La investigación del efecto sinérgico de la combinación de ácido cinámico con la
levadura antagonista Cryptococcus laurentii para el control de Penicillium
italicum.[136]
− Combinación de Candida membranifaciens con cepillado de agua caliente e
irradiación ultravioleta para inhibir la infección por P. digitatum. [137]
− Investigación de los efectos del tratamiento con agua caliente (53 °C, 2 minutos) y
Pichia membranaefaciens sobre el control de P. italicum y P. digitatum en agrios. [138]
− El estudio sobre la combinación de cinamaldehído y citronela, que exhibió una acción
sinérgica en comparación con los compuestos individuales en el crecimiento micelial
de P. digitatum, con una concentración inhibitoria mínima (MIC) y una concentración
fungicida mínima (MFC) de 0,40 ml/L. [139]
− La mezcla de extractos de Brassica con termoterapia para el control del moho verde
después de la cosecha de naranjas. [140]
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− La investigación de Palou et al. (2007) sobre el efecto de las irradiaciones de rayos X
en combinación con soluciones acuosas de carbonato de sodio en mandarinas
clementinas para el control de mohos verdes y azules durante el almacenamiento en
diferentes condiciones. [141]
Sin embargo, sigue siendo necesario la investigación en este campo, buscando
especialmente combinaciones de productos naturales que aumenten el tiempo de vida
del agente biocida, permitiendo de este modo un uso comercial del mismo.
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4. PREPARACIÓN DEL MATERIAL BIOCIDA
El análisis bibliográfico realizado sugiere que usar una combinación de materiales
que tengan efecto sinérgico en la actividad antifúngica y en el control de la liberación
del agente biocida puede ser una estrategia de trabajo importante. Siguiendo esta idea
se ha preparado una combinación de zeolitas y arcillas con aceite ese ncial de tomillo
buscando conseguir que la zeolita/arcilla actúe de soporte del material fungicida (el
aceite esencial), el cual irá liberándose poco a poco, ampliando el efecto y la duración
del material preparado. Este tipo de materiales, además, no son tóxicos ni generan
residuos, pues se preparan a partir de productos naturales.
En este punto se describe el procedimiento seguido para la preparación y
caracterización del material biocida indicado.
4.1 Materiales
En este apartado se describen los distintos materiales utilizados para preparar
los materiales fungicidas y la forma de incorporar el aceite esencial.
4.1.1 Sólidos
Los sólidos porosos utilizados fueron zeolitas y arcillas, ambos considerados
como productos naturales. En concreto se utilizó:
- Zeolita LTA preparada con sílice extraída a partir de la cáscara de arroz. Esta zeolita fue
sintetizada en la Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Es identificada por
las siglas CACLTA.
- Arcilla natural (CSNa+) modificada a través de un procedimiento de expansión con
bromuro de hexadeciltrimetilamonio (C16TAB), posterior secado a temperatura
ambiente durante 21 horas y finalmente pilareada con tetraetil ortosilicato (TEOS) y
calcinada. Esta arcilla se elaboró en colaboración con la Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (UFRGS). Es identificada por las siglas CS16-21H-C.
4.1.2 Líquidos
− Agua destilada, H2O.
− Agua ultra pura, H2O Milli-Q.
− Isopropanol, C3H8O, Acros Organics®.
− Aceite esencial de tomillo, PLANTIS.
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4.1.3 Incorporación del aceite esencial
Los sólidos descritos se funcionalizaron con aceite esencial de tomillo mediante
el método de impregnación a volumen de poro.
El aceite esencial de tomillo se añadió en estado puro o bien disuelto con el
disolvente isopropanol sobre el sólido poroso a impregnar, de tal manera que todo el
soporte quedaba totalmente empapado. Posteriormente, una vez impregnado el
soporte, se dejaron secar las muestras a temperatura ambiente durante dos días. Las
disoluciones empleadas contienen la cantidad necesaria del aceite esencial para
conseguir que el material final posea el porcentaje de aceite deseado, evitando utilizar
un exceso de disolución.
