NITROGEN SOURCES Examples of commonly used nitrogen sources Most industrially used micro-organisms can utilize inorganic or organic sources of nitrogen. Inorganic nitrogen may be supplied as ammonia gas, ammonium salts or nitrates (Hunter, 1972). Ammonia has been used for pH control and as the major nitrogen source in a defined medium for the commercial production of human serum albumin by Saccharomyces ceriuisiae (Collins, 1990). Ammonium salts such as ammonium sulphate will usually produce acid conditions as the ammonium ion is utilized and the free acid will be liberated. On the other hand nitrates will normally cause an alkaline drift as they are metabolized. Ammonium nitrate will first cause an acid drift as the ammonium ion is utilized, and nitrate assimilation is repressed. When the ammonium ion has been exhausted, there is an alkaline drift as the nitrate is used as an alternative nitrogen source (Morton and MacMil lan, 1954). One exception to this pattern is the metabolism of Gibberella fujikuroi (Borrow et al., 1961, 1964). In the presence of nitrate the assimilation of ammonia is inhibited at pH 2.8-3.0. Nitrate assimilation continues until the pH has increased enough to allow the ammonia assimilation mechanism to restart. Organic nitrogen may be supplied as amino acid, protein or urea. In many instances growth will be faster with a supply of organic nitrogen, and a few microorganisms have an absolute requirement for amino acids. It might be thought that the main industrial need for pure amino acids would be in the deliberate addition to amino acid requiring mutants used in amino acid production. However, amino acids are more commonly added as complex organic nitrogen sources which are non-homogeneous, cheaper and readily available. In lysine production, methionine and threonine are obtained from soybean hydrolysate since it would be too expensive to use the pure amino acids (Nakayama, 1972a). Other proteinaceous nitrogen compounds serving as sources of amino acids include corn-steep liquor, soya meal, peanut meal, cotton-seed meal (Pharmamedia, Table 4.8; and Proflo), Distillers' solubles, meal and yeast extract. Analysis of many of these products which include amino acids, vitamins and minerals are given by Miller and Churchill (1986) and Atkinson and Mavituna (1991a). In storage these products may be affected by moisture, temperature changes and ageing. Chemically defined amino acid media devoid of protein are necessary in the production of certain vaccines when they are intended for human use. Factors influencing the choice of nitrogen source Control mechanisms exist by which nitrate reductase, an enzyme involved in the conversion of nitrate to ammonium ion, is repressed in the presence of ammonia (Brown et al, 1974). For this reason ammonia or ammonium ion is the preferred nitrogen source. In fungi that have been investigated, ammonium ion represses uptake of amino acids by general and specific amino acid permeases (Whitaker, 1976). In Aspergillus nidulans, ammonia also regulates the production of alkaline and neutral proteases (Cohen, 1973). Therefore, in mixtures of nitrogen sources, individual nitrogen components may influence metabolic regulation so that there is preferential assimilation of one component until its concentration has diminished. It has been shown that antibiotic production by many micro-organisms is influenced by the type and TABLE 4.8. The composition of Pharmamedia (Traders Protein, Southern Cotton Oil Company, Division of Archer Dariels Midland Co.) Component Quantity In shake flask media experiments, salts of weak acids (e.g. ammonium succinate) may be used to serve as a nitrogen source and eradicate the source of a strong acid pH change due to chloride or sulphate ions which would be present if ammonium chloride or sulphate were used as the nitrogen source. This procedure makes it possible to use lower concentrations of phosphate to buffer the medium. High phosphate concentrations inhibit production of many secondary metabolites (see Minerals Section). The use of complex nitrogen sources for antibiotic production has been common practice. They are thought to help create physiological conditions in the trophophase which favour antibiotic production in the idiophase (Martin and McDaniel, 1977). For example, in the production of polyene antibiotics, soybean meal has been considered a good nitrogen source because of the balance of nutrients, the low phosphorus content and slow hydrolysis. It has been suggested that this gradual breakdown prevents the accumulation of ammonium ions and repressive amino acids. These are probably some of the reasons for the selection of ideal nitrogen sources for some secondary metabolites (Table 4.9.). In gibberellin production the nitrogen source has been shown to have an influence on directing the production of different gibberellins and the relative proportions of each type (Jefferys, 1970). Other pre-determined aspects of the process can also influence the choice of nitrogen source. Rhodes (1963) has shown that the optimum concentration of available nitrogen for griseofulvin production showed some variation depending on the form of inoculum and the type of fermenter being used. Obviously these factors must be borne in mind in the interpretation of results in media-development programmes. Some of the complex nitrogenous material may not be utilized by a micro-organism and create problems in downstream processing and effluent treatment. This can be an important factor in the final choice of substrate. MINERALS Total solids Carbohydrate Reducing sugars N o n reducing sugars Protein Amin o nitrogen Components of amino nitrogen Lysine Leucine Isoleucine Threonine Valine Phenylalanine Tryptophan Methionine Cystine Aspartic acid Serine Proline Glycine Alanine Tyrosine Histidine Arginine 9 9% 24.1% 1.2% 1.2% 5 7% 4.7% 4.5% 6.1% 3.3% 3.3% 4.6% 5.9% 1.0% 1.5% 1.5% 9.7% 4.6% 3.9% 3.8% 3.9% 3.4% 3.0% 12.3% Mineral components Calcium Chloride Phosphorus Iron Sulphate Magnesium Potassium Fat 253 0 ppm 685 ppm 1310 0 ppm 94 ppm 1800 0 ppm 7 360 ppm 1720 0 ppm 4.5% Vitamins Ascorbic acid Thiamine Riboflavin Niacin Pantotheni c acid Choline Pyidoxine Biotin Folic acid Inositol 32.0 mg kg " 4.0 mg kg " 4.8 mgkg " 83.3 mg kg - 12.4 mg kg - 327 0 mg kg - 16.4 mg kg - 1.5 mgkg - 1.6 mg kg - 1080 0 mg kg" All micro-organisms require certain mineral d- concentration of the nitrogen source in the culture ments for growth and metabolism (Hughes and Poole, medium (Aharonowitz, 1980). Antibiotic production 1989, 1991). In many media, magnesium, phosphorus, may be inhibited by a rapidly utilized nitrogen source potassium, sulphur, calcium and chlorine are essential (NHJ, NO^~, certain amino acids). The antibiotic pro- components, and because of the concentrations reduction only begins to increase in the culture broth quired, they must be added as distinct components, after most of the nitrogen source has been consumed. Others such as cobalt, copper, iron, manganese, molyb-TABLE 4.9. Best nitrogen sources for some secondary metabolites Product Main nitrogen source(s) Referenc e Penicillin Corn-steep liquor Moye r and Coghill (1946) Bacitracin Peanut granules Inskeep et al. (1951) Riboflavin Pancreatic digest of gelatine Malzahn et al. (1959) Novobiocin Distillers' solubles Hoeksem a and Smith (1961) Rifomycin Pharmamedia Sensi and Thiemann (1967) Soybean meal, (NH 4 ) 2S 0 4 Gibberellins Ammoniu m salt and natural Jefferys (1970) plant nitrogen source Butirosin Dried bee f blood or haemo - Claridge et al. (1974) globin with (NH 4 ) 2S 0 4 Polyene s Soybean meal Martin and MacDanie l (1977) denum and zinc are also essential but are usually present as impurities in other major ingredients. There is obviously a need for batch analysis of media components to ensure that this assumption can be justified, otherwise there may be deficiencies or excesses in different batches of media. See Tables 4.7 and 4.8 for analysis of corn steep liquor and Pharmamedia, and Miller and Churchill (1986) for analysis of other media ingredients of plant and animal origin. When synthetic media are used the minor elements will have to be added deliberately. The form in which the minerals are usually supplied and the concentration ranges are given in Table 4.10. As a consequence of product composition analysis, as outlined earlier in this chapter, it is possible to estimate the amount of a specific mineral for medium design, e.g. sulphur in penicillins and cephalosporins, chlorine in Chlortetracycline. The concentration of phosphate in a medium, particularly laboratory media in shake flasks, is often much higher than that of other mineral components. Part of this phosphate is being used as a buffer to minimize pH TABLE 4.10. The range of typical concentrations of mineral components (g dm - 3 ) Component Rang e *KH 2P 0 4 1.0-4.0 (part may be as buffer) MgS0 4 -7H 2 0 0.25-3. 