Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa...

1

Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong

chọn giống lúa chịu ngập chìm

Vũ Thị Thu Hằng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học

Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70

Người hướng dẫn: TS. Lưu Thị Ngọc Huyền

Năm bảo vệ: 2011

Abstract. Tổng quan về ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, nước biển dâng đến sản xuất

lúa gạo; các vùng trồng lúa ở Việt Nam có khả năng bị ngập theo kịch bản biến đổi khí

hậu. Nghiên cứu về cơ chế tính chống chịu ngập của cây lúa: gen chịu gập của cây lúa

và cơ chế hoạt động; sinh lý học tính chịu ngập của cây lúa; di truyền tính chịu ngập của

cây lúa. Tìm hiểu một số loại chỉ thị phân tử thường được sử dụng trong nghiên cứu

Genome và chọn giống thực vật, đồng thời nghiên cứu chọn tạo giống chụi ngập trên thế

giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu về giống lúa cho gen: IR64Sub1 và giống lúa nhận gen:

AS996 trong môi trường chịu ngập nước ở Việt Nam. Trình bày các phương pháp

nghiên cứu: phương pháp lai hữu tính -lai trở lại giữa giống cho và nhận gen chịu ngập

nước; phương pháp tách chiết ADN tổng số; phương pháp PCR với mồi SSR; phương

pháp điện di trên gel agarose 0,8%; phương pháp điện di trên gel polyacylamide;

phương pháp xử lý số liệu. Đưa ra kết quả nghiên cứu và thảo luận: tách chiết và tinh

sạch ADN tổng số; khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ; quy tụ gen chịu ngập chìm

SuB1 vào giống lúa AS996.

Keywords. Di truyền học; Phân tử; Giống lúa chịu ngập chìm; Cây lúa

Content.

MỞ ĐẦU

Cây lúa (Oryza Sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng cho khoảng

2/3 dân số thế giới. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, thế giới có khoảng

156,1 triệu ha đất dùng cho việc trồng lúa, sản lượng là 697,9 triệu tấn, 90% diện tích

này thuộc các nước châu Á với 651 triệu tấn thóc chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo thế

giới. (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010)[3]

2

Trên thế giới, an ninh lương thực không chỉ là vấn đề với các nước nghèo mà nó

đang trở thành vấn đề có tính toàn cầu. Dân số thế giới liên tục tăng (khoảng 7 tỷ người

năm 2011) trong khi diện tích đất dành cho việc trồng lúa hầu như không tăng mà ngày

càng giảm do đất được chuyển sang sử dụng cho các mục đích khác như xây dựng khu

công nghiệp, trường học, nhà ở, khu du lịch...

Bên cạnh đó, các dấu hiệu về sự biến đổi khí hậu hiện nay đã có thể nhận thấy

như trái đất đang nóng lên, băng tan ở hai cực, bão lũ xảy ra thường xuyên. Ở Việt Nam

nhiệt độ trung bình hàng năm tăng 0,10C và mực nước biển tăng 2,5 – 3,0 cm mỗi năm

trong thập kỷ qua. Tính đến cuối thế kỷ 21, nhiệt độ ở Việt Nam sẽ tăng khoảng 2,30C

và mực nước biển tăng 75 cm tính theo mức trung bình các năm 1980 – 1999.

Đối với gen chống chịu ngập cho đến nay các nhà khoa học ở Viện Nghiên cứu

Lúa Quốc tế đã xác định được một số các chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen có thể ứng

dụng trong chọn giống, sử dụng phương pháp MABC để chọn giống chịu ngập chìm. Để

góp phần tạo ra giống lúa có khả năng chịu ngập chìm ứng phó với biến đổi khí hậu

trong thời gian tới, ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất, chúng tôi thực hiện đề

tài: ―Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm”.

Đề tài được đề ra với mục tiêu cụ thể sau:

- Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại để quy

tụ gen chịu ngập (Sub1) đã được xác định trước vào giống lúa năng suất cao đang được

trồng phổ biến ở Việt Nam với thời gian ngắn đáp ứng nhu cầu giống trong sản xuất.

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Các giống lúa nghiên cứu

- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 là giống chịu ngập chìm là Giống lúa chống chịu

ngập đầu tiên tại Philippines đã được công nhận trong cuộc Họp Hội đồng thư ký lần thứ

27 ngày 7 tháng 7 năm 2009.

- Giống lúa nhận gen: AS996 là giống lúa chất lượng cao được bộ Bộ môn Di

truyền chọn giống Viện nghiên cứu Lúa ĐBSCL, được công nhận giống chính thức theo

3

Quyết định số 5310 QĐ/BNN-KHCN, ngày 29 tháng 11 năm 2002 của Bộ Nông Nghiệp

& PTNT.

- Một số giống lúa đang được trồng phổ biến ở Việt Nam như Q5c, Q5l, OM5472, FL478,

IR64SUB1, AS996, KDDB, BT.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

- 372 chỉ thị SSR phân bố rải rác trên12 NST (phụ lục 1)

- Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng (phụ lục 2)

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp lai hữu tính đối với các giống lúa cho và nhận gen kháng. Kết hợp

với phương pháp lai trở lại để chọn lọc và làm thuần nhanh những dòng mang gen kháng

và nền gen tối đa của giống nhận gen.

- Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB cải tiến

- Chọn lọc cây con mang gen kháng thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ

thị SSR liên kết với QTL quy định tính chịu ngập chìm (Sub1). Chọn lọc nền gen thông

qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa.

- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide.

- Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc.

- Điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe.

- Phân tích dữ liệu trên chương trình Graphical Genotyper (Van Berloo,

2008)[89].

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN TỔNG SỐ

Tách chiết ADN là bước đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh

học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp

theo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB.

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%

cùng với ADN chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả

trên máy soi cực tím.

4

Hình 3. Kết quả kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phƣơng pháp

CTAB trên gel agarose 0,8%.

Giếng số 1: Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), Các giếng từ 2 -17: ADN mẫu nghiên

cứu.

Kết quả tách chiết ADN cho thấy phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB cho

hiệu quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Nồng độ trong khoảng từ 200 –

300ng/l khi so sánh với lambda ADN chuẩn nồng độ 200ng/l giếng số 1. Các mẫu

ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ RNA bằng RNase tiến hành khá tốt thể hiện các

băng điện di gọn, rõ. Những mẫu ADN này đủ điều kiện để sử dụng cho những thí

nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.

3.2. KHẢO SÁT ĐA HÌNH GIỮA HAI GIỐNG BỐ MẸ

Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các

đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR.

