«ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΕΝ∆ΟΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΣΗΜΑΤΟ∆ΟΤΗΣΗΣ:

ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ, ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ»

∆. Καρδάσης

Σηµειώσεις Βιοχηµείας Α 2007-2008

Α) ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1) Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια είναι µηχανισµοί µε τους οποίους ένα κύτταρο επικοινωνεί µε το

περιβάλλον του και αποκρίνεται ανάλογα µε την κατάσταση στην οποία βρίσκεται.

2) Η δράση των σηµατοδοτικών µονοπατιών µπορεί να είναι γενωµική (µέσω της µεταγραφικής

ενεργοποίησης γονιδίων στόχων), µη-γενωµική (χωρίς να µεσολαβεί γονιδιακή έκφραση) ή και

τα δύο. Στην περίπτωση της γενωµικής δράσης, το σήµα φτάνει στο πυρήνα και ενεργοποιεί

µεταγραφικούς παράγοντες (πυρηνικές πρωτεΐνες που προσδένονται στον υποκινητή ή τον

ενισχυτή των γονιδίων και προκαλούν ενεργοποίηση της µεταγραφικής δραστηριότητάς τους).

Στην περίπτωση της µη-γενωµικής δράσης, το σήµα δεν φτάνει στον πυρήνα και µεσολαβείται

από την τροποποίηση της δραστικότητας κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνών (ενζύµων,

ρυθµιστικών πρωτεϊνών) ρυθµίζοντας έτσι άµεσα και ταχύτατα κυτταρικές διαργασίες (π.χ.

σύνθεση και αποικοδόµηση του γλυκογόνου από την φωσφορυλάση και την συνθάση του

γλυκογόνου ως απόκριση σε ορµόνες όπως η επινεφρίνη και η γλυκαγόνη).

3) Ένα γενικό σχήµα της ενδοκυττάριας (γενωµικής) σηµατοδότησης παρουσιάζεται στο Σχήµα 1.

Το σχήµα αυτό τονίζει ότι ένα σηµατοδοτικό µονοπάτι ξεκινά από εξωκυττάρια µόρια που

καλούνται προσδέµατα (ligands) τα οποία προσδένονται σε συγκεκριµένους και

εξειδεκευµένους υποδοχείς που διαπερνούν την πλασµατική µεµβράνη. Είναι σύνηθες

φαινόµενο οι υποδοχείς αυτοί να διµερίζονται έπειτα από την πρόσδεσή τους µε τα

προσδέµατα. Με αυτόν τον τρόπο, οι υποδοχείς ενεργοποιούνται ούτως ώστε να

προετοιµαστούν για την µεταβίβαση του σήµατος στο εσωτερικό του κυττάρου. Η

ενεργοποίηση των υποδοχέων γίνεται µε αλλαγή στην στερεοδιαµόρφωσή τους η οποία µπορεί

να συνοδεύεται από φωσφορυλίωση συνήθως από κινάσες σερίνης/θρεονίνης ή τυροσίνης. Οι

κινάσες αυτές µπορεί να είναι είτε αναπόσπαστο τµήµα των ίδιων των υποδοχέων

(αυτοφωσφορυλίωση) είτε ξεχωριστές πρωτείνες που προσδένονται στο ενδοκυττάριο τµήµα

του υποδοχέα. Οι ενεργοποιηµένοι υποδοχείς προκαλούν στην συνέχεια την ενεργοποίηση

άλλων ενδοκυττάριων πρωτεϊνών που καλούνται διαµεσολαβητές (effectors). Τελικά το σήµα

καταλήγει στον πυρήνα όπου τροποποιεί την έκφραση συγκεκριµένων γονιδίων στόχων.

