Involvement of nucleostemin in the p53-mediated regulatory pathway

in cellular senescence

骨髄由来の間葉系幹細胞で高発現している

ヌクレオステミンの機能

Nucleostemin

1) Nucleostemin is expressed in nucleoli of CNS stem cells,

embryonic stem cells and several cancer cells.

2) Nucleostemin expression decreases rapidly prior to

neuronal differentiation of CNS stem cells.

3) The N-terminal basic domain specifies the p53 interaction

and growth regulatory functions.

Human nucleostemin

B CC AG4 G1

NLS

B: basic domain CC: coiled-coil domain G4: GTP-binding motif G1: GTP-binding motif A: acidic domainNLS: nuclear localization signal

epitope1 epitope21 549

KRPK2 5

KKPRK42 46

RRPR86 89

NS mergeC23

H10-8 H1299

MRC5

U2OS

U2OSHacat

NoLS of p14ARF:

+BDNF+NGF+bFGF2

NS NS

Expression of nucleostemin in differentiated marrow stromal cells

NS MAP2

neuronal differentiation

induceduninduced

- NS

Expression of nucleostemin in senescent marrow stromal cells

young

senescent

X100

X100

Y S

actin GAPDH

p53 p53NS NS

Y S

X40

X40

SA-βgal

X200

X200

SA-βgalNS NS

young senescent

mdm2 mdm2p21 p21

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300

day

0

10

20

30

40

50

60

70

Introduction of nucleostemin into late-passage marrow stromal cells

AdGFPAdNS

Brd

U-p

osit

ive

cell

(%)

P=0.0053

AdGFPAdNS

actin

p53

BrdU

X40

AdNS

Introduction of nucleostemin-siRNA stabilizes p53 protein in marrow stromal cells

marrow stromal cells U2OS cells

NS ctrl NS ctrl

NS NS

p53 p53

actin GAPDH

mdm2 mdm2

siRNA siRNA

NS NS

p53 p53

actin GAPDH

mdm2 mdm2

NS ctrl NS ctrlsiRNA siRNA

Decreased nucleostemin expression destabilizes p14ARF and mdm2 proteins.

αp14ARF 　 αNS

p14ARF-

NS

ctrl

NS-siRNA

IP

NS ctrlsiRNA

mdm2

NSp14ARF

GAPDH

NS ctrlsiRNA

mdm2

NSp14ARF

actin

NS mergep14ARF

p14ARF merge

Decreased expression of nucleostemin induces the structural change of nucleoli.

ctrl

NS-siRNA

NS mergeB23

ARF

core

nucleolus

marrow stromal cells

nucleus

nucleolus

senescent cellsdifferentiated cells

nucleus

Involvement of nucleostemin in the p53-regulatory pathway

ARF

degradation

mdm2

degradation

p53

ubub

ub

p53

NS

NS

NS NS

NS

NSNS

degradation

p53

p53

ARF

mdm2

mdm2

mdm2

mdm2

core

ARF

ub

ubub

ub

ububub

ubub

ARF

考察ヌクレオステミンの発現量を減少させると、 p14ARF と mdm2タンパク質量の減少と、 p53 タンパク質量の増加が認められたことから、ヌクレオステミンは p53 制御経路上で機能していることが示唆された。

細胞老化の M1 期は、テロメアの短縮を察知した ATM による p53 の安定化によって誘起される細胞周期の停止であると考えられている。本実験から、テロメアの短縮に加えて、ヌクレオステミン量の減少も M1 期における p53 の安定化に関与していることが示唆された。

ヒト骨髄間質細胞には寿命があることが、分化させた細胞を移植し臓器の機能回復を計る再生医療に役立てる際の大きな障壁となっている。ヌクレオステミン遺伝子の導入によって細胞周期を回転させ、多くの細胞数を得ることが可能となれば、再生医療への実用化に寄与できると考えられる。