0 KCl 0.5-12. 0 CaC0 3 5.0-17. 0 FeS0 4 -4H 2 0 0.01-0.1 ZnS0 4 -8H 2 0 0.1-1. 0 MnS0 4 H 2 0 0.01-0.1 CuS0 4 -5H 2 0 0.003-0.01 N a 2Mo0 4 -2H 2 0 0.01-0.1 * Complex media derived from plant and animal materials normally contain a considerable concentration of inorganic phosphate. changes when external control of the pH is not being used. In specific processes the concentration of certain minerals may be very critical. Some secondary metabolic processes have a lower tolerance range to inorganic phosphate than vegetative growth. This phosphate should be sufficiently low as to be assimilated by the end of trophophase. In 1950, Garner et al. suggested that an important function of calcium salts in fermention media was to precipitate excess inorganic phosphates, and suggested that the calcium indirectly improved the yield of streptomycin. The inorganic phosphate concentration also influences production of bacitracins, citric acid (surface culture), ergot, monomycin, novobiocin, Oxytetracycline, polyenes, ristomycin, rifamycin Y, streptomycin, vancomycin and viomycin (Sensi and Thieman, 1967; Demain, 1968; Liu et al, 1970; Mertz and Doolin, 1973; Weinberg, 1974). However, pyrrolnitrin (Arima et al, 1965), bicyclomycin (Miyoshi et al, 1972), thiopeptin (Miyairi et al, 1970) and methylenomycin (Hobbs et al, 1992) are produced in a medium containing a high concentration of phosphate. Two monomycin antibiotics are selectively produced by Streptomyces jamaicensis when the phosphate is 0.1 mM or 0.4 mM (Hall and Hassall, 1970). Phosphate regulation has also been discussed by Weinberg (1974), Aharonowitz and Demain (1977), Martin and Demain (1980), Iwai and Omura (1982) and Demain and Piret (1991). In a recent review of antibiotic biosynthesis, Liras et al. (1990) recognized target enzymes which were (a) repressed by phosphate, (b) inhibited by phosphate, or (c) repression of an enzyme occurs but phosphate repression is not clearly proved. A phosphate control sequence has also been isolated and characterized from the phosphate regulated promoter that controls biosynthesis of candicidin. Weinberg (1970) has reviewed the nine trace elemerits of biological interest (Atomic numbers 23-30, 42). Of these nine, the concentrations of manganese, iron and zinc are the most critical in secondary metabolism. In every secondary metabolic system in which sufficient data has been reported, the yield of the product varies linearly with the logarithmic concentration of the 4 key' metal. The linear relationship does not apply at concentrations of the metal which are either insufficient, or toxic, to cell growth. Some of the primary and secondary microbial products whose yields are affected by concentrations of trace metals greater than those required for maximum growth are given in Table 4.11. Chlorine does not appear to play a nutritional role in the metabolism of fungi (Foster, 1949). It is, however, required by some of the halophilic bacteria (Larsen, 1962). Obviously, in those fermentations where a chlorine-containing metabolite is to be produced the synthesis will have to be directed to ensure that the non-chloro-derivative is not formed. The most important compounds are Chlortetracycline and griseofulvin. In griseofulvin production, adequate available chloride is provided by the inclusion of at least 0.1% KCl (Rhodes et al, 1955), as well as the chloride provided by the complex organic materials included as nitrogen sources. Other chlorine containing metabolites are caldriomycin, nornidulin and mollisin. Chelators Many media cannot be prepared or autoclaved without the formation of a visible precipitate of insoluble metal phosphates. Gaunt et al (1984) demonstrated that when the medium of Mandels and Weber (1969) was autoclaved, a white precipitate of metal ions formed, containing all the iron and most of the calcium, manganese and zinc present in the medium. The problem of insoluble metal phosphate(s) may be eliminated by incorporating low concentrations of chelating agents such as ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), citric acid, polyphosphates, etc., into the medium. These chelating agents preferentially form complexes with the metal ions in a medium. The metal ions then may be gradually utilized by the microorganism (Hughes and Poole, 1991). Gaunt et al (1984) were able to show that the precipitate was eliminated from Mandel and Weber's medium by the addition of EDTA at 25 mg dm - 3 . It is important to check that a chelating agent does not cause inhibition of growth of the micro-organism which is being cultured. In many media, particularly those commonly used in large scale processes, there may not be a need to add a chelating agent as complex ingredients such as yeast extracts or proteose peptones will complex with metal ions and ensure gradual release of them during growth (Ramamoorthy and Kushner, 1975). GROWTH FACTORS Some micro-organisms cannot synthesize a full complement of cell components and therefore require preformed compounds called growth factors. The growth factors most commonly required are vitamins, but there may also be a need for specific amino acids, fatty acids TABLE 4.11. Trace elements influencing primary and secondary metabolism Product Trace element(s) Referenc e Bacitracin Mn Weinberg and Tonnis (1966) Protease Mn Mizusawa et al. (1966) Gentamicin Co Tilley et /. (1975) Riboflavin F e , Co Hickey (1945) Fe Tanne r et al. (1945) Mitomycin Fe Weinberg (1970) Monensin Fe Weinberg (1970) Actinomycin F e , Zn Katz et al. (1958) Candicidin F e , Zn Weinberg (1970) Chloramphenicol F e , Zn Gallicchio and Gottlieb (1958) Neomycin F e , Zn Majumdur and Majumdar (1965) Patulin Fe,Z n Brack(1947 ) Streptomycin Fe,Z n Weinberg (1970) Citric acid F e , Zn, Cu Shu and Johnson (1948) Penicillin Fe, Zn, Cu Foster et al. (1943) Koffler et al. (1947) Griseofulvin Zn Grove (1967) 104 Media for Industrial Fermentations or sterols. Many of the natural carbon and nitrogen sources used in media formulations contain all or some of the required growth factors (Atkinson and Mavituna, 1991a). When there is a vitamin deficiency it can often be eliminated by careful blending of materials (Rhodes and Fletcher, 1966). It is important to remember that if only one vitamin is required it may be occasionally more economical to add the pure vitamin, instead of using a larger bulk of a cheaper multiple vitamin source. Calcium pantothenate has been used in one medium formulation for vinegar production (Beaman, 1967). In processes used for the production of glutamic acid, limited concentrations of biotin must be present in the medium (see Chapter 3). Some production strains may also require thiamine (Kinoshita and Tanaka, 1972). NUTRIENT RECYCLE The need for water recycling in ICI pic's continuous-culture SCP process has already been discussed in an earlier section of this chapter. It was shown that M. methylotrophus could be grown in a medium containing 86% recycled supernatant plus additional fresh nutrients to make up losses. This approach made it possible to reduce the costs of media components, media preparation and storage facilities (Ashley and Rodgers, 1986; Sharp, 1989). BUFFERS The control of pH may be extremely important if optimal productivity is to be achieved. A compound may be added to the medium to serve specifically as a buffer, or may also be used as a nutrient source. Many media are buffered at about pH 7.0 by the incorporation of calcium carbonate (as chalk). If the pH decreases the carbonate is decomposed. Obviously, phosphates which are part of many media also play an important role in buffering. However, high