1

Σχήµα 1: Ένα γενικό µονοπάτι ενδοκυττάριας σηµατοδότησης µε γενωµική δράση. Το ανθρώπινο γένωµα περιέχει την πληροφορία για έναν µεγάλο αριθµό από διαµεµβρανικούς υποδοχείς (receptors) και τα προσδέµατά τους (ligands). Το σχήµα απεικονίζει τις βασικές βιοχηµικές λειτουργίες. Η αλληλεπίδραση receptor-ligand οδηγεί στην ενεργοποίηση ανενεργών (latent) µεταγραφικών παραγόντων (transcription factors). Αυτό µπορεί να γίνει είτε άµεσα από τους υποδοχείς ή µέσω ενδιάµεσων ενζύµων (κινασών, πρωτεασών, φωσφατασών), ιόντων ή ενώσεων (π.χ. ασβέστιο, λιπίδια κλπ). Αυτά τα ένζυµα και οι ενώσεις ονοµάζονται γενικά effectors (διαµεσολαβητές). Στην συνέχεια, οι ενεργοποιηµένοι µεταγραφικοί παράγοντες µεταφέρονται στον πυρήνα µέσω ειδικών πρωτεϊνών µεταφορέων (importins). Σε ορισµένα σηµατοδοτικά µονοπάτια, το ίδιο το ένζυµο-διαµεσολαβητής µπορεί να εισέλθει στον πυρήνα και να ενεργοποιήσει εκεί κάποιον µεταγραφικό παράγοντα. Στον πυρήνα, οι µεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται στο DNA και αλληλεπιδρούν µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες. Αυτό οδηγεί στην προσέλκυση, στον χώρο του υποκινητή, συν-ενεργοποιητών (co-activators) οι οποίοι είναι ένζυµα που τροποποιούν τις ιστόνες ούτως ώστε να χαλαρώσουν το πακετάρισµα της χρωµατίνης και να διευκολυνθεί η δράση της RNA πολυµεράσης ΙΙ (Pol II).

Β) ΣΗΜΑΤΟ∆ΟΤΗΣΗ ΜΕΣΩ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗΣ H φωσφορυλίωση πρωτεϊνών από κινάσες είναι ο σηµαντικότερος µηχανισµός µε τον οποίο

εξωκυττάρια σήµατα µεταβιβάζονται και πολλαπλασιάζονται στο εσωτερικό των κυττάρων. Η

φωσφορυλίωση µπορεί να γίνει είτε σε κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης από κινάσες που καλούνται

κινάσες σερίνης/θρεονίνης (Serine/Theronine kinases, STKs) είτε σε κατάλοιπα τυροσίνης από

κινάσες που καλούνται κινάσες τυροσίνης (Tyrosine kinases, TKs). Πολλοί από τους υποδοχείς

που εµπλέκονται σε σηµατοδοτικά µονοπάτια είναι οι ίδιοι κινάσες.

Το παράδειγµα της ενεργοποίησης υποδοχέων µε δραστικότητα κινάσης τυροσίνης

(Receptor Tyrosine Kinases, RTKs) είναι από τα πιο µελετηµένα. Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν

οι υποδοχείς της της ινσουλίνης και του παράγοντα ανάπτυξης επιδερµικών κυττάρων (Epidermal

Growth Factor ή EGF). Όπως φαίνεται στο Σχήµα 2, οι υποδοχείς αυτοι αποτελούνται από µια

εξωκυττάρια περιοχή πρόσδεσης του προσδέµατος (Ligand Binding Domain), µια διαµεµβρανική

περιοχή µε δοµή α-έλικας (Transmembrane Domain) και µια ενδοκυττάρια περιοχή η οποία

περιέχει την καταλυτική θέση µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης (Catalytic Domain). Στους

2

υποδοχείς αυτούς, η πρόσδεση του προσδέµατος προκαλεί τον διµερισµό ή τον ολιγοµερισµό των

υποµονάδων. Ο ολιγοµερισµός επιτρέπει την σταυρωτή φωσφορυλίωση των υποδοχέων δηλ. η

µια υποµονάδα φωσφορυλιώνει την άλλη σε συγκεκριµένα κατάλοιπα τυροσίνης. Η

φωσφορυλίωση των καταλοίπων τυροσίνης παίζει πολύ σηµαντικό ρόλο την µεταβίβαση του

σήµατος στο κυτταρόπλασµα καθώς ευνοεί την πρόσδεση άλλων ενδοκυττάριων περιοχών οι

οποίες περιέχουν SH2 (Src Homology 2) περιοχές (domains).

. Σχήµα 2: Γενικός µηχανισµός ενεργοποίησης υποδοχέων µε δραστικότητα κινάσης τυροσίνης.

Ένα άλλο παράδειγµα ενεργοποίησης υποδοχεών από φωσφορυλίωση σε κατάλοιπα

τυροσίνης είναι αυτό του υποδοχέα της ιντερφερόνης (Σχήµα 3).

