BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Sao Mai

ỨNG DỤNG HPLC ĐỂ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ XỬ LÝ

AMOXICILLIN VÀ NORFLOXACIN BẰNG VẬT LIỆU

TiO2/SBA-15 TRONG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung

thực, chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào và hoàn toàn không có sự

sao chép hoặc sử dụng kết quả của đề tài nghiên cứu nào tương tự. Mọi sự

giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn, các thông tin trích

dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc rõ ràng và được phép công bố.

Tôi xin chịu trách nhiệm với công trình nghiên cứu này.

Hà Nội, tháng 06 năm 2020

Tác giả luận văn

Nguyễn Sao Mai

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và tri ân sâu sắc đối với

TS. Nguyễn Thành Đồng và TS. Nguyễn Thị Thu Trang đã tạo điều kiện tốt

nhất cho tôi để có cơ hội được tiếp cận với nghiên cứu khoa học và nhiệt tình

định hướng cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt

là các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy các chuyên đề của toàn khóa học đã tạo

điều kiện, đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ khoa học và công nghệ (Nhiệm vụ khoa

học và công nghệ theo nghị định thư, mã số NĐT.59.GER/19) đã hỗ trợ kinh

phí cho tôi trong việc thực hiện luận văn.

Có được công trình nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập

thể những người bạn, những người anh và chị là đồng nghiệp phòng Giải

pháp công nghệ cải thiện môi trường – Viện công nghệ môi trường đã hết

lòng giúp đỡ, đóng góp và chỉ bảo tôi những kiến thức chuyên môn vô cùng

quý báu.

Bên cạnh đó, công lao không thể thiếu khi kể đến góp phần không nhỏ

trong quá trình tôi thực hiện luận văn thạc sỹ đó chính là nguồn năng lượng

sống từ gia đình và bạn bè tôi. Tôi muốn nói lời cảm ơn tới gia đình vì đã

chăm sóc, động viên tôi cả về thể chất lẫn tinh thần, luôn mang cho tôi những

động lực cố gắng.

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC ......................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4

1.1.TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH ......................................................... 4

1.1.1. Khái niệm về kháng sinh ................................................................. 4

1.1.2. Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam ..................................... 5

1.1.3. Tổng quan về kháng sinh Norfloxacin ............................................ 7

1.1.4. Tổng quan về kháng sinh Amoxicillin .......................................... 10

1.2.TỔNG QUAN VỀ NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN ................................... 13

1.3.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NORFLOXACIN VÀ

AMOXICILLIN .......................................................................................... 16

1.3.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis ........................ 16

1.3.2. Phương pháp điện hóa ................................................................... 17

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản ..................................................... 18

1.4.TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG

CAO ... ......................................................................................................... 21

1.4.1. Cơ sở lý thuyết và khái niệm ........................................................ 21

1.4.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ................................................... 22

1.4.3. Cấu tạo của hệ thống HPLC .......................................................... 22

1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của HPLC .............................................. 25

1.5.TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU TiO2/SBA-15 ...................................... 30

ii

1.5.1. Giới thiệu chung về vật liệu TiO2/SBA-15 ................................... 30

1.5.2. Ứng dụng của TiO2/SBA-15 trong xử lý môi trường ................... 32

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

......................................................................................................................... 33

2.1.MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .................................................................. 33

2.2.ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................... 33

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 33

2.2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 33

2.3.THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT .............................................. 33

2.3.1. Thiết bị .......................................................................................... 33

2.3.2. Dụng cụ ......................................................................................... 35

2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn ..................................................................... 36

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 38

2.4.1. Chuẩn bị mẫu ................................................................................ 38

2.4.2. Khảo sát bước sóng phát hiện chất ............................................... 38

2.4.3. Qui trình vận hành hệ thống HPLC .............................................. 38

2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ưu hóa hệ thống sắc ký ............................. 39

2.4.2. Thẩm định phương pháp ............................................................... 41

2.4.3. Khảo sát quy trình xử lý Norfloxacin và Amoxicillin bằng vật liệu

TiO2/SBA-15 ........................................................................................... 46

2.4.4. Ứng dụng vật liệu TiO2/SBA-15 để xử xý kháng sinh Norfloxacin

và Amoxicillin trong nước thải bệnh viện .............................................. 47

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 50

3.1.KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH SẮC KÝ ...................... 50

3.1.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu ...... 50

iii

3.1.2. Pha tĩnh và thể tích vòng mẫu ....................................................... 51

3.1.3. Khảo sát thành phần pha động ...................................................... 51

3.1.4. Khảo sát tỷ lệ pha động ................................................................. 55

3.1.5. Khảo sát tốc độ dòng ..................................................................... 57

3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................................... 59

3.2.1. Độ đặc hiệu ( Tính chọn lọc ) ....................................................... 59

3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống .......................................................... 60

3.2.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ..................... 61

3.2.4. Khoảng tuyến tính ......................................................................... 62

3.2.5. Độ chụm ........................................................................................ 65

3.2.6. Độ đúng ......................................................................................... 70

3.3. KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ KHÁNG SINH NORFLOXACIN

VÀ AMOXICILLIN BẰNG VẬT LIỆU TIO2/SBA-15 ................................

................................................................................................................. 72

3.3.1. Khảo sát hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 ................................... 72

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất tham gia phản ứng .................. 75

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng .................................. 76

3.3.4. Độ ổn định của chất xúc tác .......................................................... 78

3.4. ỨNG DỤNG VẬT LIỆU VẬT LIỆU TiO2/SBA-15 ĐỂ XỬ LÝ

NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN CHỨA KHÁNG SINH NORFLOXACIN VÀ

AMOXICILLIN .......................................................................................... 79

3.4.1. Quy trình hệ thí nghiệm ................................................................ 79

3.4.2. Xác nhận giá trị sử dụng ............................................................... 81

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 86

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học [2] ....................... 4

Bảng 1.2 Đặc tính chung của nước thải bệnh viện ......................................... 14

Bảng 2.1 Sự khác nhau giữa độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lặp ..... 44

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát 6 hệ pha động ....................................................... 55

Bảng 3.2 Các tỷ lệ khảo sát pha động ............................................................. 56

Bảng 3.3 Tính thích hợp của hệ thống đối với Norfloxacin và Amoxicillin .. 60

Bảng 3.4 Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp NOR và AMOX

trước khi tiêm vào hệ thống HPLC ................................................................. 62

Bảng 3.5 Chiều cao peak tương ứng với nồng độ của Norfloxacin và

Amoxicillin trong dãy chuẩn ........................................................................... 63

Bảng 3.6 Phương trình hồi quy của Norfloxacin và Amoxicillin ................... 65

Bảng 3.7 Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu lặp Norfloxacin ................................................................................. 66

Bảng 3.8 Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu lặp Amoxicillin ................................................................................. 67

Bảng 3.9 Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu tái lặp Norfloxacin ............................................................................ 68

Bảng 3.10 Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu tái lặp Amoxicillin ............................................................................ 69

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với Norfloxacin ....... 71

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với Amoxicillin ....... 71

Bảng 3.13 Kết quả phân tích độ lặp lại đối với mẫu nước thải bệnh viện chứa

kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin trước và sau khi xử lý bằng vật liệu

TiO2/SBA-15 ................................................................................................... 82

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Norfloxacin .................................................... 8

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Amoxicillin .................................................. 11

Hình 1.3 Hệ thống cấu tạo HPLC ................................................................... 22

Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống HPLC và sắc đồ tách ............................................... 26

Hình 1.5 Giản đồ vè sự tách của hai pic sắc ký A và B .................................. 29

Hình 1.6 Sự cân đối của pic HPLC ................................................................. 30

Hình 3.1 Phổ hấp thụ cực đại của Norfloxacin và Amoxicillin ...................... 50

Hình 3.2 Sắc ký đồ hệ PD1 ............................................................................. 52

Hình 3.3 Sắc ký đồ hệ PD2 ............................................................................. 52

Hình 3.4 Sắc ký đồ hệ PD3 ............................................................................. 53

Hình 3.5 Săc ký đồ hệ PD4 ............................................................................. 53

Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ PD5 ............................................................................. 54

Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ PD6 ............................................................................. 54

Hình 3.8 Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động ................................................. 56

Hình 3.9 Sắc ký đồ thể hiện tín hiệu chất AMOX và NOR với tốc độ dòng

thay đổi ............................................................................................................ 58

Hình 3.10 Sắc ký đồ nền mẫu trắng (không chứa chất phân tích) .................. 59

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng (chứa chất phân tích) .................................... 59

Hình 3.12 Sắc ký đồ giới hạn phát hiện của Amoxicillin và Norfloxacin ...... 61

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao peak vào nồng độ của

Norfloxacin ...................................................................................................... 64

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao peak vào nồng độ của

Amoxicillin ...................................................................................................... 64

Hình 3.15 Ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 đến hiệu quả xử

lý Amoxicillin ................................................................................................. 73

vi

Hình 3.16 Ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 đến hiệu quả xử

lý Norfloxacin ................................................................................................. 74

Hình 3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng Norfloxacin đến hiệu quả xử lý của vật

liệu xúc tác TiO2/SBA-15 ............................................................................... 75

Hình 3.18 Ảnh hưởng của hàm lượng Amoxicillin đến hiệu quả xử lý của vật

liệu xúc tác TiO2/SBA-15 ............................................................................... 76

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu quả xử lý Norfloxacin

......................................................................................................................... 77

Hình 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu quả xử lý Amoxicillin

......................................................................................................................... 77

Hình 3.21 Độ ổn định của chất xúc tác TiO2/SBA-15 trong hiệu quả xử lý

Norfloxacin và Amoxicillin ............................................................................ 78

Hình 3.22 Quy trình xử lý kháng sinh NOR và AMOX trên nền mẫu thực

bằng vật liệu TiO2/SBA-15 ............................................................................. 80

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu nước thải thêm chuẩn NOR và AMOX (10 mg/L)

trước khi xử lý bằng vật liệu TiO2/SBA-15 .................................................... 81

Hình 3.24 Sắc ký đồ mẫu nước thải thêm chuẩn NOR và AMOX sau khi xử lý

bằng vật liệu TiO2/SBA-15 ............................................................................. 81

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ

viết tắt Tên tiếng Việt

Tên tiếng Anh hoặc

tên khoa học

AAO Kỵ khí – Thiếu khí – Hiếu khí Anerobic – Anoxic – Oxic

ACN Acetonitril Acetonitrile

AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích

chính thống

Association of Official

Analytical Chemists

AMOX Amoxicillin Amoxicillin

BOD Lượng oxy hòa tan Biochemical Oxygen Demand

C Nồng độ Concentration

CIP Ciprofloxacin Ciprofloxacin

COD Nhu cầu oxy hóa học Chemical Oxygen Demand

CV Hệ số biến thiên Coefficient of Variation

DDD

Liều trung bình duy trì hằng

ngày với chỉ định chính của một

thuốc

Defined Daily Dose

HCl Axit Clohydric Hydrochloric Acid

Hpeak Chiều cao peak sắc kí Height

H3PO4 Axit Phosphoric Phosphoric Acid

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid

Chromatography

viii

Chữ

viết tắt Tên tiếng Việt

Tên tiếng Anh hoặc

tên khoa học

IUPAC

Danh pháp hóa học theo liên

minh Quốc tế về Hóa học

thuần túy và Hóa học ứng

dụng

International Union of Pure and

Applied Chemistry

KCl Kali clorua Potassium Chloride

KH2PO4 Dikali photphat

Potassium

Dihydrogenphosphate

LOD Giới hạn phát hiện Limit of Detection

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

mAU Milli-Absorbance units Đơn vị độ hấp thụ

NaOH Natri hiđroxit Sodium hydroxide

NOR Norfloxacin Norfloxacin

PPCPs Dược phẩm và các sản phẩm

chăm sóc cá nhân

Pharmaceuticals and personal

care products

ppm Phần triệu Part per million

Rs Độ phân giải Resolution

R % Độ thu hồi Recovery

RSD Độ lệch chuẩn tương đối Relative standard deviation

SD Độ lệch chuẩn Standard Deviation

T Thời gian Time

ix

Chữ

viết tắt Tên tiếng Việt

Tên tiếng Anh hoặc

tên khoa học

Tf Hệ số kéo đuôi Tailing Factor

TSS Tổng chất rắn lơ lửng Turbidity & Suspendid Solids

UV Tia cực tím hay tia tử ngoại Ultraviolet

UV-Vis Phổ tử ngoại và khả kiến Ultraviolet-Visible

V Thể tích Volume

Xtb Gía trị trung bình The average value

1

MỞ ĐẦU

Trong các loại dược phẩm, kháng sinh là loại thuốc phổ biến không

những được sử dụng rộng rãi trong các ngành trồng trọt, chăn nuôi gia súc,

gia cầm và thủy sản mà còn để điều trị các loại bệnh nhiễm khuẩn ở con

người như nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường hô hấp và các

bệnh lây truyền qua đường tình dục. Đó là những loại bệnh phổ biến ở con

người, là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tỉ lệ mắc và tử vong cao ở các nước

đang phát triển. Việc kiểm soát những loại bệnh này đã và đang chịu sự tác

động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng sinh của vi khuẩn

dẫn đến việc sử dụng các loại thuốc kháng sinh ngày càng gia tăng, đặc biệt là

tại các cơ sở bệnh viện.

Nước thải bệnh viện là một trong những mối quan tâm, lo ngại sâu sắc

đối với các nhà quản lý môi trường và xã hội vì chúng có thể gây ô nhiễm môi

trường nghiêm trọng và nguy hiểm đến đời sống của con người. Hầu hết các

loại kháng sinh được sử dụng ở người và thải ra môi trường bằng nhiều hình

thức khác nhau như bài tiết, tồn đọng hàm lượng kháng sinh trong các dụng

cụ, bông, băng y tế… điều này đã góp phần không nhỏ vào sự tồn dư trong

nước thải. Các thuốc điều trị bệnh sau khi có tác dụng trong cơ thể sẽ bài tiết

ra khỏi cơ thể qua phân hoặc nước tiểu dưới dạng hỗn hợp của những chất

chưa bị chuyển hóa. Trong môi trường tự nhiên, chúng có thể bị phân hủy

sinh học, bị khoáng hóa, hấp phụ vào bùn hoặc vẫn tồn tại trong nước thải và

cuối cùng đi vào nguồn nước tiếp nhận. Mặt khác, trên thị trường có một số

loại thuốc kháng sinh khá bền, khó phân hủy nên sự tồn dư, có mặt lâu dài của

nó trong môi trường nước sẽ ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật và những vấn đề

khác. Vì vậy, việc kiểm soát tồn dư kháng sinh trong nước thải tại các cơ sở

bệnh viện là hoàn toàn thiết yếu đối với Việt Nam nói riêng và toàn cầu nói

chung.

Norfloxacin và Amoxicillin là hai loại kháng sinh được sử dụng phổ

biến tại Việt Nam. Norfloxacin thuộc nhóm kháng sinh Fluoroquinolone, có

tác dụng chủ yếu điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu và viêm tuyến

tiền liệt. Ở dạng dung dịch tra mắt, Norfloxacin được dùng trong điều trị viêm

2

kết mạc, viêm mi mắt, viêm sụn mi nhiễm khuẩn… Nghiên cứu của Dương

Hồng Anh và cộng sự đã phát hiện kháng sinh Ciprofloxacin (CIP) và

Norfloxacin (NOR) trong nước thải tại 6 bệnh viện lớn của Hà Nội với nồng

độ từ 900 – 17,000 ng/L, đây cũng là loại kháng sinh được sử dụng nhiều ở

các đầm nuôi tôm. Amoxicilin thuộc nhóm Beta lactam, là kháng sinh hữu ích

trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm trùng da, nhiễm

trùng đường tiết niệu và một số loại bệnh khác. Amoxicilin được phát hiện

vào năm 1958, được sử dụng vào năm 1972 và nằm trong danh sách các loại

thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới, hay nhóm các loại thuốc hiệu quả

và an toàn nhất cần thiết trong một hệ thống y tế. Đây là một trong những loại

kháng sinh được kê toa phổ biến ở trẻ em. Do tốc độ trao đổi chất thấp và khả

năng phân hủy sinh học kém nên nó thường được phát hiện không chỉ trong

nước thải mà còn trong nước mặt và các môi trường khác, có thể dẫn đến tình

trạng kháng kháng sinh. Từ đó, mầm bệnh ngày càng kháng thuốc, gây ra mối

đe dọa lớn đối với các sinh vật và sức khỏe của con người thông qua nước

uống hoặc chuỗi thức ăn. Các hệ thống phân hủy kháng sinh bằng quang xúc

tác dưới tia cực tím, sắt hóa trị không có kích thước nano với H2O2, xử lý

bằng Fenton điện hóa, lưu huỳnh hoạt hóa nhiệt và chiếu xạ tia gamma đã

được triển khai để loại bỏ Norfloxacin và Amoxicilin. Tuy nhiên, những

phương pháp này còn tồn tại những nhược điểm như tiêu thụ năng lượng cao,

hiệu quả xử lý thấp và không thân thiện với môi trường. Bên cạnh đó, các

phương pháp để phân tích đồng thời Amoxicillin và Norfloxacin còn rất ít.

Trong thập kỷ qua, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện để

loại bỏ Norfloxacin và Amoxicillin trong nước thải. Tại Việt Nam, một số

nghiên cứu loại bỏ Amoxicillin và Norfloxacin bằng các vật liệu oxy hóa tiên

tiến đã được thực hiện trong nước thải, tuy nhiên các nghiên cứu đa số đều

thực hiện ở các nhóm kháng sinh cùng họ hoặc các loại kháng sinh riêng biệt.

Vì vậy, việc phát triển các vật liệu xúc tác để nghiên cứu loại bỏ kháng sinh

đa dạng nhóm và ứng dụng các phương pháp phân tích hiện đại nhằm phát

hiện lượng tồn dư còn lại trong nước thải là điều thực sự cần thiết, đóng góp

không nhỏ trong việc định hướng phát triển và bảo vệ môi trường một cách

bền vững.

3

Xuất phát từ những lý do trên và dựa vào tình hình thực tế thông qua cơ

sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước được công bố, tôi đã tiến

hành nghiên cứu đề tài: ‘‘Ứng dụng HPLC để đánh giá hiệu quả xử lý

Amoxicilin và Norfloxacin bằng vật liệu TiO2/SBA-15 trong nước thải

bệnh viện’’ với mục tiêu:

- Đưa ra quy trình phân tích Norfloxacin và Amoxicillin bằng HPLC;

- Trên cơ sở kết quả phân tích thu được, đánh giá hiệu quả xử lý

Norfloxacin và Amoxicillin bằng vật liệu TiO2/SBA-15.

Bố cục luận văn bao gồm:

- Mở đấu (3 trang)

- Chương 1: Tổng quan tài liệu (29 trang)

- Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (17 trang)

- Chương 3: Kết quả và thảo luận (34 trang)

- Kết luận và kiến nghị (2 trang)

- Tài liệu tham khảo (3 trang)

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH

1.1.1. Khái niệm về kháng sinh

Từ khi phát hiện ra kháng sinh Penicilline đến nay, hàng trăm loại

kháng sinh và các thuốc tương tự đã được phát minh và đưa vào sử dụng. Sự

ra đời của kháng sinh đã đánh dấu kỷ nguyên phát triển mới của y học về điều

trị các bệnh nhiễm khuẩn [1].

Kháng sinh (Antibiotics) là những chất kháng khuẩn (Antibacterial

substances) được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm,

Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [2].

Hiện nay từ “kháng sinh” được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có

nguồn gốc tổng hợp như các Sulfonamide và Quinolone. Có rất nhiều loại

kháng sinh và nhiều cách phân loại kháng sinh khác nhau. Tuy nhiên các

kháng sinh thường được phân loại theo cấu trúc hóa học, từ đó chúng có

chung một cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn tương tự nhau.