Giống IR64Sub1 có mang gen chịu ngập Sub1. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị

có thể sử dụng để phát hiện gen chịu ngập trong các cá thể con lai tiến hành phản ứng

PCR với ADN của các giống lúa 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; 4. IR64Sub1; 5.FL478;

6.KDDB; 7.AS996, 8. BT. Sử dụng 372 chỉ thị SSR trên 12 nhiễm sắc thể kết quả có 53

chỉ thị cho băng đa hình giữa giống AS996 và IR64Sub1 được nêu ở bảng 7.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

5

Bảng7. Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống cho và nhận gen chịu ngập

Tt Tên mồi NS

T Trình tự xuôi Trình tự ngƣợc

Kích

thƣớc

1 RM237 1 caaatcccgactgctgtcc tgggaagagagcactacagc 130

2 RM10115 1 acaagacgaggtaacacgcaagc gcgaaggatcaacgatgatatgg 245

3 RM7075 1 tgtgaagcacatccagtgatcc gggatgagtgacacttgttaatgg 317

4 S01132a 1 caatgacgacgcatgtatgt tgcttgaatgtttttcgagg 196

5 RM6 2 gtcccctccacccaattc tcgtctactgttggctgcac 163

6 RM154 2 gacggtgacgcactttatgaacc cgatctgcgagaaaccctctcc 271

7 RM341 2 caagaaacctcaatccgagc ctcctcccgatcccaatc 172

8 RM109 2 gccgccggagagggagagagag ccccgacgggatctccatcgtc 97

9 RM300 2 gcttaaggacttctgcgaacc caacagcgatccacatcatc 121

10 RM6318 2 tgctgcttctgtccagtgag ggatcataacaagtgcctcg 199

11 RM60 3 agtcccatgttccacttccg atggctactgcctgtactac 165

12 RM3867 3 tttgactggaacatcgagctc atcccctctacaccgtaccc 120

13 SO3068 3 gggatgggagaagggaataa gccagctaggatgttgaagg 178

14 RM307 4 gtactaccgacctaccgttcac ctgctatgcatgaactgctc 174

15 RM124 4 atcgtctgcgttgcggctgctg catggatcaccgagctcccccc 271

16 R4M13 4 tacacggtagacatccaaca atgatttaaccgtagattgg 169

17 R4M17 4 agtgctcggttttgttttc gtcagatataattgatggatgta 169

18 RM3367 4 ggatccatccatccactgac ggatatgtgctgctgtgtgc 126

19 RM437 5 acaccaaccagatcagggag tgctcgtcaatggtgagttc 275

20 RM18877 5 accactgctgcaaagaacattgg gcgagaataagatgagacacaagag

g 190

21 R5M20 5 ctcgctgtttactgactgg tttgatgtactgcctgctct 175

22 S06061 6 gtcagtcgaggagtcggaga ggcgtacagcacaaaacaca 178

23 S06065a 6 ccccttcatcattgcaactt agtctctccatcacccgtct 164

24 RM508 6 ggatagatcatgtgtggggg acccgtgaaccacaaagaac 235

25 RM19840 6 ttatacacagatgacgcacacg tgggttaagggacacacttagg 200

26 RM3635 7 cgtgagagcgtgagagacag actttggtgttccctccctc 109

27 RM18 7 ttccctctcatgagctccat gagtgcctggcgctgtac 157

28 S07053 7 cgaaactttgggacgaaatg cgtccaccattcactgtcac 223

29 RM149 8 ggaagcctttcctcgtaacacg gaacctaggccgtgttctttgc 253

30 RM310 8 ccaaaacatttaaaatatcatg gcttgttggtcattaccattc 105

31 RM337 8 gtaggaaaggaagggcagag cgatagatagctagatgtggcc 192

32 RM105 9 gtcgtcgacccatcggagccac tggtcgaggtggggatcgggtc 134

6

33 RM215 9 caaaatggagcagcaagagc tgagcacctccttctctgtag 148

34 RM257 9 cagttccgagcaagagtactc ggatcggacgtggcatatg 147

35 RM316 9 ctagttgggcatacgatggc acgcttatatgttacgtcaac 192

36 RM23662 9 gagaggacgatggcactattgg cgaggaacttgattcgcatgg 149

37 RM24013 9 tccatcttcctctcctagagcttcc ctccctgtcccgagttagtgc 192

38 R9M10 9 ctttggattcaggggga aacttgaaacggaggcag 135

39 RM7175 9 acagtaaacgtggtgcctcc agaagtagcctcgaggaccc 105

40 ART5 9 cagggaaagagatggtgga ttggccctaggttgtttcag 159

41 SC3 9 gctagtgcagggttgacaca ctctggccgtttcatggtat 165

42 R9M30 9 cacatggcaccaacctcc gccaagtcattcactactctgg 123

43 RM296 9 cacatggcaccaacctcc gccaagtcattcactactctgg 123

44 RM228 10 ctggccattagtccttgg gcttgcggctctgcttac 154

45 RM271 10 tcagatctacaattccatcc tcggtgagacctagagagcc 101

46 RM25271 10 agacgctactcccacctgtaacc atatcattgccgcaacacaagc 185

47 S11117C 11 caaccatgtctatgatcgatgt ggctgtctccatgttgaggt 205

48 RM287 11 ttccctgttaagagagaaatc gtgtatttggtgaaagcaac 118

49 RM206 11 atatgagttgctgtcgtgcg caacttgcatcctcccctcc 134

50 RM224 11 atcgatcgatcttcacgagg tgctataaaaggcattcggg 157

51 RM17 12 tgccctgttattttcttctctc ggtgatcctttcccatttca 184

52 RM7558 12 cagtagcaggctcccttttg atcaggaacaccagagacgg 149

53 RM7102 12 ttgagagcgtttttaggatg tcggtttacttggttactcg 169

Tổng số 53 chỉ thị cho đa hình giữa giống cho gen (IR64 Sub1) và giống nhận gen

(AS996) đã được sử dụng để đánh giá xác định kiểu gen ở các thế hệ con lai.

Hình 4. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị

RM17; RM186; RM257; RM510

ADN: 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; 4. IR64Sub1; 5.FL478; 6.KDDB; 7.AS996

7

Để lựa chọn gen đích (Sub1) tiến hành khảo sát một nhóm chỉ thị nằm ở vị trí của

gen và về hai phía của gen Sub1 trên nhiễm sắc thể số 9. Đã xác định được hai chỉ thị là

ART5 và SC3 cho đa hình. Hai chỉ thị này liên kết rất chặt với gen Sub1. Chỉ thị ART5

được thiết kế từ vùng promoter của gen Sub1 ở vị trí 6,3 Mb và chỉ thị SC3 ở ở vị trí

6,6Mb trên nhiễm sắc thể số 9.