phosphate concentrations are critical in the production of many secondary metabolites (see Minerals section earlier in this chapter). The balanced use of the carbon and nitrogen sources will also form a basis for pH control as buffering capacity can be provided by the proteins, peptides and amino acids, such as in corn-steep liquor. The pH may also be controlled externally by addition of ammonia or sodium hydroxide and sulphuric acid (Chapter 8). THE ADDITION OF PRECURSORS AND METABOLIC REGULATORS TO MEDIA Some components of a fermentation medium help to regulate the production of the product rather than support the growth of the micro-organism. Such additives include precursors, inhibitors and inducers, all of which may be used to manipulate the progress of the fermentation. Precursors Some chemicals, when added to certain fermentations, are directly incorporated into the desired product. Probably the earliest example is that of improving penicillin yields (Moyer and Coghill, 1946, 1947). A range of different side chains can be incorporated into the penicillin molecule. The significance of the different side chains was first appreciated when it was noted that the addition of corn-steep liquor increased the yield of penicillin from 20 units cm - 3 to 100 units c m - 3 . Corn-steep liquor was found to contain phenylethylamine which was preferentially incorporated into the penicillin molecule to yield benzyl penicillin (Penicillin G). Having established that the activity of penicillin lay in the side chain, and that the limiting factor was the synthesis of the side chain, it became standard practice to add side-chain precursors to the medium, in particular phenylacetic acid. Smith and Bide (1948) showed that addition of phenylacetic acid and its derivatives to the medium were capable of both increasing penicillin production threefold and to directing biosynthesis towards increasing the proportion of benzyl penicillin from 0 to 93% at the expense of other penicillins. Phenylacetic acid is still the most widely used precursor in penicillin production. Some important examples of precursors are given in Table 4.12. Inhibitors When certain inhibitors are added to fermentations, more of a specific product may be produced, or a metabolic intermediate which is normally metabolized is accumulated. One of the earliest examples is the microbial production of glycerol (Eoff et al, 1919). Glycerol production depends on modifying the ethanol fermentation by removing acetaldehyde. The addition of sodium bisulphite to the broth leads to the formation of the acetaldehyde bisulphite addition compound (sodium hydroxy ethyl sulphite). Since acetaldehyde is 105 Principles of Fermentation Technology, 2nd Edn. TABL E 4.12. Precursors used in fermentation processes Precursor Product Micro-organism Referenc e Phenylacetic-acid Penicillin G Pnicillium chrysogenum Moyer and Coghill and related compounds (1947) Phenoxy acetic acid Penicillin V Pnicillium chrysogenum Soper et al. (1948) Chloride Chlortetracycline Streptomyces aureofaciens V an Dyck and de Some r (1952) Chloride Griseofulvin Pnicillium griseofulvin Rhode s et al. (1955) * Propionate Riboflavin Lactobacillus bulgaricus Smiley and Stone (1955) Cyanides Vitamin B12 Proprianobacterium, Mervyn and Smith Streptomyces spp. (1964) /3-Iononones Carotenoids Phycomyces blakesleeanus Reye s et al (1964) -Amino butyric acid L-Isoleucine Bacillus subtilis Nakayama (1972b) D-Threonine L-Isoleucine Serratia marcescens Anthranilic acid L-Tryptophan Hansenula anomala Nucleoside s and Nikkomycins Streptomyces tendae Vecht-Lifshitz and bases Braun (1989) Dihydronovobionic Dihydronovo- Streptomyces sp. Walton et al. (1962) acid biocin p-Hydroxycinnamate Organomycin Streptomyces organonensis Eiki et al. (1992) A and DL-a -Amin o butyric acid Cyclosporin A Tolypocladium inflatum Kobel and Traber L-Threonine Cyclosporin C (1982) Tyrosine or p-hydroxy- Dimethylvanco- Nocardia orientalis Boeck et al. (1984) phenylglycine mycin * Yields are not so high as by othe r technique s no longer available for re-oxidation of NADH2 , its place as hydrogen acceptor is taken by dihydroacetone phosphate, produced during glycolysis. The product of this reaction is glycerol-3-phosphate, which is converted to glycerol. The application of general and specific inhibitors are illustrated in Table 4.13. In most cases the inhibitor is effective in increasing the yield of the desired product and reducing the yield of undesirable related products. A number of studies have been made with potential chlorination inhibitors, e.g. bromide, to minimize Chlortetracycline production during a tetracycline fermentation (Gourevitch et al, 1956; Lepetit S.p.A., 1957; Goodman etal, 1959; Lein et al, 1959; Szumski, 1959). Inhibitors have also been used to affect cell-wall structure and increase the permeability for release of metabolites. The best example is the use of penicllin and surfactants in glutamic acid production (Phillips and Somerson, 1960). Inducers The majority of enzymes which are of industrial interest are inducible. Induced enzymes are synthesized only in response to the presence in the environment of an inducer. Inducers are often substrates such as starch or dextrins for amylases, maltose for pullulanase and pectin for pectinases. Some inducers are very potent, such as isovaleronitrile inducing nitralase (Kobayashi et al, 1992). Substrate analogues that are not attacked by the enzyme may also serve as enzyme inducers. Most inducers which are included in microbial enzyme media (Table 4.14) are substrates or substrate analogues, but intermediates and products may sometimes be used as inducers. For example, maltodextrins will induce amylase and fatty acids induce lipase. However, the cost may prohibit their use as inducers in a commercial process. Reviews have been published by Aunstrup et al (1979) and Demain (1990). One unusual application of an inducer is the use of yeast mannan in streptomycin production (Inamine et al, 1969). During the fermentation varying amounts of streptomycin and mannosidostreptomycin are produced. Since mannosidostreptomycin has only 20% of the biological activity of streptomycin, the former is an undesirable product. The production organism Streptomyces griseus can be induced by yeast mannan to produce /3-mannosidase which will convert mannosidostreptomycin to streptomycin. It is now possible to produce a number of heterologous proteins in yeasts, fungi and bacteria. These include proteins of viral, human, animal, plant and mi- 106 Media for Industrial Fermentations TABLE 4.13. Specific and general inhibitors used in fermentations Product Inhibitor Main effect Micro-organism Referenc e Glycerol Sodium bisulphite Acetaldehyde pro- Saccharomyces Eoff et al. duction repressed cerivisiae (1919) Tetracycline Bromide Chlortetracycline Streptomyces Lepetit formation repressed aureofaciens (1957) Glutamic acid Penicillin Cell wall permeability Micrococcus Phillips et al. glutamicus (1960) Citric acid Alkali metal/phos- Oxalic acid repressed Aspergillus niger Batti (1967) phate, pH below 2.0 Valine Various inhibitors Various effects with Breuibacterium Uemur a et al. different inhibitors roseum (1972) Rifamycin Di-ethyl barbiturate Othe r rifamycins Nocardia Lancini and inhibited mediterranei Whit e (1973) 7-Chloro-6 de- Ethionine Affects one-carbon Streptomyces Neidleman et al. methyltetracycline transfer reactions aureofaciens (1963) crobial origin (Peberdy, 1988; Wayne Davies, 1991). However, heterologous proteins may show some degree of toxicity to the host and have a a major influence on the stability of heterologous protein expression. As well as restricting cell growth as biomass the toxicity will provide selective conditions for segregant cells which no longer synthesize the protein at such a high level (Goodey et al, 1987). Therefore, optimum growth conditions may be achieved by not synthesizing a heterologous protein continuously and only inducing it after the host culture has grown up in a vessel to produce sufficient biomass (Piper and Kirk, 1991). In cells of S. cereuisiae where the Gall promoter is part of the gene expression system, product formation may be induced by galactose addition to the growth medium which contains glycerol or