nghiÊn cỨu xÁc ĐỊnh nỒng ĐỘ hoẠt chẤt mỘt sỐ thuỐc giẢm Đau (ibuprofen,...

8/15/2019 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ HOẠT CHẤT MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU (IBUPROFEN, DICLOFENAC, NAPROXEN, …

1/97

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜ NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

PHẠM MẠNH HÙNG

NGHIÊN CỨ U XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ HOẠT CHẤT MỘT SỐ THUỐC

GIẢM ĐAU (IBUPROFEN, DICLOFENAC, NAPROXEN, BEZAFIBRATE)

TRONG MẪU NƯỚ C BẰNG PHƯƠ NG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú


2/97

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜ NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

PHẠM MẠNH HÙNG

NGHIÊN CỨ U XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ HOẠT CHẤT MỘT SỐ THUỐC

GIẢM ĐAU (IBUPROFEN, DICLOFENAC, NAPROXEN, BEZAFIBRATE)

TRONG MẪU NƯỚ C BẰNG PHƯƠ NG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS PHẠM HÙNG VIỆT

Hà Nội – 2015




3/97

LỜ I CẢM Ơ N

Tôi xin chân thành cảm ơ n GS.TS Phạm Hùng Việt đã giao đề tài, nhiệt tình

hướ ng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợ i cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận

văn.

Tôi xin chân thành cảm ơ n TS. Dươ ng Hồng Anh cùng toàn thể các anh, em

trong nhóm điện di thuộc trung tâm CETASD đã giúp đỡ và hỗ trợ trong quá trình

thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơ n các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói

riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trongthờ i gian học tập tại trườ ng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

Tôi xin chân thành cảm ơ n cán bộ trong Trung tâm Nghiên cứu Môi trườ ng

và Phát triển Bền vững – Trườ ng Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện trong

quá trình thực hiện nghiên cứu.

Hà N ội, tháng 12 năm 2015

Học viên

Phạm Mạnh Hùng




4/97

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠ NG 1: TỔNG QUAN .................................................................................. 2

1.1 Sự xuất hiện của dượ c phẩm trong môi trườ ng ........................................... 2

1.2 Tổng quan về thuốc giảm đau chống viêm .................................................. 5

1.2.1 Khái niệm và phân loại. ....................................................................... 51.2.2 Khái niệm thuốc NASAID ................................................................... 5

1.2.3 Giớ i thiệu chung về các chất phân tích ................................................. 7

1.2.4 Tác hại của dượ c phẩm đến môi trườ ng ............................................... 8

1.3 Tổng quan các phươ ng pháp phân tích ....................................................... 9

1.3.1 Phươ ng pháp sắc ký khí ....................................................................... 9

1.3.2 Phươ ng pháp sắc ký lỏng HPLC .......................................................... 9

1.3.3 Phươ ng pháp điện di mao quản (CE).................................................. 11

1.3.4 Phươ ng pháp chiết pha rắn (SPE) ....................................................... 12

1.4 Tổng quan về phươ ng pháp điện di mao quản........................................... 13

1.4.1 Sơ lượ c về phươ ng pháp điện di mao quản ......................................... 13

1.4.2 Detector trong phươ ng pháp điện di mao quản .................................. 15

1.4.3 Bơ m mẫu trong điện di mao quản ...................................................... 16

1.4.4 Các thông số đánh giá trong phươ ng pháp điện di mao quản .............. 17




5/97

1.4.5 Một số yếu tố ảnh hưở ng tớ i quá trình tách chất trong điện di mao quản

…………………………………………………………………………………18

1.4.5.1 Pha động điện di ............................................................................. 18

1.4.5.2 Điện thế tách ................................................................................... 19

1.4.5.3 Lượ ng mẫu đi vào mao quản ........................................................... 19

CHƯƠ NG 2: THỰ C NGHIỆM ........................................................................... 20

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .............................................................. 20

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu........................................................................... 20

2.1.2 Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 20

2.2 Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 21

2.2.1 Hóa chất............................................................................................. 21

2.2.2 Thiết bị. ............................................................................................. 21

2.2.2.1 Hệ thiết bị điện di mao quản 2 kênh sử dụng detector độ dẫn không

tiếp xúc ........................................................................................................ 21

2.2.2.2 Các thiết bị khác ............................................................................. 23

2.3 Phươ ng pháp nghiên cứu .......................................................................... 23

2.3.1 Chuẩn bị hóa chất .............................................................................. 23

2.3.2 Chuẩn bị mẫu ..................................................................................... 24

2.3.3 Khảo sát điều kiện chiết. .................................................................... 24

2.3.3.1 Khảo sát các loại cột C18 ................................................................ 24

2.3.3.2 Khảo sát thành phần dung môi rửa giải ........................................... 25

2.3.3.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải ................................................. 25

2.3.3.4 Khảo sát thể tích nạp mẫu ............................................................... 25

2.3.4 Khảo sát điều kiện hóa học ................................................................ 25




6/97

2.3.4.1 Khảo sát thành phần đệm điện di. .................................................. 25

2.3.4.2 Khảo sát pH của pha động điện di .................................................. 26

2.3.4.3 Lựa chọn nồng độ chất bổ trợ HP-β-CD ........................................ 26

2.3.5 Khảo sát thông số thiết bị ................................................................... 26

2.3.5.1 Khảo sát thờ i gian chuyển mẫu ...................................................... 26

2.3.5.2 Khảo sát thờ i gian đẩy mẫu vào mao quản ..................................... 26

2.3.5.3 Khảo sát vị trí van kim................................................................... 26

2.3.5.4 Khảo sát điều kiện áp thế ............................................................... 27

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phươ ng pháp phân tích ................... 272.4.1 Giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ) của phươ ng

pháp phân tích ................................................................................................. 27

2.4.2 Độ chụm (độ lặp lại) của phươ ng pháp .............................................. 27

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của phươ ng pháp .............................................. 28

CHƯƠ NG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 29

3.1 Khảo sát điều kiện làm giàu và tách chiết pha rắn ..................................... 293.1.1 Khảo sát loại cột C18 ......................................................................... 30

3.1.2 Khảo sát tỷ lệ thể tích của Axetonitril trong dung môi rửa giải. .......... 31

3.1.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải .................................................... 32

3.1.4 Khảo sát thể tích nạp mẫu đối vớ i cột chiết. ....................................... 33

3.2 Khảo sát điều kiện tối ưu hệ đệm .............................................................. 35

3.2.1 Khảo sát ảnh hưở ng của thành phần đệm ........................................... 35

3.2.1.1 Khảo sát nồng độ của đệm ............................................................. 35

3.2.1.2 Khảo sát ảnh hưở ng pH của đệm .................................................. 38




7/97

3.2.1.3 Khảo sát ảnh hưở ng của nồng độ HP-β-CD ................................. 41

3.2.2 Khảo sát điều kiện dẫn lỏng ............................................................... 42

3.2.2.1 Khảo sát thờ i gian chuyển mẫu. ................................................... 43

3.2.2.2 Khảo sát thờ i gian đẩy mẫu ......................................................... 46

3.2.2.3 Khảo sát vị trí van kim chia dòng .................................................. 48

3.2.2.4 Khảo sát ảnh hưở ng của thế đặt vào hai đầu mao quản .................. 50

3.3 Đánh giá phươ ng pháp phân tích .............................................................. 54

3.3.1 Đườ ng chuẩn, LOQ, LOD.................................................................. 54

3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)....................... 583.3.2.1 Độ chụm...................................................................................... 58

3.3.2.2 Độ đúng ...................................................................................... 59

3.4 Đo mẫu thật .............................................................................................. 51

3.4.1 Đo mẫu thật trên CE ........................................................................... 52

3.4.2 So sánh kết quả trên CE và phươ ng pháp HPLC ................................ 54

3.4.2.1 So sánh kết quả Ibuprofen trên CE và HPLC ............................... 55

3.4.2.2 So sánh kết quả của Bezafibrate, Diclofenac va Naproxen trên CE

vớ i HPLC. ................................................................................................... 57

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 62

PHỤ LỤC ............................................................................................................. 66




8/97

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Giá trị tiền thuốc sử dụng theo năm của ngườ i Việt Nam .......................... 3

Bảng 1.2 Thông tin chung của các dượ c phẩm ......................................................... 8

Bảng 3.1 Chươ ng trình Gradien pha động HPLC………………………………….30

Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi và độ lệch chuẩn tươ ng đối của các chất ở các thể tích

nạp mẫu. ................................................................................................................ 34

Bảng 3.3 Độ phân giải của các chất ở các nồng đệm khác nhau ............................. 37

Bảng 3.4 Độ phân giải của các chất ở các pH của đệm .......................................... 40