Sau đó, để lựa chọn các cá thể tái tổ hợp tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình

trên nhiễm sắc thể số 9, những chỉ thị này nằm về hai phía của gen Sub1 có khoảng cách

gần nhất là 1,8 Mb ở đầu trên tại vị trí của R9M10 và 2,8Mb ở đầu dưới tại vị trí của

RM24013 so với gen Sub1 (vị trí của gen Sub1 là 6.3–6.6 Mb hoặc 4.4–6.8 cM). (Xu et

al. 2006)[93]

Những mồi cho đa hình trên các nhiễm sắc thể còn lại không liên kết với gen

Sub1 được sử dụng để kiểm tra nền di truyền của giống nhận gen. Kết quả đánh giá đa

hình được tổng kết lại ở bảng 8.

Bảng 8. Các bƣớc chọn lọc sử dụng chỉ thị SSR cho đa hình trong các quần thể lai

trở lại

Các bƣớc chọn lọc Các mồi đa hình sử dụng cho quần thể

BC1F1 đến BC3F1

1 Lựa chọn cá thể ART5, SC3

Hình 5. Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị

RM18; RM118; RM152; RM223; RM284

ADN: 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; 4. IR64Sub1; 5.FL478; 6.KDDB; 7.AS996

8

mang gen đích

(Sub1)

2 Lựa chọn cá thể tái

tổ hợp

RM23662, RM316, R9M10, RM24013, RM105,

RM7175, RM257, RM215, RM296, R9M30

3 Lựa chọn nền di

truyền cây nhận gen

RM6, RM17, RM18, RM60, RM109, RM124, RM149,

RM154, RM206, RM224, RM228, RM237, RM311,

RM287, RM300, RM307, RM310, RM341, RM6318,

RM7558, RM10115, RM7102, RM25271, SO6061,

SO6065A, SO7053, S1117C, SO1132A, R4M13,

R4M17, R5M20, RM7075, SO3068, RM3367,

RM3867, RM437, RM508, RM19840, RM3635,

RM337, RM7102.

3.3. QUY TỤ GEN CHỊU NGẬP CHÌM SUB1 VÀO GIỐNG LÚA AS996

3.3.1. Xác định con lai F1

Thế hệ F1 lai tạo được 22 cá thể. Các cá thể này được trồng, tách chiết ADN để

xác định cây lai nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử.

Để xác định các cá thể F1 mang gen kháng, tiến hành phản ứng PCR với AND của

mẹ (AS996) và bố (IR64Sub1) và các con lai F1 với hai chỉ thị cho đa hình liên kết chặt

với gen Sub1 là SC3, ART5. Kết quả kiểm tra xác định cá thể mang gen được minh họa ở

hình 10.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Hình 10. Kiểm tra cá thể mang gen kháng ở thế hệ F1 với chỉ thị SC3

Giếng số 1: AS996, giếng số 2: IR64Sub1, giếng 3-24 con lai F1

9

Trong tổng số 22 cá thể F1 được đánh số từ 1-22 tương ứng từ giếng số 3 đến

giếng số 24, ghi nhận có 11 mẫu ADN của 11 cá thể có mang 2 băng: 1 băng đặc trưng

cho AS996, một băng đặc trưng cho IR64Sub1 là các cá thể số: 4, 5, 6, 7, 9, 16, 17, 19,

20, 21, 22. Các cá thể này được chọn làm mẹ để tiến hành lai trở lại với giống nhận gen

tạo thế hệ BC1F1.

3.3.2. Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC1F1

Dựa trên bản đồ vùng QTL chịu ngập thì chỉ thị tốt nhất trong khu vực Sub1 là

ART5 được thiết kế từ vùng promoter của gen và SC3 được thiết kế ở phía dưới của gen

Sub1 trên NST số 9 được sử dụng để lựa chọn những cá thể mang gen. Phản ứng PCR

được tiến hành giữa ADN các giống lúa AS996, IR64Sub1 và các con lai với hai chỉ thị

trên.

Tổng số 497 cá thể của quần thể BC1F1 đƣợc tiến hành tách chiết ADN và

kiểm tra sự có mặt của gen đích (Sub1) bằng hai chỉ thị liên kết chặt là ART5 và

SC3. Kết quả đƣợc minh họa ở hình 11 và 12.

Kết quả trên hình 11 thể hiện khi phân tích các cá thể BC1F1 với chỉ thị SC3

những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 49 và giống cho

Hình 11. Kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị

SC3. Giếng 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC1F1

Giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1

10

gen ở giếng số 50 là các giếng số 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 18, 23, 25, 27, 29,

36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 48.

Giếng số 5, 11, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 41, 46, 47 chỉ mang

băng của giống nhận gen, những cá thể này không mang gen kháng được loại bỏ ở các

bước sàng lọc sau.

Kết quả trên hình 12 thể hiện khi phân tích các cá thể BC1F1 với chỉ thị ART5

những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 2 và giống cho

gen ở giếng số 3 là các giếng số 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24,26, 27,

33, 34, 39, 45, 47, 48.

Kết quả thu được 165 cá thể BC1F1 dị hợp tử với cả hai chỉ thị ART5 và SC3.

Những cá thể dị hợp tử mang cả hai băng của giống nhận gen và giống cho gen với cả

hai chỉ thị ART5 và SC3 được lựa chọn để chọn lọc các cá thể tái tổ hợp. Sàng lọc cá thể

tái tổ hợp từ 165 cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho

đa hình trên nhiễm sắc thể số 9.

Kết quả phân tích để sàng lọc cá thể tái tổ hợp trên NST 9.

Hình 13. Sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM23662

Giếng 1,26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC1F1 giếng 49:AS996,

giếng 50: IR64Sub1

Hình 12. Kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị

ART5.Giếng 1, 50: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub1, 4-49: các cá

thể BC1F1

11

Sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM23662 ở hình 13 cho thấy cá thể tái tổ

hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 44 và giếng số 46.

Sàng lọc các cá thể BC1F1với chỉ thị RM240113 ở hình 14 cho thấy cá thể tái tổ hợp

mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 14, 27, 34, và giếng số 46.

Tương tự sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM7175 ở hình 15 cho thấy cá thể

tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 2, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 18,

20, 24, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 42 và giếng số 46.

Sử dụng 10 chỉ thị lựa chọn đƣợc tổng số 14 cá thể tái tổ hợp, trong đó 5/14

cá thể tái tổ hợp mang trao đổi chéo tại vị trí của R9M10 và RM24013; 9/14 cá thể

tái tổ hợp tại 1 đầu của NST tại vị trí của RM24013. Kết quả này đã xác định đƣợc

đoạn trao đổi chéo mang gen Sub1 ở cả hai đầu trên và dƣới của gen Sub1 đã đƣợc

chuyển vào các dòng BC1F1. Kết quả 14 cá thể tái tổ hợp đƣợc lựa chọn để tìm cá

thể mang nền di truyền cây mẹ lớn nhất là các cá thể số 5, 6, 39, 62, 63, 103, 153,

166, 215, 327, 340, 412, 422, 428.