El método de impregnación a volumen de poro fue utilizado para preparar
diferentes materiales con distintos porcentajes en peso de aceite esencial. En los
ensayos de fitotoxicidad se usó la arcilla pilareada (CS16-21H-C), con un contenido
teórico de aceite esencial del 40%, 27% y 20% (en peso). Para el estudio in vivo se
prepararon también por este método la zeolita LTA sintetizada a partir de la sílice
extraída de la cáscara de arroz (CACLTA) y la arcilla (CS16-21H-C), ambas estructuras
impregnadas al 40% con aceite esencial de tomillo.
4.2 Métodos de caracterización
Las técnicas de caracterización que se emplearon para caracterizar los sólidos
fueron las siguientes:
4.2.1 Difracción de Rayos X
La difracción de rayos X (DRX) es uno de los fenómenos físicos que se producen
al interaccionar un haz de rayos X, de una determinada longitud de onda, con un sólido
cristalino. El fenómeno de difracción puede describirse con la Ley de Bragg, que predice
la dirección en la que se da la interferencia constructiva entre los haces de rayos X
dispersados coherentemente por un cristal, y establece la relación entre el ángulo de
incidencia de la radiación con el espacio interplanar para cada línea de difracción:
𝑛𝜆 = 2𝑑ℎ𝑘𝑙 · sen𝜃 (1)
donde n es un número entero (n=1, 2, 3, …), λ es la longitud de onda, dhkl es el espaciado
interplanar de los planos cristalinos con índices de Miller (h, k, l), y θ es el ángulo de
incidencia del haz de rayos X.
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El análisis de las muestras sólidas utilizadas en este TFM se realizó con un
difractómetro CUBIX de PANalytical equipado con un detector PANalytical X’Celerator.
Se empleó una radiación de rayos X de Cu Kα (λ1 = 1,5406 Å, λ2 = 1,5444 Å, I2/I1 = 0,5), y
un voltaje e intensidad de tubo de 45 kV y 40 mA, respectivamente, para la obtención
de los difractogramas.
4.2.2 Análisis textural
El análisis textural es una técnica de caracterización que proporciona
información sobre las propiedades texturales del sólido mediante fenómenos de
adsorción y desorción, empleando nitrógeno como gas adsorbente. Esta técnica nos
permite conocer la superficie de área total y la superficie microporosa.
Este estudio se llevó a cabo en un equipo Micromeritics ASAP 2040, a una
temperatura de -196 °C y empleando una muestra de 200 mg aproximadamente. La
muestra se pastilleó y se tamizó para conseguir partículas de entre 0,4-0,6 mm.
Previamente, a la muestra se le realizó un pre-tratamiento a 200 °C aplicando vacío.
La superficie específica se determinó aplicando un modelo de la isoterma
Brunauer, Emmett y Teller (BET), la cual considera el llenado de los poros por adsorción
en múltiples capas de adsorbato.
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5. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOCIDA
En este apartado se describe el procedimiento empleado para la evaluación del
efecto fungicida de los materiales impregnados con aceite esencial de tomillo frente a
los hongos Penicillium Digitatum (PD), Penicillium Italicum (PI) y Geotrichum Citri-
aurantii (GC). Asimismo, se describen también diferentes ensayos de fitotoxicidad
realizados con anterioridad para determinar la formulación más idónea, es decir, que no
genere cambios de color en la piel del cítrico, para su posterior aplicación.
Las cepas de los tres hongos empleados fueron aisladas de frutos cítricos
infectados recogidos en almacenes citrícolas de la zona de Valencia y fueron catalogadas
de la siguiente forma:
− Penicillium digitatum NAV-7, depositada en la Colección Española de Cultivos
Tipo (CECT, UV, Valencia) con el número CECT 21108.
− Penicillium italicum MAV-1, depositada como CECT 21109.
− Geotrichum Citri-aurantii NAV-1, depositada como CETC 13166.
La actividad biocida de los materiales preparados se evaluó frente a estos hongos
preparando distintas formulaciones de recubrimientos que, por lo general, contenían un
2% de polímero de almidón de patata, 1% glicerol, 0,5% lípido, 0,25% GiraLec, 0,25%
Moglicet, 2% material fungicida y 94% de agua destilada. Para los ensayos de
fitotoxicidad, la cantidad de material fungicida y de agua destilada se modificaron en
función del tipo de ensayo realizado.