Bảng 3.5 Độ phân giải của các chất theo nồng độ HP- β- CD ................................ 42

Bảng 3.6 Độ phân giải của các chất theo thờ i gian chuyển mẫu ............................. 45

Bảng 3.7 Độ phân giải của các chất theo thờ i gian đẩy mẫu. .................................. 47

Bảng 3. 8 Độ phân giải của các chất theo vị trí van kim ......................................... 50

Bảng 3. 9 Độ phân giải của các chất theo điện thế ................................................. 52

Bảng 3.10 Các điều kiện tối ưu phụ vụ phân tích dượ c phẩm ................................. 53

Bảng 3.11 Nồng độ của các chất trong các mẫu chuẩn ........................................... 54Bảng 3.13 Đườ ng chuẩn, giớ i hạn phát hiện, giớ i hạn định lượ ng của các chất ...... 57

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ lặp lại trên các nền mẫu của các chất ................... 58

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá độ đúng của các chất ................................................. 50

Bảng 3.16 Tên một sô mẫu nướ c thải dùng đê phân tích trên CE và HPLC ............ 51

Bảng 3.17 Kết quả đo mẫu thật trên CE ................................................................. 53

Bảng 3.18 Kết quả phân tích Ibuprofen trong nướ c thải trên CE và HPLC ............ 55

Bảng 3.19 Kết quả phân tích Bezafibrate, Diclofenac, Naproxen trong nướ c thải

trên CE và HPLC ................................................................................................... 58




9/97

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình đào thải của dượ c phẩm ra ngoài môi trườ ng ............................. 4

Hình 1.2 Cơ chế tác động của thuốc chống viêm giảm đau ...................................... 6

Hình 1.3 Quá trình chiết pha rắn ............................................................................ 13

Hình 1.4 Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơ n giản .......................................... 14

Hình 1.5 Lớ p điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong EOF ........................ 15

Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo detector C4D ..................................................................... 16

Hình 1.7 Các k ĩ thuật bơ m mẫu trong điện di mao quản ........................................ 17

Hình 2.1 Hình ảnh tổng thể của thiết bị: bên ngoài và bên trong vali……………..22Hình 3.1 Sự phụ thuộc hệ số thu hồi của các chất theo từng loại cột chiết………...31

Hình 3.2 Sự phụ thuộc hệ số thu hồi của các chất vào tỷ lệ ACN ........................... 32

Hình 3.3 Sự phụ thuộc hệ số thu hồi của các chất và thể tích dung môi rửa giải..... 33

Hình 3.4 Giản đồ đồ điện di của các chất ở nông độ đệm khác nhau. ..................... 36

Hình 3.5 Đồ thị diện tích pic của các chất ở các nồng độ đệm khác nhau. .............. 37

Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát ảnh hưở ng pH của đệm .......................................... 39

Hình 3.7 Đồ thị biểu thị diện tích pic của các chất ở các pH của đệm .................... 40

Hình 3.8 Điện di đồ khảo sát ảnh hưở ng của HP-β-CD đến độ phân giải của các

chất ........................................................................................................................ 41

Hình 3.9 Sơ đồ hệ thống dẫn lỏng trên hệ thiết bị điện di mao quản xách tay hai

kênh tự động .......................................................................................................... 43

Hình 3.10 Điện di đồ khảo sát ảnh hưở ng của thờ i gian chuyển mẫu ..................... 44

Hình 3.11 Đồ thị diện tích pic của các chất theo thờ i giản chuyển mẫu. ................. 45

Hình 3.12 Điện di đồ khảo sát ảnh hưở ng của thờ i gian đẩy mẫu ........................... 46

Hình 3.13 Đồ thị diện tích pic của các chất theo thờ i gian đẩy mẫu ....................... 47




10/97

Hình 3.14 Điện di đồ khảo sát ảnh hưở ng của vị trí van kim đến diện tích pic của

các chất. ................................................................................................................ 48

Hình 3.15 Đồ thị diện tích pic của các chất theo vị trí van kim .............................. 49

Hình 3.16 Điện di đồ khảo sát ảnh hưở ng của điện thế áp vào đến diện tích pic và

thờ i gian di chuyển của các chất. ........................................................................... 51

Hình 3.17 Đồ thị biểu thị diện tích pic của các chất theo điện thế .......................... 52

Hình 3.18 Đườ ng chuẩn xác định nồng độ của Ibuprofen ...................................... 55

Hình 3.19 Đườ ng chuẩn xác định nồng độ của Bezafibrate .................................... 55

Hình 3.20 Đườ ng chuẩn xác định nồng độ của Naproxen ...................................... 56

Hình 3.21 Đườ ng chuẩn xác định nồng độ của Diclofenac..................................... 56

Hình 3.22 Điện di đồ đánh giá độ lặp, độ chụm của các chất trên các nền mẫu ...... 59

Hình 3.23 Điện di đồ đo mẫu thật .......................................................................... 54

Hình 3.24 Mối tươ ng quan kết quả nồng độ ibuprofen giữa HPLC và CE.............. 57

Hình 4.1 Sắc đồ phân tích một số thuôc giảm đau trong mẫu SN3 trên HPLC……66

Hình 4.2 Điện dị đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu SN3 trên CE ...... 66

Hình 4.3 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu SS1 trên HPLC ........ 67

Hình 4.4 Điện di đồ phân tích một số thuôc giảm đau trong mẫu SS1 trên CE ....... 67

Hình 4.5 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL1 trên HPLC ....... 68

Hình 4.6 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL1 trên CE ...... 68


Hình 4.8 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL2 trên CE ..... 69


Hình 4.10 Điện di đồ phân tích một số thuôc giảm đau trong mẫu TL3 trên CE .... 70

Hình 4.11 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu YHN trên HPLC .... 71




11/97

Hình 4.12 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu YHN trên CE ... 71

Hình 4.13 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL4 trên HPLC ..... 72

Hình 4.14 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL4 trên CE .... 72

Hình 4.15 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu KN1 trên HPLC ..... 73

Hình 4.16 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu KN1 trên CE .... 73

Hình 4.17 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TT1 trên HPLC ..... 74

Hình 4.18 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TT1 trên CE .... 74

Hình 4.19 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu NCT2 trên HPLC .. 75

Hình 4.20 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu NCT2 trên CE . 75




12/97

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầ đủ

ACN Acetonitril

BGE Hệ đệmC4D Detectơ độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CE Phươ ng pháp điện di mao quản

CZE Điện di mao quản vùng

EOF Dòng điện di thẩm thấu

GC Sắc ký khí

His Histidin

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Leff Chiều dài hiệu dụn của mao uản

Ltot Tổng chiều dài mao quản

LOD Giớ i hạn hát hiện

LOQ Giớ i hạn định lượ n

MEKC Điện di mao uản điện độn học Mixen

MS Detetor khối hổ

NSAID Thuốc chốn viêm khôn steroid

%RSD % độ lệch chuẩn tươ ng đối

SD Độ lệch chuẩn

SDS Chất hoạt độn bề mặt

SPE Chiết ha rắn

Tris (h drox meth l) aminomethane

UPLC Sắc k lỏn siêu hiệu năn




13/97

1

MỞ ĐẦU

Những năm gần đây sự xuất hiện dượ c phẩm trong môi trườ ng nướ c trở thành

vấn đề nổi cộm về môi trườ ng. Hiện nay rất nhiều dượ c phẩm đã bị xếp vào loại vào

các chất gây ô nhiễm môi trườ ng do có độ ưa mỡ và khả năng phân hủy chậm, dẫn tớ ikhả năng tích lũy sinh học cao và gây ảnh hưở ng tớ i sức khỏe con ngườ i cũng như

môi trườ ng sinh thái. Nướ c thải của những nhà máy sản xuất dượ c phẩm, nướ c thải

bệnh viện không đượ c xử lý đúng cách xả ra môi trườ ng và sự đào thải dượ c phẩm

qua quá tình sử dụng thuốc của con ngườ i là những nguyên nhân gây ra sự xuất hiện

của dượ c phẩm trong môi trườ ng nướ c, trong đó có thuốc giảm đau, chống viêm là

một trong những loại thuốc đượ c sử dụng rộng rãi trong đờ i sống hằng ngày.