Đối với thế hệ BC1F1, tổng số 26 chỉ thị cho đa hình không liên kết với gen

Sub1 trên 11 nhiễm sắc thể còn lại để lựa chọn nền di truyền của cây nhận gen.

Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical

Genotyper để lựa chọn. Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ

Hình 14. Sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM24013 Giếng 1,26,51: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC1F1, giếng 49:AS996, giếng50:IR64Sub1

12

đƣợc lựa chọn để lai tạo thế hệ BC2F1. Kết quả đƣợc nêu ở bảng 10, hình 16, và

hình 17.

Bảng 10. Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 14 cá thể BC1F1 tái tổ hợp

Cây số 5 6 39 62 63 103 153 166 215 327 340 412 422 428

A 66.67 54.17 62.50 41.67 54.17 45.83 58.33 45.83 66.67 58.33 66.67 72.00 75.00 72.00

H 25.00 45.83 37.50 58.33 45.83 33.33 41.67 54.17 33.33 41.67 33.33 24.00 25.00 24.00

R% 79.17 77.08 81.25 70.83 77.08 62.50 79.17 72.92 83.33 79.17 83.33 84.00 87.50 84.00

Từ kết quả trên cho thấy 14 cá thể tái tổ hợp có mang gen Sub1 và chứa tối

đa nền gen của giống nhận gen từ 62,5% đến 87,5%. Các cá thể có nền di truyền

cao nhất là P422 với 87,5% ngoài ra còn có các cá thể P412 (84%) P428 (84%),

P215 (83,33) và P39 (81,25).

Kết quả đã lựa chọn được 5 cá thể BC1F1 có mang vùng gen Sub1 và chứa tối đa

nền gen của giống nhận gen (R%) trong khoảng từ 80 - 86% để tiếp tục lai tạo thế hệ

BC2F1. Gen Sub1 là một trong những gen chính quy định tới 70% tính chống chịu ngập

chìm trong hầu hết các giống lúa đã được các nhà khoa học IRRI thử nghiệm từ trước tới

nay.


Từ 5 cá thể BC1F1 đƣợc lựa chọn đã lai tạo đƣợc quần thể thế hệ BC2F1 với

506 cá thể. Tiến hành tách chiết ADN, làm phản ứng PCR với các bƣớc nhƣ ở thế

hệ BC1F1. Kết quả đƣợc minh họa ở hình 18 và hình 19

Khi phân tích các cá thể BC2F1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2

băng của cả giống cho gen và giống nhận gen là giếng số 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14,

17, 18, 19, 22, 25, 27, 29, 31, 35, 36, 39.

Hình 18. Sàng lọc các cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3

1.AS996, 2. IR64Sub1, các giếng ký hiệu từ C1-C41: các cá thể BC2F1

13

Những giếng còn lại các cá thể chỉ cho 1 băng của giống nhận gen là AS996

những cá thể này không mang gen Sub1.

Khi phân tích các cá thể BC2F1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2

băng của cả giống là giếng số 3, 5, 10, 16, 18, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37,

38, 39, 40, 42, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 60, 61.

Những giếng còn lại mang băng của AS996.

Sau bƣớc sàng lọc gen đích với hai chỉ thị ART5 và SC3 để kiểm tra sự có

mặt của gen đích Sub1 trong các cá thể con lai thu đƣợc 245 cá thể dị hợp tử mang

hai băng của cả giống cho và nhận gen.

Sau đó,Tiến hành chọn lọc các cá thể tái tổ hợp bằng 10 chỉ thị kề hai bên gen

Sub1 trên nhiễm sắc thể số 9 được nêu ở bảng 8 với 245 cá thể mang gen. Kết quả được

minh họa từ hình 20 đến hình 22.


hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 55, 56, 57, 66.

Hình 19. Sàng lọc các cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5

ADN: 1AS996, 2. IR64Sub1, Các giếng ký hiệu từ C67-C328: Các cá thể BC2F1


1.AS996, 2. IR64Sub1, C3-C189:Các cá thể BC2F1

14


hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 8, 12, 14, 17, 19, 25, 31,

45.51.

Sau khi sàng lọc với 10 chỉ thị trên NST số 9 chọn ra đƣợc 17 cá thể tái tổ

hợp.

Kết quả cá thể có nền gen cây nhận gen cao nhất là 93,75 % là cá thể số P442

-11 và P442 -14. Cá thể có nền gen cây nhận gen thấp nhất là 89,7% ở cá thể số

P39-80. Ngoài ra, còn có các cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có nền gen cây

nhận gen là 92,25%. Các cá thể có mang gen Sub1 và có nền gen cây nhận gen cao

nhất là P442 -11 và P442 -14. P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 đƣợc chọn để lai tạo

quần thể BC3F1.


Tƣơng tự nhƣ với quần thể BC2F1 cho thế hệ BC3F1 với 445 cá thể. Sử dụng

hai chỉ thị ART5 và SC3 là hai chỉ thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể

mang gen Sub1 ở thế hệ BC3F1. Kết quả đƣợc minh họa ở hình 23 và 24


ADN: 1.AS996, 2. IR64Sub1, giếng 3-53: các cá thể BC2F1

1 2 3

Hình 23. Sàng lọc các cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3 Giếng 1: 25bp

ladder, 2-48: các cá thể BC3F1, giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1

15

Khi phân tích các cá thể BC3F1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2

băng của cả giống cho gen ở giếng số 49 và giống nhận gen ở giếng số 50 là giếng số 3,

5, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 30, 31, 32, 33, 35, 39, 40, 41, 42, 43, 46,

47.

Những giếng còn lại các cá thể đều mang băng của giống nhận gen AS996.

Khi phân tích các cá thể BC3F1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2

băng của cả giống nhận gen và giống cho gen là giếng số 5, 6, 10, 16, 17, 19, 22, 23, 24,

25, 28, 31, 32, 34, 35, 36, 38, 41, 43, 44, 45, 50, 51.

Các giếng còn lại các cá thể chỉ cho băng của AS996

Lựa chọn những cá thể dị hợp tử với cả hai chỉ thị chúng tôi xác định được 124 cá

thể mang gen Sub1. Sau đó, 124 cá thể mang gen này tiếp tục sàng lọc với các chỉ thị

trên NST số 9 để tìm ra các cá thể tái tổ hợp.

Hình 25. Sàng lọc các cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị 7175

Giếng1:25bp ladder, 4-45:Các cá thể BC3F1, giếng 2,46 :AS996, giếng3,47: IR64Sub1

Hình 24. Sàng lọc các cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5 giếng 1, 27:

25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub1, 4 26, 28-49: các cá thể BC1F1.

16

Sàng lọc các cá thể BC3F1 với chỉ thị RM7175 ở hình 25 cho thấy tất cả các cá

thể là tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen.

Sàng lọc các cá thể BC3F1 với chỉ thị RM24013 ở hình 26 cũng cho thấy tất cả

các cá thể là tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen.