low non-repressing levels of glucose as a carbon source. One commercial system that has been developed is based on the ale A promoter in Aspergillus nidulans to express human interferon al (Wayne Davies, 1991). This can be induced by volatile chemicals, such as ethylmethyl ketone, which are added when biomass has increase to an adequate level and the growth medium contains a non-repressing carbon source or low non-repressing levels of glucose. Methylotrophic yeasts such as Hansenula polymorpha and Pichia pastoris may be used as alternative systems because of the presence of an alcohol oxidase TABLE 4.14. Some examples of industrially important enzyme inducers Enzyme Inducer Micro-organism Referenc e -Amylase Starch Aspergillus spp. Windish and Mhatre (1965) Maltos e Bacillus subtilis Pullulanase Maltose Aerobacter Wallenfels et al. (1966) aerogenes a-Mannosidas e Yeast mannans Streptomyces griseus Inamine et al. (1969) Penicillin acylase Phenylacetic acid Escherichia coli Carrington (1971) Protease s Various proteins Bacillus spp. Keay(1971 ) Streptococcus spp. Aunstrup (1974) Streptomyces spp. Asperigillus spp. Mucor spp. Cellulase Cellulose Trichoderma viride Rees e (1972) Pectinases Pectin Aspergillus spp. Fogarty and Ward (1974) (beet pulp, apple pomace , citrus peel) Nitralase Isovaleronitrile Rhodococcus Kobayashi et al. (1992) rhodochrous promoter (Veale and Sudbery, 1991). During growth on methanol, which also acts as an inducer, the promoter is induced to produce about 30% of the cell protein. In the presence of glucose or ethanol it is undetectable. Expression systems have been developed with P. pastons for tumour necrosis factor, hepatitis surface antigen and -galactosidase. Hepatitis surface antigen and other heterologous proteins can also be expressed by H. polymorpha. OXYGEN REQUIREMENTS It is sometimes forgotten that oxygen, although not added to an initial medium as such, is nevertheless a very important component of the medium in many processes, and its availability can be extremely important in controlling growth rate and metabolite production. This will be discussed in detail in Chapter 9. The medium may influence the oxygen availability in a number of ways including the following: 1. Fast metabolism. The culture may become oxygen limited because sufficient oxygen cannot be made available in the fermenter if certain substrates, such as rapidly metabolized sugars which lead to a high oxygen demand, are available in high concentrations. 2. Rheology. The individual components of the medium can influence the viscosity of the final medium and its subsequent behaviour with respect to aeration and agitation. 3. Antifoams. Many of the antifoams in use will act as surface active agents and reduce the oxygen transfer rate. This topic will be considered in a later section of this chapter. Fast metabolism Nutritional factors can alter the oxygen demand of the culture. Pnicillium chrysogenum will utilize glucose more rapidly than lactose or sucrose, and it therefore has a higher specific oxygen uptake rate when glucose is the main carbon source (Johnson, 1946). Therefore, when there is the possibility of oxygen limitation due to fast metabolism, it may be overcome by reducing the initial concentration of key substrates in the medium and adding additional quantities of these substrates as a continuous or semi-continuous feed during the fermentation (see Tables 4.1. and 4.15; Chapters 2 and 9). It can also be overcome by changing the composition of the medium, incorporating higher carbohydrates (lactose, starch, etc.) and proteins which are not very rapidly metabolized and do not support such a large specific oxygen uptake rate. Rheology Deindoerfer and West (1960) reported that there can be considerable variation in the viscosity of compounds that may be included in fermentation media.BLE 4.15. Some processes using batch feed or continuous feed or in which they have been tried Product Additions Referenc e Yeast Molasses, nitrogen sources, and Mg Harrison (1971) Ree d and Peppie r (1973) Glycerol Sugar, Na 2C 0 3 Eoff et al. (1919) Acetone-butyl alcohol Additions and withdrawals of wort Soc. Richard et al. (1921) Riboflavin Carbohydrate Moss and Klein (1946) Penicillin Glucos e and NH 3 Hosie r and Johnson (1953) Novobiocin Various carbon and nitrogen sources Smith (1956) Griseofulvin Carbohydrate Hockenhull (1956) Rifamycin Glucose , fatty acids P an et al. (1959) Gibberellins Glucos e Borrow et al. (1960) Vitamin B 1 2 Glucos e Beche r et al. (1961) Tetracyclines Glucos e Avanzini (1963) Citric acid Carbohydrates, NH 3 Shepherd(1963 ) Single-cell protein Methanol Harrison et al. (1972) Candicidin Glucos e Martin and McDanie l (1975) Streptomycin Glucose , ammonium sulphate Singh et al. (1976) Cephalosporin Fresh medium addition Trilli et al. (1977)

Fuentes de nitrgeno Ejemplos de fuentes de nitrgeno utilizados comnmente utilizados industrialmente ms microorganismos pueden utilizar fuentes inorgnicas u orgnicas de nitrgeno. El nitrgeno inorgnico puede ser suministrado como gas amonaco, sales de amonio o nitratos (Hunter, 1972). El amonaco se ha utilizado para el control de pH y como la principal fuente de nitrgeno en un medio definido para la produccin comercial de albmina de suero humano por Saccharomyces ceriuisiae (Collins, 1990). Sales de amonio tales como sulfato de amonio por lo general se producen condiciones cidas como se utiliza el in de amonio y el cido libre se liber. En los otros nitratos mano normalmente causar una deriva alcalina, ya que se metabolizan. El nitrato de amonio en primer lugar hacer una deriva cido como el ion amonio se utiliza, y la asimilacin de nitrato es reprimida. Cuando el ion amonio se ha agotado, hay una deriva alcalina como el nitrato se utiliza como una fuente de nitrgeno alternativa (Morton y MacMil lan, 1954). Una excepcin a este patrn es el metabolismo de Gibberella fujikuroi (Borrow et al., 1961, 1964). En presencia de nitrato de la asimilacin de amoniaco se inhibe a un pH de 2,8-3,0. Asimilacin de nitratos contina hasta que el pH ha aumentado lo suficiente para permitir que el mecanismo de asimilacin amoniaco para reiniciar. El nitrgeno orgnico puede ser suministrado como el cido amino, protena o urea. En muchos casos, el crecimiento ser ms rpido con un suministro de nitrgeno orgnico, y algunos microorganismos tienen un requisito absoluto para aminocidos. Se podra pensar que la principal necesidad industrial de aminocidos puros estara en la adicin deliberada a los amino cidos que requieren mutantes utilizados en la produccin de aminocidos. Sin embargo, los aminocidos se aaden ms comnmente como fuentes de nitrgeno orgnicas complejas que no son homogneos, ms barato y fcilmente disponible. En la produccin de lisina, metionina y treonina se obtienen a partir de hidrolizado de soja, ya que sera demasiado caro para utilizar los aminocidos puros (Nakayama, 1972a). Otros compuestos nitrogenados protenicos que sirven como fuentes de aminocidos incluyen licor de maz escarpado, harina de soja, harina de cacahuete, harina de semilla de algodn (Pharmamedia, Tabla 4.8, y Proflo), solubles de destilera, harina y extracto de levadura. Anlisis de muchos de estos productos que incluyen aminocidos, vitaminas y minerales son dadas por Miller y Churchill (1986) y Atkinson y Mavituna (1991a). En el almacenamiento de estos productos pueden ser afectados por la humedad, cambios de temperatura y el envejecimiento. Qumicamente definido aminocido desprovisto de medios de protena son necesarios en la produccin de ciertas vacunas cuando estn destinados para el uso humano. Existen factores que influyen en la eleccin de los mecanismos de control de la fuente de nitrgeno por el cual la nitrato reductasa, una enzima implicada en la conversin de nitrato a iones amonio, se reprime en presencia de amoniaco (Brown et al, 1974). Por esta razn, el amonaco o ion amonio es la fuente de nitrgeno preferida. En los hongos que han sido investigados, ion amonio reprime la captacin de aminocidos por permeasas de aminocidos generales y especficos (Whitaker, 1976). En Aspergillus nidulans, el amonaco tambin regula la produccin de proteasas alcalinas y neutras (Cohen, 1973). Por lo tanto, en mezclas de fuentes de nitrgeno, los componentes individuales de