Mặt khác, trong cùng một nhóm kháng sinh, tính chất dược động học

và sự dung nạp cũng như phổ kháng khuẩn thường khác nhau, vì vậy cũng

cần phân biệt các kháng sinh trong cùng một nhóm. Bảng 1.1 thể hiện cách

phân loại kháng sinh phổ biến nhất:

Bảng 1.1 Bảng phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học [2]

STT Tên nhóm Phân nhóm

1 Beta-lactam Các Penicillin

Các Cephalosporin

Các Beta-lactam khác

Carbapenem

Monobactam

Các chất ức chế Beta-lactamase

2 Aminoglycosid

5

STT Tên nhóm Phân nhóm

3 Macrolid

4 Lincosamid

5 Phenicol

6 Tetracylin Thế hệ 1

Thế hệ 2

7 Peptid Glycopeptid

Polypetid

Lipopeptid

8 Quinolon Thế hệ 1

Các Fluoroquinolon: Thế hệ 2, 3, 4

9 Các nhóm kháng sinh khác

Sulfonamid

Oxazolidinon

5-nitroimidazol

1.1.2. Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam

Thuốc kháng sinh có lẽ là những họ thuốc thành công nhất của dược

phẩm. Cho đến nay, thuốc kháng sinh đã được nghiên cứu phát triển vô cùng

mạnh mẽ để phục vụ cải thiện sức khỏe con người. Bên cạnh ứng dụng trong

việc chữa trị và phòng bệnh cho con người, thuốc kháng sinh cũng đã được sử

dụng để ngăn ngừa và điều trị cho động vật, thực vật cũng như đối với việc

thúc đẩy tăng trưởng trong chăn nuôi gia súc. Tất cả các hoạt động trên sẽ

phát thải số lượng lớn dư lượng chất kháng sinh vào hệ sinh thái. Cũng giống

như kim loại nặng, thuốc kháng sinh là những hợp chất tự nhiên có trong các

hệ sinh thái khác nhau. Tuy nhiên, con người khi sử dụng thuốc kháng sinh đã

làm tăng khả dụng sinh học của chúng, dẫn đến những thay đổi lớn trong hệ

sinh thái, làm hệ sinh thái bị ô nhiễm. Khác với các kim loại nặng, hậu quả

của ô nhiễm kháng sinh đối với hệ sinh thái còn chưa được chú ý tới [3].

6

Theo kết quả khảo sát về việc bán thuốc kháng sinh ở các hiệu thuốc

vùng nông thôn và thành thị các tỉnh phía Bắc cho thấy nhận thức về kháng

sinh và kháng kháng sinh của người bán thuốc và người dân còn thấp đặc biệt

là ở vùng nông thôn. Trong tổng số 2953 nhà thuốc được điều tra: Có

499/2083 hiệu thuốc ở thành thị (chiếm tỷ lệ 24%) và 257/870 hiệu thuốc ở

nông thôn (chiếm tỷ lệ 29,5%) có bán đơn thuốc kê kháng sinh. Kháng sinh

đóng góp 13,4% (ở thành thị) và 18,7% (ở nông thôn) trong tổng doanh thu

của hiệu thuốc. Phần lớn kháng sinh được bán mà không có đơn chiếm 88% ở

thành thị và 91% ở nông thôn. Mua kháng sinh để điều trị ho chiếm 31,6% ở

thành thị và sốt chiếm 21,7% ở nông thôn. Ba loại kháng sinh được bán nhiều

nhất là Ampicillin/Amoxicillin (29.1%), Cephalexin (12.2%) và

Azithromycin (7.3%). Người dân thường yêu cầu được bán kháng sinh mà

không có đơn là 49,7% (thành thị) và 28,2% (nông thôn) [1].

Số liệu thống kê trong báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh

tại 15 bệnh viện ở Việt Nam của Bộ Y tế (Bao gồm các bệnh viện đa khoa

tuyến tỉnh và tuyến trung ương tại các tỉnh như: Hà Nội, Quảng Ninh, Bình

Định, Đà Nẵng, Huế, Đồng Tháp, T.p Hồ Chí Minh) cho thấy mức độ tiêu thụ

kháng sinh trung bình là 274,7 DDD/100 ngày/giường. Tỷ lệ này cao hơn

đáng kể so với báo cáo của Hà Lan cùng kỳ là 58,1 DDD/100 ngày/giường và

báo cáo từ 139 bệnh viện của 30 nước châu Âu năm 2001 là 49,6 DDD/100

ngày/giường. Đối với bệnh viện nhi khoa, mức độ sử dụng kháng sinh trung

bình là 65 DDD trên 100 ngày/giường. Kháng sinh nhóm Cephalosporin thế

hệ 2 và 3 được sử dụng phổ biến nhất ở tất cả các bệnh viện, sau đó là các

kháng sinh thuộc nhóm Penicillin phổ rộng, Fluoroquinolone và macrolides.

Tương ứng với mức độ sử dụng kháng sinh tương đối cao so với các nước

khác trên thế giới, tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã cho thấy mức

độ đáng báo động tại tất cả các bệnh viện. Trong số các nước thuộc mạng lưới

giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức

độ kháng Penicillin cao nhất (71,4%) và kháng Erythromycin (92,1%) [4].

Theo TS.BS Phạm Hùng Vân [5] cho biết, đã có 235 chủng vi khuẩn

Staphylococus aureus từ 7 phòng thí nghiệm vi sinh của 7 bệnh viện tại Đà

7

Nẵng, Cần Thơ và Tp Hồ Chí Minh được gửi về trung tâm nghiên cứu. Kết

quả ghi nhận được 47% Staphylococus aureus kháng Methicillin; 42% với

Gentamicin, 63% với Erythromycin, 68% với Azithromycin, 39% với

Ciprofloxacin, 38% với Cefuroxime, 30% với Amoxicillin và chỉ 8% với

Rifampicine.

Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch

Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có

không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng

nhất, dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch

cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan.

Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương – Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền

mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện.

Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli

(gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở

Ampicillin là 88%, Amoxicillin là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây

bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampicilline gần

97% và Amoxicilline là 42% [6].

Có thể thấy rằng, thuốc kháng sinh đang ngày càng được lạm dụng một

cách không hợp lí và hệ quả của việc này đã gây ra tình trạng kháng kháng

sinh và thải ra một lượng không nhỏ hàm lượng kháng sinh dư thừa ra môi

trường mà chưa qua xử lý.

1.1.3. Tổng quan về kháng sinh Norfloxacin

1.1.3.1. Đặc điểm và tính chất của Norfloxacin

Norfloxacin là kháng sinh thuộc loại 1- thế hệ thứ 2 của nhóm

Quinolone, một loại biệt dược Fluoroquinolone tổng hợp có tác dụng diệt

khuẩn với cả vi khuẩn ưa khí Gram dương và Gram âm [2].

Norfloxacin có dạng bột kết tinh màu trắng hoặc màu vàng nhạt, nhạy

cảm với ánh sang, rất khó tan trong nước, khó tan trong aceton và ethanol

96% [7].

8

Nhóm dược lý: Thuốc chống nhiễm khuẩn, trị ký sinh trùng, kháng

virus, kháng nấm;

Tên biệt dược: Effectsal, Intasnor, Loravax;

Tên theo IUPAC: Axit 1 – etyl – 6 – flooro – 4 – oxo – 7 – piperazin –

1 – ylquinolin – 3 – carboxylic

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Norfloxacin

Tên thương mại: Noroxin, Chibroxin, Floxenor, Norofin, Norxacin

Công thức hóa học: C16H18FN3O3

Khối lượng phân tử: 319.331 g/mol

Nhiệt độ nóng chảy: 220 đến 221 0C (428 đến 430 0F)

Norfloxacin thường được sử dụng để điều trị nhiễm trùng đường tiết

niệu, nhiễm trùng phụ khoa, viêm tuyến tiền liệt, lậu, nhiễm trùng bàng quang

và các loại bệnh khác. Ngày nay, loại kháng sinh này đang bị lạm dụng một

cách bừa bãi trong việc điều trị tại gia các bệnh phụ khoa và nhiễm trùng. Bên

cạnh đó, một hàm lượng lớn Norfloxacin chưa qua sử dụng hoặc dư thừa bị xả

thải ra ngoài môi trường mà chưa qua xử lí một cách phù hợp. Mặt khác,

Norfloxacin lại khó tan trong nước và dung môi hữu cơ nên vấn đề tồn đọng

và sự có mặt của chúng ở trong môi trường là điều tất yếu.

1.1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng

Norfloxacin ức chế DNA - gyrase, một enzym cần thiết cho sự sao chép

DNA của vi khuẩn.

9

Norfloxacin có tác dụng diệt khuẩn với cả vi khuẩn ưa khí Gram dương

và Gram âm. Norfloxacin có tác dụng với hầu hết các tác nhân gây bệnh

đường tiết niệu thông thường nhất như: Escherichia coli, Proteus mirabilis,

Staphylococcus saprophyticus. Ngoài ra, Norfloxacin cũng có tác dụng diệt

các khuẩn gây bệnh đường tiết niệu khác như Klebsiella spp., Enterobacter

spp., Proteus spp. indol dương, Pseudomonas aeruginosa và Streptococcus

faecalis.

Norfoxacin cũng diệt Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter

spp., Vibrio cholerae và Yersina enterocolitica, và các vi khuẩn có liên quan.

Nó còn có tác dụng diệt Neisseria gonorrhoeae (Cả các chủng tạo Penicilinase

hoặc không tạo ra Penicilinase). Chlamydia và các vi khuẩn yếm khí như

Bacteroides spp. không nhạy cảm với Norfloxacin.

Norfloxacin cũng thường có tác dụng ngay khi vi khuẩn đã kháng với

Acid nalidixic.

Trong ống nghiệm, Norfloxacin ức chế đa số các chủng nhạy cảm gây

bệnh ở mắt như: Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas hydrophila,

Hemophilus influenzae, Staphylococcus aureus. Ða số các chủng

Pseudomonas aeruginosa bị ức chế bởi Norfloxacin ở nồng độ 4 microgam/ml

hoặc thấp hơn. Norfloxacin tác dụng yếu hơn Ciprofloxacin chống các chủng

gây bệnh nhạy cảm và cũng yếu hơn Ciprofloxacin trong một số mô hình

viêm giác mạc gây ra bởi Pseudomonas aeruginosa trong ống nghiệm. Sự đề

kháng đối với Norfloxacin truyền qua phân tử ADN vòng nhỏ chưa được xác

định [8].

1.1.3.3. Dược động học

Khả năng hấp thu của Norfloxacin được đưa vào cơ thể thông qua

đường tĩnh mạch và đường uống. Khi dùng liều 200 mg hay 400 mg

Norfloxacin, trong vòng 1 - 2 giờ nồng độ tối đa của thuốc trong huyết tương

tương ứng là 0,8 mg/lít và 1,5 mg/lít. Norfloxacin được bài tiết theo hai

đường: Lọc cầu thận và bài tiết ở ống thận. Nồng độ thuốc tối đa trong nước

tiểu đạt được sau khi uống thuốc 2 giờ. Nồng độ diệt khuẩn của thuốc trong

10

nước tiểu được duy trì trong vòng 12 giờ. Thời gian bán thải của thuốc trong

huyết tương khoảng 3 - 5 giờ. Ðối với những người suy thận ở mức độ trung

bình có độ thanh thải Creatinin dưới 30 ml/phút, thời gian bán thải của thuốc

trong huyết tương kéo dài gấp đôi (6 - 10 giờ) [8].

1.1.4. Tổng quan về kháng sinh Amoxicillin

1.1.4.1. Đặc điểm và tính chất của Amoxicillin

Amoxicillin là kháng sinh của nhóm Cephalosporin thuộc họ Beta-

lactam, là kháng sinh cùng họ với các Penicillin. Amoxicillin có tác dụng

ngăn chặn và diệt các loại vi khuẩn Gram dương như viêm họng, da tẩy mủ

hay nhiễm trùng da, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi… Amoxicillin

được phát hiện vào năm 1958, sử dụng vào năm 1972 và là loại kháng sinh

được nằm trong danh sách các loại thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới,

hay nhóm các loại thuốc hiệu quả và an toàn nhất cần thiết trong một hệ thống

y tế. Đây là một trong những loại kháng sinh được kê toa phổ biến nhất ở trẻ

em.

Amoxicillin có dạng bột trắng, khó tan trong nước và rất khó tan trong

Ethanol 96%, thực tế không tan trong dầu béo. Tan trong các dung dịch Acid

loãng và dung dịch Hydroxyd kiềm loãng [7].

Nhóm thuốc: Thuốc trị ký sinh trùng, chống nhiễm khuẩn, kháng virus,

kháng nấm

Tên biệt dược: Amoxicillin, Amitron, Amoxfap, Fleming Infection,

Euromox

Tên theo IUPAC:

(2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-(4hydroxyphenyl)acetyl]amino]3,3dimethyl-

7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0] heptan-2-carboxylic trihydrat [9]

11

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Amoxicillin

Tên thương mại: Amoxil, Tycil, Trimox

Công thức hóa học: C16H19N3O5S

Khối lượng phân tử: 365,4 g/mol

Amoxicilin thường dùng để điều trị các bệnh như:

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên (bao gồm cả Tai mũi họng) như:

viêm Amiđan, viêm xoang, viêm tai giữa

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới do liên cầu khuẩn, phế cầu khuẩn, tụ

cầu khuẩn không tiết Penicilinase và H. influenza

- Nhiễm khuẩn đường mật, đường tiết niệu không biến chứng

- Bệnh lậu

- Nhiễm khuẩn da, cơ do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, E. coli nhạy cảm

với amoxicilin

1.1.4.2. Dược lý và cơ chế tác dụng

Amoxicillin là Aminopenicilin, bền trong môi trường acid, có phổ tác

dụng rộng hơn Benzylpenicilin, đặc biệt có tác dụng chống trực khuẩn Gram

âm. Tương tự như các Penicilin khác, Amoxicillin tác dụng diệt khuẩn, do ức

chế sinh tổng hợp Mucopeptid của thành tế bào vi khuẩn. Trong ống nghiệm,

Amoxicillin có hoạt tính với phần lớn các loại vi khuẩn Gram âm và Gram

dương như: Liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn không tạo Penicilinase, H.

influenzae, Diplococcus pneumoniae, N. gonorrheae, E. coli, và Proteus

mirabilis. Cũng như Ampicillin, Amoxicilin không có hoạt tính với những vi

12

khuẩn tiết Penicilinase, đặc biệt các tụ cầu kháng Methicilin, tất cả các chủng

Pseudomonas và phần lớn các chủng Klebsiella và Enterobacter.

Amoxicillin có tác dụng trong ống nghiệm mạnh hơn Ampicillin đối

với Enterococcus faecalis và Salmonella spp., nhưng kém tác dụng hơn đối

với Shigella spp. Phổ tác dụng của Amoxicillin có thể rộng hơn khi dùng

đồng thời với Sulbactam và Acid Clavulanic, một chất ức chế Beta -

lactamase. Amoxicillin dạng uống được ưa dùng hơn Ampicillin dạng uống,

đặc biệt trong điều trị nhiễm khuẩn đường hô hấp, do được hấp thu hoàn toàn

hơn từ đường tiêu hóa, nồng độ trong huyết thanh, mô và dịch cao hơn, tần

suất uống ít hơn và ít xảy ra tác dụng phụ (tiêu chảy) hơn.

Theo thông báo số 2 và số 3 năm 2000 của Chương trình giám sát quốc

gia về tình hình kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp (ASTS) thì

mức độ kháng Ampicilin của E.coli là 66,7%, Salmonella typhi là 50%,

Shigella là 57,7%, Acinetobacter spp. là 70,7%, các vi khuẩn đường ruột khác

(Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Morganella, Proteus, Serratia...) là

84,1%, Streptococcus spp. là 15,4%, của các chủng Enterococcus spp là

13,1% và các chủng trực khuẩn Gram âm khác (Achromobacter,

Chriseomonas, Flavobacterium, Pasteurella...) là 66,7% [8].

1.1.4.3. Dược động học

Amoxicillin bền vững trong môi trường Acid dịch vị. Hấp thu không bị

ảnh hưởng bởi thức ăn, nhanh và hoàn toàn hơn qua đường tiêu hóa so với

Ampicillin. Khi uống cùng liều lượng như Ampicillin, nồng độ đỉnh

Amoxicillin trong huyết tương cao hơn ít nhất 2 lần. Amoxicillin phân bố

nhanh vào hầu hết các mô và dịch trong cơ thể, trừ mô não và dịch não tủy,

nhưng khi màng não bị viêm thì Amoxicillin lại khuếch tán vào dễ dàng. Sau

khi uống liều 250 mg Amoxicilin từ 1 - 2 giờ, nồng độ Amoxicillin trong máu

đạt khoảng 4 – 5 microgam/ml, khi uống 500 mg từ 1 – 2 giờ, nồng độ

amoxicilin đạt khoảng 8 – 10 microgam/ml. Tăng liều gấp đôi có thể làm

nồng độ thuốc trong máu tăng gấp đôi. Amoxicillin uống hay tiêm đều cho

những nồng độ thuốc như nhau trong huyết tương. Thời gian bán thải của

13

Amoxicilin khoảng 61,3 phút, dài hơn ở trẻ sơ sinh, và người cao tuổi. Ở

người suy thận, thời gian bán thải của thuốc dài khoảng 7 - 20 giờ [8].

Khoảng 60% liều uống Amoxicillin thải nguyên dạng ra nước tiểu

trong vòng 6 - 8 giờ. Probenecid kéo dài thời gian thải của Amoxicillin qua

đường thận. Amoxicillin có nồng độ cao trong dịch mật và một phần thải qua

phân [8].

1.2. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN

Trong đời sống hằng ngày, ngành y tế giữ vai trò rất quan trọng trong

việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng, điều trị bệnh, đảm bảo sức khỏe cho con

người để học tập và lao động sản xuất. Đi đôi với tốc độ phát triển nhanh

chóng của xã hội hiện đại nói chung và ngành dịch vụ y tế nói riêng, lượng

nước thải phát sinh từ các dịch vụ y tế ngày một gia tăng, đặc biệt là các cơ sở

bệnh viện. Nước thải bệnh viện (nước thải y tế) là một dạng của nước thải

sinh hoạt. Nước thải bệnh viện phát sinh từ các nguồn chính như: nước mưa

chảy tràn trên toàn bộ diện tích của bệnh viện, nước thải sinh hoạt từ khu nhà

bếp, nhà ăn, khu hành chính bệnh viện, các hoạt động khám và chăm sóc điều

trị từ các phòng bệnh nhân cùng một số công trình phụ trợ khác. Các yếu tố ô

nhiễm thông thường có trong nước thải bệnh viện, bao gồm các chất hữu cơ,

dầu mỡ động, thực vật, những chất bẩn khoáng, các vi khuẩn gây bệnh, chế

phẩm thuốc, chất khử trùng, các dung môi hóa học, dư lượng thuốc kháng

sinh và có thể có các chất ô nhiễm phóng xạ đặc trưng được sử dụng trong

quá trình chụp X-quang, chiếu xạ [3].

Từ những đặc điểm trên, có thể thấy rằng nước thải bệnh viện là loại

nước thải đặc thù và có yêu cầu xử lý cao hơn, cũng như đòi hỏi các kỹ thuật

của hệ thống xử lý nước thải phức tạp hơn. Bảng 1.2 thể hiện những đặc tính

chung của các thông số ô nhiễm thông thường đối với loại hình nước thải

bệnh viện.

14

Bảng 1.2 Đặc tính chung của nước thải bệnh viện

STT Thông số Đơn vị Min Max Trung bình

1 pH - 6,9 7,58 7,15

2 Amôni (N-NH4) mg/l 18,5 35,3 25

3 Tổng Coliform MNP/100ml 4x107 2x109 2x108

4 BOD5 mg/l 120 320 210

5 COD mg/l 210 450 320

6 Photphat (PO43-) mg/l 2,1 7,9 5,2

7 TSS mg/l 120 170 190

Xử lý và đánh giá mức độ ô nhiễm từ các nguồn thải tại các bệnh viện

là một trong những nhiệm vụ quan trọng về công tác quản lý môi trường y tế

nằm trong báo cáo thường niên hàng năm của Bộ Y tế. Tại Việt Nam hiện

nay, việc xử lý nước thải bệnh viện thường áp dụng nhiều giải pháp công

nghệ dể xử lý an toàn và triệt để như: công nghệ sinh học nhỏ giọt (Biophil),

bùn hoạt tính trong bể hiếu khí (Aerotank), nguyên lý hợp khối, công nghệ

AAO, hồ sinh học ổn định, bãi lọc trồng cây kết hợp bể lọc yếm khí…Sự kết

hợp của các công nghệ xử lý nước thải này sẽ giúp tăng nhanh quá trình phân

hủy sơ bộ các chất hữu cơ như COD, BOD, Nitơ và Amoni. Tuy nhiên, một

số thành phần dư lượng PPCPs trong nước thải còn tồn đọng sau xử lý thường

vẫn ở mức cao, lâu dần theo thời gian sẽ làm ảnh hưởng lớn đến môi trường

hệ sinh thái.

Theo báo cáo của Viện Y học lao động và vệ sinh môi trường (2011),

chất lượng nước thải tại điểm thải ra môi trường của 7 bệnh viện thuộc tuyến

trung ương và 10 bệnh viện tuyến tính/ thành phố. Thông số không đạt

QCVN có tỷ lệ cao nhất là chỉ tiêu Amoni (trung bình 2 tuyến là 68,8%), rồi

đến Coliform (trung bình 2 tuyến 56,3%), Sunfua (trung bình 2 tuyến 50%).