Sàng lọc từ 10 chỉ thị cho đa hình trên NST số 9 với 124 cá thể. Kết quả chọn

được 22 cá thể tái tổ hợp. Những cá thể này được tiếp tục chọn lọc nền di truyền của

giống nhận gen. Sử dụng 19 chỉ thị trên 11 nhiễm sắc thể còn lại. Thí nghiệm này được

minh họa ở hình số 28 đến hình số 30.

Sàng lọc các cá thể BC3F1 ở hình 3.26 với chỉ thị RM10115 trên NST số 1 và Chỉ

thị S11117C trên NST số 11 nhận thấy tất cả các cá thể đều mang băng đồng hợp tử

giống nhận gen là AS996 .

Hình 28. Sàng lọc các cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM10115 (trái) Giếng1,25:

25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể BC3F1.

S1117C (phải) giếng1: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể BC3F1.


Giếng 47: 25bp ladder,3-44: Các cá thể BC3F1, giếng1, 45:AS996, giếng2, 46: IR64Sub1

17

Sàng lọc các cá thể tái tổ hợp BC3F1 ở hình 29 với chỉ thị R4M17 trên NST số 4

còn 3 cá thể ở giếng số 3, 4, 5, vẫn mang băng của giống cho gen. Chỉ thị R5M20 trên

NST số 5 thì các cá thể đều mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen

Sàng lọc các cá thể BC3F1 ở hình 30 với chỉ thị RM341 trên NST số 2 và chỉ thị

RM228 trên NST số 10 cũng nhận thấy tất cả các cá thể đều mang băng đồng hợp tử

giống nhận gen là AS996 .

Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical

Genotyper để lựa chọn cá thể BC3F1. Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ

nhiều nhất sẽ đƣợc lựa chọn để lai cho lai tạo thế hệ BC4F1.

1: chrom1 2: chrom2 3: chrom3 4: chrom4 5: chrom5 6: chrom6 7: chrom7 8: chrom8 9: chrom9 10: chrom10 11: chrom11 12: chrom12

15

45

57

144

164

176

177

178

189

201

216

239

251

252

255

318

320

321

354

356

357

404

Consensus

Legend . A B H

Hình 31. Biểu đồ 12NST của 22 cá thể thế hệ BC3F1 (AS996/IR64 Sub1)

Hình 29. Sàng lọc các cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị R4M17 và R5M20

Giếng1,26 AS996, giếng 2,27: IR64Sub1;3-22, 28-49: các cá thể BC3F1, giếng25: 25bp

18

Kết quả xác định đƣợc hai cá thể P422-14-164 và P422-14-178 có nền gen cây

nhận lên đến 96.29% so với AS996 ban đầu, cá thể số 422-14-177 là tốt nhất với

100% alen từ AS996 trong tổng số 53 chỉ thị sử dụng. Tất cả 3 cá thể này một mặt

đƣợc dùng để tự thụ cho gen Sub1 đồng hợp tử BC3F2, đồng thời tiếp tục lai tạo

quần thể BC4F1.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1/ Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ AS996xIR64Sub1 thu đƣợc 53 chỉ

thị đa hình trong tổng số 372 chỉ thị. Xác định đƣợc 11 cá thể mang gen Sub1 từ 22

cá thể F1 từ tổ hợp lai AS996 x IR64Sub1.

2/ Kết quả sàng lọc 497 cá thể BC1F1 thu đƣợc 165 cá thể mang gen Sub1, từ

đó chọn lọc đƣợc 14 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 và chứa tối đa nền gen giống

nhận gen từ 62,5%- 87,50%. Trong đó, cá thể có nền gen của giống nhận gen cao

nhất là P422 với 87,50%.

3/ Kết quả sàng lọc 506 cá thể BC2F1 thu đƣợc 245 cá thể mang gen Sub1,

xác định đƣợc 17 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 và hai trong số 17 cá thể này

chứa nền gen của giống nhận gen cao nhất là cá thể P442 -11 và P442 -14 đạt 93,75

%.

4/ Kết quả sàng lọc 445 cá thể BC3F1 thu đƣợc 124 cá thể mang gen Sub1 trong đó

có 22 cá thể tái tổ hợp. Dòng BC3F1 có nền di truyền cây nhận gen cao nhất là P422-

14-177 với 100% alen từ AS996 trên tổng số 53 chỉ thị đã phân tích.

Kiến nghị

Các dòng BC4F1 và BC3F2 sẽ tiếp tục đƣợc nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, đánh

giá ngập nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo các dòng AS996-

Sub1 có thể trồng ở các vùng ngập nƣớc, lũ lụt góp phần vào công tác chọn tạo

giống lúa ứng phó với biến đổi khí hậu.

19

References.

Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T., Bùi Chí Bửu và Bùi Bá Bổng (2001), Chọn giống

nhờ Marker và Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr. 44 - 58.

2. Bộ Tài nguyên và Môi trường (2009), ―Chương trình mục tiêu quốc gia ứng phó với

biến đổi khí hậu‖ Kịch bản biến đổi khí hậu, nước biển dâng cho Việt Nam, Hà Nội

tháng 6 năm 2009.

3. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2009), Quy hoạch sử dụng đất lúa cho

từng vùng trên cả nước.

4. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2010), Số liệu ước tính của USDA.

5. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2000), Những nguyên tắc cơ bản trong chọn

giống cây trồng, Di truyền phân tử I, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh.

6. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối

với thiệt hại do môi trường của cây lúa, Nxb Nông nghiệp TPHCM.

7. Lưu Minh Cúc, Nguyễn Thị Kim Liên, Vũ Thị Thu Hằng, Nguyễn Quang Đàm, Phạm

Thị Minh Hiền, Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang (2010). ―Khảo sát đa dạng

di truyền một số giống lúa nếp bằng chỉ thị phân tử SSR‖. Tạp chí khoa học và

công nghệ nông nghiệp Việt Nam số 6 (19), trang 2-6.

8. Nguyễn Văn Cường, Tổng quan về BĐKH và tác động của chúng đến hoạt động của

con người, Viện Nghiên cứu và Đào tạo Phát triển Công nghệ.

9. Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập 4, Nxb Giáo dục.

10. Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh Quân, Phạm Thị

Hoa, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Thị Tân Phương, Trịnh Minh Hợp, Nguyễn Duy

Bảy, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Thanh Thủy (2009), ―Phân tích và xác định

các chỉ thị phân tử đa hình phục vụ lập bản đồ các nhóm liên kết genome và xác

định vị trí gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ (Gossypium arboreum L.)‖, Tạp

chí Công nghệ Sinh học Việt Nam, 8 (1), tr. 69-74.

11. Đào Xuân Học Thứ trưởng Bộ NN và PTNT, Bài trình bày Hội thảo Việt Nam thích

ứng với biến đổi khí hậu, Hội An – Quảng Nam 31/7/2009.