La preparación de la formulación se inicia elaborando una solución de almidón al
5% en agitación continua. Una vez preparada la solución de almidón, se añade a un
matraz Erlenmeyer junto con todos los compuestos que forman la formulación descrita
anteriormente, a excepción del material fungicida (arcilla pilareada impregnada con
aceite esencial de tomillo). La mezcla preparada se homogeneiza con un equipo ultra-
turrax, calentando previamente el matraz junto con los diferentes compuestos hasta 92
°C en un horno microondas. Posteriormente, se enfría la mezcla en un baño de hielo en
agitación continua hasta una temperatura comprendida entre 20-30 °C. Por último, para
terminar la formulación, se añade el material fungicida. Cabe destacar que el material
fungicida se incorpora al resto de formulación a última hora, el mismo día que vaya a
tener lugar el recubrimiento del fruto. Los frutos sobre los que se evaluó la actividad
biocida de las formulaciones preparadas fueron mandarinas de la variedad Orri.
La actividad fungicida de los materiales frente a los hongos PD, PI y GC se evaluó
mediante el análisis de diferentes parámetros, conocidos como incidencia, severidad,
esporulación y fitotoxicidad.
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5.1 Ensayo de fitotoxicidad
Se realizó un estudio de fitotoxicidad (referido a manchas o cambio de coloración
en el fruto) para evaluar la concentración máxima de material fungicida que se puede
incorporar a los recubrimientos alimentarios sin que produzca alteraciones en cítricos
incubados a 20 °C y con HR 70-80%. Para ello se prepararon diferentes formulaciones
con distintos porcentajes de material biocida y aceite esencial. Unas contenían como
material fungicida arcilla pilareada con aceite esencial y otras únicamente aceite
esencial emulsionado sin el material de soporte, para así poder establecer una
comparación de los tratamientos en función de la concentración de aceite empleado. El
estudio se realizó sobre 10 frutos con cada tratamiento. En total se realizaron 8
tratamientos incluyendo el control, donde los frutos no se recubrieron y se realizó la
observación a los 7 días de incubación.
5.2 Ensayos para determinar la actividad biocida
El desarrollo del estudio de la actividad fungicida del material preparado se
realizó in vivo en mandarinas de la variedad Orri. Se estudió el efecto antifúngico de dos
tipos de materiales funcionalizados con aceite esencial de tomillo frente a 3 tipos de
hongos diferentes (Penicillium Digitatum, Penicillium Italicum, Geotrichum Citri-
aurantii). Además, también se realizó un ensayo control en el que los frutos no se
recubrieron y un ensayo cuyo recubrimiento contenía únicamente aceite esencial como
material biocida (sin soporte). Por tanto, se realizaron 4 ensayos.
En primer lugar, se realizó la inoculación del hongo con un punzón de acero
inoxidable, previamente mojado en una suspensión de 105 esporas/mL del hongo
específico, realizando una herida de aproximadamente 2 mm de profundidad y 1 mm de
anchura en el centro de uno de los lados de la mandarina, como se aprecia en la Figura
13. PD y PI se inocularon en una misma mandarina y GC de forma independiente . De
cada ensayo (4) se realizaron 40 repeticiones y como cada género de hongo ( Penicillium
y Geotrichum) se inoculó de forma independiente, se emplearon un total de 320
mandarinas para la realización de todos los ensayos.
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Pasado un día tras la inoculación de los hongos, se incorporó el recubrimiento a
la fruta con una formulación (% en peso) basada en una mezcla de polímeros (2%),
glicerol (1%), lípidos (0,5%), GiraLec (0,25%), Moglicet (0,25%), antifúngico (2%) y agua
(94%). Este recubrimiento se impregnó mediante la inmersión de la mandarina en la
formulación preparada. En el caso del ensayo control, la fruta se mojó únicamente con
agua.
Tras inocular y tratar las frutas, las mandarinas infectadas con el género
Penicillium se incubaron a 20 °C y las infectadas por Geotrichum se incubaron a 28 °C y
en ambos casos se trabajó con una humedad relativa en cámara aproximada de 90%.