Các dượ c phẩm đượ c coi là chất gây ô nhiễm trong môi trườ ng. Vì vậy những

năm gần đây đã có rất nhiều phươ ng pháp đượ c phát triển để xác định hàm lượ ng của

chúng trong môi trườ ng. Những phươ ng pháp xác định dượ c phẩm như sắc khí lỏng

hiệu năng cao (HPLC), phươ ng pháp sắc kí khí kết hợ p khối phổ (GC-MS). Cùng vớ i

các phươ ng pháp trên, điện di mao quản cũng là một phươ ng pháp đượ c ứng dụng khá

rộng rãi, đặc biệt, phươ ng pháp điện di mao quản tích hợ p detetor đo độ dẫn không

tiếp xúc (CE-C4D) vớ i trang thiết bị nhỏ gọn, vận hành đơ n giản có thể tự động hóavà triển khai tại hiện trườ ng, hóa chất sử dụng ít vớ i chi phí thấp, cho thấy tiềm năng

phát triển phù hợ p vớ i nhu cầu và điều kiện thực tế tại Việt Nam. Do đó, chúng tôi đã

lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định nồng độ hoạt chất một số thuốc giảm

đau(ibuprofen, diclofenac, naproxen, bezafibrate) trong mẫu nướ c bằng phươ ng pháp

điện di mao quản”.

Kết quả nghiên cứu mong muốn đóng góp một phần cho quá trình quan trắc

môi trườ ng tại Việt Nam.




14/97

2

CHƯƠ NG 1: TỔNG QUAN

1.1 Sự xuất hiện của dượ c phẩm trong môi trườ ng

Thập kỷ gần đây vớ i sự phát triển mạnh mẽ của y học thì việc sử dụng dượ c

phẩm cho con ngườ i và thú y cũng ngày càng phát triển. Vì vậy nhiều loại dượ c phẩm

đã đượ c tìm thấy trong môi trườ ng nướ c. Vấn đề này đã trở thành một mối lo ngại về

môi trườ ng và sức khỏe của con ngườ i. Nhiều loại dượ c phẩm không hoàn toàn phân

hủy trong quá trình xử lý nướ c thải và đượ c đào thải ra môi trườ ng nướ c. Mặc dù sự

xuất hiện của các dượ c phẩm trong môi trườ ng nướ c có nồng độ nhỏ nhưng đã có sự

ảnh hưở ng đến môi trườ ng sống của nhiều loại vi sinh vật trong nướ c. Khoảng

100.000 dượ c phẩm khác nhau đượ c sản xuất mỗi năm nhưng không có dữ liệu cụ thể

về quá trình sử dụng trên toàn cầu của các dượ c phẩm [13]. Đặc biệt là quá trình tiêu

thụ của từng loại lại khác nhau đáng kể ở từng nướ c khác nhau. Có những dượ c phẩm

đượ c mua bán theo đơ n nhưng có những dượ c phẩm có thể mua dễ dàng ở các nhà

thuốc mà không cần đơ n chỉ định của bác s ĩ . Chính vì vậy khó có thể xác định đượ c số

lượ ng tiêu thụ của các dượ c phẩm ở mỗi nướ c. Dượ c phẩm bao gồm rất nhiều các hợ p

chất khác nhau chia thành nhiều loại phụ thuộc vào chức năng của từng loại ví dụ như

thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau chống viêm hoặc thuốc điều chỉnh lipit. Theo thốngkê dữ liệu ở các nướ c châu Âu sản lượ ng các thuốc chống viêm, giảm đau như

ibuprofen ở Đức năm 2001 có sản lượ ng 344,89 tấn, ở Anh ibuprofen năm 2000 đạt

sản lượ ng 162,3 tấn. Ngoài ra còn các loại thuốc khác như diclofenac ở Đức sản lượ ng

85 tấn trong năm 2001, bezafibrate ở Ý có sản lượ ng 7,6 tấn [10]. Bên cạnh đó còn

nhiều loại chưa đượ c thống kê đầy đủ. Ngay cả ở Việt Nam theo thống kê của cục

quản lý dượ c, giá trị tiền thuốc sử dụng của ngườ i Việt tăng dần theo năm như trong

bảng 1.1.




15/97

3

Bả ng 1.1 Giá tr ị tiề n thuố c sử d ụ ng theo nă m củ a ngườ i Việ t Nam

Năm

Tổng trị giá tiền

thuốc sử dụng

(1.000USD)

Trị giá SX

trong nướ c

(1.000USD)

Trị giá thuốc

nhập khẩu

(1.000USD)

Bình quân

tiền thuốc đầungườ i

(USD)

2005 817.396 395.157 650.180 9,85

2006 956.353 475.403 710.000 11,23

2007 1.136.353 600.630 810.711 13,39

2008 1.425.657 715.435 923.288 16,45

2009 1.696.135 831.205 1.170.828 19,77

2010 1.913.661 919.039 1.252.572 22,25

Theo cục quản lý dượ c Việt Nam thì sự phát triển của thị trườ ng dượ c Việt

Nam tiếp tục tăng trưở ng đến năm 2011 thị trườ ng tiếp tục tăng từ 17-19% và đạt 2 tỷ

USD [1]. Như vậy cùng sự phát triển của ngành dượ c thì dượ c phẩm đượ c phát hiện

trong môi trườ ng ngày càng tăng. Dượ c phẩm có thể xâm nhập vào môi trườ ng quanhiều con đườ ng khác nhau như hình 1.1.




16/97

4

Sau khi con ngườ i sử dụng, dượ c phẩm đượ c bài tiết qua thông qua phân

hoặc nướ c tiểu và theo con đườ ng đó xâm nhập vào nướ c thải. Trong quá trình xử lý

nướ c thải dượ c phẩm không dễ bị biến đổi hoặc bị loại bỏ và từ đó đượ c chuyển ra

môi trườ ng nướ c sông hồ. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc thú y cũng tươ ng tự như ở

con ngườ i. Động vật cũng bài tiết dượ c phẩm qua phân và nướ c tiểu. Khi sử dụng sản

phẩm từ phân gia súc để làm nông nghiệp cũng là con đườ ng để dượ c phẩm xâm nhập

vào môi trườ ng. Ngoài ra, nướ c thải của các nhà máy sản xuất dượ c phẩm và nướ c

Hình 1.1 Quá trình đ ào thải củ a d ượ c phẩ m ra ngoài môi trườ ng




17/97

5

thải của các bệnh viện không đượ c xử lý đúng cách thải ra môi trườ ng sông hồ cũng

chính là con đườ ng giúp dượ c phẩm xâm nhập vào môi trườ ng [6].

Vớ i những con đườ ng khác nhau và cách xử lý không đúng dẫn đến sự ô nhiễm

dượ c phẩm trong môi trườ ng nướ c sông, hồ, đất và ở một số trườ ng hợ p đặc biệt cònphát hiện một số dượ c phẩm như methaqualone và thuốc kháng sinh vớ i các nhóm

penicilloyl trong nướ c uống [9, 25]. Trong số những dượ c phẩm phát hiện nhiều trong

môi trườ ng nướ c có những dượ c phẩm thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau.

1.2 Tổng quan về thuốc chống viêm, giảm đau

1.2.1 Khái niệ m và phân loại

Thuốc chống viêm là thuốc có tác dụng lên một khâu nào đó của quá trình viêmhoặc làm ngưng hẳn quá trình viêm.

Phân loại thuốc chống viêm, giảm đau: có nhiều cách phân loại theo tác dụng,

theo cách sử dụng, theo các nhóm. Ở đây chúng tôi phân loại theo hai loại: tác dụng

toàn thân và tác dụng cục bộ. Trong đó thuốc NSAID là một trong những loại thuốc có

tác dụng toàn thân đượ c sử dụng phổ biến từ lâu.

1.2.2 Khái niệ m thuố c NSAID

NSAID: Thuốc chống viêm không steroid (tiếng anh: non-steroidal anti-

inflammatory drug, viết tắt là NSAID) là loại thuốc có tác dụng hạ sốt, giảm đau,

chống viêm không có cấu trúc steroids. NSAID là thuốc giảm đau ngoại vi và không

có tác dụng gây nghiện. Những thuốc tiêu biểu của nhóm này gồm có aspirin,

ibuprofen, diclofenac và naproxen đã đượ c sử dụng rộng rãi trong điều trị từ

lâu. Paracetamol (acetaminophen) có tác dụng chống viêm không đáng kể, nhưng lại

có tác dụng hạ sốt và giảm đau rất tốt, nên đôi khi vẫn đượ c xếp trong nhóm này.




18/97

6

Cơ chế chống viêm của thuốc NSAID: thuốc ức chế cyclooxygenase (COX) nên

ức chế tổng hợ p prostaglandin (PG) và thromboxan. Có hai dạng COX, COX-1 cần

thiết để tổng hợ p prostaglandin (bảo vệ niêm mạc dạ dày) và thromboxan cần thiết cho

tiểu cầu kết dính, và COX-2 tham gia tạo ra prostaglandin khi có viêm [17]. Các thuốc

chống viêm không chọn lọc ức chế cả hai loại COX-1 và COX-2, bao gồm ibuprofen,

indometacin, naproxen, piroxicam, diclofenac, ketoprofen. Các thuốc NSAID ức chế chọn lọc COX-2 gồm có ketorolac, parecoxib, celecoxib, meloxicam, rofecoxib…

• Thuốc có tác dụng ức chế sinh tổng hợ p PG do ức chế men COX làm

giảm tổng hợ p PG.

