ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC

KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ

BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC

KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ

BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH

Mã số: CH. 1001190

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

PGS. TS. NGUYỄN VĂN TUYẾN

Hà Nội - năm 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH .................................................................................................. i

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ........................................................................................................ ii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 2

1.1. BETA LACTAM ............................................................................................................. 2

1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM ........................................................................................ 3

1.2.1. Phản ứng Staudinger ................................................................................................. 3

1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể ................................................. 4

1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ........................................................... 7

1.3.1. Phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym ........................................ 7

1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ .................................... 8

1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại .......................... 8

1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phƣơng pháp NMR ..................................................... 9

1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) .............................................................. 17

1.4.1. Khái niệm ............................................................................................................... 17

1.4.2. Phân loại ................................................................................................................. 17

1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................................. 17

1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo ............................................................................... 18

1.4.5. DETECTOR DAD .................................................................................................. 19

1.4.6. DETECTOR MS .................................................................................................... 20

CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 22

2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu và trang thiết bị. ................................................................... 22

2.1.1. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ. ........................................................................ 22

2.1.2. Dụng cụ và hóa chất. .............................................................................................. 22

2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng. 23

2.1.4. Các phƣơng pháp phân tích cấu trúc. ..................................................................... 23

2.2 Tổng hợp các hợp chất β-lactam..................................................................................... 25

2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic .......................................................... 25

2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine ........................................................................................ 26

2.2.3. Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam ........................................................................... 27

2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và

13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f ........ 28

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 31

3.1. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-LACTAM ................................................................ 31

3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-β-LACTAM .............................................. 32

3.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9a ................................................................ 32

3.2.2. Phân tích phổ 1H –NMR của hợp chất 9b .............................................................. 33

3.2.3. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9c ................................................................ 33

3.2.4. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9d ................................................................ 34

3.2.5. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e ................................................................ 35

3.2.6. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e ................................................................ 35

3.3. XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-MS ....................... 37

3.3.1. Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu ...................................... 37

3.3.2. Khảo sát phổ MS .................................................................................................... 40

3.3.3. Khảo sát chƣơng trình dung môi cho quá trình sắc ký ........................................... 41

3.4.4. Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký. .................................................... 43

KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 49

PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 51

i

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam .............................................................................. 3

Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1-

phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10

Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1-

phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10

Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA ........... 12

Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trƣờng hợp .............................. 13

Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel .................................................................................... 14

Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phƣơng pháp X-Ray ..... 14

Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B .................................................................... 16

Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS ............................................................................... 18

Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang ............................................................... 19

Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). .... 20

Hình 3.1. Phổ 1H của hợp chất 9a ............................................................................ 32

Hình 3.2. Phổ 1H của hợp chất 9b ............................................................................ 33

Hình 3.3. Phổ 1H của hợp chất 9c ............................................................................. 33

Hình 3.4. Phổ 1H của hợp chất 9d ............................................................................ 34

Hình 3.5. Phổ 1H của hợp chất 9e ............................................................................. 35

Hình 3.6. Phổ 1H của hợp chất 9f ............................................................................. 35

Hình 3.7. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a ....................................................... 37

Hình 3.8. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b ...................................................... 38

Hình 3.9. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c ....................................................... 38

Hình 3.10. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d .................................................... 38

Hình 3.11. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive..................................... 40

Hình 3.12. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative ................................... 40

Hình 3.13. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 ............... 42

Hình 3.14. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 ............... 42

Hình 3.15. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 ............... 42

Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a ...................................................................... 43

Hình 3.17. Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a) .................................................... 44

Hình 3.18. Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a) .................................................... 44

Hình 3.19. Sắc ký đồ của hợp chất 9b ...................................................................... 45

Hình 3.20. Sắc ký đồ của hợp chất 9c ...................................................................... 46

Hình 3.21. Sắc ký đồ của hợp chất 9d ...................................................................... 47

ii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger ................................................................................. 3

Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger ..................................................................... 4

Sơ đồ 1.3. Con đƣờng hình thành β –lactam .............................................................. 5

Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối (12) tổng hợp β-lactam ...................................................... 6

Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16) tổng hợp β-lactam ....................................................... 6

Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene ............................................. 7

Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ........................................... 26

Sơ đồ 2.2. Tổng hợp dẫn xuất imin .......................................................................... 26

Sơ đồ 2.3. Tổng hợp dẫn xuất cis-β-lactam ............................................................. 27

Sơ đồ 3.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ........................................... 31

Sơ đồ 3.2. Cơ chế hình thành chất 5a,b .................................................................... 32

iii

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Chú thích

1 SKPB Sắc ký phân bố

2 SKPD Sắc ký pha đảo

3 SKPT Sắc ký pha thuận

4 HPLC High-performance liquid chromatography

5 MS Mass spectrometry

6 NMR Nuclear magnetic resonance

iv

1

MỞ ĐẦU

Với sự biến đổi không ngừng của vi khuẩn, hàng loạt thuốc kháng sinh

không còn sử dụng đƣợc hoặc phổ tác dụng hẹp lại do khả năng kháng thuốc của

vi khuẩn. Làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và gây ra những biến chứng không

mong muốn cho ngƣời bệnh.

Azetidin-2-ones (β-lactams) đại diện cho nhóm thuốc kháng sinh quan

trọng [9] và ứng dụng làm các synthon trong tổng hợp hữu cơ [13]. Để tạo ra

những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao và chƣa bị vi khuẩn kháng lại, thì

việc tổng hợp và bán tổng hợp β-lactam mới là một việc làm rất quan trọng.

Mặt khác, nhƣ ta đã biết hoạt tính sinh học của các đồng phân quang học

(đồng phân đối quang hoặc đồng phân lập thể không đối quang) là rất khác nhau

và việc tách các đồng phân đó thì rất tốn kém, tốn rất nhiều thời gian. Vì vậy

việc tổng hợp chọn lọc lập thể các đồng phân quang học là rất quang trọng, làm

giảm chi phí cho thực hiện quá trình tách, tăng hiệu quả điều trị.

Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc

và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất β-lactams, thu đƣợc từ phản

ứng tổng hợp theo phƣơng pháp Staudinger, bằng các phƣơng pháp hiện đại nhƣ

HPLC-MS và NMR.

2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. BETA LACTAM

β-lactam đƣợc phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và đƣợc chia thành

4 nhóm:

β-lactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa.

o β-lactam có chứa vòng thiazolidine đƣợc gọi tên là penams (A)

o β-lactam có chứa vòng pyrrolidine đƣợc gọi tên là carbapenams (B)

o β-lactam hợp nhất để oxazolidine vòng đƣợc gọi tên là oxapenams

hoặc clavams (C)

β-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:

o β-lactam có chứa vòng thiazol 2,3-dihydro đƣợc gọi tên là penems

(D)

o β-lactam có chứa vòng 2,3-dihydro-1H-pyrrole đƣợc gọi tên là

carbapenems (E)

β-lactam kết hợp với vòng 6 cạnh chƣa bão hòa:

o β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-thiazine đƣợc gọi tên là

cephems (G)

o β-lactam có chứa vòng 1,2,3,4-tetrahydro pyridin đƣợc gọi tên là

carbacephems (H)

o β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-oxazine đƣợc gọi tên là

oxacephems (I)

β-lactam không kết hợp với bất kỳ một vòng nào đƣợc gọi tên là

monobactams

3

Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam

Hợp chất chứa vòng β-lactam đƣợc ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm

thuốc kháng sinh.

1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM

Azetidin-2-ones(β-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan

trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian

trong tổng hợp hữu cơ [13]. Nhiều phƣơng pháp tổng hợp β-lactam đã đƣợc phát

triển nhƣ: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm

carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9].

1.2.1. Phản ứng Staudinger

Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức

imine, là phƣơng pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam. Kể từ khi

đƣợc phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã đƣợc nghiên cứu

thực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập

thể. Nó đƣợc áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactam (Sơ đồ 1.1).

Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phƣơng pháp tốt nhất cho quá

trình tổng hợp β –lactam [14].

Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger

4

1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể

Cơ chế của phản ứng Staudinger đƣợc đƣa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tả

tốt nhất [15]. Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống

(LUMO) của nhóm đồng phẳng carbonyl ketene tạo ketene thế. Quá trình tấn

công xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phẳng của imine

vuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2).

Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger

Hợp chất trung gian này đã đƣợc phát hiện và đặc trƣng bởi quang phổ IR

[22]. Chuyển động quay của các imine đi vào mặt phẳng của ketene xảy ra đồng

thời với việc đóng vòng conrotatory tạo ra sản phẩm β –lactam (6) trong đó

nhóm imine R1 và nhóm L của ketene là cis. Khi nhóm thế trên carbon sp

2 của

imine (R1 trong sơ đồ) ổn định điện tích dƣơng, hợp chất trung gian zwitterioncó

thể bị đồng phân hóa tạo thành dạng cis của liên kết iminium vàtạo ra sản phẩm

trans-β-lactam (9). Tỷ lệ tƣơng đối của các quá trình sẽ xác định sản phẩm hóa

học lập thể của phản ứng ketene/imine.