20

12. Lê Thị Ánh Hồng (2002), Bệnh học phân tử thực vật, Nxb Nông nghiệp.

13. Hội thảo về Biến đổi Khí hậu, Kịch bản biến đổi khí hậu nước biển dâng cho việt

nam, Hội An, 31/7/2009 phần II.

14. Lưu Thị Ngọc Huyền (2003), Nghiên cứu lập bản đồ gen kháng rầy nâu ở giống lúa

CR203 và ứng dụng trong chọn giống, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Di

truyền Nông nghiệp Việt Nam.

15. Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang, Lưu Minh Cúc, Phạm Thị Minh Hiền, Vũ Thị

Thu Hằng, Nguyễn Thị Trang, Đinh Văn Thành (2010), ―Chỉ thị phân tử trợ giúp

trong chọn giống lúa kháng rầy nâu‖. Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp

Việt Nam số 6 (19), trang 11-17.

16. Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh

học, Nxb Nông nghiệp, TPHCM.

17. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2004), ―Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen

mùi thơm trên lúa‖, Di truyền học và Ứng dụng (2).

18. Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng dụng

công nghệ gen trong chọn giống cây trồng. Anh tuấn

19. Lã Tuấn Nghĩa (2011), chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn có năng suất chất

lượng cao bằng chỉ thị phân tử, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,

2+3/2011.

20. Nguyễn Đức Ngữ, ―Biến đổi khí hậu và khô hạn, hoang mạc hóa‖ Báo cáo tại Hội

thảo BĐKH toàn cầu và giải pháp ứng phó của Việt Nam, Hà Nội, 26-29/2/2008.

21. Nguyễn Kỳ Phùng, Bùi Chí Nam, Đánh giá tác động nước dâng do biến đổi khí hậu

đến dải ven biển tỉnh khánh hòa, Hội ĐTM Việt Nam và Phân viện Khí tượng

Thủy văn và Môi trường phía nam.

22. Susmita Dasgupt, Benoit Laplante, Craig Meisner, David Wheeler,

Jianping Yan

(2007), Ảnh hưởng của mực nước biển dâng cao ở các nước đang phát triển Phân

tích so sánh , Bài nghiên cứu Chính sách của Ngân hàng Thế giới 4136 tháng 2 năm

2007.

23. Lê Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn tạo giống thực vật, Nxb ĐHQG Hà Nội.

21

24. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Bài giảng công nghệ sinh học, Trường

Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, Viện Sinh học Nông nghiệp, tr. 61.

25. Lê Anh Tuấn (2009), Tổng quan về nghiên cứu biến đổi khí hậu và các hoạt động

thích ứng ở miền Nam Việt Nam, Viện Nghiên cứu Biến đổi Khí hậu – Trường Đại

học Cần Thơ.

Tài liệu tiếng Anh

26. Abdelbagi M. Ismail, Evangelina S. Ella, Georgina V. Vergara and David J. Mackill

(2009), Mechanisms associated with tolerance to flooding during germination and

early seedling growth in rice (Oryza sativa), Annals of Botany 103: 197–209.

27. Armour J.A..L. and Jeffreys A..J. (1992). ―Biology and application of human

minisatellite loci‖. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, pp. 850 - 856.

28. Bert Collard and David Mackill (2005), Marker assisted breeding for rice

improvement, MAB lecture of plant breeding genitics and Biotechnology

division, IRRI.

29. Botstein D., White R.L., Skolnick.M. and Davis R.W. (1980) ―Construc tion of

a genetic linkage mapin man using restriction fragement length

polymorphisms‖. Amer. J. Hum. Genet. 32, pp. 314 - 331.

30. Caldo, RA and Sebastian, LS (1998), ―Molecular diversity of philippine improved

rice varieties and their progenitors using RAPD and SSR markers‖, Agricultural

biotechnology, 72, pp. 79 - 81.

31.Chang TT, JT Armenta-Soto, CX Mao, R Peiris, and C Loresto (1985), ―Genetic

studies on the components o drought resistance in rice (Oryza sativa L.)‖, Paper

presented at the ins. Rice Genetics symposium, 27-3 May 1985. IRRI. Los Banos,

Philippines.

32. Chen D., Dela Vina M., et al (1999), ―Molecular mapping of the blast resistance

gene, Pi-44(t), in a line derived from a durably resistance rice cultivar,‖ Theor.

Appl. Genet, 97, pp. 345 - 355

22

33. Chen X. M., Line R. F., Leung H. (1998), "Genome scanning for resistance gene

analogs in rice, barley and wheat by high- resolution electrophoresis", Theor. Appl.

Genet., 97, pp. 345-355.

34. C. N. Neeraja, R. Maghirang-Rodriguez, A. Pamplona, S. Heuer, B. C. Y. Collard

E. M. Septiningsih, G. Vergara, D. Sanchez, K. Xu, A. M. Ismail, D. J. Mackill

(2007), ―A marker-assisted backcross approach for developing submergence-

tolerant rice cultivars‖, Theor Appl Genet (2007) 115:767–776.

35. Choudhury MA (1975), ―Genetics and breeding of deepwater rice‖, In Proceeding of

the Int. Seminaron deepwater rice 197, Bang ladesh. pp. 83-86.

36. Church, J.A., Gregory, J.M., Huybrechts, P., Kuhn, M., Lambeck, K., Nhuan, M.T.,

Qin, D., Woodworth, P.L., (2001) ―Changes in sea level‖ In: Houghton, J.T.,

Ding, Y., Griggs, D.J., Noguer, M., van der Linden, P.J., Xiaosu, D. (eds.),

Climate Change 2001, The Scientific Basis. Cambridge University Press,

Cambridge, pp. 639-693.

37. Collard BCY and Mackill DJ (2008), ―Marker assisted selection: an approach for

precision plant breeding in the twenty-first century‖ Phil Trans Roy Soc Lond B

Biol Sci 363: 557—572.

38. Collard B.C.Y, Vera-Cruz C.M., McNally K.L., Virk P.S., and Mackill D.J. (2008),

―Rice Molecular Breeding Laboratories in the Genomics Era: Current Status and

Future Considerations‖ Internat. J. Plant Genomics, vol. 2008, article ID 524847,

pp.25.

39. Cruz, R.V., H. Harasawa, M. Lal, S. Wu, Y. Anokhin, B. Punsalmaa, Y. Honda, M.

Jafari, C. Li and N. Huu Ninh (2007) Asia. Climate Change 2007: Impacts,

Adaptation and Vulnerabilit,. Contribution of Working Group II to the Fourth

Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change, M.L.

Parry, O.F. Canziani, J.P. Palutikof, P.J. van der Linden and C.E. Hanson, Eds.,

Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp.469-506.

