no “ ómicas” de las estrategias de análisis metabolómico · espectros ei (elevada y...

Aplicaciones no “-ómicas” de las estrategias

de análisis metabolómico

17 de junio de 2012

Página 1

Aplicaciones

NO “-ómicas” de las

Estrategias de Análisis

Metabolómico

Isidro Masana

Especialista Productos LC/MS

AGILENT TECHNOLOGIES

13:00-13:30

Seminario: La Metabolómica: una -ómica

Clave en Investigación Biomédica

Martes, 19 Junio 2012, CEMBIO - Univ. San Pablo – CEU



17 de junio de 2012

Página 2

PROGRAMA:

Aplicaciones



Metabolómico

1.- Posibles Aplicaciones NO Metabolómicas del Análisis Comparativos de Muestras

2.- Resumen Instrumentación y Software necesario para Metabolómica y Estudios Comparativos de Muestras.

3.- Ejemplos de Resultados.

4.- Conclusiones.

Objetivo: mostrar el enorme potencial aplicativo del

análisis comparativo de muestras en todo tipo de sectores.



17 de junio de 2012

Página 3

Posibles Aplicaciones NO Metabolómicas del Análisis

Comparativos de Muestras: ¿Para qué nos puede ser útil conocer ….?

¿Qué diferencias en su composición

química se correlacionan con las

diferencias observadas en

poblaciones semejantes?

¿Tienen

compuestos

químicos en

común?

¿Qué

compuestos

químicos

difieren en

concentración?



17 de junio de 2012

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Posibles Aplicaciones NO Metabolómicas del

Análisis Comparativos de Muestras Aplicando las mismas estrategias y herramientas analíticas

• Descubrimiento y Validación de Proteínas como Biomarcadores.

• Identificar los compuestos responsables de anomalías o episodios de contaminación, medio ambiental o alimentaria (p.e. malos olores, sabores,….).

• Descubrir compuestos correlacionados con comportamientos anómalos de un lote de productos, con su origen, con tratamientos a que han sido sometidos,……

• Estudiar las similitudes y diferencias de composición entre sus productos y otros semejantes en el mercado (“Benchmark”).

• Estudiar el impacto del tratamiento de un alimento en su composición. Buscar marcadores de deterioro del producto, de su ingesta,…..

• Optimizar condiciones de procesos de Extracción / Síntesis (temperatura, pH, presión,….) para maximizar su eficiencia.

• Q.C.: Comprobar la homogeneidad de diferentes lotes de producción, de materias primas complejas (p.e. productos naturales, excipientes, verificar su origen,….), perfil de impurezas, lixiviados de fábrica,…..

• A partir de muestras de referencia, poder clasificar/AUTENTIFICAR muestras desconocidas, materias primas, según su origen, tipo, tratamientos a que han sido sometidas, detectar fraudes,….

• …. …. ….

5-25m



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Página 5

2.- Resumen Instrumentación

y Software necesario para

Metabolómica y Estudios

Comparativos de Muestras.

• LC/MS: para todo tipo de compuestos

• GC/MS: para compuestos volátiles

• CE/MS: para compuestos iónicos

• RMN: sólo para componentes mayoritarios

Aplicaciones


Estrategias de

Análisis Metabolómico

6-24m



17 de junio de 2012

Página 6

CE-LC/MS

Análisis

Preparación

Muestra

GC/MS

Análisis

Análisis

Estadístico

Comparat.

“Peak

Finding”

Normalización

de Datos

Identificar

Compuestos

Las “3 Etapas” Necesarias para Estudios

Comparativos de Muestras por LC/MS - GC/MS

Validación

Compuestos

Modelización

Potenciales

Compuestos

Diferenciales

Interpretación

Resultados

2.-Extraer automáticamente la

información para cuantificar

relativamente MILES de

compuestos desconocidos

Soft.