Tính toán ab initio xác định sự có mặt của hợp chất trung gian zwitterion

và đóng vòng conrotatory [25]. Nghiên cứu tiếp theo [9] khẳng định bản chất

hai bƣớc của quá trình và chứng minh một số điểm tƣơng đồng với mô hình đề

xuất bởi Houk cho phản ứng conrotatory của cyclobutenes [18].

Gần đây, nghiên cứu mới của nhóm Xu [9] đề xuất một cơ sởđể giải thích

kết quả lập thể của phản ứng, xem xét lại mô hình đƣợc mô tả bởi Hegedus và

chỉ ra nguồn gốc động học của tỷ lệ cis/trans của sản phẩm β –lactam. Con

5

đƣờng đƣợc đề xuất cho sự hình thành β –lactam đƣợc mô tả dƣới đây (Sơ đồ

1.3).

Sơ đồ 1.3. Con đƣờng hình thành β –lactam

Khi sử dụng ketene dẫn xuất một lần thế thƣờng cho tấn công exo là ƣu

thế. Sản phẩm hóa học lập thể cuối cùng chịu ảnh hƣởng bởi bản chất của các

ketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứng

đóng vòng (k1) và phản ứng đồng phân hóa imine (k2). Tỷ lệ k1/k2 xác định tỷ lệ

cis/trans của sản phẩm β –lactam. Các tác giả đề xuất [9], bƣớc đóng vòng có

thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate

nhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic. Tăng mật độ điện tử cho

ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng

(tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- β –lactam. Mặt khác, làm giảm mật độ

electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k1

và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- β –

lactam. Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏ

trong chọn lọc lập thể. Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tƣơng tự thực

hiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không có

ảnh hƣởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phản

ứng Staudinge [21].

Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hƣởng bởi tính chất của dung môi, các

dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- β –lactam, trong khi

dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans. Ngoài ra, cách ketene

6

đƣợc hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hƣởng đến độ

chọn lọc lập thể của sản phẩm [27]. Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa

ketene và tác nhân imine ảnh hƣởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tƣơng

tự nhƣ nhiệt độ [19].

Một phƣơng pháp rất hiệu quả để thu đƣợc trans- β -lactam đƣợc phát

triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) nhƣ một anion

xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4). Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl

clorua béo [28].

Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối 12 tổng hợp β-lactam

Việc sử dụng sorbyl clorua (16) nhƣ một một tiền chất của

butadienylketene thu đƣợc một số kết quả thú vị liên quan đến đồng phân lập thể

không đối quang. Khi phản ứng Staudinger đƣợc thực hiện với N-aryl imine, thu

đƣợc chủ yếu là sản phẩm trans, trong khi sử dụng N-akyl imine thu đƣợc chủ

yếu là cis- β –lactam (Sơ đồ 1.5)[24].

Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16)tổng hợp β-lactam

7

Việc chọn lọc trans cũng thu đƣợc trong phản ứng Staudinger giữa imine

và vinylketene chứa một γ – heteroatom. Cấu hình Z của nhánh vinyl của đồng

đồng phân lập thể có tác dụng ổn định vinylketene và sản phẩm chính là trans-3-

vinyl - β –lactam (Sơ đồ 1.6) [23].

Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene

1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG

Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hợp raxemic bằng các

phƣơng pháp vật lý và hóa học. Thông thƣờng, sự tách đƣợc thực hiện sau khi

chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân đối

quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thể tách

bằng cách trực tiếp. Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thể tách đƣợc bằng

các phƣơng pháp kết tinh chọn lọc, phƣơng pháp sắc ký hoặc phƣơng pháp

NMR.

1.3.1. Phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym

Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định. Dựa

vào tính chất này, ngƣời ta đã sử dụng các enzym để chuyển hóa chọn lọc một

trong hai đối quang trong hỗn hợp. Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemic

của este bằng enzym pig liver estease. Dƣới tác dụng của enzym này, chỉ có

đồng phân S đƣợc thủy phân. Nhờ đó mà ngƣời ta tách đƣợc hai đồng phân này

ra khỏi nhau.

8

1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ

Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một

tâm bất đối thƣờng không thể tách ra khỏi nhau. Tuy nhiên, khi tham gia phản

ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản

phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách đƣợc bằng các phƣơng pháp hóa

lý khác nhau. Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách đƣợc

đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai

đối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau

bằng phƣơng pháp kết tinh. Phƣơng pháp này vẫn đƣợc sử dụng hiệu quả để

tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau.

Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm

bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ

khác. Các đồng phân “dia” nhận đƣợc có thể tách ra bằng các phƣơng pháp hóa

lý khác nhau. Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ đƣợc loại bỏ, thu đƣợc các

đồng phân đối quang tinh khiết.

1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại

Các đối quang có thể đƣợc tách nhờ các phƣơng pháp sắc ký khí (GC),

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral. Bản chất của các

phƣơng pháp này là các hỗn hợp đối quang tƣơng tác với pha tĩnh (tâm bất đối

trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tƣơng tác mạnh hơn với

9

tâm bất đối của cột. Đối quang có tƣơng tác yếu sẽ đƣợc rửa giải nhanh nhờ pha

động, kết quả là hai đối quang đƣợc tách ra khỏi nhau. Phƣơng pháp này thƣờng

đƣợc sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng. Nếu

phản ứng nhận đƣợc hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B

(ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chọn lọc đối quang đƣợc

xác định theo công thức:

% er % er

% er % er

enantiom A enantiom Bee

enantiom A enantiom B

% as % as

% as % as

di teroisomerA di teroisomerBde

di teroisomerA di teroisomerB

1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phƣơng pháp NMR

Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp

khác nhau, nhƣng phổ NMR là một phƣơng pháp hữu ích và phổ biến, vì nó

không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lƣợng nhỏ

hỗn hợp hai đồng phân đối quang. Các đồng phân khác nhau đƣợc xác định nhờ

độ dịch chuyển hóa học và hằng số tƣơng tác spin-spin của những nguyên tử

hydro trong từ trƣờng.

Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và

13C của hai đồng phân

“dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau. Tỉ lệ của các đồng phân có

mặt trong hỗn hợp có thể tính toán đƣợc bằng sự phân tích các tín hiệu này. Nếu

trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng

phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ

nhỏ.

a). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher

Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽ

không phân biệt đƣợc bằng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, do tín

hiệu của chúng không đƣợc phân tách trong từ trƣờng. Để phân biệt đƣợc hai

cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, ngƣời ta phải chuyển hợp chất

nghiên cứu thành đồng phân dia. Cơ sở của phƣơng pháp Mosher là chuyển hợp

chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của

hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau

đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đƣa ra đƣợc cấu hình của

chất ban đầu. Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-

10

1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để

tạo ra hai đồng phân dia nhƣ mô tả trong sơ đồ dƣới đây.

Hai đồng phân dia này sẽ đƣợc phân biệt rõ trên phổ cộng hƣởng từ hạt

nhân proton. Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este

Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trƣờng cao, trong khi

tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ

dịch chuyển về phía trƣờng thấp. Nhƣ vậy, ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu

hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu.

Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và

(R)-1-phenylbutan-1-ol

Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1-

phenylbutan-1-ol

11

Ngoài axit R-Mosher, hiện nay ngƣời ta đang nghiên cứu sử dụng một số

tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol,

amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ nhƣ các tác nhân bổ trợ sau.

b). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA)

Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tac nhân

hữu dụng nhất, cho phep xac đinh nhanh ty lê cua cac đông phân lâp thê . Khi co

măt cua chât nay, các đối quang của lacton, amin và ancol trong tƣ trƣơng tạo ra

phổ không tƣơng đƣơng. Có thể là do cả hydroxyl và các hydro cacbinyl của

chât CSA tạo ra các tƣơng tác với các tâm bazơ. Ƣu điểm của của phƣơng pháp

này là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuất

với tác nhân bổ trợ nên hạn chế đƣợc quá trình raxemat hóa, đặc biệt là có thể sử

dụng để xác định cấu hình của các chất có hàm lƣợng nhỏ.

Ví dụ, để nghiên cứu cấu hình của hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân

bổ trợ CSA, kết quả do tƣơng tác cầu hydro của oxazirindin với CSA tạo thành

phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của hai đối quang đƣợc tách biệt trong từ

trƣờng. Nghiên cứu của phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đồng phân (-)-oxaziridin

khi không có tác nhân chuyển dịch CSA thì các tín hiệu proton không phân biệt

đƣợc trong từ trƣờng, nhƣng khi cho kết hợp với (S)-(+)-CSA thì các tín hiệu

của metyl, metin đƣợc tách ra. Dựa vào phổ này, ngƣời ta có thể xác định đƣợc

tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin.