Οι υποδοχείς της ιντερφερονης ανήκουν στην κατηγορία των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης

και είναι προσδεµένοι, στο κυτταροπλασµατικό τους τµήµα, σε άλλες ενδοκυττάριες κινάσες

τυροσίνης που ονοµάζονται κινάσες Ιανός (JANUS Κinases ή JAK). Το σηµατοδοτικό µονοπάτι

της ιντερφερόνης ξεκινά µε µια σειρά φωσφορυλιώσεων σε κατάλοιπα τυροσίνης: α) στις

πρωτεϊνες JAK, β) στους υποδοχείς γ) στις πρωτεϊνες STAT. Συγκεκριµένα, µετά την πρόσδεση

του προσδέµατος, οι πρωτεϊνες JAK έρχονται κοντά η µια µε την άλλη λόγω του διµερισµού των

υποδοχέων ιντερφερόνης πάνω στους οποίους προσδένονται και αυτοφωσφορυλιώνονται µε

σταυρωτή φωσφορυλίωση σε κατάλοιπα τυροσίνης. Στην συνέχεια, οι ενεργοποιηµένες JAK

φωσφορυλιώνουν τους υποδοχείς σε κατάλοιπα τυροσίνης και έτσι δηµιουργούν θέσεις

ελλιµενισµού πρωτείνών που διαθέτουν περιοχές SH2 (οι περιοχές SH2 προσδένονται σε περιοχές

µε φωσφορυλιωµένη τυροσίνη). Τέτοιες πρωτεϊνες είναι οι µεταγραφικοί παράγοντες STAT

(Signal Transducers and Activators of Transcription) οι οποίοι αφού προσδεθούν,

φωσφορυλιώνονται από τις κινάσες JAK. Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών STΑΤ προκαλεί τον

διµερισµό τους µέσω των SH2 περιοχών που διαθέτουν και την επακόλουθη µεταφορά τους στον

πυρήνα όπου προσδένονται σε γονίδια στόχους.

3

Οι πρωτεϊνες STAT είναι µεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται από µια πληθώρα

κυτταροκινών (πάνω από 20) µε κυριότερο εκπρόσωπο την ιντερφερόνη γ. Ο κύκλος

ενεργοποίησης-απενεργοποίησης των πρωτεϊνών STAT είναι σχετικά σύντοµος, περίπου 15 λεπτά.

Υπάρχουν 7 γνωστές STAT πρωτεϊνες, η κάθε µια µε ξεχωριστή λειτουργία όπως φαίνεται και από

γενετικές µελέτες σε ζώα στα οποία τα γονίδια των STAT απενεργοποιήθηκαν µε οµόλογο

ανασυνδυασµό (ζώα knock out) .

Σχήµα 3: Το σηµατοδοτικό µονοπάτι της ιντερφερόνης που γίνεται µέσω των πρωτεϊνών JAK/STAT και οι µηχανισµοί φωσφορυλίωσης σε κατάλοιπα τυροσίνης που εµπλέκονται σε αυτό.

Με ετεροπολυµερισµό και αυτοφωσφορυλίωση ενεργοποιούνται και οι υποδοχείς µε

δραστικότητα κινάσης σερίνης/θρεονίνης. Τα καλύτερο µελετηµένο παράδειγµα είναι αυτό του

υποδοχέα του µετασχηµατίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGFβ).

O υποδοχέας του TGFβ, είναι ένα τετραµερές το οποίο αποτελείται από ένα διµερές

υπδοχεών τύπου ΙΙ και ένα διµερές υποδοχέων τύπου Ι.

Σχήµα 4: Μηχανισµός ενεργοποίησης του υποδοχέα του µετασχηµατίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGFβ) ο οποίος έχει δραστικότητα κινάσης σερίνης/θρεονίνης.

4

Και οι δυο τύποι υποδοχέων (Ι και ΙΙ) του TGFβ έχουν δραστικότητα κινάσης σερίνης/θρεονίνης. Ο

τυπου ΙΙ υποδοχέας είναι µόνιµα ενεργός ενώ ο τύπου Ι υποδοχέας ενεργοποιείται έπειτα από

φωσφορυλίωση από τον τύπου ΙΙ υποδοχέα. Η πρόσδεση του TGFβ στο διµερές υποδοχέων τύπου

ΙΙ προκαλεί τον ετεροµερισµό τους µε ένα διµερές υποδοχέων τύπου Ι και την φωσφορυλίωση των

τελευταίων σε συγκεκριµένα κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης. Στην συνέχεια, ο ενεργοποιηµένος

υποδοχέας τύπου Ι φωσφορυλιώνει κυτταροπλασµατικές πρωτεϊνες της οικογένειας Smad όπως θα

εξηγηθεί παρακάτω.