40. Devos K.M. and Gale M.D. (1992), ―The use of random amplified polymorphic

DNA markers in wheat‖. Theor. Appl. Genet. 84: 567-572.

23

41. Emes MJ, CP Wilkins, PA Smith, K Kurkanchanakul, K Hawker, WA Charlton, EG

Cutter (1988), ―Starch utilization by deep water rice during submergence‖, In;

Proceedings of the 1987 International DeepWater Rice Workshop, 20-30 Oct,

Bangkok, Thailand. IRRI, Philippines. pp. 319-326.

42. Frisch M., Bohn M. and Melchinger A.E. (1999), ―Comparision of selection

strategies for marker-assisted backcrossing of a gene‖, Crop Sci, 39, pp.1295-1301.

43. Grant M. R., et al. (1995), ―Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual

specificity disease resistance‖, Science, 269: 843-846.

44. Hamada H. and Kakunaga T. (1982), ―Potential Z-DNA forming sequences are

highly dispersed in Human genome”, Natural 298:396 – 398.

45. Haque QA, D HilleRisLambers, NM Tepora, QD de la Cruz (1989), ‗Inheritance of

submergence tolerance in rice‖, Euphytica 41: 247-251.

46. Hoanh, C.T., H. Guttman, P. Droogers and J.Aerts. (2004), ―Will we produce

sufficient food under climate change? Mekong Basin (South-east Asia)‖, Climate

Change in Contrasting River Basins: Adaptation Strategies forWater, Food, and

Environment, J.C.J.H. Aerts and P. Droogers, Eds., CABI Publishing,Wallingford,

pp.157-180.

47. IPCC (2007) The 4th assessement report of the Intergovernmental Panel on Climate

Change. http://en.wikipedia.org/wiki

48. Ishikawa R., Morishima H., Kinoshita T., Harada T. and Nuzeki M. (1991) ―Linkage

analysis of nine Isozyme gens on the conventional linkage map in rice‖. Jpn. J.

Breed. 41, pp. 265 - 272.

49. Inouye J, and VT Xuan. 1973. On the growth habits of floating single and double -

Transplanting rice plants in South Vietnam. I. Mesocotyl elongation in darkness.

Ipn. J. Trop. Agric. 17 (2): 75 - 80.

50. Jackson BR and BS Vergara (1979), ―Progress in deepwater rice research‖ int.

deepwater rice workshop, Pages 3 - 12 in proceeding of the 1978, Aug. 17-19,

1978. Calentta, India.

http://en.wikipedia.org/wiki

24

51. Jackson BR and BS Vergara (1979), ―Progress in deepwater rice research in

proceeding of the 1978 int‖, deepwater rice workshop, Aug. 17-19, 1978, Calentta,

India, pp. 3 – 12.

52. Jena S, Sahoo P, Mohanty S, Das AB (2004 ) ―Identification of RAPD markers, in

situ DNA content and structural chromosomal diversity in some legumes of the

mangrove flora of Orissa‖, Genetica, 122; No. 3; pp. 217-226.

53. Julia Bailey-Serres, Takeshi Fukao, Pamela Ronald, Abdelbagi Ismail, Sigrid Heuer,

David Mackill (2010), Submergence Tolerant Rice: SUB1’s Journey from

Landrace to Modern Cultivar, This article is published with open access at

Springerlink.com

54. Kadam SS, J Singh, SL Mehta (1973), ―Changes in isoenzymes in embryo and

endosperm of normal and opaque-2 Zea mays during inhibition‖, Phytochemistry

12: 1221-1225.

55. K. M. Iftekharuddaula, M. A. Newaz, M. A. Salam, H. U. Ahmed, M. A. A.

Mahbub, E. M. Septiningsih, B. C. Y. Collard, D. L. Sanchez, A. M. Pamplona,

D. J. Mackill (2010), Rapid and high-precision marker assisted backcrossing to

introgress the SUB1 QTL into BR11, the rainfed lowland rice mega variety of

Bangladesh, Springer Science+Business Media B.V. 2010.

56. Krishnayya GR, RM De, SB Lodh (1990) ―Physiological basis for submergence

tolerance in rice‖ Oryza 27:286-290.

57. Lang NT. (1999) ―QTL mapping for salt tolerance in rice. Final report‖ Japan

Fellowship.

58. Mackill D. J. and Bonman J. M. (1992), "Inheritance of blast resistance in near-

isogenic lines of rice", Phytopathol., 82, p p.746-749.

59. Mazaredo AM and BS Vergara (1982), ―Physiological differences in rice varieties

tolerant of and susceptible to complete submergence‖, In proceeding of the 1981

int. deepwater rice workshop. IRRI, Los Banos Philippines. pp. 327-342.

60. Ministry of Planning and Investment (MPI) (2009), Statistical Yearbook of Vietnam

2008. Hanoi. pp.819.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15609544&query_hl=5

25

61. Ministry of Natural Resources and Environment (MONRE) (2009), Climate change,

sea level rise scenarios for Vietnam, Hanoi, pp. 34.

62. Mishra SB (1995), Genetics of submergence tolerance and elongation ability of

flood-prone rice. Plant Breeding, Genetics and Biochemistry Division. IRRI,

Philippines. pp.16.

63. Mohanty HK, GS Khush. (1985), ―Diallel analysis of submergence tolerance in rice,

Oryza sativa‖, Theo Appl Genet 70: 467-473.

64. Mohanty HK, B Suprihatno, GS Khush, WR Coffman, and BS Vergara (1982)

―Inheritance of submergence tolerance in deepwater rice‖, In: Proceeding of the

1981 int. deepwater rice workshop. IRRI, Los Banos Philippines, pp.121-134.

65. Mohan M, Nair S, Bhagwat A, Krishna TG, Yano M, Bhatia CR, Saki T (1997),

―Genom mapping, molecular markers and marker- assisted selection in crop

plants‖, Molecular Breeding 3: 87 - 103.

66. Murty KG, KK Nanda (1974), ―Changes in peroxidase isoenzymes of Phaseolus

mungo hypocotyl cutting rooting‖, Phytochemistry 13:1089-1093.

67. Nandi S, PK Subudhi, D Senadhira, NL Manigbas, S sen-Mandi, N Huang (1997),

―Mapping QTLs for submergence tolerance in rice by AFLP analysis and selective

genotyping‖ Mol Gen Genet, 255: 1-8.

68. Napvi N..I., Bonman J.M., Mackil D..J., Nelson F..J. .and Chattoo B..B. (1995).

―Identification of RAPD markers linded to a major blast resistance gene in rice‖,

Mol. Breed. 1:341 – 348.

69. Oka HI (1975), ―Floating rice, an ecotype adapted to deepwater paddies‖, Review

from the viewpoint of breeding, pp. 277-287. from rice in Asia. National Institute

of genetics. Mishima, Japan.