Tác giả Trần Quang Toàn cùng các cộng sự [10] đã nghiên cứu điều tra theo

phương pháp mô tả cắt ngang bằng bảng câu hỏi kết hợp với quan sát trực

tiếp và quan trắc quá trình quản lý và xử lý nước thải của 98 bệnh viện các

15

tuyến tại Việt Nam, cho thấy mặc dù nước thải của các bệnh viện đều được

xử lý trước khi thải ra môi trường, nhưng chỉ có khoảng 30% bệnh viện có

nước thải y tế đáp ứng tiêu chuẩn thải của QCVN 02:2010/BTNMT. Các

thông số ô nhiễm phổ biến không đạt Tiêu chuẩn thải gồm Amoni, Coliform,

COD và BOD5.

Hầu hết các nghiên cứu về sự xuất hiện PPCPs trong môi trường và

đánh giá rủi ro liên quan đã được thực hiện ở châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản và

gần đây là tại Hàn Quốc.[11] Tương đối ít nghiên cứu được biết về tình hình

dư lượng các dược phẩm tồn tại trong môi trường nước thải nói riêng ở các

nước đang phát triển như Việt Nam, nơi thị trường dược phẩm đang phát triển

nhanh chóng và các quy định về môi trường chưa được thiết lập tốt. Sự hiện

diện của kháng sinh trong môi trường ở Việt Nam lần đầu tiên được báo cáo

bởi Satoshi Manageaki [12], người đã tìm thấy Sulfamethazine ở nồng độ cao

(19,2 mg / L) trong nước thải trang trại lợn. Theo Hồng Ánh Dương cùng các

cộng sự [13] đã điều tra sự xuất hiện của nhóm các chất kháng khuẩn

Fluoroquinolone trong nước thải bệnh viện tại Hà Nội. Kết quả cho thấy

Nồng độ của Ciprofloxacin (CIP) và Norfloxacin (NOR) trong sáu chất thải

của bệnh viện, tương ứng dao động từ 1,1 đến 44 µg/L và từ 0,9 đến 17 µg/L,

việc loại bỏ Fluoroquinolone khỏi dòng nước thải là từ 80 đến 85%, có lẽ là

do sự hấp phụ của bùn thải. Một số thuốc kháng sinh là các hợp chất tự nhiên

có tiếp xúc với vi sinh vật môi trường hàng triệu năm mới phân hủy sinh học,

thậm chí nó đóng vai trò như là một nguồn thức ăn cho một số vi sinh vật.

Kháng sinh tổng hợp (Ví dụ Quinolone) là chất khó để phân hủy sinh học.

Tuy nhiên, chúng vẫn đang bị suy thoái ở mức độ khác nhau trong môi trường

tự nhiên. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng sự gắn kết của các Quinolone

trong đất và trầm tích làm chậm quá trình phân hủy sinh học của chúng. Tuy

nhiên, xử lý nước thải của các vùng nước ô nhiễm Quinolone không đạt hiệu

quả loại bỏ các kháng sinh bởi các quá trình bao gồm không chỉ phân hủy

sinh học mà còn xảy ra sự suy thoái của các chất [3]. Một nghiên cứu sơ bộ

về sự xuất hiện của các hợp chất có hoạt tính dược phẩm trong nước thải bệnh

viện và nước mặt ở Hà Nội, Việt Nam [11] cho thấy sự hiện diện của các hợp

chất hoạt tính dược phẩm (PhACs) thuộc các nhóm trị liệu khác nhau (bao

16

gồm cả thuốc chống viêm không Steroid, thuốc giảm đau, thuốc chống động

kinh và chất điều chỉnh Lipid) trong mẫu nước thải bệnh viện và nước mặt lần

đầu tiên được điều tra tại Việt Nam. Kết quả phân tích cho thấy 10 PhACs,

bao gồm Naproxen, Indomethacin, Ketoprofen, Fenoprofen, Ibuprofen,

Propyphenazone, Diclofenac, Axit Clofibric, Gemfibrozil và Carbamazepine

đã được phát hiện ít nhất một lần trong mẫu nước thải bệnh viện. Việc phát

hiện các PhACs cho thấy nước thải bệnh viện được coi là nguồn gây ô nhiễm

môi trường đáng kể bởi các dược phẩm.

Vì vậy, việc đánh giá hiện trạng nước thải bệnh viện tại các cơ sở y tế ở

Việt Nam và nghiên cứu để đưa các vật liệu nhằm xử lý lượng kháng sinh còn

dư thừa là điều hết sức cần thiết nhằm quản lý môi trường và điều chỉnh để

đưa ra các biện pháp giải quyết sớm.

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NORFLOXACIN VÀ

AMOXICILLIN

Qua tham khảo các nghiên cứu trong và ngoài nước, hiện nay có rất

nhiều phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin và

Amoxicillin dựa vào cấu trúc và tính chất của nhóm kháng sinh Beta –

Lactam và Quinolone như: Phương pháp quang học, phương pháp điện hóa,

phương pháp điện di mao quản, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao...

Mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng.

1.3.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

Quang phổ là các vạch tối hoặc sáng (trong một quang phổ liên tục và

động dạng) do sự phát xạ hoặc hấp thụ ánh sáng trong một dải tần hẹp, so với

các dải tần lân cận. Phổ hấp thụ quang phân tử UV-Vis là phổ đám, có các

cực đại và cực tiểu của phổ nằm ở những vùng sóng nhất định tùy theo cấu

trúc và các loại liên kết của phân tử hay nhóm nguyên tử. Phổ này chủ yếu

nằm trong vùng sóng từ 190 – 900 nm [14]. Để đo được quang phổ UV-Vis,

người ta sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis giúp xác định được quang phổ

của một vật chất bất kỳ.

17

Tác giả F. Bela và cộng sự [15] xác định Amoxicillin và Ampicillin

trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải

tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCL 1M, NaOH 1M sau đó thêm

PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm.

Khoảng tuyến tính từ 8 – 40 mg/l; giới hạn phát hiện của Amoxicillin là

0,73mg/l và của Ampicillin là 0,76 mg/l.

L. Chierentin và H. R. N. Salgado [16] sử dụng phương pháp đo quang

phổ UV-Vis để xác định Norfloxacin trong viên nén thuốc. Norfloxacin cho

thấy sự hấp thụ tối đa ở bước sóng 277 nm, trong môi trường Axit Clohydric

0,1M với phương pháp UV, trong khi đối với phương pháp đo quang phổ Vis,

nó phản ứng với thuốc thử Axit Chloranilic và tạo thành dung dịch màu tím

với độ hấp thụ tối đa ở bước sóng 520 nm. Trong khoảng nồng độ từ 2,0 – 7,0

mg/L, phương trình hồi quy tuyến tính của phương pháp UV là y = 0,1303x +

0,0026 (r2 =0,9999) và của phương pháp Vis là y = 0,0037x -0,0069 (r2 =

0,9948). Cả hai phương pháp đều được đánh giá là đơn giản, nhanh chóng và

góp phần kiểm soát chất lượng của viên nén Norfloxacin.

Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis là phương pháp phân tích

hiện đại được áp dụng rộng rãi trong các lĩnh vực. Phương pháp có ưu điểm là

cho kết quả phân tích nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thiết bị không

đắt. Tuy nhiên, phương pháp này có độ chính xác không cao, độ chọn lọc

kém, chủ yếu chỉ dùng để xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh. Trong

trường hợp đối tượng phân tích có nhiều yếu tố ảnh hưởng thì việc phân tích

sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy

phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.

1.3.2. Phương pháp điện hóa

Phương pháp phân tích điện hóa là phương pháp phân tích có tính chọn

lọc, cho phép xác định hàm lượng chất cần phân tích với hàm lượng nhỏ và

vết, có thể phân tích hàng loạt mẫu trong thời gian ngắn. Phương pháp này có

ưu điểm là thuận tiện và chi phí thấp. Tuy nhiên, nhược điểm là tiêu hao năng

lượng (điện năng) lớn và không được phổ biến nhiều.

18

Một số phương pháp điện hóa cũng đã được sử dụng để phân tích

kháng sinh nhóm Beta – Lactam và Quinolone nhưng không phổ biến nhiều.

Daniela P. Santos và cộng sự [17] đã sử dụng Sensor điện thế phân tích

Amoxicillin, giới hạn phát hiện đạt 0,92 µM (0,39mg/l) trong môi trường đệm

Axetat 0,1M, pH=5,2.

Tác giả Zhenping Liu cùng các cộng sự [18] đã sử dụng phương pháp

điện hóa để xác định độ nhạy của Norfloxacin trong nước tiểu người và dược

phẩm bằng cách sử dụng một điện cực tổng hợp của MWCNT-CPE/pRGO-

ANSA/Au. Cảm biến điện hóa của Norfloxacin được nghiên cứu bằng

phương pháp vôn kế tuần hoàn, tuyến tính quét vôn kế và vôn kế xung vi

phân . Kết quả thí nghiệm cho thấy sự kết hợp của MWCNT-CPE/pRGO-

ANSA/Au mang lại độ dẫn điện cao, diện tích bề mặt lớn và hoạt động điện

cực tốt, có lợi cho hiệu suất cảm biến điện hóa. Phạm vi nồng độ trong

khoảng tuyến tính của Norfloxacin là 0,03 – 1,0 µM và 1,0 – 50,0 µM, với

giới hạn phát hiện (LOD) là 0,016 µM (S/N = 3). Các cảm biến chế tạo đã áp

dụng thành công để phát hiện sự hiện diện của Norfloxacin trong các thành

phần dược phẩm và mẫu huyết tương ở chuột.

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản (Capillary Electropherosis-CE) là

phương pháp phân tách các chất dựa vào sự khác nhau về tốc độ chuyển động

của chúng dưới tác dụng của lực điện trường trong một mao quản hẹp.

Ahmed Alnajjar, Hamed H. AbuSeada, Abubakr M. Idris [19] đã sử

dụng phương pháp điện di mao quản với kỹ thuật đầu dò UV Đi ốt quang để

áp dụng phân tích Norfloxacin và Tinidazole trong dược phẩm. Kết quả thành

công thu được bằng cách sử dụng chất điện phân Phosphate 32,5 mmol/l ở pH

= 2,5, thời gian tiêm là 8,0 s, điện áp là 25kV và nhiệt độ cột 250C với phát

hiện ở bước sóng 301nm. Độ phục hồi, độ chính xác trung gian, dải tuyến

tính, độ chọn lọc cũng như giới hạn phát hiện và định lượng đã được chứng

minh trong nghiên cứu.

19

Biyang Deng và cộng sự [20] đã sử dụng phương pháp điện di với

Detector điện quang hóa xác định Amoxicillin trong nước tiểu người với giới

hạn xác định thấp 0,31µg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 - 8 µg/l cùng độ thu hồi

cao 95,77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân

tích ngắn 6 phút/mẫu.

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [21] sử dụng phương pháp CZE và

Detector UV-DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH=8 và 20% (v/v)

Ethanol, dùng kỹ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng

phân tích đồng thời Ampicillin, Amoxicillin, Cloxacillin, Oxacillin, Pencillin

trong nền mẫu nước (nước sông, nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng

0,8; 0,8; 0,30; 0,30; 0,9 µg/l cùng độ thu hồi đạt 94-99% với độ lệch chuẩn

tương đối thấp hơn 10%.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC

Trong những năm gần đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao -

HPLC đã đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các

chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các

chất.

R. Nageswara Rao, V. Nagaraju [22] đã sử dụng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao để tách và xác định tạp chất tổng hợp của Norfloxacin. Sự

phân tách đã thực hiện được trên phương pháp HPLC pha đảo với cột C18, sử

dụng dung dịch đệm KH2PO4 0,01M và Acetonitrile (60:40, v/v, pH=3) làm

dung môi pha động, tốc độ dòng chảy là 1ml/phút ở 400C và bước sóng phát

hiện ở 260nm. Phương pháp này không chỉ được sử dụng để đảm bảo chất

lượng mà còn để theo dõi các phản ứng hóa học trong quá trình thí nghiệm.

Kết quả đã được tìm thấy cụ thể, chính xác và đáng tin cậy để xác định mức

độ không phản ứng của những nguyên liệu thô, trung gian và thành phẩm của

Norfloxacin.

M. Co´rdoba-Borrego, M. Co´rdoba-Dı ´az, D. Co´rdoba-Dı ´az [23] đã

xác định Norfloxacin và thẩm định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao. Phương pháp cho thấy độ tuyến tính tốt (r2 ≥ 0,999) trong khoảng phạm

20

vi nồng độ từ 1 – 20 mg/L. Nghiên cứu đã sử dụng cột Lichrosorb-RP-8

(10µm, 20 cm × g4,6 mm) và đầu dò phát hiện chất Detecter UV (tại bước

sóng 278nm) trong nhiệt độ môi trường. Phương pháp này cho thấy hiệu quả

tốt trong việc phân tích các mẫu Norfloxacin bị phân hủy và được áp dụng để

nghiên cứu tính ổn định trong các điều kiện khác nhau (ánh sáng mặt trời trực

tiếp, tia cực tím và ánh sáng huỳnh quang).

Một số các nghiên cứu nước ngoài đã sử dụng HPLC để phân tích

Amoxicillin như: Seyed Mohsen Foroutan cùng các cộng sự [24] đã xác định

đồng thời kháng sinh Amoxicillin và Axit clavulanic trong huyết tương người

bằng HPLC pha đảo với đầu dò UV. Việc phân tách được thực hiện trong

điều kiện pha đảo với cột Chromolith (RP-18e, 100 mm × 4,6 mm), pha động

bao gồm dung dịch đệm 0,02 M Disodium hydrogen phosphate và Methanol

(96:4, v/v), điều chỉnh pH = 3. Bước sóng được đặt ở 228 nm. Các hệ số biến

thiên được tìm thấy trong ngày là ít hơn 9,0%.

Tác giả E.Benito-Pena và các cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp

HPLC, detector UV để phân tích đồng thời các kháng sinh Beta-lactam

(Pencillin G, Amoxicillin, Ampicillin, Penicillin V, Cloxacillin, Dicloxacillin

và Nafcillin) có trong nước thải. Phương pháp này sử dụng chiết pha rắn

(SPE) và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các Penicillin đã được tách ra bằng cách

sử dụng cột LUNA C18 (150 nm × 4.6 nm, 5µm), gradient rửa giải với các

pha động bao gồm các Axit Trifluoroacetic, nước và Acetonitril tại bước sóng

220 nm. Hiệu suất thu hồi đạt trong khoảng 82 – 97% (RSD 2-9%) cho tất cả

các kháng sinh trừ Amoxicillin (52%, RDS 8%), giới hạn phát hiện khoảng 8

- 42 mg/l.

Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC là có thể phân

tích được rất nhiều loại hợp chất khác nhau, các chất từ phân cực tới không

phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung

tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của HPLC cao hơn các phương pháp

khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú. Với hiệu

năng tách cao, khả năng phân tích rộng, sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện vẫn là

21

lựa chọn ưu tiên trong ngành phân tích, đặc biệt là ứng dụng trong các lĩnh

vực hóa học, sinh hóa, hóa dầu, phân tích chất lượng môi trường…

1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG

CAO

1.4.1. Cơ sở lý thuyết và khái niệm

Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích (xác định) các chất trong

một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các

chất trong những điều kiện nhất định [26]. Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa

theo trạng thái mẫu và pha động khi tiến hành sắc ký, đó là kỹ thuật phân tích

sắc ký khí (GC) và kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng (LC). Trong kỹ thuật sắc ký

lỏng lại được chia thành hai nhóm, đó là sắc ký lỏng áp suất thường (LC) và

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

HPLC là từ viết tắt của 4 chữ cái đầu tiên của phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là

sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). HPLC là một

phương pháp phân tích sắc ký, trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh chứa

trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất

lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng

liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình này dựa trên các cơ chế

khác nhau như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, hay phân loại theo kích cỡ.

Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải

tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày

càng hiện đại hóa nhờ các ngành nghề chế tạo máy phân tích. Vì vậy, kỹ thuật

HPLC có thể phân tích rất nhiều các loại hợp chất khác nhau, từ chất phân

cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi đến các chất không bay hơi, từ

các chất trung tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của HPLC cũng cao

hơn các phương pháp khác nhác nhờ cơ chế tách, pha động và pha tĩnh đa

dạng, độ nhạy cao, hiệu suất tách cao và tốn ít thời gian cũng như tốn ít mẫu.

Với các ưu điểm đó, HPLC là lựa chọn ưu tiên trong nghiên cứu khoa học các

lĩnh vực phân tích, đặc biệt là phân tích các hàm lượng kháng sinh.

22

1.4.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách

và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa

các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh

(trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của

hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân

bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi

ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với

hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân

tách.

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện

gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Tín hiệu của cả quá trình

sắc ký cho ta sắc ký đó. Một sắc ký đồ sẽ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào

thành phần mẫu. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra

máy in.

1.4.3. Cấu tạo của hệ thống HPLC

Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC

thì cần phải có các hệ thống trang thiết bị cơ bản như sau:

Hình 1.3 Hệ thống cấu tạo HPLC

23

- Bơm cao áp:

Dùng để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa

giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400

bar) để tạo được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp

cho quá trình chạy sắc ký.

- Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi:

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép

sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn

và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%. Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh,

đôi khi bằng thép không gỉ. Cần lọc các loại hạt trong dung môi bằng các màng

lọc và đuổi khí hòa tan trong dung môi. Trong phương pháp thông thường chỉ

cần 1, 2 hoặc 3 bình dung môi để cho hệ pha động luôn được trộn đồng nhất

hơn, hệ pha động giúp ổn định quá trình rửa giải. Tất cả các dung môi dùng

cho HPLC trong việc chuẩn bị mẫu, dung dịch pha động đều phải là dung môi

tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak

tạp trong quá trình phân tích.

- Bộ khử khí:

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong

dung môi pha động, tránh sảy ra một số hiện tượng có thể như sau:

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời

gian lưu của peak thay đổi.

Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết

được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến

áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC.

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.

- Bộ phận tiêm mẫu:

Để đưa mẫu vào cột phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất

định không đổi trong một quá trình sắc ký với dung tích của loop là 5-100 µL.

24

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

(Autosamper).

- Cột sắc ký (hay còn gọi là pha tĩnh):

Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) chính là chất nhồi cột

để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích. Cột tách được coi là

trái tim của quá trình sắc ký, nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc

ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có nhiều kích cỡ khác nhau, mọi diễn

biến của sự tách một hỗn hợp chất của mẫu đều sảy ra ở đây và kết quả của sự

tách tốt hay không tốt thì cột tách luôn luôn là một yếu tố chính quyết định. Cột

pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 –

30cm, đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ = 5 - 10 µm. Ngoài ra còn

có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt. Chất nhồi cột tùy

theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24 có tiêu chuẩn hóa

các lọai cột). Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thường) hoặc là

Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo),

ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: Nhôm ôxit, Polyme xốp, chất

trao đổi ion.

- Trang bị phát hiện chất phân tích (detector hay còn gọi là đầu dò):

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu

ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các

chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp. Tín hiệu đầu dò thu

được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn

điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:

+ Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm.

+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/Vis): từ 190 đến 900 nm.

+ Detector huỳnh quang

+ Detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi)

Ngoài ra còn có một số loại detector khác như:

25

+ Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng….

+ Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ.

+ Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt.

- Bộ phận ghi nhận tín hiệu:

Trang bị chỉ thị kết quả tách sắc ký có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ

biến nhất là các máy tự ghi (Recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng pic sắc ký

của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (Intergrator), sau đó là máy tính kèm theo

bộ chương trình (Software) để xử lý kết quả và máy in để in các kết quả tách.

Ngày nay, những hệ thống HPLC hoàn chỉnh , hiện đại còn có thêm các

bộ phận nữa, đó là:

Bộ chương trình gradient dung môi (pha động)

Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu

Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột sắc ký

Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiển, kiếm soát hệ

thống HPLC, xử lý kết quả và lập báo cáo.

1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của HPLC

1.4.4.1. Thời gian lưu giữ

Các chất tan X trong một hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột

sắc ký thì chúng sẽ bị lưu giữ lại ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời

gian nhất định, tRi. Đó là thời gian lưu của nó trong hệ cột tách đã cho. Thời

gian lưu này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan

được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại (Hình 1.4). Thời gian lưu

giữ thực (tR) của chất tan X trong cột sắc ký là:

t’R = (tR - t0)

Trong đó:

t0 : Thời gian không lưu giữ (thời gian chất tan nằm trong pha động

tR : Thời gian lưu tổng cộng của chất tan X

26

Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống HPLC và sắc đồ tách

Nếu t0 = 0 thì tR = t’R Trong trường hợp này chỉ có khi tR là rất nhỏ

(thường là khi tR nhỏ hơn 4 phút). Trong một phép phân tích nếu t’R nhỏ quá

thì sự tách kém, còn nếu t’R quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak

rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như

hao tốn dung môi, hóa chất, độ chính xác của phép phân tích kém.