12

Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA

c). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3)

Tác nhân Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm

bất đối. Khi tác nhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH …) trong

phân tử có một trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia”. Phức dia tạo

thành có một số proton đƣợc tách ra trong từ trƣờng và chuyển về trƣờng thấp.

Sự tách biệt và độ chuyển dịch về phía trƣờng thấp của một số proton phụ thuộc

vào nồng độ của tác nhân phức Eu(hfc)3.

Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đối quang (R,S)-1-

axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt

đƣợc trong từ trƣờng. Tuy nhiên, khi đƣợc tạo phức với tác nhân chuyển dịch

Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu. Nhóm metyl (triplet) đƣợc tách thành hai triplet

có cƣờng độ tƣơng đƣơng nhau. Sự tách tín hiệu của proton trong từ trƣờng phụ

thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch.

Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-1-

axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều đƣợc tách ra và có độ

13

chuyển dịch hóa học chuyển về phía trƣờng thấp. Sự tách tín hiệu và độ chuyển

dịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng. Đối

với (R)-1-axetyl-1-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 đƣợc chuyển

dịch về phía trƣờng cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan. Nhƣ vậy, có thể phân

biệt và xác định đƣợc tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và (S)-1-

axetyl-1-phenylbutan nhờ 1H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyển

dịch Eu(hfc)3 (xem hình 5).

Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trƣờng hợp

1.3.5. X-ray tinh thể

a. Giới thiệu chung

Phƣơng pháp X-ray phân tử là phƣơng pháp hiện đại nhất để xác định cấu

trúc phân tử của một hợp chất hữu cơ. Từ phƣơng trình Bragg, ngƣời ta tính toán

độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục

tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lƣợng phân tử (n) xây

dựng nên tế bào cơ sở.

Phƣơng trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ

Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-cos2α-cos

2β-cos

2γ+2cosαcosβcosγ)

1/2

Số lƣợng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023

(d: tỷ trọng

g/cm3)

Mặt khác, khi chiếu bức xạ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽ

phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hƣớng (h,k,l) và hƣớng ngƣợc

lại (-h,-k,-l). Cƣờng độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-h,-k-l) đƣợc tính toán nhờ

cƣờng độ của tín hiệu nhiễu xạ (Ihkl) (|Fhkl| = (Ihkl)1/2

).

14

Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel

Mật độ electron tại một điểm trong tế bào cơ bản sẽ đƣợc tính toán bằng

công thức:

ρ(x,y,z) = [ Σhkl Fhkl exp{-2p(hx + ky + lz)}] / V

Bằng cách đo cƣờng độ của tất cả các tín hiệu nhiễu xạ Ihkl theo mặt h,k,l

khi đã biết đƣợc các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phƣơng trình Bragg ở

trên, ngƣời ta sẽ tính toán đƣợc mật độ electron tại mọi điểm trong không gian

của tế bào cơ sở, từ đó có thể xây dựng đƣợc bản đồ mật độ điện tích của phân

tử.Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chƣơng trình máy tính sẽ dựng đƣợc cấu

trúc không gian ba chiều của phân tử. Quá trình xác định cấu trúc của hợp chất

hữu cơ bằng phƣơng pháp X-ray phân tử có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phƣơng pháp X-Ray

b. Xác định cấu hình tuyệt đối

Phƣơng pháp X-ray tinh thể có khả năng xác định chính xác cấu hình

tuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bất

thƣờng. Để xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phƣơng pháp X-ray

tinh thể ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp của Bijvoet và phƣơng pháp so sánh chỉ

số R.

H,K,L

-H,-K,-L

15

Phƣơng pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi đƣợc chiếu bức xạ tia

X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thƣờng Friedel, lợi dụng nguyên tắc này

Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của

cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hƣớng (h,k,l) và hƣớng

ngƣợc lại (-h,-k,-l), để xác định cấu hình tuyệt đối.

Phƣơng pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R đƣợc xây dựng trên cơ sở hàm

thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và đƣợc

so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang. Nếu giá

trị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giá

trị này bằng phƣơng pháp thống kê.

Nhƣ vậy, cả hai phƣơng pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có

cƣờng độ cao do ảnh hƣởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử

mà chƣa so sánh đƣợc những tia tán xạ yếu. Những yếu tố tán xạ yếu chỉ đƣợc

sử dụng khi dữ liệu X-ray có số lƣợng lớn. Phƣơng pháp X-ray tinh có thể sử

dụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi.

Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, ngƣời ta có

thể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với

một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệt

đối. Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết đƣợc chọn để nghiên cứu trong

phƣơng pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận đƣợc dạng đơn

tinh thể. Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằng

phân tích X-ray đƣợc thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kết

với chất nghiên cứu. Ngoài ra, việc đƣa nhóm nguyên tử nặng nhƣ halogen (Cl,

Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho phép xác định cấu hình tuyệt

đối của chất đó nhờ phƣơng pháp Bijvoet ở trên.

Ví dụ hidroxy lacton chƣa biết cấu hình tuyệt đối đƣợc chuyển thành este

với axit Mosher để tạo thành đồng phân dia. Trong trƣờng hợp chất tạo thành

thu đƣợc dƣới dạng đơn tinh thể, cấu hình tuyệt đối của hydroxy lacton đƣợc

16

xác định thông qua cấu hình tuyệt đối đã biết của phần tác nhân Mosher thông

qua phân tích phổ X-ray.

1.3.6. Phổ CD

Phƣơng pháp phổ CD cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản của hiệu ứng

Cotton, cơ sở của phƣơng pháp này là nghiên cứu bƣớc chuyển ở trung tâm bất

đối (circular dichroism) hay còn gọi là phổ nhị sắc tròn. Việc xác định phổ CD

rất phức tạp, vì nó phụ thuộc vào bản chất của hợp chất nghiên cứu, chỉ có

những hợp chất có bƣớc chuyển n---->π* và π---->π* (có nhóm mang màu) mới

đo đƣợc hiệu ứng Cotton. Trong trƣờng hợp chất cần nghiên cứu không có bƣớc

chuyển n---->π* và π---->π* cần phải gắn thêm một nhóm mang màu vào phân

tử. Xác định cấu hình tuyệt đối của một hợp chất hữu cơ đƣợc thực hiện nhờ so

sánh hiệu ứng Cotton của nó với hiệu ứng Cotton của chất có cấu trúc tƣơng tự

đã biết về cấu hình tuyệt đối. Nhƣ vậy, cần phải có nhiều hợp chất có cấu trúc

tƣơng đồng đã biết để so sánh và xác định cấu hình tuyệt đối của chất cần

nghiên cứu.

Ví dụ, khi muốn xác định cấu hình của flavan mới, ngƣời ta phải so sánh

hiệu ứng Cotton của hợp chất cần nghiên cứu với hiệu ứng Cotton flavan đã biết

trƣớc cấu hình tuyệt đối. Hợp chất flavan B đã biết cấu hình tuyệt đối, hợp chất

flavan A chƣa biết cấu hình tuyệt đối, hiệu ứng Cotton của A và B trên phổ CD

là tƣơng tự nhau nhƣng có chiều ngƣợc nhau, nên cấu hình tuyệt đối của A là

ngƣợc so với B.

Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B

Ngoài ra, với các phân tử hữu cơ quang hoạt có chứa các phần mang màu

đã biết việc phân tích phổ CD cho phép xác định đƣợc cấu hình tuyệt đối của

cacbon bất đối trong phần mang màu này.

17

1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.4.1. Khái niệm

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968

trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một

phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên

một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa học với

các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và

phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lƣợng tốt, thích hợp tách

các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.

Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng , nhƣ phân tích các

hợp chât thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh

vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…

1.4.2. Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta

chia HPLC thành 4 loại:

Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).

Sắc ký phân bố (partition chromatography).

Sắc ký ion (ion chromatography).

Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Riêng SKPB đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa

pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng – SKPT (normal phase

chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).

Trong đo, sắc ký pha đảođƣợc sử dụng nhiều hơn cả.

1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ đƣợc

gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

Pha tĩnh đƣợc giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý →

sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).

18

Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded

phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, ngƣời ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều

ƣu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên

dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối

với hợp chất phân tích.

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên ngƣời

ta không thể ứng dụng phƣơng pháp rửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, ngƣời ta thƣờng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết

và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc

dạng này.

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu nhƣ không phân cực

hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài nhƣ C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl)

còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn nhƣ C2; ngoài ra

còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm

alkyl. Ngƣời ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các

loại khác nên đây là loại đƣợc sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS

1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

Hòa tan mẫu phân tích.

Phù hợp với đầu dò.

Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.

Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.

Tinh khiết dùng cho sắc ký.

19

Trong săc ky pha đao , dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý

thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhƣng kinh nghiệm thực tế

cho thấy nƣớc, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất. Trong

đó nƣớc là một dung môi đƣợc cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng

rửa giải.