70. Rai RSV, KS Murty (1976), Effect of submergence on some physiological changes

in rice seedlings, Ind. J. Exp. Biol. 14:369-370.

71. Rai RSV, KS Murty (1979), Note on the effect of complete submergence of RVBP

carboxylase activity on rice seedlings. Indian J. Aric. Res. 13: 61-63

26

72. Ramiah K, and K Ramaswami (1941), ―Floating habit in rice‖, Indian J. Agric. Sci.

11: 1-8.

73. S. Abdolhamid Angaji , Endang M. Septiningsih, D. J. Mackill, Abdelbagi M. Ismail

(2009), QTLs associated with tolerance of flood during germination in rice (Oryza

sativa), Springer Science+Business Media B.V. 2009.

74. Saha Ray PK, D HilleRisLambers, NM Tepora (1993), ―Combination of stem

elongation ability with submergence tolerance in rice‖ Euphytica 68:11-16

75. Saghai Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984) ―Ribosomal

DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance,

chromosomal location , and population dynamics‖, Proc Natl Acad Sci USA (81):

8014-8018.

76. Sarkar RK, Panda D, Reddy JN, Patnaik SSC, Mackill DJ, Ismail AM (2009),

―Performance of submergence tolerant rice genotypes carrying the Sub1 QTL

under stressed and non-stressed natural field conditions‖ Indian J Agric Sci. in

press.

77. Septiningsih EM., Pamplona AM., Sanchez DL., Maghirang-Rodriguez R, Neeraja

CN, Vergara GV, Heuer S, Ismail AM, Mackill DJ (2009), Development of

submergence-tolerant rice cultivars: The Sub1 gene and beyond, Ann. Bot.

103:151-160.

78. Singh S, Mackill DJ, Ismail AM (2009), Responses of SUB1 rice introgression lines

to submergence in the field: Yield and grain quality, Field Crops Res 113: 12–23.

79. Setter TL, I Waters, H Greenway, BJ Atwell, T Kupkanchanakul (1987),

―Carbohydrates status of terrestrial plants during flooding. In: Crawford RMM

(Ed.)‖, Plant Life in Aquatic and Amphibious Habitats. British Ecological Society

Symposium, No. 5. Blackwell Scientific Publications, Oxford. 411-433.

80. Setter TL, MB Jackson, I Waters, I Wallace, H Greenway (1988), ―Foodwater

carbon dioxide andethylene concentrations as factors in chlorosis development

andreduced growth of completely submerged rice‖ In: Proceedings of the 1987

International Deepwater Rice Workshop, Bangkok, Thailand, IRRI, pp. 301-310.

27

81. Setter TL, E Ellis, EV Laureles, ES Ella, D Senadhira, SB Mishra, S Sarkarung, S

Datta (1997), Physiology and genetics of submergence tolerance in rice, Annals of

Botany 79:67-77.

82. Sripongpankul K. (1998), Gene mapping andquantitative trait loci analysis of flood

tolerance in rice (Oryza sativaL.) PhD Thesis. University of The Philippines, Los

Banos (UPLP), IRRI, Philippines,pp. 137.

83. Suprihatno B, WR Coffman (1981), ―Inheritance of submergence tolerance in rice

(Oryza sativa L.)‖, SABRAO 13, pp.98-108.

84. Takeshi Fukao and Julia Bailey-Serres (2008), Submergence tolerance conferred by

Sub1A is mediated by SLR1 and SLRL1 restriction of gibberellin responses in rice,

Department of Botany and Plant Sciences, Center for Plant Cell Biology,

University of California, Riverside, CA 92521, This article contains supporting

information online at www.pnas.org/cgi/content/full/

0807821105/DCSupplemental.

85. Takeshi Fukao, Kenong Xu, Pamela C. Ronald, and Julia Bailey-Serresa (2006), ―A

Variable Cluster of Ethylene Response Factor–Like Ge Regulates Metabolic and

Developmental Acclimation Responses to Submergence in Rice‖, The Plant Cell,

Vol. 18, 2021–2034.

86. Thach TD (1994) The genetic association between elongation ability and

submergence tolerance in rice (Oryzsativa L.,. MSc Thesis, Central Luzon State

University, Nueva Ecija, Philippines. pp.65.

87. Thomson M.J., Ismail A.M., McCouch S.R., Mackill D.J. (2009), ―Abiotic Stress

Adaptation in Plants: Physiological, Molecular and Genomic Foundation‖, Marker

Assisted Breeding. Chapter 20. Springer Science & Business Media: 451-469.

88. Thomson MJ, Marjorie DO, James E, Rahman MA, Sajise AG, Adorada AL, Raiz

ET, Blumwald E, Seraj ZI, Singh RK, Gregorio GB & Ismail MA (2010),

Characterizing the Saltol Quantitative Trait Locus for Salinity Tolerance in Rice.

Rice DOI 10.1007/s12284-010-9053-8.

28

89. Van Berloo R (2008), GGT 2.0: versatile software for visualization and analysis of

genetic data,. J Hered 99:232–236.

90. Wang Z., Second G. and Tanksley S.D. (1992), ―Polymorphism and phylogenetic

relationship among species in the Genus Oryza as determined by analysis of

nuclear RFLPs‖. Theor. Appl. Genet. 83, pp. 565 - 581.

91. Williams J.G, et al (1990), "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are

useful as genetic marker", Nucleic Acid Research, 18, 6531-6535.

92. Wassmann, R., Hien, N. X., Hoanh, C. T., and Tuong, T. P. (2004), ―Sea level rise

affecting the Vietnamese Mekong Delta: Water elevation in the flood season and

implications for rice production‖, Climatic Change. 66, 89-107.

93. Wu K.S. and Tanksley S.D. (1993), ―Abuudance, polymorphism and genetic

mapping of microsatellite in rice‖. Mol. Gen. Genet. 241, pp. 225 - 235.

94. Xu K, DJ Mackill (1995), ―RADP and RFLP mapping of a submergence tolerance

locus in rice‖, Rice Genetics Newsletter 12: 244-245

95. Xu K, Xu X, Fukao T, Canlas P, Maghirang-Rodriguez R, Heuer S, Ismail AM,

Bailey-Serres J, Ronald RC, Mackill DJ. 2006. Sub1A is an ethylene-response-

factor-like gene that confers submergence tolerance to rice. Nature 442:705-708.

96. Yamada N. (1959), Physiological basis of resistance of rice plant against overhead

flooding, [in Japanese, English summary] Bull, National Institute Agricultural

Science Ser. No. 9: pp.110.

97. www.combatclimatechange.ie

98. http://www.nature.com.

99. http://www. Nongthon.com.vn

100. www.gramene.org

101. http://www.ricegenetics.com

102. www.philrice.gov.ph.

http://www.gramene.org/

http://www.ricegenetics.com/

http://www.philrice.gov.ph/

Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa...

Documents