Thời gian lưu của một chất tan trong cột sắc ký của quá trình sắc ký

phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ như bản chất sắc ký của pha tĩnh (kích

thước, độ xốp, cấu trúc xốp), pha động (pH, tốc độ dòng, tỷ lệ), cấu tạo bản

chất của các chất phân tích.

1.4.4.2. Thể tích lưu giữ

Thể tích lưu giữ của một chất là thể tích của pha động chảy qua cột sắc

ký trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu được bơm vào cột cho đến lúc chất

tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại (đỉnh pic), nghĩa là tương

ứng với thời gian lưu tR. Nếu chất tan không bị lưu giữ trong cột tách, thì thể

tích lưu của nó sẽ bằng thể tích của pha động chảy qua cột. Có thể tính được

thể tích thực VSP của pha tĩnh ở trong cột sắt ký thông qua công thức:

VSP = v0 – F.tR0

27

Trong đó:

V0 : Thể tích trống toàn phần của cột sắc ký

F: Tốc độ của pha động được bơm qua cột sắc ký (ml/phút)

tR0 : Thời gian không lưu giữ

1.4.4.1. Hệ số dung lượng

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó

trong hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha

tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.

K’ =

Trong đó:

K’: Hệ số dung lượng

tR: Thời gian lưu tổng cộng của chất tan

t0: Thời gian không lưu giữ

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị

doãng. Trên thực tế K’ từ 1 – 5 là tối ưu.

1.4.4.2. Tốc độ pha động

Tốc độ pha động: Được định nghĩa là số ml dung dịch pha động chảy

qua cột tách trong một đơn vị thời gian, tức là số ml/phút của pha động. Tốc

dộ thể tích của pha động luôn có liên quan đến tiết diện của cột tách.

Tốc độ tuyến tính của pha động: Khái niệm tốc độ này sẽ cho ta biết

trong một đơn vị thời gian thì pha động, hay một đĩa sắc ký của chất tan X

trong cột tách di chuyển được bao nhiêu cm. Tốc độ này không phụ thuộc vào

tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ giảm áp trong cột tách

theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột.

28

1.4.4.3. Số đĩa lý thuyết của cột sắc ký

Số đĩa lý thuyết N trên 1 mét chiều dài cột sắc ký (N/1m) là đại lượng

biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định, mỗi đĩa trong

cột sắc ký như là một lớp chất tan X có chiều cao (bề dày) là H. Tất nhiên lớp

này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một

cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan

trong pha tĩnh và pha động. Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cấu tạo

và bản chất của pha tĩnh, độ nhớt và tốc độ của pha động…Vì vậy, với một

điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất

phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Số đĩa lý thuyết

được tính theo công thức sau:

Trong đó:

tR: Thời gian lưu của chất phân tích

W0,5: Độ rộng tại ½ của peak

1.4.4.1. Độ phân giải

Để biết hai chất tan A và B được tách ra khỏi nhau đến mức nào, khi nó

được rửa giải ra khỏi cột sắc ký thì cần phải xét thêm đại lượng độ phân giải

R và nó được xác định theo công thức:

K’ =2.

Trong đó:

- Các giá trị t’RA và t’RB là thời gian lưu thực của hai chất A và B

- WA và WB là bề rộng đáy của pic sắc ký của hai chất A và B

Theo điều kiện tối thiểu vừa đủ để hai chất A và B có thể tách ra khỏi

nhau, theo quy luật phân bố Gauss và theo quy tắc Rayley, thì cực tiểu pic sắc

29

ký của chất A nằm gần nhất là ở vị trí cực đại của chất B (Hình 1.5) và đủ để

tách hoàn toàn rõ ràng là cực tiểu phía sau pic của B kề với cực tiểu pic phía

trước của A, tức là bề rộng đáy của hai pic A và B là:

WAB ≥ (WA + WB)

Hình 1.5 Giản đồ vè sự tách của hai pic sắc ký A và B

Như vậy, nếu R càng lớn thì pic hai chất A và B càng cách xa nhau, khi

này giữa hai pic sẽ có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của

biểu đồ sắc ký. Nếu đoạn đường nền này quá dài thì cũng không cần thiết vì

như vậy sẽ tốn dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn, độ nhạy sẽ kém.

Do đó giá trị R chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất A và B ra khỏi nhau là

tốt. Nghĩa là chỉ cần hai pic vừa tách hẳn ra khỏi nhau dứt khoát là được, tức

là WAB = (WA + WB). Trong thực tế, nếu các pic cân đối thì độ phân giải tối

thiểu để hai peak tách nhau là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù

hợp.

1.4.4.2. Hệ số bất đối xứng

Hệ số bất đối Asys cho biết mức độ không đối xứng của pic sắc ký trên

sắc ký đồ thu được. Hệ số này được tính bằng tỷ số độ rộng pic sắc ký ở nửa

sau (b) và nửa trước (a) ở vị trí tương ứng với chiều cao bằng 1/10 của chiều

cao cực đại (Hmax), công thức tính như sau:

Trong đó:

- a: nửa chiều rộng phía trước pic

30

- b: nửa chiều rộng phía sau pic

- (cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao pic)

Hình 1.6 Sự cân đối của pic HPLC

Giá trị Asys càng gần 1, pic càng đối xứng. Khi Asys ≤ 2,5 thì phép định

lượng được chấp nhận. Khi Asys > 2,5 thì điểm cuối của pic rất khó xác định,

vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho pic

cân đối hơn.

1.5. TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU TiO2/SBA-15

1.5.1. Giới thiệu chung về vật liệu TiO2/SBA-15

Ngày nay, xã hội phát triển cùng với sự bùng đổ dân số và tốc độ tăng

trưởng đô thị hóa, công nghiệp hóa đã và đang tạo ra một sức ép lớn tới môi

trường sống ở Việt Nam. Nền công nghiệp và dân số phát triển đòi hỏi một

nguồn cung cấp nước phong phú và vững bền. Đi kèm với vấn đề đó là sự ảnh

hưởng tới môi trường sống của con người, đặc biệt là môi trường nước. Trong

đó, nhiễm bẩn hữu cơ đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu của các nhà

nghiên cứu. Chất thải hữu cơ chứa hàm lượng các chất hữu cơ khó phân hủy

như các hợp chất vòng benzene, những chất có nguồn gốc từ các chất tẩy rửa,

thuốc trừ sâu, thuốc kích thích sinh trưởng, thuốc diệt cỏ, hóa chất công

nghiệp..., các chất có độc tính cao đối với sinh vật (gồm các loài sinh vật có

khả năng lây nhiễm được đưa vào trong môi trường nước. Ví dụ như nước

31

thải của các bệnh viện khi chưa được xử lý hoặc xử lý không triệt để các mầm

bệnh). Hiện nay, để xử lý chúng không thể sử dụng chất oxi hóa thông

thường, mà cần phải có một vật liệu mới có khả năng oxi cực mạnh.

Gần đây, việc sử dụng phản ứng xúc tác quang của các chất bán dẫn

như TiO2, ZnO, CdS và Fe2O3.. cấu trúc nano để tạo ra các gốc có tính oxy

hóa mạnh đang thu hút sự quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng

dụng.

So với các chất xúc tác quang khác, TiO2 thể hiện các ưu điểm vượt trội

do giá thành thấp, hiệu năng xúc tác quang cao, bền hóa học và thân thiện với

môi trường. Tuy nhiên, nhược điểm của vật liệu TiO2 được điều chế theo

phương pháp thông thường có diện tích bề mặt không lớn, hoạt tính xúc tác

quang chỉ thể hiện trong vùng ánh sáng tử ngoại và độ phân tán của xúc tác

trong hệ phản ứng dị thể không tốt. Nếu sử dụng TiO2 dưới dạng các hạt nano

để làm chất xúc tác sẽ khó thu hồi sau phản ứng. Trong lúc đó, như một chất

xúc tác lý tưởng, các vật liệu oxit silic mao quản trung bình , đặc biệt là SBA-

15 đã thực hiện tốt nhiệm vụ bởi chúng có diện tích bề mặt lớn, kích thước

mao quản có thể điều chỉnh được, khung mao quản có độ trật tự cao và đặc

biệt là trong suốt đối với tia UV. Các vật liệu xúc tác TiO2 thường được tổng

hợp theo hai phương pháp là: tổng hợp trực tiếp từ các tiền chất Si, Ti trong

sự có mặt của chất định hướng cấu trúc P123, môi trường axit và một số tác

nhân khác hoặc tổng hợp gián tiếp bằng cách phân tán TiO2 trên chất nền

SBA-15 [27]. Vì vậy, tổ hợp vật liệu TiO2/SBA-15 đã được rất nhiều nhà

nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước chế tạo và ứng dụng vào các công

trình nghiên cứu bởi nó có những ưu điểm như cải thiện được độ bền, độ đồng

đều của cỡ hạt, khả năng điều khiển hình dạng và kích cỡ nano mét của hạt,

khả năng độ hấp phụ, độ phân tán tâm xúc tác, khả năng tách, hoàn nguyên

xúc tác.

Chính vì những lí do trên nên TiO2/SBA-15 đang được ứng dụng rất

nhiều trong lĩnh vực xử lý môi trường, nó rất có ý nghĩa về mặt khoa học và

thực tiễn. Tuy vậy, việc ứng dụng vật liệu này trong xử lý kháng sinh của

32

nước thải bệnh viện còn đang là vấn đề mới mẻ và cẩn thiết phải được nghiên

cứu.

1.5.2. Ứng dụng của TiO2/SBA-15 trong xử lý môi trường

Th.S Bùi Thị Mai Lâm đã nghiên cứu tổng hợp TiO2/SBA-15 theo

phương pháp trực tiếp và ứng dụng trong xử lý các hợp chất hữu cơ ô nhiễm

trong nước thải của vật liệu xúc tác quang TiO2/SBA-15. Kết quả ứng dụng

cho thấy hàm lượng COD của mẫu chưa xử lý là 2272 mg/l trong mẫu nước

thải của nhà máy dệt nhuộm thuộc loại rất ô nhiễm, không thể thải trực tiếp ra

môi trường được. Chỉ số COD của mẫu sau khi xử lý là 368 mg/l, giảm đáng

kể so với mẫu ban đầu. Điều này đã mở ra triển vọng đối với việc ứng dụng

vật liệu nano tổ hợp trong việc xử lý môi trường dưới các điều kiện và nguồn

sáng tự nhiên [27].

Xiaoling Ren cùng các cộng sự [28] đã nghiên cứu quá trình khử lưu

huỳnh xúc tác (CADS) của mô hình nhiên liệu diesel bằng cách sử dụng

TiO2/SBA-15 trong điều kiện nhẹ. Sự hấp thụ khử lưu huỳnh nồng độ cao từ

12,7 mg/g đã được giảm xuống nồng độ thấp ở 15 ppmw-S bởi TiO2/SBA-15.

Kết quả động học cho thấy trạng thái cân bằng xúc tác CADS với TiO2/SBA-

15 đã đạt được nhanh chóng trong 0,5 giờ. Sự hấp thụ khử lưu huỳnh vượt

trội ở dải nồng độ thấp, hoạt động ở điều kiện ôn hòa và chi phí tổng hợp chất

hấp phụ thấp cho hệ thống CADS. TiO2/SBA-15 đã trở thành phương pháp

khử lưu huỳnh hiệu quả và kinh tế để sản xuất nhiên liệu sạch.

Ge Li cùng cộng sự [29] đã ứng dụng TiO2/SBA-15 trong quá trình khử

quang xúc tác của Dimethoate dưới ánh sáng mặt trời mô phỏng. Kết quả cho

thấy 26% TiO2/SBA-15 hoạt động xúc tác quang hóa cao nhất và dimethoate

bị phân hủy hoàn toàn trong vòng 7 giờ. Hoạt tính xúc tác của TiO2/SBA-15

cao hơn 62% so với TiO2 tinh khiết. Các đặc tính hấp phụ và khử điện tử của

SBA-15 là những lý do chính cho sự tăng cường quan sát được tốc độ phân

hủy thuốc trừ sâu. TiO2/SBA-15 duy trì hoạt động xúc tác quang cao và ổn

định tốt trong bốn chu kì với tỷ lệ phân hủy Dimethoate lớn hơn 94 %. Các

sản phẩm phụ được tạo ra trong quá trình quang xúc tác được xác định bằng

phương pháp sắc ký khối phổ.

33

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Thiết lập phương pháp phân tích kháng sinh Norfloxacin và

Amoxicillin trong nước thải bệnh viện bằng HPLC.

Đánh giá hiệu quả xử lý Norfloxacin và Amoxicillin có trong nước thải

bệnh viện khi sử dụng vật liệu TiO2/SBA-15.

2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu tập trung vào việc ứng dụng phương pháp sắc ký

long hiệu năng cao – HPLC để đánh giá hiệu quả xử lý kháng sinh

Amoxicilin và Norfloxacin bằng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15 trong nước

thải bệnh viện sau xử lý.

2.2.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao

gồm:

- Tối ưu hóa các điều kiện xác định kháng sinh Norfloxacin và

Amoxicillin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Detector UV

- Xây dựng quy trình phân tích mẫu nước thải bệnh viện

- Đánh giá phương pháp phân tích

2.3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.3.1. Thiết bị

STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số

1

Các bình chứa

pha động (thể

tích 1000ml)

Chai thủy tinh

đựng hóa chất

Duran

(Đức)

2 Cột sắc kí Nova-Pak C18 Water Kích thước

34

STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số

(pha tĩnh) Column (4 µm;

150 × 3,9 mm)

3 Bộ phận khử khí Degasser

DGU – 14A

Shimadzu

(Nhật Bản) C20924208780

4 Bơm cao áp Liquid pump

LC – 10AD SP

Shimadzu

(Nhật Bản) 228-36501-38

5 Bộ phận tiêm

mẫu tự động Auto injector

Shimadzu

(Nhật Bản) SIL-10AF

6 Hệ thống điểu

khiển

System

controler

SCL – 10A SP

Shimadzu

(Nhật Bản) C21014215064

7 Đầu dò

Detector

UV-Vis

SPD-M20A

Shimadzu

(Nhật Bản) L20154908054

8

Bộ gia nhiệt và

ổn nhiệt độ cho

cột sắc kí

Oven

HIC – 10A

Shimadzu

(Nhật Bản) C21354100131

9

Thiết bị nhận tín

hiệu và phần

mềm điều khiển

hệ thống

Bộ PC cài đặt

phần mềm

Phần mềm do

hãng Shimadzu

(Nhật Bản)

cung cấp

L50184100123UT

10 Máy đo pH SevenCompact

pH/Ion S220

Mettler –

Toledo Group

(Thụy Sỹ)

123215500

11 Máy siêu âm Ultrasonic Đức 901008129

35

STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số

LC 60H

12 Giấy lọc thô Filter papers Whatman

(Mỹ)

13 Giấy lọc

PTFE 0,45µm

Membrane

Filter

Startech

(Đài Loan)

14 Đầu lọc

PTFE 0,45µm

PTFE Syring

filter

Finetech

(Đài Loan)

15 Bơm hút chân

không Neuburger Đức 02872831

16 Tủ sấy JSOF-150 Hàn Quốc 080314-02

17

Cân phân tích,

độ chính xác

0,0001g.

Balances and

Precious Metal

scales

Sartorius

(Đức)

18

Máy quang phổ

tử ngoại khả

kiến

(UV-VIS)

Lambda 35

UV/Vis

spectrometor

Perkin Elmer 502508090202

19 Máy lắc Vortex mixer Labnet (Mỹ) Z1091318

20 Máy khuấy

(2 máy)

Hotplate Stirrer

JSHS-18D

JSR

(Hàn Quốc) 1210101187U099

21 Máy li tâm Centrifuge

Combi 514R Hàn Quốc NCBLC2211006

2.3.2. Dụng cụ

- Micropipet 1-10µl; 10-100µl và 100-1000µl;

- Pipet 1,00ml; 2,00ml; 5,00ml và 10,00ml;

36

- Bình định mức: 10ml, 25ml, 50ml, 100ml, 250ml, 500ml;

- Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 1000ml;

- Ống nhỏ giọt, bình tia nước cất, giấy bạc, con từ, lọ thủy tinh tối màu;

- Xilanh 12ml/CC, 50ml/CC.

2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn

2.3.3.1. Chất chuẩn

STT Tên chất chuẩn Số lô hiện hành Hãng Hàm lượng

nguyên trạng (%)

1 Norfloxacin SLBF7610V Sigma-

Aldrich ≥ 98 %

2 Amoxicillin SLBF8233V Sigma-

Aldrich ≥ 98 %

Dung dịch đơn chuẩn

Để có thể định lượng được Norfloxacin và Amoxicillin, việc chuẩn bị

dung dịch gốc là rất cần thiết. Tiến hành cân chính xác 0,0100 ± 0,0001g từng

chất chuẩn NOR và AMOX vào hai bình định định mức 100 ml tương ứng và

ghi nhãn đánh dấu. Định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần và khuấy từ 24

giờ, thu được hai dung dịch gốc: NOR 100 mg/L và AMOX 100 mg/L . Dung

dịch được đựng trong lọ thủy tinh tối màu 100 mL, đậy nắp kín và bảo quản

lạnh sau mỗi lần sử dụng .

Dung dịch hỗn hợp chuẩn

Dung dịch gốc hỗn hợp là dung dịch bao gồm NOR và AMOX đều có

nồng độ là 100 mg/L. Dung dịch hỗn hợp chuẩn chuẩn bị như sau: Lấy lần

lượt 50ml của từng dung dịch đơn chuẩn NOR (100 mg/L) và AMOX (100

mg/L) vào trong bình định mức 100 mL rồi đem lắc lên để hòa trộn đều.

Dung dịch sau khi pha được đựng trong lọ thủy tinh tối màu 100 mL, vặn nắp

kín và bảo quản lạnh mỗi lần sử dụng.

37

2.3.3.2. Dung môi pha động

Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với

các tài liệu tham khảo để khảo sát lựa chọn ra dung môi thích hợp. Các dung

môi sử dụng cho sắc ký luôn là những loại tinh khiết dành cho HPLC. Tiến

hành pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ, để ổn định, lọc dung môi

qua màng lọc PTFE 0,45 μm kết hợp bộ hút chân không và rung siêu âm

trước khi sử dụng để loại bỏ bọt khí.

STT Tên dung môi Tiêu chuẩn Hãng Hàm lượng

nguyên trạng (%)

1 Acetonitrile Dùng cho HPLC Avantor

(Mỹ) ≥ 99,9 %

2 Methanol Dùng cho HPLC Merk KGaA

(Đức) ≥ 99,9 %

2.3.3.3. Hóa chất khác

STT Tên hóa chất Hãng Nơi sản

xuất

Hàm lượng

nguyên trạng (%)

1 TiO2-SBA/15

2 Ortho-Phosphoric

acid 85% Merk KGaA Đức ≥ 98 %

3 Triethylamine Merk KGaA Đức ≥ 99 %

4 Potassium

dihydrogen phosphate Merk KGaA Đức 99,5 %

5

Disodium hydrogen

phosphate

dodecahydrate

Merk KGaA Đức ≥ 99 %

38

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Chuẩn bị mẫu

Mẫu nước thải bệnh viện được lấy tại bể đầu ra sau hệ thống xử lý nước

thải của bệnh viện. Mẫu lấy tại hiện trường được chứa trong bình thủy tinh tối

màu và bảo quản lạnh. Mẫu sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm được lọc

qua giấy lọc thô để loại bỏ các chất rắn, cặn lơ lửng chứa trong mẫu. Sau khi

lọc, mẫu được chuyển vào các lọ thủy tinh tối màu và bảo quản lạnh để phục

vụ cho việc phân tích.

2.4.2. Khảo sát bước sóng phát hiện chất

Xác định phổ UV của kháng sinh Norfloxacin và Amoxicilin bằng máy

quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS). Tiến hành pha loãng 10 lần dung dịch

gốc đơn NOR (100 mg/L), AMOX (100 mg/L) và dung dịch hỗn hợp chuẩn

(100 mg/L) để có được dung dịch NOR (10 mg/L), dung dịch AMOX (10

mg/L) và dung dịch hỗn hợp chuẩn (10 mg/L). Đo lần lượt các dung dịch vừa

pha loãng để xác định đỉnh cực đại hấp thụ (λ) của hai chất. Mỗi dung dịch đo

lặp 3 lần và lấy giá trị trung bình. Lựa chọn bước sóng tại vị trí cực đại hấp

thụ của AMOX và NOR để phục vụ cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo.