Pasado un período de 7 días, se evaluó la actividad biocida de los materiales
desarrollados analizando diferentes parámetros:
− Incidencia: porcentaje de naranjas infectadas.
− Esporulación: porcentaje de naranjas con esporas.
− Severidad: diámetro de crecimiento del hongo.
− Fitotoxicidad: referido a manchas o cambios de coloración.
Dada la cantidad de réplicas y datos que se obtienen es necesario realizar
estudios estadísticos para una evaluación adecuada. Para ello, se utilizó el software
Statgraphics Centurion XVI.I (Manugistics, Inc., Rockville, MD, USA). Se aplicó el análisis
de la varianza ANOVA con un nivel de confianza del 95% y posteriormente se
determinaron las diferencias significativas a través de la prueba LSD de Fisher (P<0,05).
Figura 13. Herida en la zona ecuatorial de
la mandarina (4 días de incubación).
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6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este apartado, se analizan los resultados obtenidos al estudiar la acción
biocida del aceite esencial impregnado en diferentes materiales frente a los
microorganismos causantes de las principales podredumbres en la piel de cítricos.
Inicialmente se pensó en preparar distintas combinaciones de soportes y aceites
esenciales añadidos en distintas formulaciones, sin embargo, debido a la suspensión de
la actividad académica presencial a partir de la pandemia, solo se pudieron preparar y
estudiar los materiales descritos en la Tabla 10, que se nombran atendiendo el siguiente
código: tipo de soporte, cantidad de aceite esencial expresado en porcentaje en peso y
aceite esencial empleado (tomillo, TO).
Tabla 10. Materiales y nomenclatura empleada en el estudio.
MATERIALES NOMENCLATURA
Zeolita LTA CACLTA- 40%TO
Arcilla pilareada CS16-21H-C- 40%TO
6.1 Caracterización de los materiales
En este trabajo, se han utilizado zeolitas sintetizadas a partir de sílice extraída de
la cáscara de arroz y arcillas pilareadas como soportes de aceites esenciales, los cuales
han sido caracterizados mediante diferentes técnicas.
6.1.1 Zeolita LTA
La zeolita LTA sintetizada a partir de la sílice de cáscara de arroz, posee una
estructura tridimensional de poros y fue funcionalizada con un 40% de aceite de tomillo
para adquirir carácter biocida.
Se realizó un estudio comparativo de difracción de rayos X entre la zeolita LTA
comercial (LTAcom), la zeolita LTA sintetizada (CACLTA) y los datos suministrados por la
International Zeolita Association (LTA-IZA). Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 14. Los difractogramas de la LTAcom y CACLTA son muy similares y ambos
materiales muestran picos a 2θ = 7,2°; 10,3°; 12,6°; 21,8°; 24,0°; 27,2°; 30,0° y 34,3°, que
son los picos característicos de la zeolita LTA, tal como indica la IZA. Estos resultados
muestran que la zeolita preparada a partir de sílice de arroz tiene la estructura de una
zeolita LTA y se ha preparado correctamente.
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Figura 14. Difractograma de la zeolita LTA comercial (LTAcom), de la sintetizada a par-
tir de sílice extraída de cáscara de arroz (CACLTA) y de la LTA proporcionado por la IZA.
También se realizó la caracterización textural de la zeolita mediante el estudio
de las isotermas de adsorción. Los valores obtenidos se muestran a continuación en la
Tabla 11.
Tabla 11. Propiedades texturales de la zeolita LTA sintetizada por UFRGS a partir de
sílice obtenida de la cáscara de arroz.
MATERIAL SBET (m2/g) SEXT (m2/g) VMICRO (cm3/g) VTP (cm3/g)
CACLTA 3,18 0,507 0,001 0,005
Se puede observar que contrariamente a lo que cabría esperar con este tipo de
materiales, la superficie BET presenta un valor muy bajo, esto es debido a que la zeolita
LTA presenta una relación Si/Al=1 y tiene sodio como cationes de compensación de
carga que ocupan la mayor parte del espacio. Esto dificulta el acceso de la molécula de
N2 a los poros de pequeño tamaño, con lo que el valor obtenido de la superficie
específica del material no es representativo. Para poder efectuar una medida correcta
empleando la técnica de adsorción de nitrógeno, habría que realizar un intercambio
iónico de sodio por calcio, de modo que el nitrógeno pueda acceder a los microporos.