Το µονοπάτι του µετασχηµατίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGFβ) και των πρωτεϊνών Smad

Το σηµατοδοτικό µονοπάτι του TGFβ παίζει έναν σηµαντικό ρόλο σε µηχανισµούς όπως η

διαφοροποίηση, η απόπτωση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός και η παραγωγή εξωκυττάριους

ουσίας. Θεωρείται ως ογκοκατασταλτικό µονοπάτι καθώς έχουν βρεθεί µεταλλάξεις στο µονοπάτι

αυτό οι οποίες προκαλούν καρκίνο. Το µονοπάτι του TGFβ παρουσιάζεται στο Σχήµα 5. Η

ενεργοποίηση του υποδοχέα τύπου Ι (η οποία περιγράφηκε παραπάνω) προκαλεί την άµεση

πρόσδεση και την επακόλουθη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών της οικογένειας Smad και συγκεκριµένα

των πρωτεϊνών Smad2 και Smad3. Μετά την φωσφορυλίωσή τους, οι πρωτεϊνες Smad2 και Smad3

(οι οποίες ονοµάζονται R-Smads δηλ Receptor-Activated Smads) σχηµατίζουν ετεροδιµερή µε την

πρωτεϊνη Smad4 (η οποία ονοµάζεται co-Smad δηλ common partner Smad). Τα διµερή

Smad2/Smad4 και Smad3/Smad4 µεταφέρονται στην συνέχεια στον πυρήνα, προσδένονται στο

DNA και ενεργοποιούν συγκεκριµένα γονίδια στόχους. Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad

γίνεται σε συγκεκριµένα κατάλοιπα σερίνης στο καρβοξυτερµατικό τους άκρο.

5

Σχήµα 5: Το σηµατοδοτικό µονοπάτι του µετασχηµατίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGFβ) και η δοµή των πρωτεϊνών Smad. H περιοχή των Smad που φωσφορυλιώνεται από τον υποδοχέα τύπου Ι συµβολίζεται ως SSXS όπου S = σερίνη και Χ= οποιοδήποτε αµινοξύ. Οι πρωτεϊνες Smad1,5,8 ανήκουν στον µονοπάτι της BMP (Bone Morphogenetic Protein) το οποίο είναι πανοµοιότυπο µε αυτό του TGFβ ως προς τα βασικά του χαρακτηριστικά. Ι- Smad: ανασταλτικά Smad δηλ πρωτεϊνες που αναστέλουν το µονοπάτι.

Όπως φαίνεται στο σχήµα 5 δεξιά, οι πρωτεϊνες Smad αποτελούνται από 2 περιοχές µε

µεγαλη οµολογία µεταξύ των µελών της οικογένειας (περιοχές MH1 και MH2 από το Mad

Homology Domain 1 και 2) οι οποίες διαχωρίζονται µεταξύ τους από µια συνδετική περιοχή που

ονοµάζεται linker. Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad γίνεται στην περιοχή MH2 σε τρεις

σερίνες στο καρβοξυτερµατικό άκρο. Η φωσφορυλίωση γίνεται µόνο µετά την πρόσδεση των

Smads στον υποδοχέα τύπου Ι µέσω των ΜΗ2 περιοχών. Εχει βρεθεί ότι η φωσφορυλίωση των

Smad2 και Smad3 πρωτεϊνών προκαλεί αλλαγές στην στερεοδιαµόρφωσή τους. Με τις αλλαγές που

γίνονται, οι ΜΗ2 περιοχές των Smad2 και 3 καθίστανται έτοιµες να αλληλεπιδράσουν µε την ΜΗ2

περιοχή της Smad4 και να σχηµατίσουν έτσι λειτουργικά διµερή. Τα διµερή Smad2/Smad4 και

Smad3/Smad4 που σχηµατίζονται ως αποτέλεσµα της ενεργοποίησης του υποδοχέα εισέρχονται

στην συνέχεια στον πυρήνα µέσω ειδικών πρωτεϊνών που ονοµάζονται ιµπορτίνες (importins από

το import που σηµαίνει εισαγωγή). Σε αυτό βοηθά µια αµινοξική αλληλουχία στην ΜΗ1 περιοχή

των Smad πρωτεϊνών που δρα ως σήµα πυρηνικού εντοπισµού (nuclear localization signal ή

NLS).