2.4.3. Qui trình vận hành hệ thống HPLC

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất,

phần mềm điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Đối với hệ thống HPLC đang

sử dụng để phục vụ nghiên cứu tại phòng thí nghiệm, trước khi bật cần kiểm

tra các chai đựng pha động, bổ sung pha động và nước cất nếu cần. Pha động

luôn phải được siêu âm kết hợp bơm hút chân không để loại bỏ hoàn toàn bọt

khí trước khi chạy máy. Kiểm tra và lắp cột chính xác đúng chiều chạy pha

động, vặn chặt các đầu van để tránh sự rò rỉ của pha động.

Bật nguồn điện cung cấp cho hệ thống máy HPLC-Shimadzu. Bật nút

“Start” theo thứ tự:

- Bơm cao áp (Pump)

- Bộ khử khí (Degasser)

39

- Bơm mẫu tự động (Auto-injector)

- Buồng ổn nhiệt cho cột phân tích (Oven)

- Detector độ dẫn (Conductivity detector)

- Bộ điều khiển (System controller)

- Máy tính kết nối ghi nhận tín hiệu (PC)

- Phần mềm ghi nhận và phân tích tín hiệu (LC solution)

Trước khi chạy máy luôn phải loại bỏ bọt khí còn sót trong ống dẫn và

bình chứa pha động bằng chế độ Purge bơm. Sau khi Purge xong, tạo Method

và cài đặt chương trình chạy. Sau khi lưu Method, bật chương trình chạy để

ổn định trước khi tiến hành phân tích tối thiểu 30 phút. Sau khi chạy phân tích

mẫu xong, rửa hệ thống ít nhất 30 phút – 1 giờ và tắt lần lượt theo thứ tự

ngược lại của thứ tự bật máy.

2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ưu hóa hệ thống sắc ký

2.4.1.1. Lựa chọn pha tĩnh

Qua các nghiên cứu trước đây, các tác giả chủ yếu lựa chọn cột pha đảo

như: Agilent Zorbax SB-C18 (5 µm; 4,6 × 250 mm), cột C18 (Waters,

Milford, USA, 25cm × 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm), cột Restek C18 (5 µm;

0,46 cm × 25 cm) và cột pha thuận như Lichrosorb C8 (10 µm; 20 cm × 4,6

mm),.. cho việc xác định Norfloxacin. Một số cột pha đảo để tiến hành định

lượng Amoxicilin như Whatman ODS-3 (5 µm; 100 × 4,6 mmđược ), cột

Agilent Zorbax SB-C18 (5 µm; 4,6 × 250 mm), cột RP-18e (100 × 4,6 mm),

cột C18 (5 µm; 250 × 4,6 mm)…

Với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, cột Nova-Pak C18 pha đảo

(4 µm; 150 × 3,9 mm), dựa trên Silica của hãng Waters đã được lựa chọn để

phân tích thành phần kháng sinh Norfloxacin và Amoxicilin trong nước thải

bệnh viện. Loại cột này được kỹ thuật viên thường xuyên kiểm tra, vệ sinh và

đánh giá tình trạng hoạt động.

40

2.4.1.2. Lựa chọn thể tích vòng mẫu

Độ chính xác, độ đúng, lượng mẫu cần thiết nạp vào cột sắc ký không

những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ

thuật nạp mẫu.

Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi

được thể tích bơm mẫu vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng làm chân pic sắc

ký doãng ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu quá lớn thì hiện tượng doãng

pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách.

Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn.

Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột

tách chiều cao hay diện tích của peak sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu =

V0 mà vẫn tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc ký sẽ không tăng

nữa và lúc đó pic sắc ký sẽ tù, doãng chân và không sắc nét. Vì vậy việc lựa

chọn thể tích cũng rất quan trọng.

Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng

nhỏ càng tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao và tránh doãng pic. Trong phân

tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 40, 50, 100 μl

trong đó vòng mẫu 20 μl thường hay được sử dụng nhất. Trong đề tài này, để

định lượng AMOX và NOR, thể tích vòng mẫu là 20 μl phù hợp với thiết bị

nạp mẫu (injector) 20 μl đã được lựa chọn để phục vụ cho các công đoạn thí

nghiệm.

2.4.1.3. Khảo sát chương trình pha động

Một trong các yếu tố quan trọng nhất khi chạy HPLC chính là thành

phần pha động. Nó quyết định dạng tồn tại và hiệu suất tách sắc ký của một

hỗn hợp mẫu chất phân tích. Dựa vào đặc tính lý hóa của các chất phân tích

và các tài liệu tham khảo nghiên cứu trong và ngoài nước, tiến hành khảo sát

41

chương trình rửa giải gradient với các hệ pha động, bao gồm các dung môi

(Acetonitrile, Methanol, nước) và các hệ đệm (sử dụng KH2PO4, Na2HPO4,

H3PO4, Triethylamine để điều chỉnh đệm sao cho phù hợp với yêu cầu mong

muốn) với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn hệ pha động cho ra tín hiệu kết quả

tốt nhất.

2.4.1.4. Khảo sát tốc độ dòng

Khi pha động đã có một thành phần phù hợp nhưng nếu tốc độ rửa giải

của pha động không phù hợp thì cũng chưa có được kết quả tách sắc ký hoàn

toàn tốt. Tốc độ pha động cũng là yếu tố quan trọng vì nó ảnh hưởng đến quá

trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng

quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng pic, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên

nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách

khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo pic lên nhau. Vì

vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích.

Tiến hành khảo sát tốc độ dòng: 0,8 ml/p; 0,9 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,1

ml/phút và 1,2 ml/phút với các thông số cài đặt chương trình.

2.4.2. Thẩm định phương pháp

Sau khi khảo sát quá trình xử lý mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành

thẩm định phương pháp định lượng Norfloxacin và Amoxicilin bằng HPLC-

UV theo hướng dẫn của ICH và có tham chiếu theo quy định của AOAC.

2.4.2.1. Tính chọn lọc

Tính chọn lọc của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng

chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất

cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc được thể hiện

trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu

trắng, pic của chất phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp. Trên sắc ký đồ

mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian

lưu của mẫu chuẩn.

42

Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp NOR và AMOX (

nồng độ 0,1 mg/L ) với chương trình sắc ký đã lựa chọn trên nền mẫu chuẩn.

Sắc ký đồ phân tích trên máy HPLC đối với mẫu trắng phải không cho tín

hiệu tại thời gian lưu tương ứng với chất phân tích.

2.4.2.2. Tính thích hợp của hệ thống

Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn

hệ thống phân tích bởi các yếu tố máy móc thiết bị. Tiến hành tiêm lặp lại 6

lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện

tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối

RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu và diện tích

pic có RSD ≤ 2 %.

2.4.2.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn

độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất

phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu

đường nền, thông thường lấy S/N = 3.

Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) là nồng độ thấp nhất của

chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích

có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. LOQ

được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường

nến, thông thường lấy S/N = 10.

Trong đó: S: chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N: nhiễu đường nền.

Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ

thấp nhất xác định được bằng sắc ký. Xác định tỷ lệ S/N.

Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: chuẩn bị

một mẫu trắng (chứa pha động), pha loãng mẫu chuẩn chứa hỗn hợp NOR và

AMOX nồng độ 1,5 mg/L đến khi nào sắc ký đồ thể hiện chiều cao pic

43

khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn

phát hiện LOD của thiết bị. Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức:

LOQ = 10/3 LOQ

2.4.2.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay

thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính.

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

dưới dạng:

Y = aX + b

Trong đó: Y là tín hiệu chất phân tích

X là nồng độ chất phân tích

Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới

hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao

nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6)

nồng độ khác nhau. Tiến hành pha một dãy các dung dịch chuẩn và thực hiện

sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Thu thập kết quả về chiều cao pic, sử dụng

phần mềm Microsoft Excel 2016 để xây dựng phương trình hồi quy thể hiện

mối quan hệ giữa nồng độ và tín hiệu chất phân tích dưới dạng Y = aX + b.

Yêu cầu phương trình hồi quy phải có hệ số tương quan 0,99 ≤ R2 ≤ 1. Cách

kiểm tra: xây dựng các phương trình đường chuẩn trên phần mềm Minitab 10.

Từ đó tìm ra giá trị Pvalue của giá trị a. So sánh giá trị Pvalue với giá trị 0,05.

Nếu Pvalue > 0,05 thì a ≠ 0 không có ý nghĩa thống kê, hay nói cách khác

phương trình hồi quy không mắc sai số hệ thống.

2.4.2.3. Độ chính xác (độ đúng và độ chụm)

Độ đúng và độ chụm dùng để diễn tả độ chính xác của một phương

pháp phân tích. Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết

quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Độ chụm

chỉ mức độ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị

trung bình.

44

Độ chụm

Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và

với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều

này do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, không thể kiểm soát

được hoàn toàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Do đó,

để kiểm soát được các sai số này, phải dùng đến độ chụm. Độ chụm chỉ phụ

thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm

được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm

càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn. Độ chụm có thể

được phân ra thành ba trường hợp sau:

- Độ lặp lại

- Độ chụm trung gian

- Độ tái lặp

Sự khác nhau giữa độ lặp lại , độ chụm trung gian và độ tái lặp được

tóm tắt trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Sự khác nhau giữa độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lặp

Điều kiện Độ lặp lại Độ chụm trung gian Độ tái lặp

Nền mẫu Khác Khác Khác

Nồng độ Khác Khác Khác

Thiết bị Giống Khác Khác

Người phân tích Giống Khác Khác

Dụng cụ, hóa chất Giống Khác Khác

Điều kiện môi trường Giống Khác Khác

Phòng thử nghiệm Giống Giống Khác

Tiến hành thí nghiệm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần) trên cùng một mẫu.

Mẫu phân tích có thể là mẫu chuẩn, mẫu trắng có thêm chuẩn, mẫu thử hay

mẫu thử thêm chuẩn. Các mẫu được dùng phân tích ở nồng độ khác nhau

(trung bình, thấp, cao) trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ làm lặp lại 10 lần

45

(ít nhất 6 lần). Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ

số biến thiên CV theo các công thức sau:

SD =

RSD% = CV% = × 100

Trong đó: SD là độ lệch chuẩn

n là số lần thí nghiệm

xi là giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

xtb là giá trị trung bình của các lần thử nghiệm

RSD% là độ đệch chuẩn tương đối

CV% là hệ số biến thiên

Sau khi có kết quả phân tích, đối chiếu giá trị tính được với giá trị

mong muốn hay giá trị yêu cầu hoặc so với RSD% lặp lại thể hiện trong bảng

“Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) – Tr.44

– Chương II – Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật

– Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – NXB. Khoa học và

kỹ thuật Hà Nội”.

Độ đúng

Độ đúng của phương pháp chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung

bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là

đúng (µ). Do đó, thước đo độ đúng thường được đánh giá qua sai số tương đối

bằng phương pháp xác định độ thu hồi. Hiệu suất thu hồi được tính bằng tỷ lệ

phần trăm lượng lượng chất chuẩn thêm vào mẫu dược liệu và giá trị hàm

lượng tìm lại được tính toán từ kết quả đo thông qua công thức:

46

Trong đó:

R(%): Hiệu suất thu hồi

Ct: Nồng độ thực tế của chất phân tích thu được sau xử lý

Ct: Nồng độ lý thuyết của chất phân tích tính toán từ lượng chuẩn thêm

vào

Phân tích mẫu thử hoặc mẫu trắng ở ba mức nồng của các chất cần

phân tích. Mỗi mức thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu, làm lặp tối

thiểu bốn lần bằng phương pháp khảo sát rồi tính độ thu hồi.

2.4.3. Khảo sát quy trình xử lý Norfloxacin và Amoxicillin bằng vật

liệu TiO2/SBA-15

2.4.3.1. Khảo sát hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15

Mục đích của việc khảo sát hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 nhằm

nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác đến hiệu quả xử lý Norfloxacin

và Amoxicillin trên vật liệu TiO2/SBA-15 với các hàm hượng khảo sát thay

đổi là 0,1 g/l; 0,3 g/l; 0,5 g/l; 1,3 g/l; 1,5 g/l. Các thí nghiệm được thực hiện ở

nhiệt độ 25oC, nguồn bức xạ là đèn UVA (λ = 365 nm; 4x8 W), thể tích dung

dịch hỗn hợp mẫu thử (nền pha động) Norfloxacin và Amoxicillin là 80 ml và

nồng độ Norfloxacin và Amoxicillin đầu vào là 10 mg/L. Mẫu được đưa vào

hệ thống HPLC để phân tích.

2.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tham gia phản ứng

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất phản ứng

(Norfloxacin và Amoxicillin) đến hiệu quả xử lý của vật liệu TiO2/SBA-15

được thực hiện với nồng độ Norfloxacin và Amoxicillin lần lượt là 1 mg/l; 3

mg/l; 5 mg/l; 7 mg/l; 10 mg/l. Kết quả được thể hiện qua tín hiệu chiều cao

pic sắc ký được phân tích trên phần mềm Lab Solution của hệ thống HPLC.

47

2.4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

Sau quá trình khảo sát và thu thập kết quả từ mục 2.4.3.1 và 2.4.3.3, lựa

chọn được hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 và nồng độ chất phản ứng

Norfloxacin và Amoxicillin để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt

độ. Nghiên cứu được thực hiện với các mức nhiệt độ lần lượt là 25oC, 50oC và

75oC; nguồn bức xạ là đèn UVA (λ = 365 nm; 4x8 W).

2.4.3.4. Độ ổn định của chất xúc tác

Độ ổn định của chất xúc tác được thực thực hiện bằng cách tiến hành 6

lần thí nghiệm trên vật liệu TiO2/SBA-15 với các điều kiện tối ưu thu được

sau quá trình khảo sát từ mục 2.4.3.1; 2.4.3.2; 2.4.3.3 dưới nguồn bức xạ là

đèn UVA (λ = 365 nm; 4x8 W).

2.4.4. Ứng dụng vật liệu TiO2/SBA-15 để xử xý kháng sinh

Norfloxacin và Amoxicillin trong nước thải bệnh viện

2.4.4.1. Điều kiện tiến hành

Sau khi khảo sát xử lý kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin bằng vật

liệu TiO2/SBA-15 trên mẫu thử (nền pha động) và đưa ra được quá trình tối

ưu ở mục 2.4.3.4, tiến hành ứng dụng vật liệu TiO2/SBA-15 để xử lý

Norfloxacin và Amoxicillin trên nền mẫu thật (mẫu nước thải bệnh viện đã

qua xử lý). Quy trình lấy mẫu nước thải được tuân theo TCVN 5999:1995

(ISO 5667/10: 1992) và TCVN 6663-3:2008. Các mẫu sau khi thu thập tại

hiện trường được dán nhãn rõ ràng, bảo quản lạnh và vận chuyển đến phòng

thí nghiệm trong vòng 1 giờ. Phân tích mẫu đầu vào và mẫu đẩu ra sau khi

được xử lý qua vật liệu dựa trên mối quan hệ giữa nồng độ và chiều cao pic

sắc ký để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải bệnh viện bằng vật liệu

TiO2/SBA-15.

2.4.4.2. Xác nhận giá trị sử dụng

Kết quả mẫu đầu ra trước và sau khi xử lý bằng vật liệu TiO2/SBA-15

được thẩm định dựa trên mục 2.4.2. Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một

điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc

trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao và diện tích pic sắc ký

48

có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng nồng độ nhất

định và không lớn, mối quan hệ tuyến tính như sau:

Hi = k1 . Ci = f(C) (1)

Hi = k1 . Ci = f(C) (2)

Trong đó:

- Hi và Si là chiều cao và diện tích pic của sắc ký cấu tử i

- Ci là nồng độ của cấu tử I với thời gian lưu tRi

- K1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc

ký cũng như bản chất pha tĩnh.

Dựa trên (1) và (2) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo

phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn.

Gía trị trung bình:

Độ lệch chuẩn:

Độ lệch chuẩn tương đối:

Các số liệu sau khi thu thập được đưa vào phần mềm Minitab 16 và

Microsoft Excel 2016 để thống kê và phân tích kết quả.

49

2.4.4.3. Đánh giá hiệu quả xử lý

Tiến hành thu thập kết quả phân tích các mẫu trước và sau khi xử lý

bằng vật liệu TiO2/SBA-15 được ghi lại từ phần mềm hệ thống HPLC để đánh

giá hiệu quả xử lý Norfloxacin và Amoxicillin theo công thức sau:

η = (C0-C)*100/C0.

Trong đó :

- C : Nồng độ từng chất kháng sinh (mg/l) ở thời gian bức xạ t (phút)

- C0 : Nồng độ ban đầu từng chất kháng sinh (mg/l)

50

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH SẮC KÝ

3.1.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu

Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện chất, chúng tôi tiến hành

quét phổ UV của kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin trên máy đo quang

phổ UV-Vis với dải bước sóng từ 190 nm đến 700nm. Kết quả được thể hiện

trên Hình 3.1.

Hình 3.1 Phổ hấp thụ cực đại của Norfloxacin và Amoxicillin

trong vùng UV-Vis

Kết quả sau khi quét phổ (Hình 3.1) cho thấy Norfloxacin có đỉnh hấp

thụ cực đại tại bước sóng 273 nm và Amoxicillin có đỉnh hấp thụ cực đại tại

bước sóng 228 nm. Vì vậy bước sóng 228 nm và 273 nm được lựa chọn để

xác định đồng thời kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin trong nước thải.

51

3.1.2. Pha tĩnh và thể tích vòng mẫu

Cột Nova-Pak C18 pha đảo (kích thước hạt 4 µm; kích cỡ cột 150 × 3,9

mm) của hãng Waters và thể tích vòng mẫu là 20 µl đã được lựa chọn và thiết

lập cố định trong suốt quá trình thí nghiệm.

3.1.3. Khảo sát thành phần pha động

Để lựa chọn được hệ pha động phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát

các hệ pha động khác nhau trong cùng điều kiện sắc kí như sau:

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Nồng độ chất chuẩn: 10 mg/L

- Thể tích vòng mẫu: 20 µl

- Bước sóng: 228 nm (AMOX) và 273 nm (NOR)

- Lò ổn nhiệt cột sắc ký: 400C

Các hệ pha động được sử dụng để khảo sát bao gồm:

- Hệ PD1 (Methanol/ đệm KH2PO4 - H3PO4)

- Hệ PD2 (Methanol/ đệm KH2PO4 - H3PO4/ Acetonitrile)

- Hệ PD3 (Acetonitrile/ đệm H3PO4 – Triethylamine)

- Hệ PD4 (Acetonitrile/ đệm Na2HPO4 - H3PO4)

- Hệ PD5 (Acetonitrile/ đệm KH2PO4 - H3PO4)

- Hệ PD6 (Methanol/ đệm Na2HPO4 - H3PO4)

Kết quả khảo sát được thể hiện như sau:

52

Hình 3.2 Sắc ký đồ hệ PD1

Hình 3.3 Sắc ký đồ hệ PD2

53

Hình 3.4 Sắc ký đồ hệ PD3

Hình 3.5 Săc ký đồ hệ PD4

54

Hình 3.6 Sắc ký đồ hệ PD5

Hình 3.7 Sắc ký đồ hệ PD6

55

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát 6 hệ pha động

PD1 PD2 PD3 PD4 PD5 PD6

AMOX

T (min) 2,337 2,191 1,159 2,242 2,260 2,244

Hpeak (mAu) 26208 37496 36158 36826 35232 39067

Tf 2,450 2,157 2,574 2,530 2,391 2,553

NOR

T (min) 4,582 3,243 3,920 4,717 4,068 4,262

Hpeak (mAu) 22180 73072 32665 54379 91704 46865

Rs 2,455 1,442 6,308 1,492 2,501 3,104

Tf 3,591 3,243 2,867 2,918 2,469 3,527

Từ các kết quả khảo sát trên cho thấy hệ PD5 cho ra tín hiệu chiều cao

pic tốt nhất, hệ số kéo đuôi thấp và độ phân giải có giá trị đạt yêu cầu (RS ≥ 1)

để hai chất tách ra khỏi nhau hoàn toàn. Vì vậy, hệ PD5 gồm Acetonitrile/

đệm KH2PO4 - H3PO4 được sử dụng cố định cho các mục đích nghiên cứu tiếp

theo.