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tƣơng tác giữa hợp chất cần phân tích

và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lƣỡng cực, tính acid hoặc tính base

của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn

lên khả năng phân tách của sắc ký.

Thông thƣờng pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nƣớc hoặc

dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan đƣợc trong

nƣớc.

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế

độ isocratic) hoặc đƣợc thay đổi theo một chƣơng trình đã định sẵn (chƣơng

trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.

1.4.5. DETECTOR DAD

Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện

nay có thể lắp 1024 diot) đƣợc sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm

silicon tinh khiết, kích thƣớc 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 –

0,050 mm.

Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang

Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ

thống đƣợc điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện

đƣợc tích – 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện

phóng điện. Sự nạp điện lại đƣợc tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng

điện tỷ lệ với lƣợng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ.

20

a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng,

c) đường quang phản xạ nhiều lần

Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell).

1.4.6. DETECTOR MS

Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp nghiên

cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó

dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện

trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) có ảnh

hƣởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện tích của ion

thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó.

Do qua trinh phân tich vơi đâu do MS đoi hoi mƣc đô chân không cao ,

nhiêt đô cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí , vân tôc dong chay nho ;

trong khi hê thông LC lai hoat đông ơ ap suât cao vơi môt lƣơng dung môi

tƣơng đôi lơn , nhiêt đô tƣơng đôi thâp , các chất phân tích ở thể lỏng . Điều này

gây rât nhiêu kho khăn trong viêc tim cach giai quyêt đƣơc sƣ tƣơng thich giƣa

hê thông săc ky long va đâu dò khối phổ.

Đê khăc phuc nhƣng kho khăn trên , cân phai co môt ky thuât trung gian

gọi la giao diên . Rât nhiêu ky thuât giao diên (interface technology) nhƣ chum

tia hat (FB), băn pha nguyên tƣ nhanh dong liên tuc (CF-FAB),… đa đƣơc

nghiên cƣu va ƣng dung , nhƣng mai cho đên cuôi thâp nhiên 80, mơi co sƣ đôt

phá thật sự với ky thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure

Ionization – API).

Ƣu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển

ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng

trƣớc đó cho LC/MS nhƣ bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục

(continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay nhƣ tia nhiệt

(thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp . Một thuận lợi nữa của API là sự

ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích

21

nhờ đó thu đƣợc khối phổ của ion phân tử . Ngoài ra, với ky thuật này, ngƣời ta

có thể điều khiển đƣợc quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy

theo yêu cầu phân tích.

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

* Phun mù điện tử (ESI).

* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI).

* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI).

Trong đo, hai ky thuật APCI và ESI , đăc biêt la ESI đƣợc sử dụng nhiều

hơn cả.

c. Các loại đầu dò khối phổ

Có các loại tổng quát sau:

* Sự uấn cong nhờ từ trƣờng (Magnetic field deflection)

- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trƣờng (a single focussing magnetic

sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.

- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn

cong nhờ từ trƣờng và điện trƣờng, máy có độ phân giải cao.

* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)

- Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter)

- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap)

* Máy khối phổ sử dụng ky thuật thời gian bay (time of flight mass

spectrometry)

* Máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier

(Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS).

Trong đo, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng ky thuật thời gian

bay; máy khối phổ cộng hƣởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi

Fourierđƣợc sử dụng nhiều hơn cả

22

CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu và trang thiết bị.

2.1.1. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ.

Sử dụng phản ứng đóng vòng Staudinger và một số phƣơng pháp khác tại

phòng thí nghiệm Hoá dƣợc- Viện Hoá học- Viện Khoa học & Công nghệ Việt

Nam.

2.1.2. Dụng cụ và hóa chất.

Nguyên liêu đ ầu: phenol, m-clophenol, este 2-brom metylaxetat,

benzylamin, p-brom benzandehit….

Dung môi: axeton, metanol, etanol, n-hexan, diclometan, etyl axetat,

nƣớc.

Dung dịch hiện màu: dragendoff, ceri sunfat/ axit sunfuric đặc.

Các chất xúc tác và dung môi khác cho các phản ứng đƣợc mua của hãng

Merck (Đức) và Aldrich (My).

Bột silica gel cho sắc kí cột kích thƣớc 0,01÷0,02 mm (Merck), bông y tế

dùng nhồi cột.

Bản mỏng sắc kí silica gel đế nhôm tráng sẵn Art. 5554 DC – Alufolien

Kiesel 60 F254 , dày 0,2 mm, kích thƣớc 20 x 20 cm (Merck).

Cột sắc kí thuỷ tinh, giá ống nghiệm, ống capila, bình triển khai sắc kí bản

mỏng.

Bình cầu phản ứng 250 ml, con khuấy từ, máy khuấy từ, giá kẹp bình

phản ứng.

Phễu chiết 250 ml, cốc mỏ vịt, natri sunfat để làm khô.

23

2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc

kí lớp mỏng.

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản

phẩm. Thông thƣờng chất đầu và sản phẩm với giá trị Rf khác nhau, màu sắc và

sự phát quang khác nhau…. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết đƣợc phản ứng xảy

ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng… dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các

giá trị Rf tƣơng ứng. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc

vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm đƣợc

dung môi hay hỗn hợp dung môi để các chất tách ra xa khỏi nhau (Rf khác xa

nhau) hay tìm đƣợc hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất.

Quy trình chạy sắc kí lớp mỏng:

Cho chất lên bản sắc kí: Hòa tan hoàn toàn chất nghiên cứu bằng dung

môi dùng để điều chiết sao cho dung dịch thu đƣợc không quá loãng hay quá

đặc. Dùng capila thủy tinh lấy chất rồi chấm lên trên bản mỏng sao cho các vệt

chấm phải tròn, gọn và các mép bên của bản mỏng 0,5 cm; cách chân bản mỏng

0,7 cm. Các vết chất cách nhau 0,5 cm. Chiều cao bản mỏng 7 cm.

Tiến hành sắc kí lớp mỏng:

Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám và

lắc ky. Đặt một mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hòa dung môi. Lƣợng dung

môi lấy sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết chất.

Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng đƣợc đặt nghiêng một

góc 15. Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai. Khi tiền tuyến

dung môi cách mép trên 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản mỏng, sau đó

hiện sắc phổ dƣới đèn tử ngoại rồi bằng thuốc hiện.

2.1.4. Các phƣơng pháp phân tích cấu trúc.

Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp đƣợc, chúng tôi tiến hành

các phƣơng pháp sau:

24

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo trên máy Gallenkamp

của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá học - Viện Khoa học

& Công nghệ Việt Nam.

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và

13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu

đƣợc đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi CDCl3 và TMS

là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân - Viện Hoá Học - Viện

Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

- MÁY HPLC

+ Hóa chất, thiết bị dùng cho máy HPLC

Dung môi: Kênh A: H2O (PA); Kênh B: Metanol (PA)

Pha tĩnh: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) đƣợc nhồi octadecylsilayl

silica gel (C18)

Thiết bị:LC-MSD Agilent 1100 Series (USA)

+ Đặt điều kiện cho hệ thống

Detector DAD: đặt ở bƣớc sóng 260nm.

Detector MS:

- Source: ESI

- Capilary: 3000V; 17nA

- End Plate Offset: 500V; 435nA

- Dry Gas: 5,0 l/min

- Dry Temp: 325 ºC

- Skimmer: 40.0V

- Cap Exit: 200.0V

- Polarity: Positive

Flow: 0,25 ml/min

Stop time: 30 min

25

Thể tích tiêm: 20 – 50 µl (tùy vào lƣợng mẫu)

Min

Gradient pha động

Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

%B %B %B

0

5

6

10

15

16

17

30

5

20

20

50

70

100

100

100

15

30

30

50

100

100

100

100

20

30

60

80

100

100

100

100

2.2. Tổng hợp các hợp chất β-lactam

2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

Hỗn hợp của phenol (5,1 mmol) 1a, DMF (3 ml) và Na2CO3 (5,1 mmol)

đƣợc đun hồi lƣu ở 140oC, trong thời gian 10 phút. Sau đó thêm este 2-brom

metyl axetat (4,6 mmol) và tiếp tục đun hồi lƣu ở 140oC, trong khoảng 4h. Hỗn

hợp sau phản ứng đƣợc cho thêm dung dịch HCl 10% đến môi trƣờng axit, sau

đó thêm dung dịch NaHCO3 đến môi trƣờng trung tính và đƣợc chiết ba lần

bằng CH2Cl2. Dịch chiết CH2Cl2 đƣợc làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ dung

môi ở áp suất thấp thu đƣợc sản phẩm thô 2a, sau đo thêm 8 ml NaOH 1N và 8

ml MeOH/H2O (1:1), tiêp tuc đun hồi lƣu ở 140oC trong 24h. Hỗn hợp sau phản

ứng đƣợc chiết bằng CH2Cl2, dịch chiết đƣợc làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ

dung môi ở áp suất thấp thu đƣơc san phâm thô . Sản phẩm thô đƣợc làm sạch

bằng sắc ký cột với hệ dung môi rƣa giai là n-hexan/EtOAc (9:1) thu đƣợc axit

3a hiệu suất 70%. Axit 3a là các chất rắn màu trắng có điểm chảy là 98-100oC.

