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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DE CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS TROPICALES
TEMA: CLOSTRIDIUM BOTULINUM
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERALDOCENTE: Blgo. WILBER ZUÑIGA
CARRERA PROFESIONAL DE ING. DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
INTEGRANTES: JUNIOR GALVEZ VENEGAS
PAUL VARA ZAMALLOA
J.JOSE HUARCA SUTTA
INTRODUCCION
• BOTULUS
• 1897:
• B. heridas
• B. lactantes
1870
Primera descripción de C. BOTULINUM
toxina
VAN ERNENGEM
CLOSTRIDIUM BOTULINUM
REINO Bacteria
DIVISION Firmicutes
CLASE Clostridia
ORDEN Clostridiales
FAMILIA clostridiaceae
GENERO clostridium
ESPECIE clostridium botulinum
CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Bacilos Gram positivos
4-8 micras
Es móvil, flagelo con esporas
Anaerobio
20 – 30 °C
PH 7.2 a 7.4
FUENTE DE INFECCION SUELO
HABITAT INTESTINO DE ALGUNOS ANIMALES
MECANISMO DE TRANSMICION ALIMENTOS
• Se adquiere por la ingestión de alimentos enlatados (carnes o verduras). Aquí se encuentran las esporas de C. botulinum.
• Las esporas germinan si la esterilización no fue correcta, debido a que en estos productos se forma un ambiente de anaerobiosis.
• Tiempo de incubación variable y depende de la cantidad ingerida. Promedio 12 – 36 horas.
BOTULISMO
.
MEDIOS DE CULTIVO E INCUBACIÓN MEDIOS SÓLIDOS.- Se pueden utilizar son el agar sangre o yema de huevo, el agar Brucella con 5% de sangre ovina y el agar alcohol feniletílico con sangre. MEDIOS LÍQUIDOS.- Incluyen un medio de almidón, glucosa y carne picada, un medio de carne cocida, un medio clostridial reforzado, caldo anaerobio y otros.
En los medios sólidos, las colonias de C. botulinum a menudo son de un color blanco grisáceo con un borde irregular. Las colonias son generalmente betahemolíticas en agar sangre, mientras que en un medio de yema de huevo, con frecuencia muestran iridiscencia en la superficie, que se extiende más allá de la colonia (lipasa positiva), y son variables para la actividad de la lecitinasa. La zona iridiscente que rodea la colonia tiende a ser mayor para las toxinas C, D y E.
EspecieGlucos
aMaltos
aLactos
aSalicilina H2S L de
GelatinaIndol Leche
C. Chavovel + + + + + Acidificada
C. septicum + + + + + + Acidificada
C. novyi + + + + Digerida
C.
perfringens
+ + + + +
C.
Perfringens
+ + + + + Muy fermentad
a
C.
hemolyticum
+ + + + Acidificada
C. tetani +/ Sin cambio
C. botulinum + + + + Acidificada
C.
hystoliticum
+/ + Digerida
PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA DETERMINAR LA ESPECIE DEL CLOSTRIDIUM BOTULIUM
• Prueba de la producción de lecitinasa y lipasa en agar yema de huevo
• Prueba de la urea
Las muestras que pueden ser útiles paraaislamiento son las siguientes: • Heces• Alimentos• hisopado de herida.
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM
1.Obtención y transporte de la Muestra
El tratamiento con calor o etanol puede ayudar a la recuperación en muestras altamente contaminadas tales como alimentos o heces. Estos tratamientos destruyen los microorganismos que compiten a la vez que permiten la supervivencia de las esporas clostridiales
Triturar u homogenizar el alimento (muestra) Poner en el tubo de dilución de tapa rosca muestra a
igual al peso de la solución salina a utilizar (dilución 1/1).
Centrifugar el homogenizado a alta velocidad, preferentemente en centrifuga refrigerada (se tendrán 2 tubos, o sea dos muestras).
Cogemos uno de s tubos centrifugados y lo sometemos a baño María por 10 min. (agua hervida).
2. Enriquecimiento
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM
• Para el aislamiento usamos medios enriquecidos como el de carne cocida o el medio tripticasa-glucosa (ATG).
• En tubos de dilución con tapa rosca colocamos 10 ml del medio a usar (este esta previamente calentado, por lo tanto semilíquido).
• Previamente en cada tubo hemos agregado un poco de la muestra y luego agregaremos en cada tubo el ATG semilíquido calentado previamente.
Se podrá observar (si la muestra es positiva) la presencia de gas y resquebrajamiento del medio.
3. Aislamiento Selectivo
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM
A partir del sedimento se siembra en agar yema de huevo para anaerobios y se incuba a 30º durante 72 horas. Las colonias de clostridium son con borde regular rodeadas de precipitado amarillento debido a la actividad lipolítica que da lugar a ácidos grasos que precipitan son de aspecto nacarado. Seleccionar colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días Si los cultivos son toxigénicos, se debe Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamiento de Clostridium botulinum (CBI)Seleccionar colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY.. Incubar a 30ºC durante 5 días en jarra de Bre Wer (anaerobiosis)
• Algunas especies producen lecitinasa o lipasa que pueden demostrarse en agar yema de huevo. La lecitinasa (alfa-toxina, fosolipasa C) produce un halo opaco alrededor de la colonia por lisis de la lecitina y la lipasa transforma las grasas en glicerol y ácidos grasos, dando una capa iridiscente que cubre la superficie de la colonia.
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM
4. Pruebas Bioquimicas
• Se sembró la bacteria en medio BHI y se incubó por 7 días a 35ºC. • El cultivo se centrifugó a 2 500 rpm durante 20 minutos.• el sedimento se lavó dos veces con agua destilada estéril (ADE) y se resuspendió en 2 mL de ADE.• Este preparado se cuantificó según lo siguiente: se tomó 0,5 mL de la suspensión, se calentó en baño a 80ºC
durante 10 minutos para eliminar las células vegetativas y provocar la germinación de las esporas.• se enfrió en baño de agua fría y se le añadió 4,5 mL de ADE.
Preparación y cuantificación de la suspensiónde esporas de C. botulinum.
• Se hicieron diluciones decimales, desde 10-1 hasta 10-5 y se sembró, por esparcimiento, 0,1 ml de cada una de las diluciones en platos de agar tripticasa soya, por duplicado.
• Las placas se incubaron 48 horas a 35ºC en anaerobiosis y se realizó el recuento de colonias, procedimiento que se repitió a los 2 y a los 8 días de preparada la suspensión inicial.
PRUEBA EXPLORATORIA DE PRESENCIA DE LA TOXINA
Del contenido, inyectamos 0.5 ml. Al ratón de prueba, esto con aguja de tuberculina (N° 25) vía intraperitoneal.
Del otro tubo centrifugado se le inyectara a otro ratón de prueba de la misma cantidad de inoculo.
Se recomienda que antes de inyectarle el sobrenadante a los ratones se le debe inocular la antitoxina
Observar por 4 días
La positividad de la prueba se comprueba por la parálisis motora progresiva, es abdomen contraído, respiración dificultosa, arrastre de las patas, debilidad de la muestra.
La presencia de la toxina E causa una mucho más rápida (en menos de 24)