nitrgeno pueden influir en la regulacin metablica de modo que no es la asimilacin preferencial de un componente hasta que su concentracin ha disminuido. Se ha demostrado que la produccin de antibiticos por muchos microorganismos est influenciada por el tipo y la TABLA 4.8. La composicin de Pharmamedia (Traders protena, Southern algodn Oil Company, Divisin de Archer Dariels Midland Co.) Cantidad Componente En los experimentos de los medios de comunicacin en matraces agitados, sales de cidos dbiles (por ejemplo, succinato de amonio) se puede utilizar para servir como una fuente de nitrgeno y erradicar la fuente de un fuerte cambio de pH cido debido a cloruro o sulfato de iones que estaran presentes si el cloruro de amonio o sulfato se utilizaron como fuente de nitrgeno. Este procedimiento hace posible el uso de concentraciones ms bajas de fosfato para tamponar el medio. Las altas concentraciones de fosfato inhiben la produccin de muchos metabolitos secundarios (ver Seccin Minerales). El uso de fuentes de nitrgeno complejas para la produccin de antibiticos ha sido una prctica comn. Se piensa para ayudar a crear las condiciones fisiolgicas en el trophophase que favorecen la produccin de antibiticos en el idiophase (Martin y McDaniel, 1977). Por ejemplo, en la produccin de antibiticos de polieno, harina de soja se ha considerado una buena fuente de nitrgeno debido a la equilibrio de nutrientes, el bajo contenido de fsforo y la hidrlisis lenta. Se ha sugerido que esta ruptura gradual evita la acumulacin de iones de amonio y aminocidos represivas. Estos son probablemente algunas de las razones para la seleccin de fuentes de nitrgeno ideales para algunos metabolitos secundarios (Tabla 4.9.). En la produccin de giberelina se ha demostrado la fuente de nitrgeno a tener una influencia en la direccin de la produccin de diferentes giberelinas y las proporciones relativas de cada tipo (Jefferys, 1970). Otros aspectos predeterminados del proceso tambin pueden influir en la eleccin de la fuente de nitrgeno. Rhodes (1963) ha demostrado que la concentracin ptima de nitrgeno disponible para la produccin de griseofulvina mostr alguna variacin dependiendo de la forma de inculo y el tipo de fermentador se utiliza. Obviamente, estos factores deben ser tenidos en cuenta en la interpretacin de los resultados en los programas de los medios de comunicacin para el desarrollo. Parte del material nitrogenado complejo no puede ser utilizada por un microorganismo y crear problemas en el procesamiento aguas abajo y de tratamiento de efluentes. Esto puede ser un factor importante en la eleccin final de sustrato. MINERALES total de slidos de hidratos de carbono Azcares reductores N en la reduccin de azcares o componentes de nitrgeno proteico Amin de nitrgeno amino de la lisina Leucina Isoleucina Valina Treonina Fenilalanina Triptfano Metionina cistina cido asprtico Serina Proline Glicina Alanina Tirosina Histidina Arginina 9 9% 24,1% 1,2% 1,2% 5% 7 4,7% 4,5% 6,1% 3,3% 3,3% 4,6% 5,9% 1,0% 1,5% 1,5% 9,7% 4,6% 3,9% 3,8% 3,9% 3,4% 3,0% 12,3% componentes minerales Cloruro de Calcio Fsforo Hierro Sulfato de Magnesio Potasio Fat 253 0 ppm 685 ppm 1310 0 ppm 94 ppm 1800 ppm 0 7 360 ppm 1720 0 ppm 4,5% de cido ascrbico Vitaminas Tiamina Riboflavina Niacina Pantotheni c cido colina Pyidoxine Biotina cido flico inositol 32,0 mg kg "4,0 mg kg" 4,8 mgkg "83.3 mg kg - 12,4 mg kg - 327 0 mg kg - 16,4 mg kg - 1.5 mg kg - 1.6 mg kg - 1080 0 mg kg "Todos microorganismos requieren desconcentracin cierto mineral de la fuente de nitrgeno en los mentos de cultivo para el crecimiento y el metabolismo (Hughes y Poole, medio (Aharonowitz , 1980). La produccin de antibitico 1989, 1991). En muchos medios, magnesio, fsforo, puede ser inhibida por una fuente de nitrgeno utilizada rpidamente potasio, azufre, calcio y cloro son esenciales (NHJ, NO ^ ~, ciertos aminocidos). Los componentes antibitica, y debido a la reduccin de las concentraciones de slo comienza a aumentar en el rido caldo de cultivo, deben ser aadidos como componentes distintos, despus de la mayor parte de la fuente de nitrgeno ha sido consumida. Otros, como el cobalto, cobre, hierro, manganeso, molyb-TABLA 4.9. Las mejores fuentes de nitrgeno para alguna fuente de metabolitos secundarios del producto principal de nitrgeno (s) Referenc e penicilina maz empinada licor Moye ry Coghill (1946) Bacitracina man granulado Inskeep et al. (1951) La riboflavina pancretico compendio de gelatina Malzahn et al. (1959) solubles de destilera Novobiocina Hoeksem unos y Smith (1961) Rifomycin Pharmamedia Sensi y Thiemann (1967) harina de soja, (NH4) 2S 0 4 giberelinas Ammoniu m sal y Jefferys fuente de nitrgeno (1970) de plantas naturales butirosina abeja secos f sangre o hemo - Claridge et al. (1974) globina con (NH 4) 2S 0 4 Polyene s harina de soja Martin y MacDanie l (1977) denum y zinc tambin son esenciales, pero usualmente estn presentes como impurezas en otros ingredientes principales. Es evidente que hay una necesidad de un anlisis por lotes de componentes de los medios para asegurar que este supuesto se puede justificar, de lo contrario puede haber deficiencias o excesos en diferentes lotes de medios de comunicacin. Ver las Tablas 4.7 y 4.8 para el anlisis de licor de maz fermentado y Pharmamedia, y Miller y Churchill (1986) para el anlisis de otros ingredientes de medios de comunicacin de origen vegetal y animal. Cuando se utilizan medios sintticos los elementos menores tendrn que ser aadido deliberadamente. La forma en el que los minerales se suministran por lo general y los intervalos de concentracin se dan en la Tabla 4.10. Como consecuencia del anlisis de la composicin del producto, tal como se describe anteriormente en este captulo, es posible estimar la cantidad de un mineral especfico para el diseo medio, por ejemplo, de azufre en las penicilinas y cefalosporinas, cloro en clortetraciclina. La concentracin de fosfato en un medio, en particular los medios de laboratorio en matraces de agitacin, a menudo es mucho mayor que la de otros componentes minerales. Parte de este fosfato se utiliza como un tampn para minimizar TABLA pH 4,10. El intervalo de concentraciones tpicas de componentes minerales (g dm - 3) Componente Rang E * KH 2P 0 4 1,0-4,0 (parte puede ser como tampn) MgS0 4 7H 2 0 0,25-3. 0 KCl 0,5-12. 0 CaC0 3 5,0-17. 0 FeS0 4 4H 2 0 0,01-0,1 ZnS0 4 8H 2 0 0,1-1. 0 MnS0 4 H 2 0 0,01-0,1 CuS0 4 5H 2 0 0,003-,01 N a * medios Complejo 2Mo0 4 2H 2 0 0,01-0,1 derivados de materiales vegetales y animales normalmente contienen una considerable concentracin de fosfato inorgnico. cambia cuando no se est utilizando el control externo del pH. En los procesos especficos de la concentracin de ciertos minerales puede ser muy crtico. Algunos procesos metablicos secundarios tienen un rango de tolerancia inferior al fosfato inorgnico que el crecimiento vegetativo. Este fosfato debe ser lo suficientemente bajo como para ser asimilado por el final de trophophase. En 1950, Garner et al. sugiri que una funcin importante de sales de calcio en medios fermention era para precipitar el exceso de fosfatos inorgnicos, y sugiri que el calcio mejor indirectamente el rendimiento de estreptomicina. La concentracin de fosfato inorgnico tambin influye en la produccin de bacitracinas, cido ctrico (cultivo de superficie), el cornezuelo, monomycin, novobiocina, oxitetraciclina, polienos, ristomycin, rifamicina Y, estreptomicina, vancomicina y viomicina (Sensi y Thieman, 1967; Demain, 1968; Liu et al, 1970; Mertz y Doolin, 1973; Weinberg, 1974). Sin embargo, pirrolnitrina (Arima et al, 1965), bicyclomycin (Miyoshi et al, 1972), Thiopeptin (MIYAIRI et al, 1970) y metilenomicina (Hobbs et al, 1992) se producen en un medio que contiene una alta concentracin de fosfato. Dos antibiticos monomycin se producen selectivamente por Streptomyces jamaicensis cuando el fosfato es 0,1 mM o 0,4 mM (Hall y Hassall, 1970). Regulacin de fosfato tambin ha sido discutido por Weinberg (1974), Aharonowitz y Demain (1977), Martin y Demain (1980), Iwai y Omura (1982) y Demain y Piret (1991). En una revisin reciente de la biosntesis de antibiticos, Liras et al. (1990) reconoci que eran enzimas diana (a) reprimida por fosfato, (b) inhibe por el fosfato, o (c) la represin de una enzima se produce pero la represin de