Μόλις εισέλθουν στον πυρήνα, τα διµερή των Smads δρούν ως κλασσικοί µεταγραφικοί

ενεργοποιητές δηλαδή προσδένονται σε συγκεκριµένες αλληλουχίες DNA στους υποκινητές

γονιδίων στόχων και προκαλούν έναρξη της µεταγραφής. Η µεταγραφική ενεργοποίηση από τις

πρωτεϊνες Smad γίνεται σε συνδυασµό µε άλλες µεταγραφικές πρωτεϊνες που τις υποβοηθούν

καθώς οι Smad έχουν πολύ µικρή συγγένεια για το DNA.

Ποια γονίδια ενεργοποιούνται από τις πρωτεϊνες Smad και κατ επέκταση από τον TGFβ;

Σίγουρα όχι όλα. Η επιλογή των γονιδίων γίνεται από την ύπαρξη της ακολουθίας 5’ CAGAC 3’ σέ

έναν υποκινητή (που αποτελεί ένα ρυθµιστικό στοιχείο πρόσδεσης των Smad) καθώς και από

βοηθητικούς παράγοντες. Είµαστε σήµερα σε θεση, χρησιµοποιώντας τεχνολογίες γονιδιωµατικής

ανάλυσης όπως οι µικροσυστοιχίες DNA (DNA microarrays) να εντοπίσουµε όλα τα γονίδια τα

οποία ενεργοποιούνται από ένα σηµατοδοτικό µονοπάτι όπως αυτό του TGFβ.

6

Ο ρόλος της γενετικής στην κατανόηση του µηχανισµού λειτουργίας και της βιοϊατρικής

σηµασίας των µονοπατιών σηµατοδότησης.

Η κατανόηση των µηχανισµών µε τους οποίους γίνεται η µεταβίβαση των εξωκυττάριων σηµάτων

στο εσωτερικό των κυττάρων καθώς και η βιολογική σηµασία των µονοπατιών διευκολύνθηκε

σηµαντικά µε:

Α) Tην ανίχνευση και τον χαρακτηρισµό µεταλλάξεων (σε ασθενείς) στα γονίδια που συµµετέχουν

στα σηµατοδοτικά µονοπάτια

Β) Tην δηµιουργία και την µελέτη µοντέλων ζώων κυρίως ποντικών που είτε υπερεκφράζουν

κάποιο γονίδιο (transgenic mice) είτε έχουν έλλειψη σε αυτό (knock out mice).

Στον Πίνακα Ι παρουσιάζεται η συχνότητα των µεταλλάξεων στα γονίδια του σηµατοδοτικού

µονοπατιού του TGFβ σε ασθενείς µε καρκίνο ή άλλες ασθένειες. Από τον Πίνακα αυτό

συµπεραίνουµε ότι η εύρυθµη λειτουργία του µονοπατιού του TGFβ είναι κεφαλαιώδους σηµασίας

για την προστασία των κυττάρων από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό που οδηγεί στην

νεοπλασία. Παρ όλα αυτά, η προστατευτική δράση του TGFβ παύει να ισχύει σε προχωρηµένα

στάδια της νόσου λόγω συγκεκριµένων λειτουργιών του TGFβ (π.χ. αγγειογέννεση,

ανοσοκαταστολη) οι οποίες υποβηθούν το φαινόµενο.

Πίνακας Ι: Γενετικές µεταλλάξεις στο µονοπάτι του µετασχηµατίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGFβ) οι οποίες προκαλούν καρκίνο και άλλες ασθένειες.

7

Σηµαντική πληροφορία όσον αφορά την σηµασία συγκεκριµένων πρωτεϊνών στην σηµατοδότηση

καθώς και σε συγκεκριµένες βιολογικές διεργασίες όπως π.χ. ανάπτυξη, διαφοροποίηση, απόπτωση

κλπ έχει προέλθει και από τις µελέτες µοντέλων ζώων. Παραδείγµατα παρουσιάζονται στον

Πίνακα ΙΙ όσον αφορά την λειτουργία των πρωτεϊνών STAT. Στις µελέτες αυτές, η επιλεκτική

απενεργοποίηση των γονιδίων έγινε µε οµόλογο ανασυνδυασµό σε αρχέγονα πολυδύναµα βλαστικά

κύτταρα (embryonic stem cells). Μια απλούστευση της µεθοδολογίας για την δηµιουργία ζώων

knock out παρουσιάζεται στο Σχήµα 6.