Deconvolución

Cromatografía / MS

Soft. Comparación y

Clasificación Estadística

Multivariante con PCA PLS-DA

Objetivo: descubrir

y cuantificar todos

los compuestos

ionizados

1.-Adquirir Datos

Espectrales Genéricos* 3.- Buscar Correlaciones entre Grupos

de Complejos Datos Espectrales

*También puede utilizarse

una aproximación de

comparación de perfiles

de compuestos

específicos



17 de junio de 2012

Página 7

La Clave para una Buena Comparación de la

Composición de las Muestras

Se debe asegurar la comparación de respuestas de los

mismos compuestos entre las diversas

poblaciones comparadas



17 de junio de 2012

Página 8

Necesidades para una Buena Comparación

de Muestras en GC/MS y LC/MS:

MS y software capaces de proporcionar señales selectivas y

específicas de todos los compuestos ionizados

aunque coeluyan con otros.

• GC/MS (Q/QqQ/QTOF): buenas herramientas de deconvolución de

espectros EI (elevada y especifica fragmentación ~“huellas dactilares”).

• LC-CE/MS (TOF/QTOF): buenas herramientas de deconvolución de

espectros API (“no fragmentados”) especificidad y selectividad la

proporcionarán una masa exacta robusta y una elevada resolución

espectral. Exactitud

Masa (ppm)

Nº posibles

fórmulas

empíricas

Tecnología

165 ppm 209 QUAD/TRAP

10ppm 13

5 ppm 7

2 ppm 2 TOF /Q-TOF

Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

“masa exacta”

x107

1

2

3

4

5

6

7

Counts vs. Acquisition Time (min) 10 20 30 40 50

x107

1

2

3

4

5

6

7

Counts vs. Acquisition Time (min) 10 20 30 40 50

10-20m

Fase Comparación Perfiles: Selectividad Cuantitativa

de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina

IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da Clenbuterol S/N = 14

Rango extracción típico Cuadrupolo

IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm S/N = 102

LC/MS-TOF Agilent 6210

Exactitud

Masa (ppm)

Nº posibles

fórmulas

empíricas

Tecnología

165 ppm 209 QUAD/TRAP

10ppm 13

5 ppm 7

2 ppm 2 TOF /Q-TOF

Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

Página 9

¿Qué masas extraer en

un análisis NO dirigido?



17 de junio de 2012

Página 10

Deconvolución 3-D con AMDIS (GC/MS) y Mass Hunter

Molecular Feature Extractor”(LC/MS)

TIC (suma de los 3)

Componente 1

Componente 2

Componente 3

“Deconvolución”

Picos deconvolucionados y espectros

Componente 1

Componente 2

Componente 3

TIC & Espectro

En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios compuestos no

resueltos y algunos del propio fondo

[M+H]+

[M+Na]+

[M+H]+

[M+Na]+ [2M+H]+

[M+H]+

E.C.C.: Suma de intensidades de sus

iones específicos

Ejemplo con espectros de LC/MS

API-LC/MS apenas produce fragmentación

Tr C1 Masa Exacta (LC/MS)

Área C1



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Página 11

Fácil y Rápida Detección e “Identificación”: Ejemplo M.F.E.+M.F.G.: 400 Compuestos en Miel en 5 min!

Detailed

Formula

Generation

Results

Lista de

compuestos con

las fórmulas

moleculares

calculadas

Espectro de masas

del compuestos

superpuesto con el

patrón del pefil

isótopico teórico.

Resultados

detallados del

cálculo la fórmula

molecular

Superposición de

cromatogramas de

los compuestos

encontrados



17 de junio de 2012

Página 12

CE-LC/MS

Análisis

Preparación

Muestra

GC/MS

Análisis

Análisis

Estadístico

Comparat.

“Peak

Finding”

Normalización

de Datos

Identificar

Compuestos

Las “3 Etapas” Necesarias para Estudios

Comparativos de Muestras por LC/MS - GC/MS

Validación

Compuestos

Modelización

Potenciales

Compuestos

Diferenciales

Interpretación

Resultados

2.-Extraer automáticamente la

información para cuantificar

relativamente MILES de

compuestos desconocidos

Soft.