fosfato no est claramente demostrado. Una secuencia de control de fosfato tambin se ha aislado y caracterizado a partir del promotor regulado de fosfato que controla la biosntesis de candicidina. Weinberg (1970) ha revisado los nueve elemerits traza de inters biolgico (nmeros atmicos 23-30, 42). De estos nueve, las concentraciones de manganeso, hierro y zinc son los ms crticos en el metabolismo secundario. En cada sistema metablico secundaria en la que se ha informado de datos suficientes, el rendimiento del producto vara linealmente con la concentracin logartmica de la llave metal 4 '. La relacin lineal no se aplica a concentraciones de metal que son insuficientes, o txicas, para el crecimiento celular. Algunos de los productos microbianos primaria y secundaria cuyos rendimientos se ven afectadas por las concentraciones de metales traza mayores que los requeridos para el crecimiento mximo se dan en la Tabla 4.11. El cloro no parece jugar un papel nutricional en el metabolismo de los hongos (Foster, 1949). Es, sin embargo, requiere de algunas de las bacterias halfilas (Larsen, 1962). Obviamente, en aquellos fermentaciones donde un metabolito que contiene cloro se va a producir la sntesis tendr que ser dirigida para asegurar que la no-cloro-derivado no se forma. Los compuestos ms importantes son clortetraciclina y la griseofulvina. En la produccin de griseofulvina, cloruro disponible adecuada proporcionada por la inclusin de al menos 0,1% de KCl (Rhodes et al, 1955), as como el cloruro proporcionada por los materiales orgnicos complejos incluidos como fuentes de nitrgeno. Otros metabolitos que contienen cloro se caldriomycin, nornidulin y mollisin. Quelantes Muchos medios de comunicacin no se pueden preparar o en autoclave sin la formacin de un precipitado visible de fosfatos de metales insolubles. Gaunt et al (1984) demostraron que cuando se someti a autoclave el medio de Mandels y Weber (1969), un precipitado blanco de iones de metal formado, que contiene todo el hierro y la mayora del calcio, manganeso y zinc presente en el medio. El problema de fosfato (s) de metal insoluble se puede eliminar mediante la incorporacin de concentraciones bajas de agentes quelantes tales como cido etilendiaminotetraactico (EDTA), cido ctrico, polifosfatos, etc., en el medio. Estos agentes quelantes forman preferentemente complejos con los iones metlicos en un medio. Los iones metlicos a continuacin, se pueden utilizar gradualmente por el microorganismo (Hughes y Poole, 1991). Gaunt et al (1984) fueron capaces de demostrar que el precipitado fue eliminado del medio Mandel y de Weber por la adicin de EDTA a 25 mg dm - 3. Es importante comprobar que un agente quelante no causa la inhibicin del crecimiento del microorganismo que est siendo cultivado. En muchos medios de comunicacin, en particular los utilizados comnmente en los procesos a gran escala, puede que no haya necesidad de aadir un agente quelante como ingredientes complejas tales como extractos de levadura o las peptonas proteosa formar un complejo con iones metlicos y asegurar la liberacin gradual de ellos durante el crecimiento (Ramamoorthy y Kushner, 1975). FACTORES DE CRECIMIENTO Algunos microorganismos no pueden sintetizar un conjunto completo de componentes de la clula y por lo tanto requieren compuestos preformados llamadas factores de crecimiento. Los factores de crecimiento ms comnmente requeridas son las vitaminas, pero tambin puede haber una necesidad de aminocidos especficos, cidos grasos TABLA 4.11. Los oligoelementos que influyen elemento primario y secundario Traza el metabolismo del producto (s) Referenc e bacitracina Mn Weinberg y Tonnis (1966) de la proteasa Mn Mizusawa et al. (1966) Gentamicina Co Tilley et /. (1975) Riboflavina F e, Co Hickey (1945) Fe Tanne r et al. (1945) Mitomicina Fe Weinberg (1970) monensina Fe Weinberg (1970) actinomicina F e, Zn Katz et al. (1958) Candicidina F e, Zn Weinberg (1970) El cloranfenicol F e, Zn Gallicchio y Gottlieb (1958) Neomicina F e, Zn Majumdur y Majumdar (1965) La patulina Fe, Z n Brack (1947) La estreptomicina Fe, Z n Weinberg ( 1970) El cido ctrico F e, Zn, Cu Shu y Johnson (1948) Penicilina Fe, Zn, Cu Foster et al. (1943) Koffler et al. (1947) Griseofulvina Zn Grove (1967) 104 Medios de Fermentaciones Industriales o esteroles. Muchas de las fuentes de carbono y nitrgeno naturales utilizados en formulaciones de medios contener todos o algunos de los factores de crecimiento necesarios (Atkinson y Mavituna, 1991a). Cuando hay una deficiencia de vitamina que a menudo se puede eliminar mediante una cuidadosa mezcla de materiales (Rhodes y Fletcher, 1966). Es importante recordar que si slo se requiere una vitamina puede ser en ocasiones ms econmico para agregar la vitamina pura, en lugar de utilizar un mayor ms grande de una fuente de vitamina mltiple ms barato. Pantotenato de calcio se ha usado en una formulacin del medio para la produccin de vinagre (Beaman, 1967). En los procesos utilizados para la produccin de cido glutmico, las concentraciones limitadas de biotina deben estar presentes en el medio (vase el captulo 3). Algunas cepas de produccin tambin pueden requerir tiamina (Kinoshita y Tanaka, 1972). NUTRIENTES RECICLAR La necesidad de reciclaje de agua en continuo-cultura de ICI pic proceso SCP ya ha sido discutido en una seccin anterior de este captulo. Se demostr que M. methylotrophus podra ser cultivada en un medio que contiene 86% de sobrenadante reciclado ms nutrientes frescos adicionales para compensar prdidas. Este enfoque ha permitido reducir los costos de los componentes de los medios, la preparacin de medios e instalaciones de almacenamiento (Ashley y Rodgers, 1986; Sharp, 1989). BUFFERS El control de pH puede ser extremadamente importante si la productividad ptima se ha de lograr. Un compuesto se puede aadir al medio para servir especficamente como un tampn, o tambin puede ser utilizado como una fuente de nutrientes. Muchos medios se almacenan a aproximadamente pH 7,0 por la incorporacin de carbonato de calcio (como la tiza). Si el pH disminuye el carbonato se descompone. Obviamente, los fosfatos que son parte de fuentes. Otros metabolitos que contienen cloro se caldriomycin, nornidulin y mollisin. Quelantes Muchos medios de comunicacin no se pueden preparar o en autoclave sin la formacin de un precipitado visible de fosfatos de metales insolubles. Gaunt et al (1984) demostraron que cuando se someti a autoclave el medio de Mandels y Weber (1969), un precipitado blanco de iones de metal formado, que contiene todo el hierro y la mayora del calcio, manganeso y zinc presente en el medio. El problema de fosfato (s) de metal insoluble se puede eliminar mediante la incorporacin de concentraciones bajas de agentes quelantes tales como cido etilendiaminotetraactico (EDTA), cido ctrico, polifosfatos, etc., en el medio. Estos agentes quelantes forman preferentemente complejos con los iones metlicos en un medio. Los iones metlicos a continuacin, se pueden utilizar gradualmente por el microorganismo (Hughes y Poole, 1991). Gaunt et al (1984) fueron capaces de demostrar que el precipitado fue eliminado del medio Mandel y de Weber por la adicin de EDTA a 25 mg dm - 3. Es importante comprobar que un agente quelante no causa la inhibicin del crecimiento del microorganismo que est siendo cultivado. En muchos medios de comunicacin, en particular los utilizados comnmente en los procesos a gran escala, puede que no haya necesidad de aadir un agente quelante como ingredientes complejas tales como extractos de levadura o las peptonas proteosa formar un complejo con iones metlicos y asegurar la liberacin gradual de ellos durante el crecimiento (Ramamoorthy y Kushner, 1975). FACTORES DE CRECIMIENTO Algunos microorganismos no pueden sintetizar un conjunto completo de componentes de la clula y por lo tanto requieren compuestos preformados llamadas factores de crecimiento. Los factores de crecimiento ms comnmente requeridas son las vitaminas, pero tambin puede haber una necesidad de aminocidos especficos, cidos grasos TABLA 4.11. Los oligoelementos que influyen elemento primario y secundario Traza el metabolismo del producto (s) Referenc e bacitracina Mn Weinberg y Tonnis (1966) de la proteasa Mn Mizusawa et al. (1966) Gentamicina Co Tilley et /. (1975) Riboflavina