Dung dịch của hôn hợp gômaxit 3a (0,36 mmol), (COCl)2(1,8 mmol) và

0,1 ml DMF trong 5ml CH2Cl2 đƣợc khuấy ở nhiệt độ thƣờng trong 24h. Kết

thúc phản ứng, loại bỏ dung môi CH2Cl2ở áp suất thấp thu đƣợc sản phẩm 2-

phenoxy clorua axetat 4a.

26

Dẫn xuất 2-(m-clo phenoxy) clorua axetat 4b đƣơc tông hơp tƣơng tƣ nhƣ

4a. Nguyên liêu đâu la m-clophenol 1b, thu đƣơc axit 3b vơi hiêu xuât 50%,

điêm nong chay tƣơng ƣng la 108-110oC.

Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine

Dung dịch của benzylamin(18,7 mmol) 6a, p-brom benzanđehit (18,7

mmol) 7a và Na2SO4 (37,4 mmol) đƣợc đun hồi lƣu ở 50-60oC trong dung môi

CH2Cl2, trong thời gian 4h. Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc chiết hai lần bằng

CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu đƣợc các

dẫn xuất imine 8a, đƣợc sử dụng ngay cho phản ứng tiếp theo.

Dân xuât imine 8b đƣơc tông hơp tƣơng tƣ nhƣ 8a. Nguyên liêu đâu la 6a

và dẫn xuất p-metoxy benzanđehit 7b.

Dẫn xuất imine 8c đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ 8a. Nguyên liệu đầu là 6b

và dẫn xuất p-metoxy benzanđehit 7b.

Sơ đồ 2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine

27

2.2.3. Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam

Hơp chất 4a (0,75 mmol) đƣợc hòa tan vào 5 ml toluen sau đó dung môi

toluen đƣợc cất loại ở áp suất thấp để loại bỏ (COCl)2 còn dƣ, tiếp theo làm lạnh

và thêm Et3N (1,125 mmol) thu đƣợc dẫn xuất ketene 5a, sau đo cho thêm chất

8a (0,75 mmol)và dung môi CH2Cl2(5 ml), đun hồi lƣu ở 55oC trong 24h. Hỗn

hợp sau phản ứng đƣợc chiết hai lần bằng CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và

loại bỏ dung môi ở áp suất thấp. Sau đó làm sạch bằng cột silica gel với hệ dung

môi hexan và EtOAc (9:1) thu đƣợc dẫn xuất 9a với hiệu suất 73%.

Dân xuât 9b đƣơc tông hơp tƣơng tƣ nhƣ 9a, vơi nguyên liêu đâu la 4b và

8a, thu đƣơc vơi hiêu suât 67%.

Dân xuât 9ccũng đƣợc tổng hợp tƣơng tƣ nhƣ 9a, vơi nguyên liêu đâu la

4b và 8b, thu đƣơc vơi hiêu suât 69%.

Dẫn xuất 9dcũng đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ 9a, với nguyên liệu đầu là

4a và 8b, thu đƣợc với hiệu suất 71%.

Dẫn xuất 9e đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và

8c, thu đƣợc với hiệu suất 68%.

Dẫn xuất 9f cũng đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ 9a, với nguyên liệu đầu là

4a và 8c, thu đƣợc với hiệu suất 65%.

Sơ đồ 2.3. Tổng hợp dẫn xuất cis-β-lactam

28

2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và

13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d,

9e, 9f

Các chất sau khi đƣợc tổng hợp, đƣợc đo phổ cộng hƣởng từ proton 1H-

NMR (500 MHz) và cacbon 13

C-NMR (125 MHz) đƣợc đo trên máy công

hƣơng tƣ hat nhân Avance 500 (Bruker, CHLB Đức).

a). Hợp chất 9a: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: toC: 105-106

oC

1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,41 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’);

7,31-7,34 (3H, m, H-4’’, H-2’’’, H-6’’’); 7,11-7,15 (6H, m, H-2’’, H-3’’, H-5’’,

H-6’’, H-3’’’, H-5’’’); 6,89 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-4’’’); 6,72 (2H, d, J = 8,0 Hz,

H-2’, H-6’); 5,40 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,70

(1H, d, J = 4,5Hz, H-4); 3,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b).

13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 165,42 (C=O); 156,82 (C-1’’’);

134,53 (C-1’); 131,51(C-3’); 130,30 (C-5’); 129,30 (C-3’’’); 128,94 (C-6’’’);

128,68 (C-2’’); 128,11 (C-6’’); 122,84 (C-4’); 122,21 (C-4’’’); 115,53 (C-2’’’,

C-6’’’); 82,10 (C-3); 60,91 (C-4); 44,4 (C-5)

b). Hợp chất 9b: là chất lỏng

1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,43 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’);

7,31-7,33 (3H, m, H-3’’, H-5’’, H-4’’’); 7,12-7,15 (4H, m, H-2’, H-6’, H-2’’, H-

6’’); 7,05 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-5’’’); 6,88 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-4’’’); 6,71

(1H, t, J = 1,5 Hz, H-2’’’); 6, 65 (1H, dd, J = 1,0; 7,5 Hz, H-6’’’); 5,36 (1H, d, J

= 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,71 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-4);

3,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b).

13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 164,79 (C=O); 157,32 (C-1’’’);

134,66 (C-1’); 134,34 (C-1’’); 131,58 (C-3’’’); 131,61 (2C, C-3’, C-5’); 130,19

(2C, C-3’’, C-5’’); 130,13 (C-5’’’); 128,97 (2C, C-2’, C-6’); 128,67 (2C, C-2’’;

C-6’’); 128,17 (C-4’’); 123,03 (C-4’); 122,45 (C-4’’’); 115,97 (C-2’’’); 113,86

(C-6’’’); 81,92 (C-3); 60,61 (C-4); 44,44 (C-5).

29

c). Hợp chất 9c: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: toC: 110-111

oC

1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,31 (3H, m, H-3’’, H-5’’, H-4’’);

7,14-7,19 (4H, m, H-2’, H-6’, H-2’’, H-6’’); 7,03 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-5’’’);

6,80-6,85 (3H, m, H-4’’’, H-3’, H-5’); 6,71 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-2’’’); 6,64 (1H,

dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-6’’’); 5,34 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); ); 4,87 (1H, d, J =

14,5 Hz, H-5a); 4,72 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-4); 3,84 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b);

3,78 (3H, s, OCH3).

d). Hợp chất 9d: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: toC: 81-81,5

oC

1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,29-7,32 (3H, m, H-2’’’, H-6’’’, H-

4’’); 7,20 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’); 7,17 (2H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-2’, H-

6’); 7,11 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-3’’’, H-5’’’); 6,86 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4’’’); 6,81

(2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’’, H-6’’); 6, 72 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’’, H-5’’); 5,37

(1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,71 (1H, d, J = 4,5

Hz, H-4); 3,84 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-5b); 3,77 (3H, s, OCH3).

13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 165,64 (C=O); 159,91 (C-4’’);

157,02 (C-1’’’); 134,86 (C-1’); 129,98 (2C, C-3’’’, C-5’’’); 129,18 (2C, C-2’’,

C-6’’); 128,85 (2C, C-3’, C-5’); 128,67 (2C, C-2’, C-6’); 124,51(C-4’); 121,93

(C-4’’’); 115,58 (2C, C-2’’’, C-6’’’); 113,79 (2C, C-3’’, C-5’’); 82,17 (C-3);

61,05 (C-4); 55,22 (OCH3); 44,04 (C-5).

e). Hợp chất 9e: là chất lỏng

1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,23-7,27 (3H, m, H-4’’’, H-3’’’, H-

5’’’); 7,15 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-6’, H-2’); 6,89 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-3’, H-5’);

6,87 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-2’’, H-5’’); 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’’’, H-6’’’);

6,77 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’); 6,73 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-4’’, H-6’’); 5,40

(1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-5a); 4,77 (1H, d, J = 4,0

Hz, H-4); 3,85 (1H, d, J = 15 Hz, H-5b); 3,79 (6H, s, OCH3).