Deconvolución

Cromatografía / MS

Soft. Comparación y

Clasificación Estadística

Multivariante con PCA PLS-DA

Objetivo: descubrir

y cuantificar todos

los compuestos

ionizados

1.-Adquirir Datos

Espectrales Genéricos 3.- Buscar Correlaciones entre Grupos

de Complejos Datos Espectrales

• Tr , m/z exacta

• Áreas

• Áreas

15-15m

Proyectos

Experimentos de MS: datos de abundancia

de compuestos medidas por MS (LC/MS, GC/MS, CE/MS, ICP/MS),…

Microarray-based, Q-PCR,

NSG,… Datos Genómica

Rutas Metabólicas “Pathways”: el nexo de union entre

experimentos: transcriptómica / proteómica/ metabolómica

Mass Profiler Profesional 12: Muy potente Integración de Datos de

Múltiples Plataformas para su Análisis Estadístico: LC/MS,GC/MS,CE/MS,

ICP/MS,…..Genómica. Incluyendo plataformas No Agilent.

Página 13 Aplicaciones no “-ómicas” de las estrategias


17 de junio de 2012

Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras

Análisis

Estadístico

Admite Experimentos:

• Estudios simples (A vs. B)

• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….

• Clasificación (/ Autentificación) de muestras,…

Proporciona Muy Potentes Herramientas Estadísticas y de Visualización Comparación: • Filtrado simple (test de frecuencia)

• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)

• Análisis de Componentes Principales (PCA)

• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),

• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)

• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)

• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……

• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…),…..

Página 14

• Con MS Agilent facilita reaprovechar la información obtenida (gran cantidad de datos) para mejorar la calidad de los resultados, p.e.:

• Flujos de trabajo recursivos para reinterrogar muestras con la información obtenida de otras (análisis NO dirigido Dirigido). • Exportar la programación en el tiempo de los MS/MS de los compuestos relevantes para facilitar su identificación con Q-TOF’s de Agilent. • …..

QC: Predicción de Clases Automática Lab. R&D QC

Etapas:

1.- A partir de muestras de

referencia conocida, se genera un

modelo predictivo (lab. I&D)

mediante algoritmos de predicción de

clases con Mass Profiler Profesional “MPP”

(a partir de datos Mass Hunter u otros):

– Partial Least Squares Discrimination

– Naïve Bayes

– Decision Tree

– Support Vector Machine

– Neural Network

2.-El modelo predictivo generado se

aplica en laboratorios Control

Calidad (GC/MS Q/ QqQ/QTOF –

LC/MS TOF/QTOF/QqQ) para

clasificar nuevas muestras

automáticamente sin intervención del

usuario (mediante SCP: “Sample Class

Predictor”).

Acquisition Feature

Extraction SCP: Sample Class Prediction

Mo

delo

Report _____________

_______

__________

__________

Acquisition Feature

Extraction SCP

Mo

delo

Report _____________

_______

__________ __________

Acquisition Feature

Extraction SCP

Mo

delo

Report _____________

_______

__________

__________

Acquisition Feature

Extraction SCP

Mo

delo

Report _____________

_______

__________

__________

Acquisition Feature Extraction Chemometric

Analysis

Sample Class Predictor (SCP)

Aplicación Modelo Automática via Scripting (QC lab)

Mo

delo

Pre

dic

tiv

o

MPP MassHunter

(MH) MassHunter (MH)

MassHunter (MH)

MassHunter (MH)

MassHunter (MH)

Desarrollo del Modelo (lab. R&D)

Página 15

Muestras

Referencia



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3.- Ejemplos de

Resultados.

Aplicaciones

NO “-ómicas” de

las Estrategias de

Análisis Metabolómico

1.- Optimización Extracción Líquido/Líquido.

2.- Determinación de Adulteraciones.

19-11m



17 de junio de 2012

Página 17

Ejemplo 1: Optimización Proceso de

Extracción Líquido/Líquido de

Metabolitos de Glóbulos Rojos

PARÁMETROS INFLUENCIAN RENDIMIENTO EXTRACCIONES LÍQUIDO/LÍQUIDO:

• pH fase acuosa (parámetro estudiado en este ejemplo)

• Proporciones fase acuosa/orgánica

• Adición de sales / modificadores orgánicos fase acuosa

• Temperatura

• ...