3.1.4. Khảo sát tỷ lệ pha động

Tỷ lệ pha động có ảnh hưởng trực tiếp đến lực rửa giải các chất phân

tích, thời gian lưu và hệ số tách của hai chất. Tiến hành khảo sát tỷ lệ pha

động với các điều kiện như sau:

- Thành phần pha động: ACN - đệm KH2PO4 (điều chỉnh pH = 3 với

H3PO4)

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Nồng độ chất chuẩn: 10 mg/L

- Thể tích vòng mẫu: 20 µl

- Bước sóng: 228 nm và 273 nm

- Lò ổn nhiệt cột sắc ký: 400C

56

Hình 3.8 Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động

Bảng 3.2 Các tỷ lệ khảo sát pha động

STT

Tỷ lệ khảo sát (v/v)

ACN Đệm KH2PO4 (điều chỉnh

pH = 3 với H3PO4)

1 40 60

2 30 70

3 25 75

4 20 80

5 15 85

Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động (Hình 3.8) cho thấy: thời gian lưu

của Amoxicillin không thay đổi nhiều ( phút 2,2 ± 0,1), tỷ lệ ACN càng giảm

thì chiều cao pic càng giảm, thời gian lưu của Norfloxacin càng tăng, độ phân

57

giải càng lớn. Các tỷ lệ (1); (2); (3) đều không đáp ứng được độ phân giải tối

thiểu (R ≥ 1); tỷ lệ ACN càng tăng thì hai chất càng gần nhau, không tách ra

khỏi nhau rõ ràng. Tỷ lệ (5) cho thấy thời gian lưu của Norfloxacin càng tăng,

độ phân giải lớn, chiều cao pic càng giảm. Tuy nhiên không cần thiết vì như

vậy sẽ tốn nhiều dung môi ( pha động ) và thời gian để rửa giải các chất. Tỷ lệ

(4) có hệ số độ phân giải là R = 3,682; đạt yêu cầu để hai chất tách khỏi nhau

hoàn toàn và tiết kiệm dung môi. Vì vậy tỷ lệ pha động ACN – đệm KH2PO4,

pH = 3 với H3PO4 (20:80) sẽ được dùng cho các công trình thí nghiệm tiếp

theo.

3.1.5. Khảo sát tốc độ dòng

Tốc độ dòng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng

đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc

độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng pic, thời gian rửa giải lâu hơn.

Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp

không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo pic

lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân

tích.

Tiến hành khảo sát tín hiệu chất Norfloxacin và Amoxicillin với tốc độ

dòng thay đổi theo thứ tự là 0,8 ml/phút; 0,9 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,1

ml/phút; 1,2 ml/phút theo các điều kiện sắc ký đã khảo sát ở mục 3.1.4. Kết

quả được thể hiện ở Hình 3.9.

Từ kết quả trong Hình 3.9 cho thấy, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến

thời gian lưu và hệ số tách. Khi thay đổi tốc độ dòng từ 1,0 – 1,2 ml/phút, thời

gian lưu thay đổi không đáng kể. Khi thay đổi tốc độ dòng từ 1,0 – 0,8

ml/phút, thời gian lưu và chiều cao pic thay đổi rõ rệt. Tốc độ dòng càng giảm

thì sẽ kéo dài thời gian phân tích, gây ra hiện tượng doãng pic (hệ số kéo đuôi

lớn), hệ số tách càng lớn, và tín hiệu chiều cao pic càng giảm. Tốc độ dòng

càng lớn thì tín hiệu pic sẽ rõ ràng hơn, tuy nhiên sẽ làm hao tốn dung môi và

hệ số tách giảm dần. Vì vậy, để tiết kiệm dung môi , thời gian phân tích hợp

lý và hai chất có hệ số tách vừa đạt yêu cầu thì tốc độ dòng 1,0 ml/phút sẽ

58

được chọn để tiến hành định lượng Norfloxacin và Amoxicillin trong suốt quá

trình nghiên cứu.

Hình 3.9 Sắc ký đồ thể hiện tín hiệu chất AMOX và NOR với tốc độ dòng

thay đổi

59

Từ các quá trình khảo sát trên, chúng tôi đã đưa ra được các điều kiện

phân tích Norfloxacin và Amoxicillin trên hệ thống HPLC như sau:

- Pha động: ACN – đệm KH2PO4, pH = 3 với H3PO4 (20:80, v:v)

- Bước sóng: 228 nm và 273 nm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích vòng mẫu: 20 µl

3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.2.1. Độ đặc hiệu ( Tính chọn lọc )

Với mục tiêu phân tích đồng thời Norfloxacin và Amoxicillin, tiến

hành phân tích mẫu trắng (không chứa chất phân tích) và mẫu trắng thêm

chuẩn (nồng độ Norfloxacin và Amoxicillin là 0,1 mg/L). Sắc ký đồ phân tích

trên máy HPLC với mẫu trắng phải không cho tín hiệu tại thời gian lưu tương

ứng với chất phân tích. Kết quả sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 3.10 và

Hình 3.11.

Hình 3.10 Sắc ký đồ nền mẫu trắng (không chứa chất phân tích)

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng (chứa chất phân tích)

60

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn cho thấy không có sự xuất

hiện pic tạp trùng với vị trí của thời gian lưu phất phân tích Norfloxacin và

Amoxicillin (Hình 3.11). Đường nền tại vị trí peak của Norfloxacin và

Amoxicillin cho tín hiệu thấp.. Như vậy, kết quả thu được chứng tỏ phương

pháp phân tích và hệ thống lựa chọn có tính đặc hiệu tốt.

3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá thông qua giá trị RSD (%)

của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu

chuẩn hỗn hợp Norfloxacin và Amoxicillin nồng độ 0,05 mg/L với điều kiện

sắc ký đã khảo sát. Tiến hành ghi lại thời gian lưu và diện tích pic tương ứng.

Kết quả thu được như Bảng 3.3.

Bảng 3.3 Tính thích hợp của hệ thống đối với Norfloxacin và Amoxicillin

TT Norfloxacin Amoxicillin

T (phút) Hpic (mAu) T (phút) Hpic (mAu)

1 3,974 570 2,293 330

2 3,941 542 2,285 334

3 3,986 549 2,289 342

4 3,954 565 2,286 324

5 3,949 558 2,294 328

6 3,960 552 2,29 337

TB 3,961 556 2,290 333

SD 0,0167 10,4115 0,0036 6,5038

RSD (%) 0,42 1,87 0,16 1,96

Kết quả cho thấy các giá trị % RSD đối với chiều cao peak và thời gian

lưu của Norfloxacin và Amoxicillin đều nhỏ hơn 2%, cho thấy các điều kiện

61

sắc ký đã lực chọn và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp, đảm bảo độ ổn định

của phép phân tích định lượng đồng thời Norfloxacin và Amoxicillin.

3.2.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Trong một quy trình phân tích, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn

định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.

Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: chuẩn bị

một mẫu trắng làm nền (sử dụng pha động), pha loãng mẫu chuẩn gốc hỗn

hợp Norfloxacin và Amoxicillin từ nồng độ 100 mg/l thành 10 ml mẫu chuẩn

chứa hỗn hợp Norfloxacin và Amoxicillin có nồng độ 1 mg/l. Tiếp tục pha

loãng 5 -10 lần dung dịch làm việc hỗn hợp Norfloxacin và Amoxicillin, sau

đó đưa các mẫu vào hệ thống HPLC để tiến hành phân tích. Theo dõi kết quả

tín hiệu peak của Norfloxacin và Amoxicillin đến khi nào chiều cao pic gấp 2

– 3 lần đường nền thì lấy đó là LOD. Sắc ký đồ thể hiện tín hiệu giới hạn phát

hiện của Norfloxacin và Amoxicillin trên nền mẫu trắng được thể hiện trong

Hình 3.12.

Hình 3.12 Sắc ký đồ giới hạn phát hiện của Amoxicillin và Norfloxacin

Kết quả phân tích cho thấy: khi nồng độ Amoxicillin là 0,03 mg/l và

nồng độ Norfloxacin là 0,008 mg/l thì chiều cao pic của hai chất phân tích đạt

mức tỷ lệ giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) đạt xấp sỉ 3. Vì vậy:

LOD của Amoxicillin là 0,03 mg/l

LOD của Norfloxacin là 0,008 mg/l

62

Từ đó suy ra:

LOQ của Amoxicillin = 10/3 LOD = 0,1 mg/l

LOQ của Norfloxacin = 10/3 LOD = 0,02 mg/l

3.2.4. Khoảng tuyến tính

Để xác định khoảng nồng độ tuyến tính giữa nồng độ của Norfloxacin

và Amoxicillin với chiều cao pic sắc ký, tiến hành pha lần lượt dãy dung dịch

chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 0,05 – 1,5 mg/l trong dung môi pha động bằng

cách như sau:

- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp Norfloxacin và Amoxicillin gốc

có nồng độ 100 mg/l thành 50ml dung dịch làm việc có nồng độ 2,0 mg/l: hút

chính xác 1 ml từ dung dịch hỗn hợp gốc 100 mg/l cho vào bình định mức 50

ml và định mức đến vạch bằng pha động.

- Pha dãy chuẩn từ dung dịch 2 mg/l vừa thu được ở trên: hút chính xác

Vx ml từ dung dịch làm việc hỗn hợp có nồng độ 2 mg/l cho vào bình định

mức 10 ml và định mức đến vạch bằng pha động. Cụ thể như sau:

Bảng 3.4 Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp Norfloxacin và

Amoxicillin trước khi tiêm vào hệ thống HPLC

Kí hiệu mẫu C (mg/l) Vx (ml) VPha động (ml)

M0 - blank 10

M1 0,01 0,05 9,95

M2 0,05 0,25 9,75

M3 0,07 0,35 9,65

M4 0,1 0,5 9,5

M5 0,3 1,5 8,5

M6 0,5 2,5 7,5

M7 0,7 3,5 6,5

M8 0,9 4,5 5,5

M9 1,3 6,5 3,5

M10 1,5 7,5 2,5

63

Sau khi chuẩn bị các dãy chuẩn, tiến hành đưa mẻ mẫu vào hệ thống

HPLC với điều kiện sắc kí đã khảo sát và được lựa chọn như sau:

- Thành phần pha động: ACN - đệm KH2PO4 (điều chỉnh pH = 3 với

H3PO4)

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích vòng mẫu: 20 µl

- Bước sóng: 228 nm và 273 nm

- Lò ổn nhiệt cột sắc ký: 40oC

Kết quả khảo sát được thể hiện trong Bảng 3.5 và sử dụng phần mềm

Microsoft Excel 2016 để xây dựng đường chuẩn (Hình 3.13 và Hình 3.14).

Bảng 3.5 Chiều cao pic tương ứng với nồng độ của Norfloxacin và

Amoxicillin trong dãy chuẩn

Norfloxacin Amoxicillin

C (mg/l) Hpic C (mg/l) Hpic

0,01 161 0,05 312

0,05 570 0,07 409

0,07 801 0,1 543

0,1 1026 0,3 1288

0,3 3196 0,5 2000

0,5 5128 0,7 2694

0,7 7225 0,9 3478

0,9 9358 1,3 4970

1,3 13682 1,5 5640

1,5 15467

64

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao peak vào

nồng độ của Amoxicillin

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao pic vào nồng

độ của Norfloxacin

65

Bảng 3.6. Phương trình hồi quy của Norfloxacin và Amoxicillin

Chất phân

tích Phương trình hồi quy

Hệ số tương

quan R2

Khoảng nồng độ

tuyến tính (mg/l)

Norfloxacin Y = 10357x + 37,307 R2 = 0,9998 0,01 – 1,5

Amoxicillin Y = 3674,6x + 157,53 R2 = 0,9998 0,05 – 1,5

Qua các kết quả phân tích và thống kê cho thấy chiều cao pic sắc ký và

nồng độ chất phân tích phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với

hệ số tương quan cao đạt yêu cầu ở mục 2.4.2.2 là 0,99 ≤ R2 ≤ 1, đảm bảo để

thực hiện phép phân tích Norfloxacin và Amoxicillin.

Sử dụng phần mềm Minitab 16 để xây dựng đường chuẩn và phân tích

phương sai các phương trình đường chuẩn xây dựng được. Kết quả thu được

các giá trị phương sai của Amoxicillin là 0,0077; giá trị phương sai của

Norfloxacin là 0,0085. Nhận thấy răng Pvalue thu được của Norfloxacin và

Amoxicillin đều lớn hơn 0,05 nên có thể kết luận được rằng, với độ tin cậy 95

% thì sự sai khác giữa a và 0 không có ý nghĩa thống kê, phương pháp không

mắc sai số hệ thống.

3.2.5. Độ chụm

Để đánh giá độ chụm của phương pháp thì đánh giá thông qua độ lặp

lại và độ tái lặp.

Độ lặp lại

Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát trên nền mẫu chuẩn hỗn

hợp Norfloxacin và Amoxicillin bằng cách tiêm lặp 7 lần các mẫu có ba mức

nồng độ khác nhau (thấp, trung bình, cao). Đối với Norfloxacin, thí nghiệm

được tiến hành trên ba mẫu có các nồng độ là 0,03 mg/L; 0,09 mg/L; 0,13

mg/l. Đối với Amoxicillin, thí nghiệm được tiến hành trên ba mẫu có các

nồng độ là 0,07 mg/l; 0,3 mg/L; 0,9 mg/. Kết quả được đánh giá thông qua độ

66

lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của nồng độ các mẫu lặp

được tính từ chiều cao pic sắc ký Hpic.

Bảng 3.7. Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu lặp Norfloxacin

Số lần thí nghiệm

Kết quả mẫu lặp của Norfloxacin

Hpic

Mẫu 1

(0,03

mg/l)

C

Mẫu 1

(0,03

mg/l)

Hpic

Mẫu 2

(0,09

mg/l)

C

Mẫu 2

(0,09

mg/l)

Hpic

Mẫu 3

(0,13

mg/l)

C

Mẫu 3

(0,13

mg/l)

Lần 1 369 0,032 995 0,093 1508 0,142

Lần 2 374 0,033 978 0,091 1416 0,133

Lần 3 365 0,032 993 0,092 1428 0,134

Lần 4 370 0,032 984 0,092 1421 0,134

Lần 5 359 0,031 996 0,093 1407 0,132

Lần 6 363 0,032 977 0,091 1412 0,133

Lần 7 357 0,031 989 0,092 1418 0,133

Xtb 0,03 0,09 0,14

SD 0,0006 0,0008 0,0034

RSD % 1,9 0,8 2,5

RSD % theo yêu

cầu của AOAC RSD ≤ 15 % RSD ≤ 15 % RSD ≤ 11 %

67

Bảng 3.8. Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu lặp Amoxicillin

Số lần thí

nghiệm

Kết quả mẫu lặp của AMOX

Hpic

Mẫu 4

(0,07

mg/l)

C

Mẫu 4

(0,07

mg/l)

Hpic

Mẫu 5

(0,3

mg/l)

C

Mẫu 5

(0,3

mg/l)

Hpic

Mẫu 6

(0,9

mg/l)

C

Mẫu 6

(0,9

mg/l)

Lần 1 423 0,072 1275 0,304 3465 0,900

Lần 2 421 0,072 1277 0,305 3480 0,904

Lần 3 414 0,070 1258 0,300 3476 0,903

Lần 4 424 0,073 1269 0,303 3462 0,899

Lần 5 427 0,073 1281 0,306 3470 0,901

Lần 6 422 0,072 1273 0,304 3458 0,898

Lần 7 419 0,071 1279 0,305 3472 0,902

Xtb 0,07 0,30 0,90

SD 0,0011 0,0021 0,0021

RSD % 1,6 0,7 0,2

RSD % theo yêu

cầu của AOAC RSD ≤ 15 % RSD ≤ 11 % RSD ≤ 11 %

Từ bảng số liệu phân tích được thể hiện trong Bảng 3.7 và Bảng 3.8, có

thể thấy rằng hệ thống sắc ký lỏng có độ lặp lại tốt. Đối chiếu giá trị tính được

với độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC cho

thấy hệ số biến thiên (CV%) cũng như độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) nằm

68

trong mức giới hạn chấp nhận được, như vậy phương pháp áp dụng có độ

chụm đạt yêu cầu và kết quả đáng tin cậy.

Độ tái lặp

Độ tái lặp được tiến hành trên cùng một phương pháp, thí nghiệm trên

các nồng độ mẫu khác nhau, các thiết bị khác nhau và được làm lặp lại trong

7 ngày làm việc liên tiếp. Việc làm tái lặp mẫu nhằm mục đích đánh giá độ

chụm thông qua độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Kết quả các mẫu tái lặp

được thể hiện trong Bảng 3.9 và Bảng 3.10.

Bảng 3.9. Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu tái lặp Norfloxacin

Ngày phân tích

Kết quả mẫu tái lặp của Norfloxacin

Hpic

Mẫu 7

(0,07

mg/l)

C

Mẫu 7

(0,07

mg/l)

Hpic

Mẫu 8

(0,15

mg/l)

C

Mẫu 8

(0,15

mg/l)

Hpic

Mẫu 9

(1,3

mg/l)

C

Mẫu 9

(1,3

mg/l)

Ngày 1 779 0,072 1622 0,153 13704 1,319

Ngày 2 772 0,071 1627 0,154 13640 1,313

Ngày 3 798 0,074 1638 0,155 13701 1,319

Ngày 4 784 0,072 1627 0,154 13689 1,318

Ngày 5 803 0,074 1621 0,153 13695 1,318

Ngày 6 774 0,071 1629 0,154 13703 1,319

Ngày 7 792 0,073 1625 0,153 13715 1,320

Xtb 0,07 0,15 1,32

69

Ngày phân tích

Kết quả mẫu tái lặp của Norfloxacin

Hpic

Mẫu 7

(0,07

mg/l)

C

Mẫu 7

(0,07

mg/l)

Hpic

Mẫu 8

(0,15

mg/l)

C

Mẫu 8

(0,15

mg/l)

Hpic

Mẫu 9

(1,3

mg/l)

C

Mẫu 9

(1,3

mg/l)

SD 0,0012 0,0005 0,0024

RSD % 1,6 0,4 0,2

RSD % theo yêu

cầu của AOAC RSD ≤ 15 % RSD ≤ 11 % RSD ≤ 7,3 %

Bảng 3.10. Thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC đối với

các mẫu tái lặp Amoxicillin

Ngày phân tích

Kết quả mẫu tái lặp của Amoxicillin

Hpic

Mẫu 10

(0,09

mg/l)

C

Mẫu 10

(0,09

mg/l)

Hpic

Mẫu 11

(0,5

mg/l)

C

Mẫu 11

(0,5

mg/l)

Hpic

Mẫu 12

(1,3

mg/l)

C

Mẫu 12

(1,3

mg/l)

Ngày 1 498 0,093 1992 0,499 4899 1,290

Ngày 2 491 0,091 1987 0,498 4944 1,302

Ngày 3 487 0,090 1993 0,500 4906 1,292

Ngày 4 492 0,091 2001 0,502 4927 1,298

Ngày 5 496 0,092 2003 0,502 4916 1,295

70

Ngày phân tích

Kết quả mẫu tái lặp của Amoxicillin

Hpic

Mẫu 10

(0,09

mg/l)

C

Mẫu 10

(0,09

mg/l)

Hpic

Mẫu 11

(0,5

mg/l)

C

Mẫu 11

(0,5

mg/l)

Hpic

Mẫu 12

(1,3

mg/l)

C

Mẫu 12

(1,3

mg/l)

Ngày 6 488 0,090 1995 0,500 4903 1,291

Ngày 7 494 0,092 2000 0,501 4928 1,298

Xtb 0,09 0,50 1,30

SD 0,0011 0,0016 0,0044

RSD % 1,2 0,3 0,3

RSD % theo

yêu cầu của

AOAC

RSD ≤ 15 % RSD ≤ 11 % RSD ≤ 7,3 %

Theo kết quả thống kê và phân tích giá trị sử dụng của hệ thống HPLC

đối với các mẫu tái lặp Amoxicillin và Norfloxacin cho thấy độ lệch chuẩn

của các mẫu đạt yêu cầu theo AOAC. Qua đó có thể thấy rằng phương pháp

có độ chính xác cao.

3.2.6. Độ đúng

Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi

(còn gọi là độ tìm lại ) của phương pháp phân tích. Để đánh giá độ đúng của

phương pháp, tiến hành khảo sát trên mẫu trắng đã thêm chuẩn ở ba mức

nồng độ khác nhau (thấp, trung bình, cao) / mỗi chất phân tích, mỗi mẫu được

thực hiện lặp lại 4 lần. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.11 và Bảng 3.12.