Pero, la mejor opción sería la realización de un análisis de adsorción de CO2 a 0 °C para
poder así obtener un resultado de superficie BET cercano a la realidad. Estos ensayos no
se han podido realizar, pero acudiendo a bibliografía se ha podido ver que este tipo de
zeolitas presenta un área superficial próxima a 500 m2/g [142].
LTAcom
CACLTA
LTA-IZA
2
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6.1.2 Arcilla
La arcilla CS16-21H-C fue preparada a partir de arcilla sódica CSNa+ tras su
expansión con C16TABr y posterior pilarización con TEOS. La funcionalización para dotar
a este material de actividad biocida se realizó por impregnación al 40% en peso de aceite
esencial de tomillo.
El análisis textural de la arcilla muestra un aumento considerable del área
superficial BET tras la expansión y posterior pilarización del material. En consecuencia,
también se incrementaron la proporción de mesoporos y microporos como se aprecia
en la Tabla 12.
Tabla 12. Propiedades texturales de la arcilla sódica precursora (CSNa +) y la
arcilla sintetizada (C16-21H-C).
MATERIAL SBET (m2/g) SEXT (m2/g) VMICRO (cm3/g) VTP (cm3/g)
CSNa+ 43,8 27,9 0 0,084
C16-21h-C 331,1 290,5 0,016 0,617
Los difractogramas de rayos X de la arcilla pilareada y de la arcilla sódica se
muestran en Figura 15. En la arcilla pilareada desaparecen los picos a bajos ángulos
característicos de los materiales laminados, pasando de ser un material ligeramente
cristalino a un material amorfo.
Figura 15. Difractograma de la arcilla inicial CSNa+ y de la modificada CS16-21H-C.
CS16-21H-C
CSNa+
2
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Estaba previsto realizar más ensayos de caracterización, como estudios de
espectroscopía infrarroja y un análisis termogravimétrico de ambos materiales
impregnados con el aceite esencial, pero debido al cierre de la universidad por la
pandemia ha sido imposible realizarlos.
6.2 Estudios fungicidas
Se realizaron dos tipos de estudios, uno destinado a establecer la mejor
combinación soporte + aceite esencial que no generara fitotoxicidad en los frutos y otro
enfocado a evaluar la actividad biocida de los materiales elaborados a partir de la
formulación más idónea.
6.2.1 Determinación de la fitotoxicidad
En primer lugar, se realizó un estudio in vivo para determinar qué cantidad
máxima de aceite esencial de tomillo (TO) se podía incorporar a los recubrimientos sin
producir fitotoxicidad en los frutos. Por ello, se prepararon diversas formulaciones en
las que se varió la cantidad de aceite esencial. Estas formulaciones se aplicaron a las
mandarinas que se mantuvieron en incubación a 20 °C durante 7 días. Tras ello se evaluó
la presencia de manchas y cambios de color en el hesperidio de las mandarinas. El
ensayo se realizó con formulaciones de material arcilloso con aceite esencial TO y se
comparó también con una formulación de aceite esencial puro a distintas
concentraciones como se aprecia en la Tabla 13.
Tabla 13. Diferentes tratamientos realizados para el estudio de fitotoxicidad.