PREPARACIÓN MUESTRA:

1.- Centrifugar sangre (con citrato como anticoagulante) y eliminación del sobrenadante.

2.- Lavado con PBS (solución salina de tampón fosfato) para eliminar los metabolitos del exterior de los glóbulos.

3.- “Quenching” y lisado de la membrana de los glóbulos para liberar los metabolitos de su interior.

4.- Adición modificador fase acuosa (metanol).

5.- Adición fase orgánica (cloroformo).

6.- Extracción líquido-líquido a diferentes pH’s fase acuosa.

7.- Evaporación a vacío y reconstitución fase acuosa.

20-10m



17 de junio de 2012

Página 18

Influencia pH en nº Metabolitos Extraídos Diagrama de Venn con distribución 1211 metabolitos

distintos identificados en MetLin DB por su masa

exacta con <10ppm error (LC/MS-TOF)

Incluye compuestos no

identificados en MetLin DB

+ inf. en nota aplicación: Maximizing Metabolite Extraction for

Comprehensive Metabolomics Studies of Erythrocytes p/n: 5989-7407EN



17 de junio de 2012

Página 19

Ejemplo 2: Determinación Adulteraciones /

Autentificaciones con Tiempos de Vuelo

Ejemplo: Caracterización de vinos usando un sistema

HPLC-QTOF y herramientas avanzadas de extracción de datos,

estadística, comparación y clasificación (PLS-DA) de muestras.

Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa,

Jerry Zweigenbaumb

a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic b Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA

La Clave: una adecuada

caracterización de los diversos

tipos de vinos/muestras para una

buena modelización y posterior

correcta clasificación de muestras

desconocidas.



17 de junio de 2012

Página 20

Ejemplo de Aplicación de Autentificación de Vinos

• 45 Vinos Tintos para modelizar (+ 5 muestras “desconocidas”)

• 3 Variedades: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)

• 11 países de origen: República Checa, Eslovaquia, Francia,

Italia, Macedonia, Bulgaria, Hungría, Australia, Chile,

Alemania, EE.UU.

• 5 años de Cosecha : 2004 – 2008

CONJUNTO DE MUESTRAS MUY VARIADO



17 de junio de 2012

Página 21

Sin preparación previa de muestra, análisis directo (previa microfiltración).

Instrumentación Utilizada

Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa, Jerry Zweigenbaumb

a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic b Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA

Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS

Agilent Technologies 1200 RRLC system

Jet Stream ESI source

Multimode ion source

Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm) HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)

Software de

Análisis Estadístico

Multivariante

?



17 de junio de 2012

Página 22

? ?

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BLANCO

Procesado de Datos: ejemplo T.I.C.

TIC de Vino y blanco, LC-(ESI+) QTOFMS

? ? ?

?

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VINO

• Datos muy complejos.

• Compuestos minoritarios enmascarados.

Se requiere software que extraiga y

caracterice todos los compuestos

ionizados.

Los espectros corresponden a

múltiples compuestos coeluyentes



17 de junio de 2012

Página 23

Extracción de Datos: “Find By Molecular Feature”

Find compound by

Molecular Feature Extractor

M.F.E. extrae 20.506 “features” del

conjunto de todas las muestras (en

las condiciones utilizadas)



17 de junio de 2012

Página 24

Filtro por omisión: la existencia del “feature” en el

100%* de las muestras de al menos en un grupo.

En conjuntos de muestras muy variadas, algunos compuestos importantes podrían ser filtrados ...