71

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với Norfloxacin

Độ thu hồi Norfloxacin

Nồng độ thêm vào:

0,1 mg/l

Nồng độ thêm vào:

0,6 mg/l

Nồng độ thêm vào:

1 mg/l

Lần

lặp

C

mẫu

nền

C

mẫu

thêm

chuẩn

% R

C

mẫu

nền

C

mẫu

thêm

chuẩn

% R

C

mẫu

nền

C mẫu

thêm

chuẩn

% R

1 1 1,10 98,6 1 1,59 98,3 1 1,98 97,9

2 1 1,10 99,00 1 1,59 97,9 1 1,99 98,7

3 1 1,10 100,7 1 1,59 98,5 1 1,98 97,8

4 1 1,10 99,4 1 1,60 99,2 1 1,99 98,5

R % yêu cầu theo AOAC : 80 – 110 %

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với Amoxicillin

Độ thu hồi Amoxicillin

Nồng độ thêm vào:

0,3 mg/l

Nồng độ thêm vào:

0,7 mg/l

Nồng độ thêm vào:

1,3 mg/l

Lần

lặp

C

mẫu

nền

C

mẫu

thêm

chuẩn

% R

C

mẫu

nền

C

mẫu

thêm

chuẩn

% R

C

mẫu

nền

C mẫu

thêm

chuẩn

% R

1 1 1,30 98,6 1 1,69 98,8 1 2,29 99,1

72

Độ thu hồi Amoxicillin

Nồng độ thêm vào:

0,3 mg/l

Nồng độ thêm vào:

0,7 mg/l

Nồng độ thêm vào:

1,3 mg/l

Lần

lặp

C

mẫu

nền

C

mẫu

thêm

chuẩn

% R

C

mẫu

nền

C

mẫu

thêm

chuẩn

% R

C

mẫu

nền

C mẫu

thêm

chuẩn

% R

2 1 1,29 98,1 1 1,70 100,0 1 2,28 98,8

3 1 1,31 102,2 1 1,69 98,6 1 2,28 98,7

4 1 1,30 99,4 1 1,70 99,5 1 2,29 98,9

R % yêu cầu theo AOAC : 80 – 110 %

Sau khi đánh giá độ thu hồi, tham chiếu kết quả theo quy định của

AOAC cho thấy tỷ lệ phục hồi của các mức nồng độ khác nhau của hai chất

AMOX và NOR nằm trong khoảng từ 80 – 110 % nên phương pháp đạt yêu

cầu về độ đúng.

Như vậy quy trình định lượng AMOX và NOR bằng phương pháp

HPLC có khoảng tuyến tính rộng, độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu.

3.3. KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ KHÁNG SINH NORFLOXACIN

VÀ AMOXICILLIN BẰNG VẬT LIỆU TIO2/SBA-15

3.3.1. Khảo sát hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15

Nồng độ xúc tác TiO2/SBA-15 trong thí nghiệm phản ứng quang xúc

tác tác động lớn đến hiệu quả xử lý thành phần kháng sinh trong nước thải.

Nghiên cứu được thực hiện dưới nguồn bức xạ là đèn UVA (λ = 365 nm; 4x8

W), lượng xúc tác lần lượt là 0,25 g/l; 0,5 g/l; 0,75 g/l; 1,25 g/l; 1,5 g/l trong

200 ml dung dịch hỗn hợp Norfloxacin và Amoxicillin (nồng độ 10 mg/l).

Mẫu sau khi tiến hành xử lý bằng vật liệu xúc tác được đưa vào hệ thống

HPLC với các điều kiện sắc ký được kết luận ở mục 3.1.5. Kết quả tín hiệu

73

peak sắc ký được quy ra nồng độ với phương trình hồi quy của từng chất và

tính toán hiệu suất xử lý. Kết quả khảo sát được thể hiện ở Hình 3.15 và Hình

3.16.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 đến hiệu quả

xử lý Amoxicillin

74

Hình 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 đến hiệu quả

xử lý Norfloxacin

Kết quả cho thấy khi tăng hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 thì hiệu

suất xử lý Norfloxacin và Amoxicillin trong suốt quá trình hấp phụ và phân

hủy quang xúc tác trong 180 phút dưới bức xạ UV tăng. Tuy nhiên, khi tăng

hàm lượng lớn hơn 0.5g/l thì thời gian phân hủy quang xúc tác hiệu quả xử lý

Norfloxacin và Amoxicillin không đáng kể. Có thể thấy rằng nồng độ

Norfloxacin bị phân hủy nhanh hơn Amoxicillin sau 30 phút đầu giai đoạn

hấp phụ vật liệu lên chất phân tích. Hiệu suất xử lý Norfloxacin cao hơn so

với Amoxicillin trên vật liệu xúc tác trong 60 phút tiếp theo. Từ 120 – 180

phút, hiệu quả xử lý Norfloxacin đạt tới 99,26 %, cao hơn so với Amoxicilin

là 90,6 %. Hàm lượng xúc tác vật liệu TiO2/SBA-15 từ 0,5 g/L đến 1,5 g/l

trong suốt quá trình khảo sát cho thấy hiệu quả xử lý Norfloxacin và

Amoxicillin dao động không đáng kể. Vì vậy, để phù hợp với điều kiện thí

75

nghiệm, hàm lượng xúc tác TiO2/SBA-15 0,5 g/l sẽ được lựa chọn cho các

khảo sát tiếp theo.

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất tham gia phản ứng

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng độ Norfloxacin và Amoxicillin

trong phản ứng xúc tác trên vật liệu TiO2/SBA-15 được thực hiện với 200 ml

dung dịch hỗn hợp Norfloxacin và Amoxicillin có nồng độ lần lượt là 5 mg/l,

10 mg/l và 15 mg/l; nhiệt độ 25oC, nguồn bức xạ là đèn UVA (λ = 365 nm;

4x8 W), lượng xúc tác là 0,50 g/l.

Kết quả thể hiện trong Hình 3.17 và Hình 3.18 cho thấy nồng độ hỗn

hợp Norfloxacin và Amoxicillin càng tăng thì hiệu suất xử lý kháng sinh bằng

vật liệu TiO2/SBA-15 càng giảm.

Hình 3.17. Ảnh hưởng của hàm lượng Norfloxacin đến hiệu quả xử lý của vật

liệu xúc tác TiO2/SBA-15

76

Hình 3.18. Ảnh hưởng của hàm lượng Amoxicillin đến hiệu quả xử lý của vật

liệu xúc tác TiO2/SBA-15

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình phân hủy

Norfloxacin và Amoxicillin bằng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15. Nghiên cứu

ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả xử lý Norfloxacin và Amoxicillin được

thực hiện với các mức nhiệt độ lần lượt là 25oC, 50oC và 75oC. Các điều kiện

xử lý bao gồm nguồn bức xạ là đèn UVA (λ = 365 nm; 4x8 W), lượng xúc tác

là 0,50 g/l trong 200 ml dung dịch hỗn hợp Norfloxacin và Amoxicillin (nồng

độ 10 mg/L).

Kết quả khảo sát được thể hiện trong Hình 3.19 và Hình 3.20. Có thể

thấy rằng, nhiệt độ càng tăng thì quá trình phân hủy cũng như hiệu quả xử lý

Norfloxacin và Amoxicillin càng cao. Hiệu suất xử lý của từng chất ở các

mức nhiệt độ dao động rất ít và không đáng kể.

77

Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu quả xử lý Norfloxacin

Hình 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu quả xử lý Amoxicillin

78

3.3.4. Độ ổn định của chất xúc tác

Để xác định độ ổn định của chất xúc tác TiO2/SBA-15 trong xử lý

kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin được tiến hành bằng cách làm lặp lại

6 lần mẫu với điều kiện phân tích bằng HPLC theo mục 3.1.5 và các điều kiện

xử lý như sau: nhiệt độ lần phản ứng là 25oC, nguồn bức xạ là đèn UVA (λ =

365 nm; 4x8 W), lượng xúc tác TiO2/SBA-15 là 0,50 g/l với 200 ml dung

dịch hỗn hợp NOR và AMOX (nồng độ 10 mg/L).

Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong Hình 3.18 cho thấy sau 6 lần

phân tích, kết quả hiệu suất của Norfloxacin và Amoxicillin thay đổi không

đáng kể: hiệu quả bị xử lý của Norfloxacin dao động trong khoảng từ 89,9 –

99,5 %, cao hơn so với hiệu quả xử lý của Amoxicillin là 89,7 – 90,6 %. Như

vậy, có thể thấy rằng hoạt tính quang xúc tác của TiO2/SBA-15 cao và ổn

định.

Hình 3.21. Độ ổn định của chất xúc tác TiO2/SBA-15 trong hiệu quả xử lý

Norfloxacin và Amoxicillin

Từ các quá trình khảo sát trên có thể thấy rằng khả năng xúc tác quang

hóa làm phân hủy kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin phụ thuộc vào rất

nhiều yếu tố như: nồng độ chất tham gia phản ứng, hàm lượng chất xúc tác,

nhiệt độ phản ứng, thời gian diễn ra phản ứng. Để phù hợp với các điều kiện

thí nghiệm cũng như tiết kiệm chi phí với hiệu quả xử lý kháng sinh trong

79

nước thải, chúng tôi đã tối ưu hóa đưa ra được quy trình xử lý kháng sinh

Norfloxacin và Amoxicillin trong nước thải trên vật liệu TiO2/SBA-15 là:

- Khối lượng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15 : 0,5 (g/L)

- Nồng độ kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin: 10 (mg/L)

- Nhiệt độ phản ứng : 25oC

- Thời gian phản ứng : 180 phút.

3.4. ỨNG DỤNG VẬT LIỆU VẬT LIỆU TiO2/SBA-15 ĐỂ XỬ LÝ NƯỚC

THẢI BỆNH VIỆN CHỨA KHÁNG SINH NORFLOXACIN VÀ

AMOXICILLIN

3.4.1. Quy trình hệ thí nghiệm

Quy trình tiến hành ứng dụng vật liệu TiO2/SBA-15 để xử lý kháng

sinh Norfloxacin và Amoxicillin trong mẫu thực (mẫu nước thải bệnh viện

sau xử lý) được thể hiện trong Hình 3.22. Các mẫu đưa vào hệ thống HPLC

phân tích với các điều kiện đã tối ưu là:

- Pha động: ACN – đệm KH2PO4, pH = 3 với H3PO4 (20:80, v:v)

- Bước sóng: 228 nm và 273 nm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích vòng mẫu: 20 µl

Kết quả sắc ký đồ mẫu nước thải bệnh viện trước và sau khi xử lý

bằng vật liệu TiO2/SBA-15 được thể hiện trong Hình 3.23 và Hình 3.24.

80

Hình 3.22. Quy trình xử lý kháng sinh NOR và AMOX trên nền mẫu thực

bằng vật liệu TiO2/SBA-15

81

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu nước thải thêm chuẩn NOR và AMOX (10 mg/L)

trước khi xử lý bằng vật liệu TiO2/SBA-15

Hình 3.24. Sắc ký đồ mẫu nước thải thêm chuẩn NOR và AMOX sau khi xử lý

bằng vật liệu TiO2/SBA-15

3.4.2. Xác nhận giá trị sử dụng

Các mẫu được phân tích lặp lại 4 lần và đánh giá thông qua giá trị trung

bình nồng độ, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối. Kết quả được thể hiện

trong Bảng 3.13 và được đánh giá hiệu suất xử lý kháng sinh bằng vật liệu

TiO2/SBA-15 trên mẫu nước thải bệnh viện.

82

Bảng 3.13. Kết quả phân tích độ lặp lại đối với mẫu nước thải bệnh viện chứa

kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin trước và sau khi xử lý bằng vật liệu

TiO2/SBA-15

Số lần

thí

nghiệm

Kết quả mẫu lặp của Norfloxacin Kết quả mẫu lặp của

Amoxicillin

Hpic

trước

xử lý

(mAU)

C

trước

xử lý

(mg/l)

Hpic

sau xử

lý

(mAU)

C

sau

xử lý

(mg/l)

Hpic

trước

xử lý

(mAU)

C

trước

xử lý

(mg/l)

Hpic

sau xử

lý

(mAU)

C

sau

xử lý

(mg/l)

Lần 1 103814 10,02 659 0,06 37087 10,05 3685 0,96

Lần 2 103504 9,99 762 0,07 37014 10,03 3906 1,02

Lần 3 103711 10,01 659 0,06 36830 9,98 4016 1,05

Lần 4 104022 10,04 555 0,05 37124 10,06 3759 0,98

Xtb 10,02 0,06 10,03 1,00

SD 0,0208 0,0082 0,0356 0,0403

RSD % 0,2 13,6 0,4 4,0

RSD %

theo yêu

cầu của

AOAC

RSD ≤ 5,3 % RSD ≤ 15 % RSD ≤ 5,3 % RSD ≤ 7,3 %

Hiệu

suất xử

lý (%)

99,40 % 90,03 %

83

Từ bảng số liệu phân tích được thể hiện trong Bảng 3-15 cho thấy giá

trị độ lệch chuẩn tương đối đạt theo yêu cầu của AOAC, như vậy phương

pháp có độ chụm đạt yêu cầu. Hiệu suất xử lý kháng sinh Norfloxacin (99,40

%) trong nước thải bệnh viện sau xử lý bằng vật liệu TiO2/SBA-15 đối với

Norfloxacin là 99,40 %, cao hơn Amoxicillin (90,03 %) là 1,10 lần. Có thể

thấy với các điều kiện xử lý kháng sinh bằng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15

được khảo sát và lựa chọn ở mục 3.3.4 thì hiệu quả xử lý Norfloxacin gần như

được loại bỏ hoàn toàn, Amoxcixillin chỉ được loại bỏ khoảng 90,00% trong

tổng số 180 phút.

84

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

- Xây dựng phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

để xác định đồng thời kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin trong nước thải

sử dụng: Cột sắc ký Nova-Pak C18, Detector DAD (Diode array) với bước

sóng 228 nm (Amoxicillin) và 273 nm (Norfloxacin). Thể tích tiêm mẫu là

20 µl; tốc độ dòng 1 ml/phút; pha động bao gồm Acetonitrile – đệm

KH2PO4, điều chỉnh pH = 3 với H3PO4 (20:80, v:v).

- Thẩm định phương pháp phân tích Norfloxacin và Amoxicillin:

Amoxicillin Norfloxacin

Phương trình hồi quy tuyến

tính y = 3674,6x +157,53 y = 10357x + 37,307

Khoảng tuyến tính 0,05 – 1,5 mg/L 0,01 – 1,5 mg/L

Hệ số tương quan (R2) 0,9998 0,9998

Giới hạn phát hiện (LOD) 0,03 mg/L 0,008 mg/L

Giới hạn định lượng (LOQ) 0,1 mg/L 0,02 mg/L

Hiệu suất thu hồi (R%) 98,1 – 102,2 % 98,5 – 100,7 %.

Độ lặp (RSD %) 0,2 – 1,6 % 0,8 – 2,5 %

Độ tái lặp (RSD %) 0,3 – 1,2 % 0,2 – 1,6 %

- Đánh giá hiệu quả xử lý kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin trong

nước thải bệnh viện sau xử lý bằng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15:

Điều kiện xử lý:

Khối lượng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15 : 0,5 (g/l)

Nồng độ kháng sinh đầu vào Norfloxacin và Amoxicillin : 10 (mg/l)

85

Nhiệt độ phản ứng : 25oC

Thời gian phản ứng : 180 phút.

- Đánh giá hiệu suất xử lý :

Kết quả thực nghiệm cho thấy TiO2/SBA-15 có hiệu quả xử lý kháng

sinh cao, hiệu suất của Norfloxacin đạt tới 99,40 % và của Amoxicillin là

90,03 %. Vì vậy, có thể ứng dụng thực tiễn để xử lý kháng sinh trong môi

trường nước thải.

Kiến nghị

Ứng dụng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15 để tiến hành nghiên cứu phân

tích đồng thời các dư lượng dược phẩm khác (PPCPs) như nhóm các loại

thuốc giảm đau, các nhóm thuốc hooc-mon, các nhóm kháng sinh khác, vv. có

mặt trong nước thải bệnh viện.

86

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bộ Y Tế Việt Nam, 2013, Kế hoạch hành động quốc gia về chống

kháng thuốc, Hà Nội.

[2] Bộ Y Tế Việt Nam, 2015, Hướng dẫn sử dụng kháng sinh, Nhà xuất bản

Y học Hà Nội.

[3] Cục quản lý môi trường y tế, 2015, Hướng dẫn áp dụng công nghệ xử lý

nước thải y tế, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.

[4] Bộ Y Tế Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng

kháng sinh GARPViệt Nam và Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH

Oxford , 2012, Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng sinh tại 15 bệnh

viện Việt Nam năm 2008-2009.

[5] Phạm Hùng Vân, 2015, Nghiên cứu invitro phối hợp kháng sinh trong

nhiễm khuẩn do vi khuẩn đa kháng, Hội nghị đề kháng kháng sinh trong

viêm phổi cộng đồng và phiêm phổi bệnh viện lần thứ 4, Hội nghị khoa

học và đào tạo liên tục, Nội san tháng 12/2017, TP.HCM.

[6] Phạm Thị Thanh Huyền, 2017, Nghiên cứu sự phân hủy của kháng sinh

Cefotaxin natri bằng kỹ thuật bức xạ UV có xúc tác nano TiO2. Đại học

quốc gia Hà Nội, Trường Đại học khoa học tự nhiên.

[7] Bộ Y Tế Việt Nam, 2017, Dược điển Việt Nam - lần xuất bản thứ năm,

tập 1, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.

[8] Bộ Y Tế Việt Nam, 2002, Dược thư quốc gia Việt Nam - Lần xuất bản

thứ nhất, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.

[9] Hội đồng dược điển Việt Nam, 2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc,

Bộ khoa học và công nghệ.

[10] N. L. C. Trần Quang Toàn, Doãn Ngọc Hải, Nguyễn Hữu Hạnh,

Nguyễn Phương Hằng, 2016, Wastewater management and treatment at

hospitals, Vietnam J. Prev. Med., vol. 184, no. 11, p. 235.

[11] Tran, N. H., Urase, T., & Ta, T. T., 2014, A preliminary study on the

occurrence of pharmaceutically active compounds in hospital

wastewater and surface water in Hanoi, Vietnam, CLEAN–Soil, Air,

Water, 42(3), 267-275.

[12] Managaki, S., Murata, A., Takada, H., Tuyen, B. C., & Chiem, N. H.,

2007, Distribution of macrolides, sulfonamides, and trimethoprim in

tropical waters: ubiquitous occurrence of veterinary antibiotics in the

Mekong Delta, Environmental Science & Technology, 41(23), 8004-

8010.

87

[13] Duong, H. A., Pham, N. H., Nguyen, H. T., Hoang, T. T., Pham, H. V.,

Pham, V. C., ... & Alder, A. C., 2008, Occurrence, fate and antibiotic

resistance of fluoroquinolone antibacterials in hospital wastewaters in

Hanoi, Vietnam. Chemosphere, 72(6), 968-973.

[14] Phạm Luận, Phương pháp phân tích phổ phân tử, 2014, Nhà xuất bản

Bách khoa Hà Nội.

[15] El-Enany, N., Belal, F., & Rizk, M, 2007, Kinetic spectrophotometric

determination of ethamsylate in dosage forms, Journal of AOAC

International, 90(3), 679-685.

[16] Chierentin, L., & Salgado, H. R. N., 2014, Performance characteristics

of UV and visible spectrophotometry methods for quantitative

determination of norfloxacin in tablets, Journal of Scientific Research,

6(3), 531-541.

[17] Raymond, D. P., Pelletier, S. J., Crabtree, T. D., Gleason, T. G., Hamm,

L. L., Pruett, T. L., & Sawyer, R. G., 2001, Impact of a rotating empiric

antibiotic schedule on infectious mortality in an intensive care unit.

Critical care medicine, 29(6), 1101-1108.

[18] Liu, Z., Jin, M., Cao, J., Wang, J., Wang, X., Zhou, G., ... & Shui, L.,

2018, High-sensitive electrochemical sensor for determination of

Norfloxacin and its metabolism using MWCNT-CPE/pRGO-ANSA/Au,

Sensors and Actuators B: Chemical, 257, 1065-1075.

[19] Alnajjar, A., AbuSeada, H. H., & Idris, A. M., 2007, Capillary

electrophoresis for the determination of norfloxacin and tinidazole in

pharmaceuticals with multi-response optimization. Talanta, 72(2), 842-

846.

[20] Deng, B., Shi, A., Li, L., & Kang, Y., 2008, Pharmacokinetics of

amoxicillin in human urine using online coupled capillary

electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection,

Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 48(4), 1249-1253.

[21] Bailón-Pérez, M. I., Garcia-Campana, A. M., Cruces-Blanco, C., & del

Olmo Iruela, M., 2008, Trace determination of β-lactam antibiotics in

environmental aqueous samples using off-line and on-line

preconcentration in capillary electrophoresis, Journal of

Chromatography A, 1185(2), 273-280.

[22] Rao, R. N., & Nagaraju, V., 2004, Separation and determination of

synthetic impurities of norfloxacin by reversed-phase high performance

liquid chromatography, Journal of pharmaceutical and biomedical

analysis, 34(5), 1049-1056.

88

[23] Cordoba-Borrego, M., Córdoba-Dıaz, M., & Córdoba-Dıaz, D., 1999,

Validation of a high-performance liquid chromatographic method for

the determination of norfloxacin and its application to stability studies

(photo-stability study of Norfloxacin), Journal of pharmaceutical and

biomedical analysis, 18(6), 919-926.