F e, Co Hickey (1945) Fe Tanne r et al. (1945) Mitomicina Fe Weinberg (1970) monensina Fe Weinberg (1970) actinomicina F e, Zn Katz et al. (1958) Candicidina F e, Zn Weinberg (1970) El cloranfenicol F e, Zn Gallicchio y Gottlieb (1958) Neomicina F e, Zn Majumdur y Majumdar (1965) La patulina Fe, Z n Brack (1947) La estreptomicina Fe, Z n Weinberg ( 1970) El cido ctrico F e, Zn, Cu Shu y Johnson (1948) Penicilina Fe, Zn, Cu Foster et al. (1943) Koffler et al. (1947) Griseofulvina Zn Grove (1967) 104 Medios de Fermentaciones Industriales o esteroles. Muchas de las fuentes de carbono y nitrgeno naturales utilizados en formulaciones de medios contener todos o algunos de los factores de crecimiento necesarios (Atkinson y Mavituna, 1991a). Cuando hay una deficiencia de vitamina que a menudo se puede eliminar mediante una cuidadosa mezcla de materiales (Rhodes y Fletcher, 1966). Es importante recordar que si slo se requiere una vitamina puede ser en ocasiones ms econmico para agregar la vitamina pura, en lugar de utilizar un mayor ms grande de una fuente de vitamina mltiple ms barato. Pantotenato de calcio se ha usado en una formulacin del medio para la produccin de vinagre (Beaman, 1967). En los procesos utilizados para la produccin de cido glutmico, las concentraciones limitadas de biotina deben estar presentes en el medio (vase el captulo 3). Algunas cepas de produccin tambin pueden requerir tiamina (Kinoshita y Tanaka, 1972). NUTRIENTES RECICLAR La necesidad de reciclaje de agua en continuo-cultura de ICI pic proceso SCP ya ha sido discutido en una seccin anterior de este captulo. Se demostr que M. methylotrophus podra ser cultivada en un medio que contiene 86% de sobrenadante reciclado ms nutrientes frescos adicionales para compensar prdidas. Este enfoque ha permitido reducir los costos de los componentes de los medios, la preparacin de medios e instalaciones de almacenamiento (Ashley y Rodgers, 1986; Sharp, 1989). BUFFERS El control de pH puede ser extremadamente importante si la productividad ptima se ha de lograr. Un compuesto se puede aadir al medio para servir especficamente como un tampn, o tambin puede ser utilizado como una fuente de nutrientes. Muchos medios se almacenan a aproximadamente pH 7,0 por la incorporacin de carbonato de calcio (como la tiza). Si el pH disminuye el carbonato se descompone. Obviamente, los fosfatos que son parte de muchos medios de comunicacin tambin juegan un papel importante en el almacenamiento en bfer. Sin embargo, altas concentraciones de fosfato son crticos en la produccin de muchos metabolitos secundarios (ver seccin Minerales anteriormente en este captulo). El uso equilibrado de las fuentes de carbono y nitrgeno tambin formar una base para el control del pH como capacidad de amortiguacin puede ser proporcionada por las protenas, pptidos y aminocidos, tales como en el licor de maz escarpado. El pH tambin puede ser controlado externamente mediante la adicin de amonaco o hidrxido de sodio y cido sulfrico (captulo 8). LA ADICIN DE PRECURSORES Y REGULADORES metablica para MEDIA Algunos componentes de una fermentacin ayuda medio para regular la produccin del producto en lugar de apoyar el crecimiento del microorganismo. Tales aditivos incluyen precursores, inhibidores e inductores, todos los cuales pueden ser usados para manipular el progreso de la fermentacin. Algunos productos qumicos precursores, cuando se aade a ciertas fermentaciones, se incorporan directamente en el producto deseado. Probablemente el ejemplo ms antiguo es el de mejorar los rendimientos de la penicilina (Moyer y Coghill, 1946, 1947). Una gama de diferentes cadenas laterales se puede incorporar en la molcula de la penicilina. El significado de las diferentes cadenas laterales se aprecia primero cuando se observ que la adicin de licor de maz escarpado aument el rendimiento de la penicilina de 20 unidades cm - 3 a 100 unidades de cm - 3. Se encontr licor de maz escarpado para contener la feniletilamina que fue incorporada preferentemente en la molcula de la penicilina para producir bencilpenicilina (penicilina G). Habiendo establecido que la actividad de la penicilina estaba en la cadena lateral, y que el factor limitante fue la sntesis de la cadena lateral, se convirti en la prctica estndar de aadir los precursores de la cadena lateral para el medio, en particular el cido fenilactico. Smith y Bide (1948) mostraron que la adicin de cido fenilactico y sus derivados, para el medio eran capaces de aumentar tanto la produccin de penicilina triple y para dirigir la biosntesis hacia el aumento de la proporcin de bencil penicilina 0-93% a expensas de otras penicilinas. El cido fenilactico sigue siendo el precursor ms ampliamente utilizado en la produccin de penicilina. Algunos ejemplos importantes de precursores se dan en la Tabla 4.12. Inhibidores Cuando se aaden ciertos inhibidores de la fermentacin, ms de un producto especfico se pueden producir, o un intermedio metablico que normalmente se metaboliza se acumula. Uno de los primeros ejemplos es la produccin microbiana de glicerol (Eoff et al, 1919). La produccin de glicerol depende de la modificacin de la fermentacin del etanol mediante la eliminacin de acetaldehdo. La adicin de bisulfito de sodio al caldo conduce a la formacin del compuesto de adicin de bisulfito de acetaldehdo (sulfito de sodio hidroxi etilo). Desde acetaldehdo es 105 Principios de la tecnologa de fermentacin, segundo Edn. TABL E 4.12. Precursores utilizados en procesos de fermentacin Precursor Producto Microorganismo Referenc e-cido fenilactico Penicilina G Penicillium chrysogenum Moyer y Coghill y compuestos relacionados (1947) actico Fenoxi Penicilina V Penicillium chrysogenum Soper et al. (1948) Cloruro clortetraciclina Streptomyces aureofaciens v Una Dyck y de algunos R (1952) Cloruro Griseofulvina Pnicillium griseofulvina Rhode s et al. (1955) * propionato Riboflavina Lactobacillus bulgaricus Smiley y Stone (1955) Los cianuros vitamina B12 Proprianobacterium, Mervyn y Smith Streptomyces spp. (1964) / 3-Iononones carotenoides Phycomyces blakesleeanus Reye s et al (1964) -amino butrico-L isoleucina Bacillus subtilis Nakayama (1972b) D-treonina L-isoleucina Serratia marcescens cido antranlico L-triptfano Hansenula anomala Nuclesido s y nicomicinas Streptomyces tendae Vecht-Lifshitz y bases Braun (1989) Dihydronovobionic Dihydronovo- Streptomyces sp. Walton et al. (1962) biocin cido p-hidroxicinamato Organomycin Streptomyces organonensis Eiki et al. (1992) A y DL-a -amin o butrico Ciclosporina A Tolypocladium inflatum Kobel y Traber L-Treonina ciclosporina C (1982) Tirosina o p-hidroxi Dimethylvanco- Nocardia orientalis Boeck et al. (1984) Mycin fenilglicina * Los rendimientos no son tan altos como por la tcnica r othe s ya no est disponible para la re-oxidacin de NADH2, su lugar como aceptor de hidrgeno es tomada por dihydroacetone fosfato, producido durante la gluclisis. El producto de esta reaccin es el glicerol-3-fosfato, que se convierte en glicerol. La aplicacin de los inhibidores generales y especficos se ilustran en la Tabla 4.13. En la mayora de los casos, el inhibidor es eficaz para aumentar el rendimiento del producto deseado y reducir el rendimiento de productos indeseables. Un nmero de estudios han sido realizados con inhibidores de cloracin potenciales, por ejemplo, bromuro, para minimizar la produccin de clortetraciclina durante una fermentacin tetraciclina (Gourevitch et al, 1956; Lepetit SpA, 1957; Goodman et al, 1959; Lein et al, 1959; Szumski, 1959). Inhibidores tambin se han utilizado para afectar a la estructura de la pared celular y aumentar la permeabilidad para la liberacin de metabolitos. El mejor ejemplo es el uso de penicllin y tensioactivos en la produccin de cido glutmico (Phillips y Somerson, 1960). Inductores La mayora de las enzimas que son de inters industrial son inducibles. Enzimas inducidas se sintetizan slo en respuesta a la presencia en el medio ambiente de un inductor. Los inductores son a menudo sustratos tales como almidn o dextrina para amilasas, maltosa para pululanasa y pectina para pectinasas. Algunos inductores son muy potentes, tales como la induccin de isovaleronitrile nitralase (Kobayashi et al, 1992). Anlogos de sustrato que no son atacados por la enzima tambin pueden servir como inductores