13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 165,57 (C=O); 159,91 (C-3’’);

159,85 (C-4’); 156,94 (C-1’’’); 136,26 (C-1’’’); 129,91 (C-1’); 129,83 (C-5’’);

30

129, 12 (2C, C-3’’’, C-5’’’); 124,45 (C-6’); 121,86 (C-2’); 121,05 (C-4’’’);

120,81 (C-6’’); 115,50 (C-6’’’); 114,42 (C-2’’’); 114,04 (C-5’); 113,91 (C-3’);

113,71(C-4’’; 113,47 (C-2’’); 82,08 (C-3); 61,03 (C-4); 55,18 (1C, OCH3);

55,13 (1C, OCH3); 43,94 (C-5).

f). Hợp chất 9f: là chất lỏng

1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,20-7,26 (1H, m, H-5’’ ); 7,18 (2H,

d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-6’ ); 7,02 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-5’’’) 6,82 (4H, t, J = 8,5

Hz, H-3’, H-5’, H-4’’, H-6’’); 6,73 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- 4’’’); 6,70 (1H, dd, J

= 1,5 Hz, H- 2’’’ ); 6,68 (1H, s, H-2’’); 6,64 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’’’);

5,34 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,82 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,74 (1H, d, J =

4,0 Hz, H-4); 3,81 (1H, d, J = 14,5 Hz , H-5b); 3,76 (6H, s, OCH3).

13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 164,94 (C=O); 159,93 (C-3’’);

159,89 (C-4’); 157,41 (C-1’’’); 136,05 (C-1’’); 134,39 (C-3’’’); 129,91 (C-5’’’);

129,83 (C-1’); 129,80 (C-2’, C-6’); 124,02 (C-5’’); 122,05 (C-4’’’); 120,76 (C-

6’’); 115,98 (C-2’’’); 114,03 (C-4’’); 113,76 (C-3’, C-5’); 113,73 (C-6’’);

113,46 (C-2’’); 81,87 (C-3); 60,74 (C-4); 55,12 (C-OCH3); 43,98 (C-5).

31

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-LACTAM

Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

Phản ứng ete hóa các dẫn chất của phenol với este 2-brom metyl axetat

trong môi trƣờng Na2CO3 và DMF ở 140oC. Phản ứng đƣợc tiến hành ở nhiệt độ

này trong thời gian 4h. Tiếp theo, thực hiện phản ứng thủy phân trong môi

trƣờng NaOH 1N và dung môi là MeOH/H2O, ở nhiệt độ sôi trong thời gian 12

h nhận đƣợc các axit 3a, 3b với hiệu suất 70%, 50%. Hợp chất 3a, b đƣợc clo

hóa bởi tác nhân (COCl)2 trong dung môi CH2Cl2 và xúc tác DMF, thu đƣợc hợp

chất 4a, b (sơ đô 3.1).

Sơ đồ 3.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic

Tổng hợp dẫn xuất imine

Bƣớc tiếp theo là tổng hợp dẫn xuất imine. Dẫn xuất imine 8a,b thu đƣợc

nhờ phản ứng cộng nucleophin giữa dẫn xuất của benzylamin 6 và dẫn xuất

benzanđehit 7a-b trong môi trƣờng CH2Cl2 và một đƣơng lƣợng của Na2SO4.

Phản ứng đƣợc đun hồi lƣu trong thời gian 4h nhận đƣợc sản phẩm imine 8a-b

(sơ đồ 2.2)

Tổng hợp các dẫn xuất cis-β- lactam

Phản ứng tổng hợp hợp β-lactam đƣợc tiến hành khi cho imine 8a-c phản

ứng với các hợpchất ketene 5a-b, nhận đƣợc insitu khi các clorua axit phản ứng

với 1,5đƣơng lƣơng Et3N, thu đƣợc dẫn xuất β-lactam (cơ chế phản ứng tạo

thành ketene từ clorua axit đƣợc nêu trong sơ đồ 3.2) [15].

32

Sơ đồ 3.2. Cơ chế hình thành chất 5a,b

3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-β-LACTAM

Cấu trúc của các hợp chất cis-β-lactam đã đƣợc nghiên cứu bằng các

phƣơng pháp phổ

3.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9a

Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9a

Phổ proton của chất 9a có các tín hiệu cộng hƣởng dạng AB tại 7,41ppm

(2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’) và 6,72 ppm (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’, H-6’) đặc

trƣng cho nhân thơm thế brom ở vị trí para. Hai nhân thơm còn lại có các tín

hiệu cộng hƣởng tại 7,31-7,34 ppm (3H, m, H-4’’, H-2’’’, H-6’’’); 7,11-7,15

ppm (6H, m, H-2’’, H-3’’, H-5’’, H-6’’, H-3’’’, H-5’’’) và 6,89 ppm (1H, t, J =

7,0 Hz, H-4’’’. Ngoài ra trong phổ 1H NMR của dẫn chất 9a có tín hiệu cộng

hƣởng các proton của vòng lactam: H-3 (5,40 ppm) là doublet có hằng số tƣơng

33

tác J = 4,5 Hz, tín hiệu cộng hƣởng doublet của proton H-4 (4,70 ppm) với hằng

số J = 4,5 Hz khẳng định sản phẩm 9a là cis-β-lactam [9].

3.2.2. Phân tích phổ 1H –NMR của hợp chất 9b

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9b

Trong phổ1H NMR của dẫn chất 9b có hằng số tƣơng tác spin spin của

các H-3 và H-4 là 4,5 Hz, từ đó có thể khẳng định sản phẩm 9b là cis-β-lactam.

3.2.3. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9c

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9c

34

Tƣơng tự nhƣ vậy trong phổ1H NMR của dẫn chất 9c có hằng số tƣơng

tác spin spin của các H-3 và H-4 là 4,5 Hz, cho cho phép khẳng định sản phẩm

9c là cis-β-lactam.

3.2.4. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9d

Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9d

Trên phổ proton của chất 9d có các tín hiệu cộng hƣởng tại 3,77 ppm đặc

trƣng cho proton của nhóm OCH3 và tín hiệu cộng hƣởng dạng AB tại 7,20 ppm

(2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’); 7,17 ppm (2H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-2’, H-6’)

đặc trƣng cho nhân thơm thế nhóm OCH3 ở vị trí para. Hai nhân thơm còn lại có

các tín hiệu tại 7,29-7,32 ppm (3H, m, H-2’’’, H-6’’’, H-4’’); 7,11 ppm (2H, t, J

= 8,0 Hz, H-3’’’, H-5’’’); 6,86 ppm (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4’’’); 6,81 ppm (2H, d,

J = 8,5 Hz, H-2’’, H-6’’); 6,72 ppm (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’’, H-5’’). Ngoài ra,

Ngoài ra trong phổ 1H NMR của dẫn chất 9d có tín hiệu cộng hƣởng các proton

của vòng lactam: H-3 (5,37 ppm) là doublet có hằng số tƣơng tác J = 4,5 Hz, tín

hiệu cộng hƣởng doublet của proton H-4 (4,71 ppm) với hằng số J = 4,5 Hz

khẳng định sản phẩm 9d là cis-β-lactam

35

3.2.5. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9e

Trên phổ 1H NMR của dẫn chất 9e cũng có hằng số tƣơng tác spin spin là

4,5 Hz, cho cho phép khẳng định sản phẩm 9e là cis-β-lactam.

3.2.6. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9f

Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9f

36

Từ phổ 1H NMR của dẫn chất 9f cũng có hằng số tƣơng tác spin spin là

4,5 Hz, cho cho phép khẳng định sản phẩm 9f là cis-β-lactam.

Sản phẩm nhận đƣợc có độ chọn lọc lập thể cao, chỉ có mặt của cis-β-

lactam. Điều này có thể đƣợc giải thích nhờ hiệu ứng điện tử của các tác nhân

tham gia phản ứng. Các dẫn xuất β-lactam 9a-c đều là các β-lactam có chứa

nhóm thế là các hệ thơm đƣợc tổng hợp từ phản ứng giữa hợp chất imine

R2N=CHR

3 (R

1 và R

3 đều là các nhóm thế lớn với nhân thơm benzen) và dẫn

xuất ketene có gắn nhóm thế phenoxy ( R1). Chúng ta thấy rằng, tất cả các dẫn

xuất thu đƣợc đều tồn tại ở dạng cis-β-lactam với các nhóm thế lớn gắn với C-3

và C-4 ở phía sau, do hằng số tƣơng tác spin-spin của hai proton H-3 và H-4 có

hằng số bé (J = 4,5 Hz). Điều này đƣợc giải thích bởi sự điều khiển phản ứng

Staudinger qua hai giai đoạn với các phức chuyển tiếp (phức π và phức

σ)[15],[19].

Phức π phức σ

Khi các nhóm R1, R

2, R

3 đều là các nhóm giàu điện tử thì phức π hình

thành giữa ketene và imine ở dạng exo. Nhóm thế R1 và R

2 của imine là các

nhóm giàu điện tử giúp cho điện tích dƣơng trên nguyên tử nitơ đƣợc giải tỏa

làm cho phức σ bền hơn. Hơn nữa, nhóm R1 của ketene là nhóm phenoxy, đây

cũng là một nhóm giàu điện tử, làm cho dạng enolat ở phức σ tăng tính

nucleophin dẫn đến phức σ dễ dàng chuyển thành sản phẩm theo con đƣờng tạo

cis-β-lactam.