[24] Foroutan, S. M., Zarghi, A., Shafaati, A., Khoddam, A., & Movahed,

H., 2007, Simultaneous determination of amoxicillin and clavulanic acid

in human plasma by isocratic reversed-phase HPLC using UV

detection, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 45(3),

531-534.

[25] Benito-Peña, E., Moreno-Bondi, M. C., Orellana, G., Maquieira, Á., &

van Amerongen, A., 2005, Development of a novel and automated

fluorescent immunoassay for the analysis of β-lactam

antibiotics, Journal of agricultural and food chemistry, 53(17), 6635-

6642.

[26] Phạm Luận, 2014, Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách, Nhà

xuất bản Bách khoa Hà Nội.

[27] Bùi Thị Mai Lâm, 2012, Nghiên cứu tổng hợp theo phương pháp trực

tiếp và ứng dụng xử lý các hợp chất hữu cơ ô nhiễm của vật liệu xúc tác

quang TiO2/SBA-15.

[28] Ren, X., Miao, G., Xiao, Z., Ye, F., Li, Z., Wang, H., & Xiao, J, 2016,

Catalytic adsorptive desulfurization of model diesel fuel using

TiO2/SBA-15 under mild conditions. Fuel, 174, 118-125.

[29] Li, G., Wang, B., Xu, W. Q., Han, Y., & Sun, Q., 2018, Rapid

TiO2/SBA-15 synthesis from ilmenite and use in photocatalytic

degradation of dimethoate under simulated solar light, Dyes and

Pigments, 155, 265-275.

Vietnam Journal of Science and Technology 58 (3A) (2020) 13-19 doi:10.15625/2525-2518/58/3A/14229

REMOVAL OF NORFLOXACIN BY TiO2-SBA-15

PHOTOCATALYST

Nguyen Thi Thu Trang 1, *

, Tran Quang Vinh2, Ha Van Giang

1, Nguyen Sao Mai

1,

Nguyen Thanh Dong1, Pham Tuan Linh

1, Nguyen Viet Hoang

1, Nguyen Minh Tan

3

1Institute of Environmental Technology, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi, Viet Nam

2Institute of Chemistry, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi, Viet Nam

3School of Chemical Engineering, HUST, 1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Ha Noi, Viet Nam

*Email: thutrangnguyen1210@gmail.com

Received: 16 August 2019; Accepted for publication: 17 December 2019

Abstract. Ordered SBA-15 mesoporous silica support was synthesized by a sol-gel method

using triblock copolymer Pluronic P123 and immobilized with different amounts of

photocatalyst TiO2. The synthesized composites were characterized by X-ray diffraction (XRD),

transmission electron microscopy (TEM) and N2 adsorption-desorption isotherms. The

synthesized materials possessed specific surface areas SBET of 768 m2/g, 544 m

2/g, 421 m

2/g and

333 m2/g at the TiO2:SiO2 ratio of 0, 0.25, 1.0 and 5.0, respectively. The adsorption capacities

and photocatalytic activities under UV light irradiation of these materials were evaluated for

Norfloxacin degradation. Experimental results indicate that the highest activity was observed on

the sample with TiO2:SiO2 ratio of 1.

Keywords: Norfloxacin, SBA-15, titanium dioxide, photocatalysis, mesoporous materials.

Classification numbers: 2.4.2, 2.6.1, 3.4.2.

1. INTRODUCTION

Norfloxacin (NFX) is an antibiotic that belongs to the class of fluoroquinolone antibiotics.

It is used to treat urinary tract infections, gynaecological infections, inflammation of the prostate

gland, gonorrhoea and bladder infection. Besides, NFX was detected not only in wastewater

from wastewater treatment plants but also in surface water and other water environments with

concentrations of up to 3.54 µg/L (in Hong Kong) [1]. The study of Duong Hong Anh et al. [2]

detected antibiotic ciprofloxacin and NFX in wastewater from 6 hospitals in Hanoi with the

concentration of 900 - 17,000 ng/L. NFX is used in many shrimp farms. Nearly 70 % of NFX

remains in the sludge of biological treatment plants. Thus, pathogens are increasingly resistant to

drugs, causing a significant threat to aquatic and terrestrial organisms as well as humans. NFX in

the water environment can lead to adverse environmental impacts [3], including the development

of antibiotic-resistant bacteria in fisheries [4], directly poisoning microorganisms and risks

possible for human health through drinking water or food chain [4]. Over the past decade, a lot

of research has been done to remove NFX. Photocatalytic decomposition by ultraviolet

Nguyen Thi Thu Trang, et al.

14

irradiation, zero-valent iron nanoparticles with H2O2, electrochemical Fenton, thermally

activated sulfur and gamma irradiation have been developed to remove NFX. However, these

methods still have disadvantages such as high energy consumption, low efficiency treatment and

environmental friendliness. While, the use of adsorbents was found to be an effective method,

since NFX can be adsorbed by activated sludge [5], activated carbon [6], carbon nanotubes [6]

and silica/alumina [7]. However, the removal of NFX is only physical, NFX is retained on the

absorbent and presents a risk of release to the aquatic environment if the adsorbent is improperly

used. The development of active catalytic materials for NFX removal remains a critical problem

and challenge.

Although there are essential properties such as simple synthesis, non-toxicity, high activity,

the specific surface area of TiO2 photocatalyst is low. Therefore, this limits the number of

centres that adsorb pollutant molecules on the TiO2 surface. In order to increase TiO2 surface

area, many studies of fabrication of mesoporous TiO2 or fixed TiO2 on mesoporous silica

materials such as SBA-15, MCM-41, etc. have been carried out. The results showed that the

specific surface area of the mesoporous TiO2 material was up to 430 m2/g, 4 - 5 times larger than

the conventional TiO2 nanomaterials [8]. Also, as a catalyst substrate, mesoporous silica oxide

materials such as SBA-15 receive much attention due to its high surface area, adjustable pore

size, and thick pore walls and ordered porous framework. Mesoporous material SBA-15

possesses a uniform pore size of 2 - 30 nm with a narrow pore size distribution indicating the

high order structure. SBA-15 has a large specific surface area of about 600 - 1000 m2/g.

The fixation of TiO2 on these substrate increases the dispersion of TiO2 on the substrate,

improve the adsorption capacity of pollutants, besides the presence of Ti-O-Si bond is

favourable for activation of organic pollutants [9]. Thus, TiO2 catalytic fixation on mesoporous

silica oxide material will create an adsorption catalyst system with the advantages of

photocatalyst materials and mesoporous materials, enhance the efficiency of the treatment of

durable organic compounds.

2. METHODS

2.1. Preparation of TiO2/SBA-15

The following procedures synthesized TiO2/SBA-15: P123 was added to 2M HCl solution

and stirred until mixed evenly. Under constant stirring, a certain amount of TiO2 powder was

added and stirred for a further 4 hours. TEOS was added to the above suspension and stirred for

24 hours at 40 oC. After that, the obtained mixture was transferred into a Teflon-covered

stainless steel autoclave.

The autoclave was placed in a furnace without stirring for the thermal treatment

(temperature: 80 oC; time: 24 h). After the reaction, the precipitates were collected by

centrifugation and washed with deionized water. The washed precipitates were dried in an oven

at 80 oC for 10 h and calcinated at 500

oC for 5 h. The TiO2/SiO2 atomic ratios changed from 0;

0.25; 1.0 to 5.0 corresponding to the samples denoted by SBA-15, 0.25TiO2/SBA-15.

1.0TiO2/SBA-15, 5.0TiO2/SBA-15.

2.2. Characterization of materials

The characterization methods include small-angle X-ray diffraction (SXRD) and wide-

angle X-ray diffraction (WXRD, Siemen D5000 diffractometer, CuKα radiation, λ = 1.5406 Å).

Removal of Norfloxacin by TiO2-SBA-15 Photocatalyst

15

The specific surface area of powder photocatalyst was measured using the Brunauer-Emmett-

Teller method (BET) with a MicroActive TriStar II Plus 2.03 for N2 BET at 77.3 K with a 10 s

equilibration interval. The texture of the catalysts was observed by transmission electron

microscopy (TEM, JEM-2100).

2.3. Removal of Norfloxacin

The activities of TiO2/SBA-15 samples were evaluated for the photocatalytic oxidation of

NFX. The photoreaction was conducted in a 250 ml glass beaker. UV irradiation was provided

by a 4 × 8W Ultraviolet lamp (λ = 365 nm). The amount of catalysts was chosen as 0.5 g/l. The

initial NFX concentration was 10 mg/l, the volume of NFX solution was 200 ml, and the

temperature of the reaction solution was maintained at 30 ± 0.5 oC. Some aqueous samples were

withdrawn at regular intervals, and the residual concentration of NFX was measured at 273 nm

with a spectrophotometer.

The stability of photocatalyst was assessed through repeated use of 1.0TiO2/SBA-15.

Experiments were carried out with 10 mg/l NFX concentration, 0.5 g/l photocatalyst, and 150

min irradiation for cycling run. After the first photocatalytic reaction, the remaining solution was

replaced with new NFX solution of 10 mg/L. The used 1.0TiO2/SBA-15 was dried at 105oC in

24 h before repeating the above procedure.

The degradation efficiency (%) of NFX was calculated as follows:

D% = (C0 – Ct)×100/C0,

where C0 and Ct are the initial NFX and the remaining concentration of NFX at a certain time,

respectively.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Characteristics of materials

The physicochemical structure of synthesized samples was characterized by SXRD,

WXRD, TEM, and BET. As shown in Figure 1, the SXRD patterns exhibit a very intense peak at

2θ = 0.9o, together with two other weak peaks between 1.7

o and 1.9

o, which correspond to the

(100), (110), and (200) reflections of the hexagonal mesoporous structure. The results also show

that after loading TiO2, the intensity of the low angle XRD peaks corresponding to the hexagonal

symmetry decrease and shift slightly to higher angle with increasing TiO2 loading and the

distortion of the mesoporous framework is increased by the intercalated TiO2.

The WXRD patterns of TiO2/SBA-15 samples synthesized with different TiO2:SiO2 molar

ratios are shown in Figure 2. The distinctive peaks at 2θ = 25.3o, 37.8

o; 47.7

o; 54

o, and 62.4

o

correspond to the anatase [10]. Peak intensity of the anatase phase increases with increasing

titania content.

The morphology of synthesized TiO2/SBA-15 composite photocatalysts is observed further

by TEM images. Figure 3 represents the TEM imagines of SBA-15 and TiO2/SBA-15 samples.

The images of the samples show highly ordered hexagonal arrays of the mesoporous with a

uniform pore size corresponding to the results from SXRD. The TEM images of TiO2/SBA-15

samples reveal that the spherical TiO2 nanoparticles are highly dispersed in the interior of the

SBA-15 channels and lead to a disordered mesoporous texture. The average TiO2 nanoparticle

sizes are determined from 20 to 50 nm.

Nguyen Thi Thu Trang, et al.

16

Figure 1. SXRD patterns of samples. Figure 2. WXRD patterns of samples.

Figure 3. TEM images of TiO2/SBA-15 samples

(a) SBA-15; (b) 0.25TiO2/SBA-15; 1.0TiO2/SBA-15; (d) 5.0TiO2/SBA-15.

Figure 4. Nitrogen adsorption and desorption isotherms of the samples.

Figure 4 shows that the TiO2 immobilization changed the hysteresis loops of the samples

due to the penetration of TiO2 into the mesoporous system of SBA-15 support. The data in Table

1 indicate that the TiO2 content increases, the surface area and the pore volume of the

nanomaterials decreases. Specifically, the BET surface area of SBA-15 of 768 m2/g is 2.3 times

Removal of Norfloxacin by TiO2-SBA-15 Photocatalyst

17

higher than that of 5.0TiO2/SBA-15, total pore volume decreases from 0.94 to 0.74, and the pore

diameter increases 1.7 times. This is due to the presence of TiO2, causing pore blocking effect.

Besides, the pore diameter increases due to increased TiO2 agglomeration on the surface lead to

create large secondary porosity channels. The TiO2 content increases, the agglomeration

increases, appearing more secondary porosity channels system with large pore size, resulting in

an average value of pore size of the material increases.

Table 1. Morphology and pore structure of samples.

Sample SBET (m2g

-1) Vtot (cm

3g

-1) D (nm)

SBA-15 768 0.94 4.90

0.25TiO2/SBA-15 544 0.87 6.41

1.0TiO2/SBA-15 421 0.76 7.26

5.0TiO2/SBA-15 333 0.74 8.56

3.3. Photocatalytic activity

The adsorption of NFX on TiO2, SBA-15, 0.25TiO2/SBA-15, 1.0TiO2/SBA-15 and

5.0TiO2/SBA-15 samples were carried out in dark condition for 30 minutes to reach the

adsorption equilibrium, and the results are shown in Fig. 5. After adsorption for 30 minutes,

NFX removal efficiency of 37 % is the highest on SBA-15 material. In the absence of

irradiation, the TiO2/SBA-15 materials present a higher adsorption capability of the NFX than

pure titania. The superior activity of the hybrid materials is due to their much higher specific

area and pore volume. This result indicates that the photocatalytic activity of hybrid TiO2/SBA-

15 samples depends insignificantly on their adsorption ability. The photocatalytic activity of

TiO2 is the main factor affecting the catalyst performance. When increasing TiO2 content, NFX

absorption efficiency decreases. After 30 minutes adsorption by TiO2, the removal of NFX is

lowest with 19.6 %.

Figure 5. NFX concentration change of the

photocatalytic degradation by use of SBA-15,

0.25TiO2/SBA-15, 1.0TiO2/SBA-15,

5.0 TiO2/SBA-15 under UV irradiation.

Figure 6. Removal of NFX during photocatalytic

degradation by repeated use of TiO2/SBA-15 under

UV irradiation ([NFX]0 = 10 mg/l,

catalyst dosage = 0.5 g/l, pH = 7,

irradiation time = 150 min).

Nguyen Thi Thu Trang, et al.

18

Figure 5 shows NFX degradation under UV irradiation by SBA-15, 0.25TiO2/SBA-15,

1.0TiO2/SBA-15 and 5.0TiO2/SBA-15 catalysts. It can be seen that the photocatalytic activity

obeys the following order: 1.0TiO2/SBA-15 > TiO2 > 5.0TiO2/SBA-15 > 0.25TiO2/SBA-15 >

SBA-15. NFX removal efficiencies during adsorption and photocatalytic degradation for 150

min UV irradiation by SBA-15, 0.25TiO2/SBA-15, 1.0TiO2/SBA-15, 5.0TiO2/SBA-15 and TiO2

catalysts are 38.1 %; 89.9 %, 99.3 %; 96.6 % and 99.2 %, respectively. At 150 minutes, the

photocatalytic efficiency of 1.0TiO2/SBA-15 and TiO2 was approximately the same. However,

during the entire process, the NFX removal efficiency of 1.0TiO2/SBA15 is always higher than

pure TiO2. Thus, immobilizing TiO2 on SBA-15 improves the photocatalytic activity of these

photocatalysts. According to Yang et al., the photocatalytic activity of TiO2 was improved

because fixing TiO2 on SBA-15 mesoporous material increases the thermal stability of TiO2

anatase phase on SBA-15 and prevents the development of large crystals [11]. Besides, the

porous structure of the SBA-15 substrate promotes adsorption of reactants into the porous

system of SBA-15 material, enhances the phase contact between the reactants and the catalyst

phase. Also, TiO2 is inside the porous system and thus increases the efficiency of the reaction.

However, when increasing TiO2 content to TiO2: SBA-15 = 5: 1 ratio, photocatalytic

activity did not increase compared to TiO2. The reason may be that increasing TiO2 content may

increase the possibility of the blocking carrier material, decreasing the adsorption effect of the

porous system as well as the catalytic effect of TiO2 nanoparticles inside the porous system.

Besides, the increase in TiO2 content also increases the agglomeration of TiO2 nanoparticles,

reducing the dispersion of these semiconductor particles on the SBA-15 substrate and the

photocatalytic efficiency. Otherwise, reducing TiO2 content to TiO2: SBA-15 = 0.25: 1 ratio

leads to decrease photocatalytic activity due to insufficient catalyst/reactant ratio. From this

order, it is possible to see the role of SBA-15 in dispersing TiO2 catalysts as well as promoting

diffusion and adsorption of reactants.

The stability of 1.0TiO2/SBA-15 catalyst under UV irradiation was investigated by

repeating the photocatalytic reaction of NFX, as shown in Figure 6. Under UV irradiation

condition, the removal of NFX is insignificantly reduced after 5 times reuse, from 99.3 % to

98.4 %. It is clear that the photocatalytic activity of 1.0TiO2/SBA-15 catalyst is high and stable

due to the complete mineralization of the pollutants over TiO2. Thus the adhesion of the by-

products on the catalytic surface is negligible, resulting in quick regeneration of the catalyst.

4. CONCLUSION

The mesoporous TiO2/SBA-15 nanomaterials were synthesized successfully by sol-gel

method with varying titanium loadings, and the photocatalytic activities of synthesized

TiO2/SBA-15 materials are tested by the degradation of NFX. The structure of synthesized

materials includes spherical anatase TiO2 nanoparticles distributed over-ordered hexagonal

mesoporous SBA-15 support with a pore diameter of 6.41-8.56 nm. The specific surface areas

BET are 768, 544, 421 and 333 m2/g at the TiO2:SBA-15 molar ratios of 0, 0.25, 1 and 5,

respectively. In all cases, the decomposition of NFX increase with increasing the TiO2 content.

The results of the activity test indicate that 1.0TiO2/SBA-15 hybrid material has better

photocatalytic activity performance than pure TiO2.

Acknowledgements. We greatly thank Vietnam Ministry of Science and Technology (MOST) and

German Federal Ministry for Economic Affairs and Energy (BMWi) for financing this work within the

framework of the Vietnam-Germany Cooperation Project DeGrey – NĐT.59.GER/19.

Removal of Norfloxacin by TiO2-SBA-15 Photocatalyst

19

REFERENCES

1. Leung H. W., Minh T. B., Murphy M. B., Lam J. C. W., So M. K., Martin M., Lam P. K.

S., Richardson B. J. - Distribution, fate and risk assessment of antibiotics in sewage

treatment plants in Hong Kong, South China, Environ. Int. 42 (2012) 1–9.

2. Hong Anh Duong, Ngoc Ha Pham, Hoang Tung Nguyen, Thi Thuong Hoang, Hung Viet

Pham, Van Ca Pham, Michael Berg, Walter Giger, Alfredo C. Alder - Occurrence, fate

and antibiotic resistance of fluoroquinolone antibacterial in hospital wastewaters in Ha

Noi, Viet Nam, Chemosphere 72 (2008) 968–973.

3. Lee Y. J., Lee S. E., Lee D. S., Kim Y. H. - Risk assessment of human antibiotics in

Korean aquatic environment, Environ. Toxicol. Pharmacol. 26 (2008) 216–221.

4. Phan T. P. H., Managaki S., Nakada N., Takada H., Shimizu A., Anh D. H., Viet P. H.,

Suzuki S. - Antibiotic contamination and occurrence of antibiotic-resistant bacteria in

aquatic environments of northern Viet Nam, Sci. Total Environ. 409 (2011) 2894–2901.

5. Li B., Zhang T. - Biodegradation and adsorption of antibiotics in the activated sludge

process, Environ. Sci. Technol. 44 (2010) 3468–3473.

6. Wang Z. Y., Yu X. D., Pan B., Xing B. S. - Norfloxacin sorption and its thermodynamics

on surface-modified carbon nanotubes, Environ. Sci. Technol. 44 (2010) 978–984.

7. Lorphensri O., Intravijit J., Sabatini D. A., Kibbey T. C. G., Osathaphan K., Saiwan C. -

Sorption of acetaminophen, 17 alpha-ethynyl estradiol, nalidixic acid, and norfloxacin to

silica, alumina, and a hydrophobic medium, Water Res. 40 (2006) 1481–1491.

8. Tianyou Peng, De Zhao, Ke Dai, Wei Shi, Kazuyuki Hirao - Synthesis of Titanium

Dioxide Nanoparticles with Mesoporous Anatase Wall and High Photocatalytic Activity,

J. Phys. Chem. B 109 (2005) 4947-4952.

9. Carl Anderson and Allen J. Bard - An Improved Photocatalyst of TiO2/SiO2 Prepared by a

Sol-Gel Synthesis, J. Phys. Chem. 99 (1995) 9882-9885.

10. Asiltürk M., Sayılkan F., and Arpaç E. - Effect of Fe3+

ion doping to TiO2 on the

photocatalytic degradation of Malachite Green dye under UV and vis-irradiation, J.

Photochem. Photobiol. A 203 (1) (2009) 64-71.

11. Yang J., Zhang J., Zhu L., Chen S., Zhang Y., Tang Y., Zhu Y., Li Y. - Synthesis of nano

titania particles embedded in mesoporous SBA-15: Characterization and photocatalytic

activity, Journal of Hazardous Materials B 137 (2006) 952–958.