enzimticos. La mayora de los inductores que estn incluidos en los medios de comunicacin enzima microbiana (Tabla 4.14) son sustratos o anlogos de sustrato, pero los productos intermedios y a veces pueden ser utilizados como inductores. Por ejemplo, maltodextrinas inducirn cidos grasos de amilasa y lipasa inducen. Sin embargo, el costo puede prohibir su uso como inductores en un proceso comercial. Comentarios han sido publicados por Aunstrup et al (1979) y Demain (1990). Una aplicacin inusual de un inductor es el uso de manano de levadura en la produccin de estreptomicina (Inamine et al, 1969). Durante la fermentacin cantidades variables de estreptomicina y mannosidostreptomycin se producen. Desde mannosidostreptomycin tiene slo 20% de la actividad biolgica de la estreptomicina, el primero es un producto indeseable. El Streptomyces griseus organismo de produccin puede ser inducida por manano de levadura para producir / 3-manosidasa que convertir mannosidostreptomycin a la estreptomicina. Ahora es posible producir una serie de protenas heterlogas en levaduras, hongos y bacterias. Estos incluyen las protenas de origen viral, humano, animal, vegetal y Mi- 106 Medios de Fermentaciones Industriales TABLA 4.13. Los inhibidores especficos y generales utilizados en Inhibidor fermentaciones Producto Efecto principal micro-organismo Referenc e glicerol sodio bisulfito acetaldehdo pro- Saccharomyces Eoff et al. produccin reprimida cerivisiae (1919) Tetraciclina Bromuro Clortetraciclina Streptomyces Lepetit formacin reprimido aureofaciens (1957) glutmico penicilina permeabilidad de la pared celular Micrococcus Phillips et al. glutamicus cido oxlico (1960) El cido ctrico de metal alcalino / fosfato reprimido Aspergillus niger Batti (1967) fosfato, pH por debajo de 2,0 Valina Varios Varios efectos inhibidores con Breuibacterium Uemur una et al. diferente roseum inhibidores (1972) Rifamicina Di-etil barbitrico OTRA S rifamicinas Nocardia Lancini e inhibido mediterranei Whit e (1973) 7-cloro-6 de- etionina Afecta a un carbono Streptomyces Neidleman et al. methyltetracycline reacciones de transferencia de aureofaciens (1963) origen microbianas (Peberdy, 1988; Wayne Davies, 1991). Sin embargo, las protenas heterlogas pueden mostrar cierto grado de toxicidad para el husped y tienen aa importante influencia en la estabilidad de expresin de la protena heterloga. Adems de restringir el crecimiento celular como la biomasa de la toxicidad proporcionar condiciones selectivas para las clulas segregantes que ya no sintetizan la protena en un nivel tan alto (Goodey et al, 1987). Por lo tanto, las condiciones ptimas de crecimiento se pueden conseguir no la sntesis de una protena heterloga continuamente y slo despus de la induccin de la cultura de acogida ha crecido en un recipiente para producir suficiente biomasa (Piper y Kirk, 1991). En las clulas de S. cereuisiae donde el promotor Gall es parte del sistema de expresin de genes, la formacin de producto puede ser inducida mediante la adicin de galactosa a la medio de crecimiento que contiene glicerol o bajos niveles no represoras de la glucosa como fuente de carbono. Un sistema comercial que se ha desarrollado se basa en el promotor ale A en Aspergillus nidulans para expresar al interfern humano (Wayne Davies, 1991). Esto puede ser inducida por productos qumicos voltiles, tales como etilmetil cetona, que se aaden cuando la biomasa tiene aumento a un nivel adecuado y el medio de crecimiento contiene una fuente de carbono no reprimir o bajos niveles no represoras de la glucosa. Levaduras metilotrficas tales como Hansenula polymorpha y Pichia pastoris se pueden utilizar como sistemas alternativos debido a la presencia de un alcohol oxidasa TABLA 4.14. Algunos ejemplos de industrialmente importantes inductores enzimticos inductor de enzimas de microorganismos Referenc e -amilasa Almidn Aspergillus spp. Windish y Mhatre (1965) Maltos e Bacillus subtilis Pululanasa maltosa Aerobacter Wallenfels et al. (1966) aerogenes a-Mannosidas e mananos levadura Streptomyces griseus Inamine et al. (1969) La penicilina acilasa cido fenilactico Escherichia coli Carrington (1971) de la proteasa s Varios protenas de Bacillus spp. Keay (1971) Streptococcus spp. Aunstrup (1974) Streptomyces spp. Asperigillus spp. Mucor spp. Celulosa celulasa de Trichoderma viride e Rees (1972) pectinasas pectina Aspergillus spp. Fogarty y Ward (1974) (pulpa de remolacha, pulpa de manzana, cscara de ctricos) Nitralase Isovaleronitrile Rhodococcus Kobayashi et al. (1992), el promotor rhodochrous (Veale y Sudbery, 1991). Durante el crecimiento en metanol, que tambin acta como un inductor, el promotor es inducido a producir alrededor de 30% de la protena celular. En la presencia de glucosa o etanol es indetectable. Los sistemas de expresin se han desarrollado con P. Paston para el factor de necrosis tumoral, antgeno de superficie de la hepatitis y -galactosidasa. Antgeno de superficie de la hepatitis y otras protenas heterlogas tambin se pueden expresar por H. polymorpha. REQUISITOS DE OXGENO A veces se olvida que el oxgeno, aunque no se aade a un medio inicial como tal, es sin embargo un componente muy importante del medio en muchos procesos, y su disponibilidad puede ser muy importante en el control de la tasa de crecimiento y la produccin de metabolitos. Esto se discutir en detalle en el captulo 9. El medio puede influir en la disponibilidad de oxgeno en un nmero de maneras, incluyendo las siguientes: 1. metabolismo rpido. El cultivo puede ser oxgeno limitado debido suficiente oxgeno no puede estar disponible en el fermentador si ciertos sustratos, tales como azcares metabolizados rpidamente que conducen a una alta demanda de oxgeno, estn disponibles en altas concentraciones. 2. La reologa. Los componentes individuales del medio puede influir en la viscosidad del medio final y su posterior comportamiento con respecto a la aireacin y agitacin. 3. Antiespumantes. Muchos de los antiespumantes en uso actuarn como agentes activos de superficie y reducir la tasa de transferencia de oxgeno. Este tema ser considerado en una seccin posterior de este captulo. Metabolismo rpido factores nutricionales pueden alterar la demanda de oxgeno de la cultura. Penicillium chrysogenum utilizar la glucosa ms rpidamente que la lactosa o sacarosa, y por lo tanto tiene una tasa especfica ms alta de absorcin de oxgeno cuando la glucosa es la fuente principal de carbono (Johnson, 1946). Por lo tanto, cuando existe la posibilidad de limitacin de oxgeno debido a un metabolismo rpido, puede ser superada mediante la reduccin de la concentracin inicial de sustratos clave en el medio y la adicin de cantidades adicionales de estos sustratos como una alimentacin continua o semi-continua durante la fermentacin (ver Tablas 4.1 y 4.15;. Captulos 2 y 9). Tambin se puede superar mediante el cambio de la composicin del medio, la incorporacin de los hidratos de carbono ms altos (lactosa, almidn, etc.) y protenas que no se metabolizan muy rpidamente y no son compatibles con una gran velocidad de absorcin de oxgeno, tal especfico. Reologa Deindoerfer y West (1960) informaron de que no puede haber una variacin considerable en la viscosidad de los compuestos que pueden incluirse en los medios de fermentacin.BLE 4.15. Algunos procesos que utilizan la alimentacin por lotes o continua de alimentacin o en el que se han intentado Melaza de levadura Producto Adiciones Referenc E, fuentes de nitrgeno, y Mg Harrison (1971) Ree d y peppier (1973) El glicerol Azcar, Na 2C 0 3 Eoff et al. (1919) Adiciones alcohol acetona-butilo y retiros de Soc mosto. Richard et al. (1921) La riboflavina Carbohidratos Moss y Klein (1946) Penicilina Glucos correo y NH 3 Hosie r y Johnson (1953) Novobiocina Diversas fuentes de carbono y nitrgeno Smith (1956) Griseofulvina Carbohidratos Hockenhull (1956) Rifamicina glucosa, cidos grasos P un et al. (1959) Las giberelinas Glucos e Borrow et al. (1960) La vitamina B 1 2 Glucos e Beche r et al. (1961) Las tetraciclinas Glucos e Avanzini (1963) cido ctrico carbohidratos, NH 3 Pastor (1963) de protena unicelular Metanol Harrison et al. (1972) Candicidin Glucos e Martin y McDanie l (1975) Estreptomicina glucosa, sulfato de amonio Singh et al. (1976) cefalosporina Fresh adicin de medio Trilli et al. (1977)