37

Mật độ điện tử của nhóm thế R1 của ketene đóng vai trò chính trong việc

hình thành cáccis-β-lactam hay trans-β-lactam [15], [19]. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi tiến hành tổng hợp các β-lactam từ các dẫn xuất ketene có gắn các

nhóm thế khác nhau (R1- là nhóm phenoxy- hoặc m-clophenoxy), thấy rằng khi

nhân thơm benzen của nhóm thế R1 giảm điện tử hơn do có nhóm thế clo thì sản

phẩm tạo thành vẫn là cis-β-lactam, có lẽ là nhóm này có hiệu ứng chƣa đủ

mạnh để ảnh hƣởng đến mât độ điện tử của phức phức σ trung gian, nên enolat

tạo thành có tính nucleophin mạnh xúc tiến phản ứng vòng hóa tạo thành vòng

lactam theo định hƣớng cis.

3.3. XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-MS

Đối với các loại máy HPLC-MS mà chúng tôi nghiên cứu, trong hệ thống

có hai detector: detector DAD và detector MS.

3.3.1. Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành đo phổ UV-Vis đối với các loại mẫu nghiên cứu trong

dung môi metanol và thu đƣợc kết quả nhƣ hình sau:

Hình 3.7. Phổ UV-Vis của hợp chất 9a

38

Hình 3.8. Phổ UV-Vis của hợp chất 9b

Hình 3.9. Phổ UV-Vis của hợp chất 9c

Hình 3.10. Phổ UV-Vis của hợp chất 9d

Từ các hình trên có thể nhận thấy các hợp chất 9a, 9b, 9c, và 9d đều có

hai cực đại hấp thụ vào khoảng 210 nm và 260 nm.

39

Cấu trúc các hợp chất 9a, 9b, 9c và 9d nhƣ hình vẽ sau:

Kí hiệu chất Công thức

9a

9d

9b

9c

Ta nhận thấy rằng, phân tử các hợp chất trên đều có vòng benzen. Mà

vòng benzen có các dải hấp thụ: λ=180nm; λ=203nm; λ=256nm. Và khi vòng

40

benzen có các nhóm thế có hiệu ứng +C thì các dải hấp thụ đƣợc chuyển về các

bƣớc sóng dài.

Mặt khác metanol lại có hai dải hấp thụ vào khoảng 150nm và 183nm. Vì

vậy chúng tôi đã chọn bƣớc sóng 260nm làm bƣớc sóng nghiên cứu.

3.3.2. Khảo sát phổ MS

Để chọn điều kiện cho bắn phá MS các hợp chất β-lactam theo phƣơng

pháp ESI, chúng tôi khảo sát cả hai chế độ positive và negative để thu đƣợc các

pic ion giả phân tử tƣơng ứng. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành khảo sát đối với

hợp chất 9c và thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Hình 3.11. Phổ MS positive của hợp chất 9c

41

Hình 3.12. Phổ MS negative của hợp chất 9c

Qua phổ MS ở trên ta thấy rằng với điều kiện chế độ Negative không có

mảnh ion giả phân tử phù hợp với hợp chất nghiên cứu; chế độ Positive thì cho

ta pic ion giả phân tử [2M+Na]+ = 810,10 phù hợp với công thức phân tử của

hợp chất 9c. Vậy chọn chế độ positive cho detector MS để nghiên cứu các hợp

chất 9a, 9b, 9d và đều thu đƣợc mảnh ion giả phân tử [2M+Na]+ tƣơng ứng với

từng hợp chất nghiên cứu (phụ lục 25, 26, 31, 32, 34, 35).

3.3.3. Khảo sát chƣơng trình dung môi cho quá trình sắc ký

Từ việc nghiên cứu tài liệu [8], chúng tôi nhận thấy rằng việc phân tích

các đồng phân quang học có một tâm bất đối bằng các điều kiện dung môi, cột

tách thông thƣờng là rất khó. Nhƣng những phân tử nghiên cứu có hai trung tâm

bất đối thì việc phân tích trở nên dễ dàng. Do đó chúng tôi tiến hành phân tích

các đồng phân bằng gradient pha động và tiến hành khảo sát các gradient bằng

cách tăng % kênh B (giảm độ phân cực của pha động) theo bảng sau:

Bảng 3.2.1. Bảng thay đổi thành phân pha động trong các gradient

Min

Gradient

Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

%B %B %B

0

5

6

10

15

16

17

30

5

20

20

50

70

100

100

100

15

30

30

50

100

100

100

100

20

30

60

80

100

100

100

100

Chúng tôi sử dụng 3 loại gradient: Gradient 1, gradient 2, và gradient 3

trên mẫu 9c và thu đƣợc các kết quả sau:

42

Hình 3.13.Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1

Hình 3.14.Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2

Hình 3.15.Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3

43

Từ các sắc ký đồ ta thấy rằng, khi giảm độ phân cực của pha động, sẽ làm

giảm thời gian lƣu, và làm giảm khả năng tách chất. Điều đó có thể giải thích là

do, các chất nghiên cứu đều là các chất kém phân cực, nếu ta làm giảm độ phân

cực sẽ làm giảm thời gian lƣu. Từ kết quả trên chúng tôi chọn gradien 1để

nghiên cứu và phân tích các chất.

3.4.4. Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký.

a. Kết quả phân tích hợp chất 9a

Chúng tôi áp dụng các điều kiện đã khảo sát đƣợc ở trên và tiến hành

phân tích hợp chất 9a và thu đƣợc kết quả sắc đồ nhƣ sau:

Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a

Kết quả về diện tích pic:

Trên sắc kí đồ píc 1 có tR = 22,319 phút có phổ khối lƣợng với píc ion giả

phân tử là 839,0 tƣơng ứng với [M+M+Na]+ (hình 3.17).

44

Hình 3.17: Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a)

Pic 2 có thời gian lƣu 24,124 phút cũng có píc ion giả phân tử là 839,6

tƣơng ứng với [M+M+Na]+ (hình 3.18) Khẳng định pic 1 và pic 2 là hai đồng

phân lập thể dạng cis và trans với dạng cis là chiếm ƣu thế (cấu dạng cis đã đƣợc

chứng minh bằng phổ NMR).

Hình 3.18: Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a)

Từ đó có thể thấy rằng phƣơng pháp HPLC cho phép tách và phân tích hai

đồng phân cis và trans của hợp chất beta-lactam 9a. Từ đó ta tính đƣợc độ chọn

lọc lập thể của hợp chất 9a là:

% as % as

% as % as

di teroisomerA di teroisomerBde

di teroisomerA di teroisomerB

45

de= .100% = 97,6128%

b. Kết quả phân tích hợp chất 9b

Đối với hợp chất 9b khi phân tích bằng máy HPLC chúng tôi thu đƣợc sắc

đồ:

Hình 3.19. Sắc ký đồ của hợp chất 9b

Kết quả về diện tích pic:

Tƣơng tự hợp chất 9b cũng đƣợc tách và phân tích bằng phƣơng pháp

HPLC, kết quả phân tích thu đƣợc độ chọn lọc lập thể là: de = 96,6672 %

c. Kết quả phân tích hợp chất 9c

Sắc đồ của hợp chất 9c khi phân tích bằng máy HPLC:

46

Hình 3.20. Sắc ký đồ của hợp chất 9c

Diện tích pic tƣơng ứng:

Tƣơng tự hợp chất 9c cũng đƣợc tách và phân tích bằng phƣơng pháp

HPLC, kết quả phân tích thu đƣợc độ chọn lọc lập thể là de = 96,7716 %

47

d. Kết quả phân tích hợp chất 9d

Sắc ký đồ của hợp chất 9d

Hình 3.21. Sắc ký đồ của hợp chất 9d

Diện tích pic tƣơng ứng:

Tƣơng tự hợp chất 9d cũng đƣợc tách và phân tích bằng phƣơng pháp

HPLC, kết quả phân tích thu đƣợc độ chọn lọc lập thể là de = 96,3116 %

Tóm lại, phƣơng pháp HPLC đã đƣợc sử dụng hiệu quả để tách các đồng

phân lập thể cis –trans của các hợp chất beta-lactam 9a-d. Các chất này có độ

chọn lọc lập thể rất cao (de = 96,3116 – 97,6128 %). Nhƣ vậy, tổng hợp beta-

lactam theo phƣơng pháp Staudinger sử dụng các nhóm giàu điện tử, cho phép

nhận đƣợc sản phẩm với độ chọn lọc lập thể cao (de ~ 97%).

48

KẾT LUẬN

1. Tổng hợp chọn lọc lập thể thành công 6 dẫn xuất cis-β-lactam: 9a, 9b, 9c, 9d,

9e, 9f bằng phƣơng pháp Staudinger với việc sử dụng các nhóm thế giàu điện

tử.

2. Cấu trúc các dẫn xuất của cis β-lactam đƣợc chứng minh bằng phƣơng pháp

1H-NMR và

13C-NMR qua việc so sánh hằng số J của hai H liền kề.