Hình 1.2 C ơ chế tác độ ng củ a thuố c chố ng viêm giả m đ au




19/97

7

•

Thuốc còn làm bền vững màng lysosome do đó hạn chế giải phóng

các enzyme của lysosome trong quá trình thực bào, nên có tác dụng

chống viêm.

• Ngoài ra thuốc còn ức chế các chất trung gian của quá trình viêm như

các kinin huyết tươ ng, ức chế cơ chất của enzyme, ức chế sự di chuyển

của bạch cầu, ức chế phản ứng kháng nguyên - kháng thể.

•

Riêng nhóm salicylate còn làm tăng giải phóng steroid nên làm tăng tácdụng chống viêm

1.2.3 Giớ i thiệu chung về các chấ t phân tích

Các chất phân tích đều là dượ c phẩm đã đượ c phát hiện trong môi trườ ng nướ c.

Trong đó có ba chất thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau NSAID và một chất là

dượ c phẩm tác dụng điều chỉnh lipit. Các thông tin chung của bốn dượ c phẩm đượ c

trình bày trong bảng [20, 21].

Tên Chất

Ibuprofen Diclofenac Naproxen Bezafibrate




20/97

8

1.2.4 Tác hại củ a d ượ c phẩ m đế n môi trườ ng

Tác hại của diclofenac đã đượ c đề cập ảnh hưở ng đến sự suy giảm của các cá

thể kền kền ở Ấn Độ [18, 19]. Một nghiên cứu tại vườ n quốc gia Keoladeo, Ấn Độ số

lượ ng cá thể kền kền giảm 95% năm 2003. Theo báo cáo diclofenac ở dạng thuốc thú

ý đượ c sử dụng trên động vật, gia súc nuôi. Những con kền kền ăn thịt những gia súc

có sử dụng diclofenac sẽ bị nhiễm độc dần dần, do chúng không có enzym để phá vỡ

diclofenac. Diclofenac làm cho những con kền kền có triệu chứng suy thận. Ngoài ra

đã có những báo cáo khi tiếp xúc lâu dài vớ i diclofenac sẽ ảnh hưở ng đến thận củamột số loại sinh vật như cá [24], chuột [17].

Tác giả Yohana M cùng cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của bezafibrate ảnh

hưở ng khả năng sinh dục và sinh tinh của cá ngựa vằn. Cá ngựa vằn trưở ng thành đã

Tên hóa học

(RS)-2-(4-(2-

metylpropyl)

phenyl)

propanoic

axit

2-(2-(2,6-

dichloro phenyl

amino) phenyl)

axetic axit

(+)-(S)-2-(6-

metoxy

naphtalen-2-yl)

propanoic axit

2-(4[16]phenoxy)-

2-metylpropanoic

axit

Công thức

phân tử C13H18O2 C14H11Cl2NO2 C14H14O3 C19H20ClNO4

Công thức

cấu tạo

Khối lượ ng

phân tử

(g/mol)206,28 296,148 230,259

361,819

pKa 4,41 4,18 4,8 3,6

Bả ng 1.2 Thông tin chung củ a các d ượ c phẩ m




21/97

9

đượ c tiếp xúc vớ i bezafibrate qua đườ ng miệng trong 21 ngày. Máu và bộ phận sinh

dục đượ c thu thập để đánh giá hypocholesterol. Kết quả cho thấy sự suy giảm tinh

hoàn. Nghiên cứu thấy đượ c bezafibrate tạo ra một tác nhân là hypocholesterol ở cá

ngựa vằn đực trưở ng thành. Nó là nguyên nhân gây ra sự rối loạn nội tiết ảnh hưở ngđến sinh tinh [26].

Đồng thờ i có nghiên cứu chỉ ra tác hại tổng hợ p của ibuprofen, diclofenac,

naproxen bằng phươ ng pháp kiểm tra Daphania chỉ ra các chất ảnh hưở ng đến quá

trình đến môi trườ ng sống của tảo. Tác giả đã chỉ ra các độc tính của các chất có thể

tạo ra hiểu ứng kết hợ p ảnh hưở ng đến môi trườ ng [7, 8].

1.3 Tổng quan các phươ ng pháp phân tích

1.3.1 Phươ ng pháp sắ c ký khí

Sắc kí khí là phươ ng pháp chia tách trong đó pha động là chất khí (đượ c gọi là

khí mang) và pha t ĩ nh chứa trong cột là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất

mang trơ dạng rắn hay phủ đều trên thành phía trong của cột [2].

Phươ ng pháp GCxGC-TOF_MS đượ c tác giả Petr Lacina sử dụng kết hợ p cùng

quá trình làm giàu SPE để xác định 10 loại dượ c phẩm trong nhóm thuốc chống viêm

giảm đau trong mẫu nướ c thải và nướ c mặt. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp đạt

đượ c của các dượ c phẩm từ 0,18-5 ng/L. Các mẫu đượ c lấy trên sông Svratka và mẫu

nướ c thải Brno-Modrice, Cộng Hòa Séc đượ c làm giàu bằng SPE bằng cột Oasis HLB

cartridges (3 mL, 60 mg) [14].

1.3.2 Phươ ng pháp sắ c ký l ỏ ng HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách vớ i pha t ĩ nh là chất rắn và pha

động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích đượ c chuyển lên cột tách dướ i

dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích đượ c phân bố liên tục

giữa pha động và pha t ĩ nh. Trong hỗn hợ p các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và

tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tươ ng tác của chúng vớ i pha t ĩ nh




22/97

10

và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển vớ i tốc độ khác nhau và tách ra khỏi

nhau [2]. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng

phươ ng pháp này, có thể kể đến như:

Phươ ng pháp HPLC sử dụng detector mảng diode A (DAD) kết hợ p cùng vớ iquá trình làm giàu chiết pha rắn (SPE) đã xác định sự có mặt của diclofenac trong các

mẫu nướ c thải tại các nhà máy xử lý nướ c thải tại Rio de Janeiro, Brazil [11].

Trong một nghiên cứu, tác giả JONES sử dụng phươ ng pháp HPLC vớ i

detector quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS kết hợ p cùng vớ i quá trình làm giàu SPE

để xác định 19 loại dượ c phẩm khác nhau như: ketoprofen, bezafibrate, naproxen,

warfarin, flurbiprofen, diclofenac, indomethacin, ibuprofen, meclofenamic axit,

paracetmon… Vớ i LOD của các chất từ 0,02 mg/L-0,25 mg/L . Cụ thể LOD của một

số chất như sau: diclofenac 0,15 mg/L, naproxen 0,01 mg/L, bezafibrate 0,06 mg/L,

ibuprofen 0,13 mg/L [6].

Trong nghiên cứu sử dụng phươ ng pháp HPLC –MS cũng đượ c tác giả Werner

Ahrer sử dụng để xác định một dượ c phẩm như paracetamon, penicillin, naproxen,

bezafibrate, diclofenac, ibuprofen…Vớ i LOD của các chất ở trong khoảng 0,05 -1

mg/L. Nếu kết hợ p cùng vớ i quá trình làm giàu SPE thì giớ i hạn phát hiện của cácchất có thể hạ xuống 1 ng/L [5].

Tác giả M. Jos´e G´omez đã sử dụng phươ ng pháp HPLC-MS-MS kết hợ p vớ i

quá trình làm giàu SPE vớ i cột Oasis HLB ở pH 7 để xác định 16 loại dượ c phẩm

trong nướ c thải bệnh viện như các loại thuốc giảm đau, chống viêm (ibuprofen,

naproxen, diclofenac, ketorolac, acetaminophen), thuốc chống trầm cảm(fluxetine và

paroxetine), thuốc kháng sinh (trimethoprim, metronidazole)… Phươ ng pháp có hệ số

thu hồi của dượ c phẩm cao hơ n 75%. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp từ 7 ng/mL

đến 47 ng/mL vớ i độ lệch chuẩn tươ ng đối của phươ ng pháp tính RSD từ 0,3% tớ i

4,9% [12].




23/97

11

1.3.3 Phươ ng pháp đ iệ n di mao quả n (CE)

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách chất phân tích là các ion hoặc các chất

không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ vớ i các ion trong một ống mao quản hẹp

chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trườ ng; do độ linh động điện di của các ionkhác nhau, chúng di chuyển vớ i tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [2].