TRATAMIENTO
MATERIAL FUNGICIDA EN LA FORMULACIÓN
(% en peso)
ACEITE ESENCIAL EN LA FORMULACIÓN
(% en peso)
C Control - -
T1 CS16-21H-C- 20%TO 2% 0,4%
T2 CS16-21H-C- 40%TO 2% 0,8%
T3 CS16-21H-C- 27%TO 3% 0,8%
T4 CS16-21H-C- 40%TO 3% 1,2%
T5 0,4%TO 0,4% 0,4%
T6 0,8%TO 0,8% 0,8%
T7 1,2%TO 1,2% 1,2%
Los resultados obtenidos demuestran como la utilización de la misma cantidad
de aceite esencial aplicada en la formulación de forma directa o impregnada en el
material arcilloso proporcionan unos resultados muy similares produciendo alteraciones
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en la piel de la mandarina cuando se utiliza una concentración de 1,2% de aceite esencial
en la formulación de los recubrimientos (T4 y T7), como se aprecia en la Figura 16. Los
tratamientos restantes, que poseen una concentración menor a 1,2% de aceite esencial
de tomillo en la formulación (T1, T2, T3, T5 y T6), no producen fitotoxicidad en las
mandarinas y, por ello, se escogió para los ensayos de inhibición el tratamiento con la
cantidad máxima posible de material antifúngico probada que no generara fitotoxicidad,
esto es un 2% de material fungicida (arcilla + aceite esencial) en la formulación con una
concentración total de 0,8% de aceite esencial de tomillo.
Figura 16. Tratamientos que no presentan fitotoxicidad vs tratamientos que
presentan fitotoxicidad pasados 7 días de incubación a 20 ° C tras la aplicación de los
respectivos tratamientos.
6.2.2 Determinación de la actividad fungicida
Las mandarinas fueron infectadas con los hongos G. citri-aurantii, P. digitatum y
P. italicum y se les aplicó, por inmersión, una formulación (F) que contenía el material
poroso impregnado con el aceite esencial y se analizó el progreso de la infección tras el
tratamiento, tal como se ha descrito en el punto anterior. Se realizaron tres
tratamientos y un control, como se puede apreciar en la Tabla 14. Los tratamientos se
realizaron con la arcilla pilareada (CS16-21H-C) y la zeolita LTA sintetizada a partir de
sílice de la cáscara de arroz. Estos materiales se funcionalizaron con un 40% en peso de
aceite esencial de tomillo. El material funcionalizado representaba un 2% en peso de la
formulación (F), lo que suponía un 0,8% en peso de aceite esencial en la formulación.
T4 T7
T2 T6
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Para una mejor comparación se preparó también la formulación con el mismo
porcentaje de aceite esencial, pero sin el sólido que lo soporta (T3).
Tabla 14. Diferentes tratamientos realizados in vivo para el estudio de la actividad antifúngica.
TRATAMIENTO
MATERIAL FUNGICIDA EN LA FORMULACIÓN
(% en peso)
ACEITE ESENCIAL EN LA FORMULACIÓN
(% en peso)
C Control - -
T1 CACLTA- 40%TO 2% 0,8%
T2 CS16-21H-C- 40%TO 2% 0,8% T3 O,8%TO 0,8% 0,8%
En primer lugar, se comprobó que dichos tratamientos no producían alteraciones
en la piel de la mandarina induciendo a fitotoxicidad, concluyendo que, de acuerdo con
los estudios previos, un 0,8% de aceite esencial en la formulación es una concentración
adecuada. Posteriormente, se estudió el resultado de aplicar estas formulaciones sobre
los distintos hongos, analizando la incidencia (cantidad de mandarinas infectadas), la
severidad (diámetro de crecimiento del hongo) y la esporulación (cantidad de
mandarinas en las que el patógeno ha esporulado). Estos resultados se pue den observar
en las Figuras 17, 18 y 19, donde aparecen los resultados obtenidos frente a los hongos
PD, PI y GC, respectivamente.
Figura 17. Porcentajes de reducción de la incidencia, severidad y esporulación al aplicar
los tratamientos a mandarinas infectadas con PD respecto al ensayo control.
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Los resultados mostrados en la Figura 17, referentes a la infección causada por
Penicillium digitatum, indican que el único parámetro que mostró una diferencia
significativa al añadir el material fungicida fue la severidad, es decir, el diámetro de
crecimiento del hongo, obteniendo los mejores resultados con la zeolita + aceite
esencial, mientras que, sin embargo, no existen diferencias apreciables en cuanto a la
incidencia y la esporulación de las muestras tratadas con respecto al ensayo control. Así
mismo, se observa que los tratamientos con la arcilla CS16-21H-C + aceite esencial y con
el aceite esencial sin soporte no muestran diferencias representativas respecto al
control en ninguno de los parámetros considerados.