3. Bằng phƣơng pháp HPLC đã tách đƣợc các đồng phân cis và trans β-lactam.

4. Bằng phƣơng pháp HPLC đã xác định độ chọn lọc lập thể (de) của của các

hợp chất β-lactam 9a-d tƣơng ứng là: 97,6128; 96,6672 ; 96,7716 và 96,3116

%.

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Trang web

[1]. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/

[2]. http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10073251&locale=en_US

[3]. http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/VirtTxtJml/Spectrpy/nmr/nmr1.htm

II. Tài liệu tham khảo tiếng Việt

[4]. Nguyễn Hữu Đĩnh – Trần Thị Đà, Ứng dụng một số phƣơng pháp phổ nghiên cứu

cấu trúc phân tử (1999), Nhà xuất bản giáo dục.

[5]. Nguyễn Kim Phi Phụng, Khối Phổ lý thuyết – bài tập – bài giải (2004), Nhà xuất

bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.

[6]. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ lý thuyết – bài

tập phổ - bài giải (2005), Nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.

[7]. Phạm Thị Thắm , Phạm Thế Chính, Hoàng Thị Phƣơng, Phạm Anh Tuân, Đặng

Thị Tuyết Anh, Ngô Thị Thuận, Nguyễn Văn Tuyến, Tạp chí hóa học (số 4B tập

50, 2012)

[8]. Nguyễn Văn Tuyến, Hóa học hữu cơ nâng cao – Các phƣơng pháp tổng hợp hữu

cơ hiện đại (2012), Nhà xuất bản khoa học và ky thuật.

III. Tài liệu tham khảo tiếng Anh

[9]. Ahmed Abouabdellah, Jean-Pierre Bégué, Danièle Bonnet-Delpon, Truong

Thi Thanh Nga. J.Org.Chem.,62, 8826-8833, 1997

[10]. Brady, W. T.; Gu, Y. Q. J. Org. Chem. 1989, 54, 2838.

[11]. (a) Cossio, F. P.; Ugalde, J. M.; Lopez, X.; Lecea, B.; Palomo, C. J. Am. Chem.

Soc. 1993, 115, 995. (b) Arrieta, A.; Lecea, B.; Cossìo, F. P. J. Org. Chem. 1998,

63, 5869.

[12]. For a selection of recent reviews on the biological activity of β-lactams, see: (a)

von Nussbaum, F.; Brands, M.; Hinzen, B.; Weigand, S.; Ha ¨bich, D. Angew.

Chem., Int. Ed. 2006, 45, 5072. (b) Singh, G. S. Mini-Re . Med. Chem. 2004, 4, 69.

(c) Singh, G. S. Mini-Re . Med. Chem. 2004, 4, 93. (d) Buynak, J. D. Curr. Med.

Chem. 2004, 11, 1951. (e) Veinberg, G.; Vorona, M.; Shestakova, I.; Kanepe, I.;

Lukevics, E. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 1741. (f) Kidwai, M.; Sapra, P.;

Bhushan, K. R. Curr. Med. Chem. 1999, 6, 195

[13]. For selected reviews on the “β-lactam synthon method”, see: (a) Alcaide, B.;

Almendros, P.; Aragoncillo, C. Chem. Re . 2007, 107, 4437. (b) Deshmukh,

A.R.A.S.; Bhawal, B. M.; Krishnaswamy, D.; Govande, V. V.; Shinkre, B. A.;

50

Jayanthi, A. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 1889. (c) Alcaide, B.; Almendros, P.

Curr. Med. Chem. 2004, 11, 1921. (d) Ojima, I. F.; Delaloge, F Chem. Soc. Re

1997, 26, 377.

[14]. For some previous general reviews on the topic, see: (a) Coates, C.; Kabir, J.;

Turos, E. Sci. Synth. 2005, 21, 609. (b) Walton, J. C. Top. Curr. Chem. 2006, 264,

163. (c) Singh, G. S. Tetrahedron 2003, 59, 7631. (d) Magriotis, P. A. Angew.

Chem., Int. Ed. 2001, 40, 4377. (e) Go `mez-Gallego, M.; Manchen ˜o, M. J.;

Sierra, A. M. Tetrahedron 2000, 56, 5743. (f) Barrett, A. G. M.; Sturgess, M. A.

Tetrahedron 1988, 44, 5615.

[15]. Hashim Mahamed; Bimal K. Banik. Heteroletters special issue,1, 23-26, 2011

[16]. Hegedus, L. S.; Montgomery, J.; Narukawa, Y.; Snustad, D. C. J. Am. Chem.

Soc. 1991, 113, 5784.

[17]. Hu, L.; Wang, Y.; Li, B.; Du, D.-M.; Xu, J. Tetrahedron 2007, 63, 9387.

[18]. Kirmse, W.; Rondan, N. G.; Houk, K. N. J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 7989.

[19]. Lei Jiao, Yong Liang; Jiaxi Xu. J.AM.Chem.Soc., 128, 6060-6069, 2006

[20]. Li, B.; Wang, Y.; Du, D.-M.; Xu, J. J. Org. Chem. 2007, 72, 990.

[21]. Liang, Y.; Jiao, L.; Zhang, S.; Xu, J. J. Org. Chem. 2005, 70, 334.

[22]. Pacansky, J.; Chang, J. S.; Brown, D. W.; Schwarz, W J. Org. Chem. 1982, 47,

2233.

[23]. Shaikh, A. L.; Puranik, V. G.; Deshmukh, A. R. A. S. Tetrahedron Lett. 2006,

5993.

[24]. Sharma, A. K.; Kumar, R. S.; Mahajan, M. P. Heterocycles 2000, 52, 603.

[25]. Sordo, J. A.; Gonzalez, J.; Sordo, T. L. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 6249.

[26]. Staudinger, H. Justus Liebigs Ann. Chem. 1907, 356, 51.

[27]. Wang, Y.; Liang, Y.; Jiao, L.; Du, D. M.; Xu, J. J. Org. Chem. 2006, 71, 6983.

[28]. Weatherwax, A.; Abraham, C. J.; Lectka, T. Org. Lett. 2005, 7, 3461.

51

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: PHỔ 13

C CỦA HỢP CHẤT 9a

PHỤ LỤC 2: PHỔ 1H CỦA HỢP CHẤT 9a

PHỤ LỤC 3: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9a

PHỤ LỤC 4: PHỔ 13

C CỦA HỢP CHẤT 9b

PHỤ LỤC 5: PHỔ 1H CỦA HỢP CHẤT 9b

PHỤ LỤC 6: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9b

PHỤ LỤC 7: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9b

PHỤ LỤC 8: PHỔ 1H CỦA HỢP CHẤT 9c

PHỤ LỤC 9: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9c

PHỤ LỤC 10: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9c

PHỤ LỤC 11: PHỔ 13

C CỦA HỢP CHẤT 9d

PHỤ LỤC 12: PHỔ 1H CỦA HỢP CHẤT 9d

PHỤ LỤC 13: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9d

PHỤ LỤC 14: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9d

PHỤ LỤC 15: PHỔ 13

C CỦA HỢP CHẤT 9e

PHỤ LỤC 16: PHỔ 1H CỦA HỢP CHẤT 9e

PHỤ LỤC 17: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9e

PHỤ LỤC 18: PHỔ 13

C CỦA HỢP CHẤT 9f

PHỤ LỤC 19: PHỔ 1H CỦA HỢP CHẤT 9f

PHỤ LỤC 20: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9f

PHỤ LỤC 21: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9f

PHỤ LỤC 22: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9f

PHỤ LỤC 23: PHỔ GIÃN 1H CỦA HỢP CHẤT 9f

PHỤ LỤC 24: SẮC KÝ ĐỒ CỦA HỢP CHẤT 9a

PHỤ LỤC 25: PHỔ KHỐI CỦA PIC 1 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9a

PHỤ LỤC 26: PHỔ KHỐI CỦA PIC 2 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9a

PHỤ LỤC 27: SẮC KÝ ĐỒ CỦA HỢP CHẤT 9b

PHỤ LỤC 28: PHỔ KHỐI CỦA PIC 1 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9b

PHỤ LỤC 29: PHỔ KHỐI CỦA PIC 2 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9b

PHỤ LỤC 30: SẮC KÝ ĐỒ CỦA HỢP CHẤT 9c

PHỤ LỤC 31: PHỔ KHỐI CỦA PIC 1 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9c

PHỤ LỤC 32: PHỔ KHỐI CỦA PIC 2 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9c

PHỤ LỤC 33: SẮC KÝ ĐỒ CỦA HỢP CHẤT 9d

PHỤ LỤC 34: PHỔ KHỐI CỦA PIC 1 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9d

PHỤ LỤC 35: PHỔ KHỐI CỦA PIC 2 KHI PHÂN TÍCH HỢP CHẤT 9d