Phươ ng pháp đ iện di mao quản đ iện động học Mixen (MEKC)

Một nghiên cứu đã sử dụng phươ ng pháp điện di mao quản MEKC của tác giả

Vincent J. Drover Christina S. Bottaro. Phươ ng pháp đã xác đinh 12 loại thuốc như:

ibuprofen, diclofenac, naproxen, bezafibrate, gemfibrozil, ofloxacin, norfloxacin,

carbamazepine, primidone, sulphamethazine, sulphadimethoxine vàsulphamethoxazole. Phươ ng pháp sử dụng đệm 10mM amoni hydrogen phosphat, pH

11.5, 69mM SDS, 6 mg/mL sunphat b-CD and 8.5% v/v isopropanol, điều kiện áp thế

là 30kV, chiều dài mao quản 48,5 cm và đườ ng kính là 50 µm. Phươ ng pháp kết hợ p

cùng vớ i quá trình làm giàu SPE có giớ i hạn phát hiện LODs của các chất từ 4 đến 30

µg/L. SPE đượ c thực hiện bằng cách dùng cột Strata-X 200 mg thể tích 3 mL. Hiệu

suất thu hồi của các dượ c phẩm trong quá trình làm giàu từ 82-99% vớ i độ lệch chuẩn

tươ ng đối từ 0,6-6,4% [9].

Điện di mao quản vùng (CZE).

Phươ ng pháp này đượ c tác giả Rawi Ramautar Govert W. Somsen Gerhardus J.

de Jong phát triển để xác định một số loại dượ c phẩm và mẫu y sinh. Phươ ng pháp sử

dụng kết hợ p SPE-CE-UV xác định naproxen vớ i quá trình làm giàu bằng cột C18.

Nếu không kết hợ p vớ i SPE phươ ng pháp có giớ i hạn phát hiện 0,2 µg/L. Nếu kết hợ p

vớ i SPE thì phươ ng pháp đượ c có thể phát hiện ở nồng độ 10 pg/mL. Vớ i hiệu suấtthu hồi lớ n hơ n 80% [22].

Một nghiên cứu của tác giả Alba Maci Francesc Borrull Marta Calull đã kết

hợ p SPE cùng vớ i CE để xác định naproxen bằng detector UV. Vớ i cột trong quá




24/97

12

trình SPE là cột C18 LiChrolut 500 mg của Merck. Hệ đệm 20 mM amoni axetat

trong metanol/water (70:30 v/v). Vớ i sự kết hợ p cùng SPE giớ i hạn phát hiện của

naproxen có thể xuống 10 ng/L[15].

Phươ ng pháp CE còn đượ c tác giả Ngee Mien Quek áp dụng để xác định 13loại dượ c phẩm vớ i detector C4D. Phươ ng pháp CE- C4D sử dụng hệ đệm 9 mM

Tris/5 mM axit lactic pH 8.0 có bổ sung thêm các chất như 5% n-propanol, 0.025% γ-

CD, 0.075% hydroxyl-β-CD và0.15% dimetyl-β-CD. Phươ ng pháp có giớ i hạn phát

hiện của các chất từ 61-1676 µg/L vớ i độ lệch chuẩn tươ ng đối của thờ i gian di

chuyển và diện tích pic dướ i 2 và 6%. Giớ i hạn phát hiện của 1 số chất như sau

ibuprofen 68 µg/L, naproxen 257 µg/L, diclofenac 144 µg/L [21].

1.3.4 Phươ ng pháp chiế t pha rắ n (SPE)

Trong quá trình phân tích dượ c phẩm trong mẫu môi trườ ng vì nồng độ các

dượ c phẩm rất nhỏ để giảm đượ c giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp các tác giả

thườ ng kết hợ p quá trình làm giàu chiết pha rắn vớ i các phươ ng pháp phân tích.

Chiết pha rắn là một dạng của sắc kí lỏng đượ c cải tiến thành hấp thụ pha rắn

vớ i các cơ chế khác nhau. Mục đích của chiết pha rắn là lấy các chất phân tích một

cách định lượ ng từ dung dịch, loại tạp chất và thu hồi toàn bộ nó. Sau khi làm sạch,

chất phân tích đượ c rửa giải vào một thể tích nhỏ dung dịch và lấy một cách định

lượ ng khỏi dung dịch nên có hệ số làm giàu cao [2, 4].

Chiết pha rắn có các ưu điểm sau:

- Thu hồi các chất phân tích có hiệu suất cao.

- Chiết phân tích và làm sạch tạp chất dễ dàng.

- Dễ tự động, phù hợ p vớ i sắc ký.

- Giảm lượ ng dung môi hữu cơ dẫn đến hạ giá thành.




25/97

13

Các loại chiết pha rắn: Chiết pha thườ ng, chiết pha đảo, chiết trao đổi ion, chiết

rây phân tử. Trong đó chiết pha đảo vớ i việc sử dụng pha t ĩ nh vớ i các nhóm C2, C18,

một số gốc hydrocacbon vớ i độ dài mạch khác nhau thích hợ p để tách các chất không

phân cực trong pha nướ c giống như các loại dượ c phẩm. Pha động hay chất rửa giải làdung môi phân cực thườ ng nướ c + metanol, acetonitril … Quá trình chiết như hình

1.3.

Hình 1.3 Quá trình chiế t pha rắ n

1.4 Tổng quan về phươ ng pháp điện di mao quản

1.4.1 Sơ l ượ c về phươ ng pháp đ iệ n di mao quả n

Điện di mao quản là phươ ng pháp tách chất dựa trên sự di chuyển khác nhau

của các ion dướ i tác dụng của điện trườ ng, trong lòng mao quản hẹp. Có nhiều k ĩ thuật

khác nhau trong CE, tuy nhiên, điện di mao quản vùng (CZE) là phươ ng pháp đượ c sử

dụng phổ biến nhất do đơ n giản trong vận hành và hiệu quả trong phân tích. Trong

nghiên cứu này, thuật ngữ CE đượ c hiểu là CZE.




26/97

14

Theo phươ ng pháp CE, các ion trong mao quản di chuyển vớ i tốc độ khác

nhau, theo công thức [23]:

i i

q Vv

6 πµ E

Lη r = ⋅ = ⋅

⋅ ⋅ ⋅

(1)

Trong đó: vi: tốc độ di chuyển của ion

µi: độ linh động điện di

E: cườ ng độ điện trườ ng

q: điện tích ion

η : độ nhớ t của dung dịch

r: bán kính hiđrat hóa của ion

V: hiệu điện thế

L: chiều dài mao quản

Hình 1.4 Sơ đồ củ a mộ t hệ đ iệ n di mao quả n đơ n giả n

Một yếu tố quan trọng ảnh hưở ng tớ i quá trình tách chất trong CE là dòng điện

di thẩm thấu (EOF). Mao quản sử dụng trong CE thườ ng đượ c chế tạo từ silic nóng




27/97

15

chảy (fused silica). Trên bề mặt mao quản hình thành nhiều nhóm axit yếu silanol Si-

OH. Ở pH thích hợ p, nhóm này phân li tạo thành ion silanat mang điện âm Si-O-. Đây

điều kiện để hình thành nên lớ p điện kép, trong đó lớ p di động nằm bên ngoài mang

điện dươ ng. Khi áp vào hai đầu mao quản một điện thế, lớ p di động này di chuyển về phía cực âm vớ i một vận tốc nhất định, tạo thành dòng, gọi là dòng EOF [23].

EOF EOFεξ ν µ E =

4πη= ⋅

(2)

Trong đó, ε: hằng số điện môi của dung dịch đệm

ξ: thế zeta của lớ p điện tích kép

Thườ ng thì khi pH > 3, EOF đã bắt đầu xuất hiện. Sự xuất hiện của EOF làm

tăng tốc độ di chuyển của các cation, trong khi vớ i anion thì ngượ c lại, đôi khi còn đảo

chiều của anion.

Hình 1.5 Lớ p đ iệ n kép và tố c độ di chuyể n củ a các ion trong EOF

1.4.2 Detector trong phươ ng pháp đ iệ n di mao quả n

Việc phát hiện chất trong CE đượ c thực hiện nhờ detector. Một số detector

thông dụng bao gồm detector đo quang (hấp thụ phân tử, huỳnh quang), điện hóa (đo




28/97

16

dòng, đo thế, độ dẫn) và khối phổ. Đối những thiết bị xách tay, detector độ dẫn là lựa

chọn thích hợ p nhất do có thiết bị nhỏ gọn, độ nhạy cao và phổ phân tích rộng.