Figura 18. Porcentajes de reducción de la incidencia, severidad y esporulación al aplicar
los tratamientos a mandarinas infectadas con PI respecto al ensayo control.
En el caso del tratamiento del hongo Penicillium italicum (Figura 18), se observan
mejoras significativas en todos los parámetros al aplicar los 3 tipos de material biocida.
En el caso concreto del tratamiento con la arcilla (CS16-21H-C-40%TO), este presentó
una mayor actividad biocida tanto para la incidencia como la esporulación, logrando
reducir ambos un 40% y mostrando a su vez un mejor resultado que el tratamiento
realizado con zeolita LTA (CACLTA-40%TO) y aceite esencial de tomillo puro. Cabe
destacar que el ensayo realizado con el recubrimiento que contenía aceite esencial puro
apenas mostró cambios en el porcentaje de mandarinas infectadas (incidencia), pero sí
que consiguió una reducción importante de la severidad. No obstante, este resultado no
se considera significativo, pues la reducción del porcentaje de incidencia, que es el
parámetro más importante, es mínima.
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Figura 19. Porcentajes de reducción de la incidencia y severidad al aplicar los
tratamientos a mandarinas infectadas con GC respecto al ensayo control.
Por último, se estudió también la infección generada por Geotrichum citri-
aurantii, después de la aplicación de los recubrimientos mencionados. En este caso, el
parámetro de la incidencia es el que mostró un mayor porcentaje de reducción, aunque
la misma no superó el 11% como se aprecia en la Figura 19, y la zeolita CACLTA presentó
un mayor efecto que la arcilla y el aceite puro, tanto para la inhibición del crecimiento
fúngico como para la reducción del diámetro de podredumbre. El tratamiento 0,8%TO
fue el que menos impacto presento, casi imperceptible. En este gráfico de barras no
aparece el factor de esporulación, dado que GC no se reproduce por esporas y, por
tanto, este factor no se puede evaluar.
Las imágenes de las mandarinas tratadas a partir de los materiales
funcionalizados, frente a los hongos PD, PI y GC se pueden observar en las Figura 20, 21
y 22, respectivamente.
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Figura 20. Fotografías de las mandarinas tratadas contra el hongo PD: control
(a), CS16-21H-C-40%TO (b), CACLTA-40%TO (c) y 0.8%TO (d).
Aunque los resultados obtenidos contra el hongo PI son interesantes, los
resultados finales no son los esperados, pues los sistemas preparados no parecen ser
activos frente a los otros hongos, especialmente frente al hongo GC. Sin embargo, este
pequeño estudio ha comprobado la existencia de una actividad biocida en los materiales
preparados, aunque ésta parece depender de distintos parámetros como las
características físico-químicas y estructurales de los materiales sobre los que se ha
soportado el aceite esencial. Estas características hacen que aumente o disminuya la
actividad antifúngica en función del tipo de hongo sobre el que se actúa.
a b
c d
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Figura 21. Fotografías de las mandarinas tratadas contra el hongo PI: control
(a), CS16-21H-C-40%TO (b), CACLTA-40%TO (c) y 0.8%TO (d).
a b
c d
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Figura 22. Fotografías de las mandarinas tratadas contra el hongo GC: control
(a), CS16-21H-C-40%TO (b), CACLTA-40%TO (c) y 0.8%TO (d).
A continuación, para poder comparar más fácilmente los resultados obtenidos
con cada uno de los materiales preparados frente a los tres tipos de hongos estudiados,
se han realizado las representaciones mostradas en la Figura 23. En términos generales,
se observa cómo todos los tratamientos realizados presentan una mayor eficacia frente
el hongo Penicillium italicum, seguido de la actividad frente al PD, siendo menos activos
frente al GC. Comparando los distintos tratamientos, parece que el tratamiento con
zeolita y aceite esencial de tomillo (CACLTA-40%TO) es el que presenta una actividad
antifúngica más amplia, actuando frente a todos los hongos. El tratamiento con arcilla
a b
c d
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(CS16-21H-C-40%TO), por el contrario, es muy eficaz frente al PI, pero apenas es activo
frente a los otros hongos, obteniendo los peores resultados con las formulaciones en las
que se añade el aceite esencial TO sin soporte. Esto podría indicar que la zeolita es el
mejor soporte, pero sería necesario realizar más ensayos, en los que se:
− Busque otra forma de aplicar los recubrimientos a la fruta en sustitución a la
inmersión, intentando conseguir un recubrimiento más homogéneo.