Πίνακας ΙΙ: Ο ρόλος των πρωτεϊνων STATµέσα από µελέτες σε µοντέλα ζώων knock out

Σχήµα 6: Απλουστευµένη παρουσίαση του τρόπου δηµιουργίας knock out ποντικών µε οµόλογο ανασυνδυασµό σε βλαστικά κύτταρα.

8

Προοπτικές για διάγνωση και θεραπεία

Η κατανόηση σε βάθος των µονοπατιών σηµατοδότησης όπως αυτά που αναπτύχθηκαν

ανωτέρω µας επιτρέπει να είµαστε αισιόδοξοι για την θεραπεία νοσηµάτων που εµπλεκονται σε

νοσήµατα όπως ο καρκίνος, η ίνωση κλπ. Αυτό µπορεί να επιτευχθεί µε δύο τρόπους:

1) Με καταστολή των µονοπατιών όταν αυτά απορυθµιστούν λόγω π.χ. ενεργοποιητικών

µεταλλάξεων

2) Με ενεργοποίηση των µονοπατιών όταν αυτά υπολειτουργούν λόγω αρνητικών µεταλλάξεων.

Στην περίπτωση της καταστολής των µονοπατιών είναι αναγκαίο να χρησιµοποιηθούν

εξειδεκευµενοι αναστολείς των µονοπατιών οι οποίοι µπορούν να στοχεύουν διαφορετικά στάδιά

τους όπως:

α) η πρόσδεση των προσδεµάτων στους υποδοχείς. Αυτό µπορεί να επιτευχθεί µε αντισώµατα που

προσένονται είτε στο πρόσδεµα είτε στους υποδοχείς (blocking antibodies)

β) η δραστικότητα κινάσης των υποδοχέων. Αυτό µπορεί να επιτευχθεί µε ενώσεις οι οποίες

προσδένονται επιλεκτικά στο ενεργό κέντρο των ενζύµων µε δραστικότητα κινάσης τυροσίνης ή

σερίνης/θρεονίνης

γ) η απενεργοποίηση των διαµεσολαβητών. Αυτό µπορεί να επιτευχθεί µε την νέα και πολλά

υποσχόµενη τεχνολογία της αποσιώπησης µέσω RNA ή RNA interference (RNAi) καθώς και µε

την εισαγωγή στα κύτταρα dominant negative µορφών συγκεκριµέων πρωτεϊνών (µεταλλαγµένες

µορφές των πρωτεϊνών που ενώνονται µε τις φυσιολογικές και τις απενεργοποιούν). Σε αυτό το

στάδιο µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν φυσικοί καταστολείς του µονοπατιού π.χ. οι

ανασταλτικές µορφές Smad6 και Smad7 του µονοπατιού του TGFβ.

Στην περίπτωση της ενεργοποίησης των µονοπατιών θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν

µέθοδοι γονιδιακής µεταφοράς που βασίζονται σε µη-µολυσµατικούς ιούς (π.χ. ανασυνδυασµένους

αδενοϊούς από τους οποίους έχουν αφαιρεθεί τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για την

µολυσµατικότητά τους) για την ασφαλή µεταφορά γονιδίων σε συγκεκριµένα κύτταρα στόχους

(γονιδιακή θεραπεία).

9

Εννοιες κατανόησης

1. Στόχος µονοπατιών σηµατοδότησης: Μεταβίβαση και ενίσχυση εξωκυττάριων σηµάτων (ορµόνες, κυτταροκίνες, αυξητικοί παράγοντες) στο εσωτερικό του κυττάρου µε σκοπό την επίτευξη µιας κυτταρικής απόκρισης.

2. Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια ανάλογα µε το τελικό αποτέλεσµα τους χωρίζονται σε : α. Μονοπάτια µε µη-γενωµική δράση στα οποία το µονοπάτι δεν απαιτεί την µεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων στόχων. Παράδειγµα: τροποιήσεις ενζύµων του µεταβολισµού από ορµόνες όπως η ινσουλίνη και η γλυκαγόνη. β. Μονοπάτια µε γενωµική δράση τα οποία απαιτούν την µεταγραφική ενεργοποίηση ή καταστολή γονιδίων στόχων. Παράδειγµα: Σηµατοδοτικά µονοπάτια αυξητικών παραγόντων (EGF, TGFβ, TNFα κ.α.)

3. Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια ανάλογα µε τον µηχανισµό µετάδοσης του εξωκυττάριου σήµατος στο εσωτερικό του κυττάρου χωρίζονται σε: α. Μονοπάτια στα οποία η µεταφορά του εξωκυττάριου σηµατοδοτικού µορίου γίνεται µε διάχυση µέσα από τις µεµβράνες. Παράδειγµα: Στεροειδείς ορµόνες – Πυρηνικοί υποδοχείς β. Μονοπάτια στα οποία συµµετέχουν µεµβρανικοί υποδοχείς. Σε αυτή την περίπτωση, δεν µεταφέρεται το ίδιο το σηµατοδοτικό µόριο αλλά το σήµα υπό την µορφή µιας ενεργοιηµένης διαµόρφωσης του υποδοχέα. Παράδειγµα: Αναπτυξιακοί παράγοντες, κυτταροκίνες.

4. Στα µονοπάτια σηµατοδότησης συµµετέχουν εξειδικευµένοι διαµεσολαβητές (ή δεύτεροι

αγγελιαφόροι). Τετοιοι διαµεσολαβητές είναι ενεργοποιηµένες πρωτεϊνες (π.χ. G πρωτείνες, κινάσες, φωσφατάσες κ.α.), ιόντα (π.χ. ασβεστίου) ή µόρια (π.χ. κυκλινό ΑΜΡ, φωσφολιπίδια).

5. Μερικοί υποδοχείς διµερίζονται µετά την πρόσδεση ενός προσδέµατος και σηµατοδοτούν

µέσω αυτοφωσφορυλίωσης (π.χ. υποδοχέας αυξητικής ορµόνης). Πολλοί υποδοχείς είναι οι ίδιοι κινάσες (κινάσες σερίνης/θρεονίνης ή κινάσες τυροσίνης).

6. Μεταλλάξεις σε γονίδια που συµµετέχουν σε σηµατοδοτικά µονοπάτια σχετίζονται µε

ασθένειες όπως ο καρκίνος (παραάδειγµα: µεταλλάξεις που καταστέλουν την δράση GTPάσης της πρωτεϊνης ras µε αποτέλεσµα να βρίσκεται συνεχως σε ενεργοποιηµένη κατάσταση).

7. Ασθένειες µπορούν επίσης να προκληθούν από µετα-µεταφραστικές τροποιήσεις

σηµατοδοτικών µορίων όπως οι G πρωτείνες (παραδείγµατα: η τοξίνη της χολέρας και του κοκκύτη)

8. Η γνώση των µηχανισµών που διέπουν τα µονοπάτια σηµατοδότησης καθώς και της δοµής

και της λειτουργίας των µορίων που συµµετέχουν σε αυτά µπορεί να οδηγήσει στην δηµιουργία νέων αποτελεσµατικών φαρµάκων (το παράδειγµα του Gleevec για την καταπολέµηση της χρόνιας µυελογενούς λευχαιµίας)

10

Ερωτήσεις κατανόησης

1. Σχεδιάστε ένα γενικό µονοπάτι σηµατοδότησης µε γενωµική δράση και σηµειώστε τα είδη των µορίων που συµµετέχουν σε αυτό. Τι επιτυγχάνεται µε ένα σηµατοδοτικό µονοπάτι;

2. Αναφέρατε συνήθεις τυπους δεύτερων αγγελιαφόρων σηµατοδοτικών µονοπατιών. Ποιά

είναι τα οφέλη για ένα κύτταρο από την χρήση δεύτερων αγγελιαφόρων σε ένα µονοπάτι σηµατοδότησης;

3. Πως σχηµατίζεται η κυκλική ΑΜΡ και ποιος είναι ο ρόλος της σε ένα σηµατοδοτικό

µονοπάτι; Αναφέρατε συγκεκριµένα παραδείγµατα µονοπατιών σηµατοδότησης στα οποία συµµετέχει η κυκλική ΑΜΡ.

4. Περιγράψτε συνοπτικά τον µηχανισµό ενεργοποίησης ενός υποδοχέα µέσω σταυρωτής

φωσφορυλίωσης χρησιµοποιώντας ένα συγκεκριµένο παράδειγµα.

11