Nguyên tắc thiết kế của detector độ dẫn không tiếp xúc là sử dụng hai điện cực hình

ống đặt vòng quanh và không tiếp xúc vớ i mao quản. Khi áp vào một hiệu điện thế,hai điện cực này sẽ đóng vai trò hai tụ điện còn khối dung dịch trong mao quản giữa

hai điện cực đóng vai trò điện trở . Tại đầu ra của điện cực thứ hai, tín hiệu sẽ đượ c thu

nhận đưa đến bộ khuếch đại và xử lý cho ra tín hiệu phân tích. Khi sử dụng detector

này, tín hiệu của chất phân tích (pic) thu đượ c là giá trị điện thế dướ i dạng tín hiệu số.

Việc hiển thị tín hiệu đượ c thực hiện dễ dàng bằng các phần mềm ghi tín hiệu như

eDAQ Chart hay PicoLog. Dướ i đây là sơ đồ cấu tạo của một detector đo độ dẫn

không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D).

Hình 1.6 Sơ đồ cấ u tạ o detector C 4 D

1.4.3 Bơ m mẫ u trong đ iệ n di mao quả n

Trong CE, trướ c khi phân tích, một lượ ng nhỏ mẫu đượ c nạp vào một đầu mao

quản. Có ba k ĩ thuật bơ m mẫu chủ yếu đượ c sử dụng, bao gồm bơ m áp suất, bơ m

xiphông và bơ m điện.

Kỹ thuật bơ m xiphông là đơ n giản nhất vì không yêu cầu cao về thiết bị, thích

hợ p vớ i các hệ CE vận hành bằng tay. Nguyên tắc của k ĩ thuật bơ m này là sử dụng sự

chênh lệch độ cao giữa hai đầu mao quản, trong đó, đầu nạp mẫu đượ c đặt cao hơ n.

Mẫu sẽ tự động nạp vào mao quản theo nguyên lí ống xiphông.




29/97

17

Kỹ thuật bơ m mẫu thủy động lực học dùng áp suất: Dùng một áp suất thích hợ p

để nén (đẩy) hoặc hút một lượ ng vào đầu cột mao quản trong một thờ i gian nhất định.

Kỹ thuật bơ m mẫu điện động học: Nguyên tắc của kỹ thuật này là dùng lực của

dòng điện vớ i một điện thế cao (5- 10kV) thích hợ p để đưa mẫu phân tích vào maoquản trong một thờ i gian nhất định.

Hình 1.7 Các kĩ thuậ t bơ m mẫ u trong đ iệ n di mao quả n

1.4.4 Các thông số đ ánh giá trong phươ ng pháp đ iệ n di mao quả n

Diện tích pic và độ phân giải là hai yếu tố đượ c xem xét để định lượ ng trong CE.

Diện tích pic tỉ lệ vớ i nồng độ chất phân tích đi qua detector. Dựa vào giá trị diện

tích pic, ta có thể xác định đượ c nồng độ của chất phân tích có trong mẫu.




30/97

18

S = k.C (3)

Trong đó: S là diện tích pic thu đượ c

k là hệ số

C là nồng độ chất phân tích

Việc xác định diện tích pic đượ c thực hiện đơ n giản nhờ các phần mềm ghi dữ

liệu đi kèm vớ i detector (eDAQ Chart).

Trong khi đó, độ phân giải thể hiện khả năng phân tách của hai pic gần nhau. Độ

phân giải đượ c xác định bằng công thức sau [23]:

i jiji j

2(t - t )R = w + w (4)

Trong đó: ti và t j là thờ i gian di chuyển của hai chất i và j (ti> t j)

wi và w j là độ rộng đáy của hai pic chất i và j

Theo lí thuyết, hai pic đượ c coi là tách hoàn toàn khỏi nhau (vớ i độ tin cậy 95 %) khi

độ phân giải R ≥ 1,5.

1.4.5 M ộ t số yế u tố ả nh hưở ng tớ i quá trình tách chấ t trong đ iệ n di mao quả n

1.4.5.1 Pha động đ iện di

Pha động điện di có vai trò quyết định trong quá trình tách chất. Như đã thấy

trong công thức (1), BGE ảnh hưở ng tớ i tốc độ di chuyển của các ion, thông qua giá

trị độ nhớ t của dung dịch (η ) và khả năng solvat hóa (thể hiện qua bán kính hiđrat r).

BGE thườ ng đượ c sử dụng là các dung dịch đệm trong môi trườ ng nướ c. Thành

phần của hệ đệm bao gồm một hợ p phần mang tính axit, hợ p phần còn lại mang tính

bazơ .




31/97

19

Các yếu tố cần quan tâm khi lựa chọn pha động điện di phù hợ p bao gồm thành

phần, nồng độ các hợ p phần và pH dung dịch.

1.4.5.2 Điện thế tách

Điện trườ ng đượ c tạo ra khi áp vào hai đầu mao quản một hiệu điện thế lớ n, cỡ

kV, theo công thức E = V/L. Đây là động lực cho quá trình di chuyển của các ion, ảnh

hưở ng trực tiếp tớ i khả năng tách chất và tín hiệu thu đượ c. Khi hiệu điện thế nhỏ,

chân pic dãn và diện tích pic lớ n hơ n, tuy nhiên thờ i gian phân tích dài hơ n. Trong khi

đó, hiệu điện thế lớ n có thờ i gian phân tích ngắn nhưng diện tích pic thu hẹp lại, đồng

thờ i còn gây ra hiệu ứng nhiệt. Do đó, giá trị độ lớ n của hiệu điện thế đặt vào là yếu tố

quan trọng cần quan tâm.

1.4.5.3 Lượ ng mẫ u đ i vào mao quản

Lượ ng mẫu đi vào mao quản ảnh hưở ng lớ n tớ i diện tích và khả năng phân tách

các pic. Lượ ng mẫu ít dẫn tớ i diện tích pic giảm, làm giảm khả năng phát hiện chất,

trong khi lượ ng mẫu lớ n, diện tích pic tăng, làm giảm độ phân giải.

Ngoài ra, còn một số yếu tố khác trên hệ CE ảnh hưở ng tớ i quá trình tách chất

như chiều dài và đườ ng kính trong của mao quản. Tuy nhiên, thông thườ ng, các yếu tố

này đượ c giữ cố định trên mỗi hệ thiết bị.




32/97

20

CHƯƠ NG 2: THỰ C NGHIỆM

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứ u

2.1.1 M ụ c tiêu nghiên cứ u

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu ứng dụng thiết bị điện di mao quản sử

dụng detector độ dẫn không tiếp xúc nhằm mục đích xác định đồng thờ i nồng độ

hoạt chất một số thuốc giảm đau (ibuprofen, bezafibrate, diclofenac, naproxen) trong

mẫu nướ c.

2.1.2 N ội dung nghiên cứ u

Các nội dung nghiên cứu nhằm đạt đượ c mục tiêu đề ra gồm:

- Tổng quan tài liệu về các phươ ng pháp xác định đồng thờ i các loại

dượ c phẩm, đặc biệt là các phươ ng pháp điện di mao quản.

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu xử lý mẫu, làm giàu các loại

dượ c phẩm bằng phươ ng pháp chiết pha rắn.

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thờ i nồng

độ bốn dượ c phẩm Ibuprofen, Bezafibrate, Diclofenac, Naproxen bằng phươ ng pháp

điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE–C4D).

- Đánh giá phươ ng pháp thông qua việc khảo sát khoảng tuyến tính,

xây dựng đườ ng chuẩn, đánh giá phươ ng pháp phân tích, xác định giớ i hạn phát hiện

(LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ), độ chụm và độ đúng của phươ ng pháp.

- Áp dụng các điều kiện tối ưu nghiên cứu đượ c để phân tích nồng độ

bốn dượ c phẩm trong một số mẫu thực tế.

- Thực hiện phân tích đối chứng kết quả nồng độ bốn dượ c phẩm trong

một số mẫu thực tế bằng phươ ng pháp tiêu chuẩn Sắc kí lỏng hiệu năng cao.




33/97

21

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chấ t.

• Naproxen dạng muối Natri, pa, SIGMA

• Diclofenac dạng muối Natri KCl, pa, SIGMA

• Ibuprofen dạng muối Natri, pa, SIGMA

• Bezafibrate dạng axit, pa. SIGMA

• TRIS C4H11O3N, pa, SIGMA

• HCl, pa, Merck

• Axetonitril C2H3N, pa, Merck

• HD-β-CD 97%, pa SIGMA

• Axit Lactic 85-92%, Nhật

• Metanol CH3OH, pa, Merck

• Nướ c đeion, điện trở 18,2 MΩ /cm

2.2.2 Thiế t b ị .

2.2.2.1 H ệ thiế t bị đ iện di mao quản 2 kênh sử d ụng detector độ d ẫ n không tiế p xúc

Hệ điện di mao quản 2 kênh xách tay sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

vận hành tự động (CE-C4D), trung tâm CETASD, Đại học Khoa học Tự nhiên.