− Modifique la forma de impregnación del aceite esencial sobre los soportes, pues
su liberación dependerá de esto y lo mismo es la clave para aumentar la actividad
biocida.
− Varíe la formulación de los recubrimientos o las cantidades empleadas de los
diferentes componentes, siempre buscando conseguir reducir al máximo la
incidencia y sin producir fitotoxicidad en la fruta.
− Analice si otros aceites esenciales tienen un mayor efecto sobre los hongos
estudiados, en este sentido se ha descrito el uso de aceite esencial de canela o
aceite esencial de hierba de limón o menta, entre otros.
− Disminuya la concentración de aceite esencial en la zeolita, pero se aumente la
concentración de material antifúngico en la formulación, buscando así una
mayor dispersión del material antifúngico y una liberación más prolongada.
− Realice un estudio cinético de liberación del aceite esencial en los materiales
funcionalizados.
− Cambie la variedad de los frutos empleados para los ensayos, ya que pueden
influir aspectos como el grosor y los componentes de la piel.
− Varíe las condiciones de almacenamiento durante la realización del estudio, pues
estas pueden influir en la rapidez de pudrición.
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Figura 23. Actividad de cada tratamiento frente a los tres tipos de hongos estudiados.
Incidencia Severidad Esporulación
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
% R
edu
cció
n
CACLTA- 40%TO
PD
PI
GC
Incidencia Severidad Esporulación0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
% R
edu
cció
n
CS16-21H-C- 40%TO
PD
PI
GC
Incidencia Severidad Esporulación0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
% R
edu
cció
n
O,8%TO
PD
PI
GC
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7. CONCLUSIONES
La realización de un estudio bibliográfico sobre materiales con propiedades
antifúngicas para el tratamiento de cítricos ha permitido comprobar que los productos
naturales, en concreto los aceites esenciales, son una alternativa real a los fungicidas
comúnmente empleados en la postcosecha de cítricos debido a sus propiedades
antibacterianas y antifúngicas, directamente relacionadas con la presencia de
componentes volátiles de carácter bioactivo en su composición. En base a esto, se han
sintetizado nuevos materiales con propiedades biocidas, mediante la funcionalización
de zeolitas y arcillas con aceite esencial de tomillo. Los materiales desarrollados actúan
como soportes del aceite esencial, permitiendo una liberación controlada en el tiempo
del aceite esencial. A partir de estos materiales, se han elaborado diferentes
formulaciones, las cuales se han incorporado como recubrimientos en la piel de cítricos
para estudiar in vivo la actividad biocida de los mismos contra los hongos fitopatógenos
más comunes en estos frutos.
Las formulaciones empleadas logran reducir la incidencia, la severidad y la
esporulación frente al crecimiento del hongo Penicillium italicum. Teniendo en cuenta
que el parámetro de la incidencia es el más importante para poder evaluar la actividad
biocida, se ha concluido que la formulación con arcilla natural y aceite esencial de
tomillo es la que presenta un mejor resultado. Sin embargo, la efectividad frente a
Penicillium digitatum y Geotrichum citri-aurantii de esta formulación es mucho menor
que la conseguida con la que contenía zeolita. En este sentido, el material zeolita + aceite
esencial de tomillo es el que en conjunto tiene una mejor actividad biocida frente a los
3 hongos estudiados, lo que indicaría que la zeolita es el mejor soporte para liberar el
aceite esencial. Asimismo, los resultados obtenidos han mostrado que la actividad
biocida depende de las características del soporte sobre el que se coloca el aceite
esencial y del tipo de hongo sobre el que se actúa. Además, se observa que el soporte
de aceite esencial sobre arcilla o zeolita parece aumentar su actividad biocida. Sin
embargo, sería necesario realizar más ensayos para poder conseguir un mayor poder de
inhibición y permitir obtener un sustituto a los fungicidas habituales empleados para el
tratamiento de postcosecha de cítricos.
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