Ave

rag

e i

nte

ns

ity

663 “features” de 20.506

Procesado de Datos mediante Agilent Mass Profiler Profesional:

Filtración de Entradas por Frecuencia (Incidencia en las Clases)

* Filtrando con el 50%

el nº de “features”

aumenta de 663 a 3600

25-5m



17 de junio de 2012

Página 25

PCA of the data Entradas iniciales (20506)

PCA of the data Entradas filtradas por frecuencia (3600)

CABERNET SAUVIGNON MERLOT PINOT NOIR

FILTRATION

Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante

Filtrado por Frecuencia y Análisis de Componentes

Principales (PCA)



17 de junio de 2012

Página 26

PCA de los datos: Componentes después de ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26

CABERNET SAUVIGNON

MERLOT

PINOT NOIR

FILTRACIÓN

Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante

ANOVA y Análisis de Componentes Principales (PCA)

Un adecuado

filtrado de los

datos es

esencial para

una buena

clasificación

Merlot

Cabernet Sauvignon Pinot Noir



17 de junio de 2012

Página 27

Validación del Modelo de Predicción de

Clases

• Durante la validación del modelo, 2 MERLOT fueron mal clasificados.

• Todos los Cabernet Sauvignon y Pinot Noir se clasificaron correctamente.

• La fiabilidad de predicción del modelo resuelto ser del 95.6%*

• El modelo clasificó correctamente las 5 muestras adicionales evaluadas (2 CS, 1M, 2 PN).

Número de muestras utilizadas en la validación: 45

* ANOVA utilizó para filtrar un p≤0.05.



17 de junio de 2012

Página 28

PROGRAMA:

Aplicaciones



Metabolómico

1.- Posibles Aplicaciones NO Metabolómicas del Análisis Comparativos de Muestras

2.- Resumen Instrumentación y Software necesario para Metabolómica y Estudios Comparativos de Muestras.

3.- Ejemplos de Resultados.

4.- Conclusiones.

28-2m



17 de junio de 2012

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Conclusiones:

• La selectividad de la Espectrometria de Masas en general, y de la

masa exacta de los Agilent TOFs & QTOFs con el software:

• MassHunter Molecular Feature Extractor (MFE)

• Mass Profiler Professional (MPP)

proporcionará una poderosa herramienta para el análisis

comparativo de muestras complejas tanto en aproximaciones de

perfilados genéricos, como específicos (en perfiles específicos,

también podrá utilizarse LC/MS-QqQ).

• La capacidad Multi-plataforma/ Multi-instrumento/ Multi-marca de

Mass Profiler Professional permite potenciar enormemente la

capacidad investigadora de los laboratorios I+D mediante el análisis

comparativo de muestras utilizando PCA.

e-Seminars gratuitos: “MassHunter Summer Tutorial”

Topics for TOF/QTOF Users Presented by Dr. Joachim Thiemann

1.-TOF/QTOF MassHunter Acquisition Software Essentials: Tuning, Calibration, Method Setup

Date: 27.06, 15:00 CET

2.-Data Mining Tools (Untargeted Approach): Extracting Compounds with Molecular Feature Extractor and

Find by Ion

Date: 28.06, 11:00 CET

3.- Mass Profiler Professional – Fundamentals: General Settings and Workflows

Date: 04.07, 15:00 CET

4.-Data Mining Tools (Targeted Approach): Identification of Unknowns and Targeted Data Mining

Date: 05.07, 15:00 CET

Topics for QQQ Users Presented by Dr. Jörg Riener

5.-MassHunter Quant Evaluation: Confirmation Library, Isotopic patter and Sample Types

Date: 11.07, 15:00 CET

6.- MassHunter Quant - Reporting and Compliance: Take full advantage of MassHunter Reporting and

Compliance features

Date: 12.07, 15:00 CET

Requirements: Attendees should have a basic knowledge of MassHunter software

Registro: https://agilenteseminar-emea.webex.com/agilenteseminar-emea/onstage/g.php?p=26&t=m



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Página 30



17 de junio de 2012

Página 31

www.metabolomics-lab.com



17 de junio de 2012

Página 32

Mass Spec/tacular www.metabolomics-lab.com

Agilent LC/MS-TOF & QTOF’s

True Hi-Def TOF Technology “All Performances All Time”

Isidre Masana

Especialista de Productos LC/MS

AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90

[email protected]

Muchas

Gracias



17 de junio de 2012

Página 33

Agilent LC/MS-TOF & QTOF’s

True Hi-Def TOF Technology “All Performances All Time”

Isidre Masana

Especialista de Productos LC/MS

AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90

[email protected]

¿Preguntas?

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