34/97

22

Kích thướ c/khối lượ ng: - 45 x 33 x 15 cm

- Khối lượ ng: 9 kg

Yêu cầu nguồn điện: - Điện áp: 100-240 V; Tần số: 50-60 Hz

Giao diện kết nối : - Sử dụng cổng usb, Điều khiển hệ thống thông qua vi

mạch Arduino

Nguồn điện di: - Dải điện áp: lựa chọn trong dải 0 đến ± 25 kV

- Dòng điện: lựa chọn trong dải 0 - 300 µA

Điều khiển hệ thống vớ i

phần mềm tự phát triển

trên cơ sở Arduino:

- Phần mềm tươ ng thích vớ i hệ điều hành Windows XP

(SP3)

- Các thông số đượ c chươ ng trình hóa theo thờ i gian:

tốc độ bơ m mẫu, thờ i gian bơ m mẫu, tốc độ rửa mao

quản, độ lớ n và chiều điện cao thế, ghi và xử lý dữ liệu

Chế độ bơ m bộ tạo áp bằng khí nén kết hợ p vớ i bơ m màng mini

Hình 2.1Hình ả nh tổ ng thể củ a thiế t b ị : bên ngoài và bên trong vali




35/97

23

Mao quản silica 50 µm, Polymicro Technologies

2.2.2.2 Các thiế t bị khác

• Điện cực đo pH và độ dẫn hiện trườ ng, Hach

• Cân phân tích 4 số, Shimadzu, Nhật bản

• Máy nướ c đeion Milipore – Simplicity UV, Pháp

• Máy siêu âm Elma D-78224 Singen/HTW, Đức

• Micropipet và đầu tip vớ i các cỡ khác nhau: 10, 100, 200, 1000 và 5000 µL,

Ependof.

•

Các bình định mức thủy tinh (Đức) 10, 25, 50 và 100 mL đượ c sử dụng để pha

các dung dịch gốc của các dượ c phẩm, các dung dịch đệm.

• Các lọ nhựa 20 mL, 50 mL đựng các dung dịch chuẩn.

• Các xy-lanh, kẹp

• Các lọ đựng mẫu 2000 µL, 300 µL, Đức

• Thìa cân và thuyền cân phục vụ cân mẫu

• Máy lắc Vortex Mixer KMC 1300 V, 3000 vòng/phút, Hàn Quốc

• Máy li tâm Rotina 35R, Hetteic Zentrifugen, Đức.

• Bộ chiết pha rắn Supelco

• Bơ m hút chân không Buchi V-700, Thụy S ĩ

2.3 Phươ ng pháp nghiên cứ u

2.3.1 Chuẩ n b ị hóa chấ t

Các chất chuẩn gốc bao gồm: naproxen (Nap), diclofenac (Dic), ibuprofen

(Ibu) và bezafibrate (Bez) loại tinh khiết mua từ Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim,




36/97

24

Đức). Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg/L của từng chất đượ c chuẩn bị trong

metanol và pha loãng trong nướ c deion.

Các điểm chuẩn đượ c pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc trong nền mẫu chiết

(60%ACN/40% đệm Tris 9mM).

Các dung dịch đệm (pha động điện di) cũng đượ c cân và pha trong bình định

mức bằng nướ c deion. Trướ c khi sử dụng, các dung dịch đệm đều đượ c siêu âm nhằm

loại bỏ bọt khí.

2.3.2 Chuẩ n b ị mẫ u

Mẫu nướ c thải đượ c lấy vào bình thủy tinh sạch tại các ví trí trên địa bàn Hà

Nội. Có thể tiến hành lọc thô vớ i những mẫu nhiều vẩn đục. Sau đó, mẫu đượ c lọc quagiấy lọc có đườ ng kính lỗ 0,45 µm và axit hóa mẫu bằng dung dịch HCl đến pH=3-

3,5. Mẫu sau đó đượ c tiến hành chiết pha rắn trên cột C18.

2.3.3 Khả o sát đ iều kiệ n chiế t.

Trong phần này tất cả các thí nghiệm đượ c phân tích trên HPLC. Vớ i các thông

số như sau. Điều kiện phân tích sắc ký: chươ ng trình gradien dung môi vớ i Milli-Q

water (dung môi A) và acetonitril (dung môi B). Cả hai dung môi A và B đều đượ caxit hóa vớ i 1% (v/v) HCOOH. Tốc độ dòng là 0.6 mL, thể tích mẫu bơ m là 3µL,

nhiệt độ của cột đượ c đặt ở 300C. Trong quá trình khảo sát điều kiện chiết một số

thông số đượ c giữ cố định. Tốc độ nạp mẫu và tốc độ rửa giải các chất là 1-2 mL/phút,

mẫu đượ c axit hóa vớ i pH=3-3,5.

2.3.3.1 Khảo sát các loại cột C18

Khảo sát đượ c thực hiện trên ba loại cột C18 của ba hãng khác nhau. Mẫu chiết

đượ c chuẩn bị trên nền nướ c deion. Ba loại cột C18 như sau:

- Discovery DSC-18 (500 mg-3 mL)

- Statra C18-E (500 mg-3 mL)




37/97

25

- Merck LiChrolut RP-18 (500 mg-3 mL)

2.3.3.2 Khảo sát thành phần dung môi r ử a giải

Thành phần và nồng độ của dung môi rửa giải có ảnh hưở ng lớ n tớ i hiệu suất

của quá trình chiết. Ở khảo sát này, chúng tôi thực hiện khảo sát tỷ lệ thể tích giữa

acetonitril (ACN) vớ i đệm Tris 9 mM/ Lactic pH=8. Mẫu đượ c chuẩn bị trong nền

nướ c deion.

Tỷ lệ thể tích ACN/ Đệm đượ c thay đổi lần lượ t như sau: 40/50, 50/50, 60/40,

70/30, 80/20.

2.3.3.3 Khảo sát thể tích dung môi r ử a giải

Thể tích dung môi rửa giải cũng có ảnh hưở ng trực tiếp đến hiệu suất của quá

trình chiết. Các mẫu đượ c chuẩn bị trong nền nướ c deion. Thành phần dung môi rửa

giải đượ c khảo sát và đượ c chọn là 60% ACN/ 40% Đệm về thể tích. Thể tích dung

dịch rửa giải đượ c thay đổi như sau: 2 mL, 4 mL, 6 mL, 8 mL, 10 mL.

2.3.3.4 Khảo sát thể tích nạ p mẫ u

Sau khi khảo sát các thông số về thành phần và thể tích dung môi rửa giải

chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng làm giàu các chất. Các mẫu khảo sát đượ c chuẩnbị trong nền mẫu nướ c thải có mặt các chất cần phân tích và pH của mẫu từ 3-3,5. Thể

tích mẫu đượ c nạp qua cột lần lượ t là 200 mL, 400 mL, 600 mL, 800 mL, 900 mL.

2.3.4 Khả o sát đ iều kiệ n hóa họ c

2.3.4.1 Khảo sát thành phần đệm đ iện di.

Trong điện di mao quản, pha động điện di (dung dịch đệm) có vai trò quan

trọng tớ i sự tách chất. Nghiên cứu này thực hiện khảo sát dung dịch đệm gồm Tris/Lacvớ i các nồng độ của Tris khác nhau. Nồng độ của Tris thay đổi như sau: 9 mM, 18

mM, 27 mM, 36 mM, 45 mM.




38/97

26

2.3.4.2 Khảo sát pH của pha động đ iện di

Yếu tố tiếp theo cần khảo sát đối vớ i pha động điện di là pH của dung dịch

đệm. Trong khảo sát này, pH dung dịch đệm đượ c thay đổi như sau: 7,0; 7,5; 8,0; 8,5;

9,0 bằng cách thay đổi lượ ng axit lactic thêm vào.

2.3.4.3 Lự a chọn nồng độ chấ t bổ tr ợ HP- β -CD

Chất HP-β-CD bổ sung vào trong đệm có tác dụng giúp phân tách pic của hai

chất naproxen và diclofenac. Ở khảo sát này nồng độ của HP-β-CD đượ c thay đổi như

sau: 0,5 mM; 0,75 mM; 1 mM; 1,25 mM.

2.3.5 Khả o sát thông số thiế t b ị

Các khảo sát đượ c thực hiện trên hệ thiết bị điện di hai kênh xách tay tự động

vớ i detector C4D.Quá trình khảo sát đượ c thực vớ i các thông số sau.

2.3.5.1 Khảo sát thờ i gian chuyể n mẫ u

Thờ i gian chuyển mẫu là yếu tố đầu tiên khảo sát. Trong quá trình khảo sát các

yếu tố thờ i gian đẩy mẫu và vị trí van kim đượ c giữ cố định. Thờ i gian chuyển mẫu

thay đổi từ 1 giây, 2 giây, 3 giây.

2.3.5.2 Khảo sát thờ i gian đẩ y mẫ u vào mao quản

Sau khi chọn đượ c thờ i gian đẩy mẫu yếu tố tiếp theo là thờ i gian đẩy mẫu.

Thờ i gian đẩy mẫu vào mao quản ảnh hưở ng trực tiếp đến lượ ng mẫu vào quản. Trong

khi khảo sát các yếu tố khác đượ c giữ cố định và thờ i gian đẩy mẫu đượ c thay đổi như

sau: 1 giây, 2 giây, 3 giây, 4 giây.

2.3.5.3 Khảo sát vị trí van kim

Vị trí van kim có ảnh hưở ng đến quá trình bơ m mẫu vào mao quản. Nếu vị trí

van kim càng nhỏ thì áp suất ngượ c càng lớ n giúp lượ ng mẫu vào mao quản càng

nhiều. Vị trí van kim đượ c khảo sát ở các vị trí như sau: VP12, VP14, VP16, VP18,

VP20, VP22.




39/97

27

2.3.5.4 Khảo sát đ iề u kiện áp thế

Điện thế đặt vào hai đầu mao quản tạo ra một điện trườ ng, là động lực cho quá

trình di chuyển của các ion, ảnh hưở ng tớ i quá trình tách chất. Trong khảo sát này,

điện thế tách thay đổi vớ i trị số từ -10 ÷ -20 kV.

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phươ ng pháp phân tích

2.4.1 Giớ i hạ n phát hiệ n (LOD) và giớ i hạ n đị nh l ượ ng (LOQ) củ a phươ ng

pháp phân tích

* Giớ i hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ

thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ngh ĩ a so vớ i tín hiệu mẫu trắng hay

tín hiệu nền [3]. Đối vớ i các quá trình điện di giá trị LOD thườ ng đượ c xác định theotỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3.

* Giớ i hạn định lượ ng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ

thống phân tích định lượ ng đượ c vớ i tín hiệu phân tích khác có ý ngh ĩ a định lượ ng vớ i

tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền [3]. Vớ i quá trình điện di giá trị LOQ thườ ng

đượ c xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10.

2.4.2 Độ chụ m ( độ l ặ p l ại) củ a phươ ng pháp

Độ chụm đượ c đánh giá thông qua giá trị độ lặp lại, là độ sai lệch giữa các giá trị

riêng lẻ xi và giá trị trung bình trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau. Độ lặp

lại thườ ng đượ c xác định thông qua độ lệch chuẩn tươ ng đối (RSD). Khi độ lệch

chuẩn càng lớ n thì sai số của phép phân tích càng lớ n.

2

1RSD % = .100%;

( )

1

n

i

i

SD x

SD n x

x=

−

=−

∑

[3]

Trong đó, RSD: độ lệch chuẩn tươ ng đối

SD: độ lệch chuẩn




40/97

28

: x giá trị trung bình

xi: giá trị đo đượ c

n: số thí nghiệm đượ c thực hiện.

Đối vớ i phươ ng pháp CE, độ lặp lại đượ c xác định đối vớ i thờ i gian di chuyển

và diện tích pic. Quá trình tính toán RSD đượ c thực hiện trên phần mềm Microsoft

Excel, Minitab.

2.4.3 Độ đ úng ( độ thu hồi) củ a phươ ng pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớ n các kết quả

thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đượ c chấp nhận. Do đó, thướ c đo độ đúng thườ ng

đánh giá qua sai số tươ ng đối hay bằng cách xác định độ thu hồi. Độ thu hồi thườ ng

đượ c xác định bằng phươ ng pháp thêm chuẩn vớ i công thức tính như sau:

m+c m

c

C CR% 100%

C

−= ⋅

Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ trong mẫu

Cc: Nồng độ chuẩn thêm




41/97

29

CHƯƠ NG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện làm giàu và tách chiết pha rắn

Như đã đề cập ở phần tông quan nồng độ của các chất phân tích trong môi

trườ ng nướ c là rất nhỏ, do vậy trướ c quá trình phân tích cần có giai đoạn tách chiết vớ i

mục tiêu làm sạch và làm giàu mẫu. Qua quá trình tham khảo tài liệu, chúng tôi quyết

định chọn phươ ng pháp triết pha rắn sử dụng cột C18. Mặt khác, bốn loại dượ c phẩm

nói trên đều có nhóm cacboxyl, tích điện âm trong môi trườ ng nướ c có pH trung tính.

Để các cấu tử này có thể hấp thu hoàn toàn vào các hạt chất hấp thu C18 chúng phải ở

trạng thái không tích điện, do vậy cần phải axit hóa mẫu trướ c khi nạp vào cột. Mẫu

đượ c axit hoá đến pH = 3 - 3,5 bằng dung dịch HCl, lọc bằng giấy lọc 0,45µm sau đó

đượ c nạp qua cột.

Trướ c khi sử dụng, cột chiết pha rắn đượ c hoạt hóa bằng 5 mL acetonitril, 5

mL H2O và 5 mL dung dịch đệm (Tris 9mM/ Lactic pH=8). Tiếp sau đó mẫu đượ c

nạp qua cột vớ i tốc độ 1-2 mL/phút. Sau khi nạp mẫu, cột đượ c rửa bằng nướ c deion

và 5mL đệm Tris 9 mM. Cuối cùng là quá trình rửa giải bằng dung dịch

acetonitril/ đệm [16].

Trong quá trình thực hiện các khảo sát, mẫu thu đượ c đánh giá qua hiệu suất

thu hồi bằng phươ ng pháp phân tích HPLC vớ i detector DAD. Điều kiện phân tích sắc

ký: chươ ng trình gradien dung môi vớ i Milli-Q water (dung môi A) và acetonitril

(dung môi B). Cả hai dung môi A và B đều đượ c axit hóa vớ i 1% (v/v) HCOOH. Tốc

độ dòng là 0,6 mL, thể tích mẫu bơ m là 3µL, nhiệt độ của cột đượ c đặt ở 300C.

Chươ ng trình gradient dung môi để xác định các NSAID đượ c đặt như bảng 3.1 dướ i

đây để sử dụng cho phân tích trên HPLC:




42/97

30

Bả ng 3.1 Chươ ng trình Gradien pha độ ng HPLC

Thờ i gian (phút) %A %B

0 60 40

4 30 70

10 15 85

18 15 85

21 50 50

23,1 50 50

Gradien đượ c thay đổi từ 40% B tớ i 85% B trong 10 phút, sau đó giữ nguyên

đẳng dòng trong 8 phút (từ phút thứ 10 - phút 18). Detector đượ c đặt tại bướ c sóng

phù hợ p 260 nm.

3.1.1 Khả o sát loại cộ t C18

Trong quá trình khảo sát loại cột chúng tôi thực hiện trên ba loại cột C18

thươ ng phẩm khác nhau của ba hãng lần lượ t là: Strata C18-E 500 mg/3mL,

Discovery DSC-18SPE 500 mg/3mL, Merck LiChrolut RP-18 500 mg/3mL. Các mẫu

đượ c pha trong nền nướ c deion vớ i thể tích là 100mL và nồng độ các chất 0,24 mg/L.

Kết quả thu đượ c như hình 3.1.




43/97

31

Hình 3.1 Sự phụ thuộ c hiệu suấ t thu hồi củ a các chấ t theo từ ng loại cộ t chiế t

Kết quả thu đượ c trên hình 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi của các chất đối vớ i

các cột khác nhau đều tốt > 90%. Tuy nhiên cột C18 Merck LiChrolut RP-18 500mg/3

mL có hiệu suất thu hồi tốt hơ n đối vớ i bezafibrate và naproxen. Vì vậy chúng tôi đã

quyết định chọn cột C18 Merck LiChrolut RP-18 500 mg/3 mL để tiếp tục tiến hành

khảo sát các yếu tố khác.

3.1.2 Khả o sát t ỷ l ệ thể tích củ a acetonitril trong dung môi rử a giải

Vì sau quá trình làm giàu các mẫu đượ c đo trên hệ thống CE-C4D nên thành

phần dung môi rửa giải thườ ng bao gồm thành phần hữu cơ (để giúp quá trình

nghiÊn cỨu xÁc ĐỊnh nỒng ĐỘ hoẠt chẤt mỘt sỐ thuỐc giẢm Đau (ibuprofen,...

Documents