new generation sequencing and bioinformatics in the big data era daniel guariz pinheiro, phd....
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New Generation Sequencing and Bioinformatics in the Big Data Era
Daniel Guariz Pinheiro, PhD.
Laboratório de Genética Molecular e BioinformáticaDepartamento de GenéticaFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoUniversidade de São Paulo
BIG DATA ERAIntrodução
D. ALLISONhttp://www.nature.com/nature/journal/v455/n7209/full/455028a.html
Em 2010, o universo digital somou 1,2 ZettaBytes. Em 2011 o número subiu para 1,8 ZettaBytes
Estudo da IDC sobre o Universo Digital patrocinado pela EMC, maio de 2010
1 ZettaByte (ZB) = 1 Trilhão 1,000,000,000,000 GigaBytes (GB)
1,2 ZB = 2 pilhas de DVDs da terra à lua (384.404 Km)
“Big Data” Era• “…information in our world is exploding. There are expected to be 1 trillion new devices
connected to the Internet in the near future, which will help drive 44X digital data growth by the year 2020, 80 percent of which will be unstructured content and will require great effort to analyze.
By Steve MillsIBM’s Senior Vice President & Group Executive, Software & Systems
CISCO estimates that the monthly global internet traffic in the spring of 2010 was 21 exabytes.
1 ExaByte (EB) = 1,000,000,000 GigaBytes (GB)
“Big Data Era” na Ciência
1 PetaByte (PB) = 1,000 TeraBytes (TB) = 1,000,000 GigaBytes (GB)
Researchers need to adapt their institutions and practices in response to torrents of new data — and need to complement smart science with smart searching.
Setembro 2008
Editorial
Ciclo do Conhecimento
hypothesis-driven science
data-driven science“…computational methods of data analysis, which may be automated, provide the means of generating novel hypotheses, especially in the post-genomic era.”
(Kell DB et al., 2004)
(Kell DB et al., 2004)
Gene Knock-outsProtein AssaysPoint mutations…
MicroarraysGenomicsMeta-genomicsHT proteomics…
Inundação de Dados na Áreade Ciências Biológicas
• genomas completos sequenciados;• dados de variações genômicas;• projetos de Meta-Genômica;• dados de transcritomas;• dados de proteínas;• dados de interações entre proteínas;• …
Explosão de Sequências
Preparação
Desafios
• Pontos urgentes que devem ser enfrentados:– Transferência de dados, controle de acesso e gerenciamento;– Padronização dos formatos de dados;– Integração dos dados oriundos de múltiplas fontes.
• Dados com características Multi-dimensionais e em um volume imenso;
– Exemplo: Análise funcional de variações no DNA em múltiplas amostras em diferentes tipos de tumores utilizando dados de sequenciamento de nova geração;
– Modelos preditivos para fenótipos complexos demandam computação intensa (Problemas NP-difíceis – ex. Reconstrução de uma rede Bayesiana para representar um modelo de regulação gênica)
Integração dos Bancos de Dados Biológicos
• Características– Grande volume de dados;
• Desenvolvimento de novos mecanismos e técnicas para o armazenamento e recuperação (e.g. Google BigTable );
– Não há padrão para os nomes dos objetos;• Ontologias (e.g. Gene Ontology) e organizações que regulam a
nomenclatura (e.g. HUGO)– Não há padrão para acesso aos dados, cuja natureza é distribuída;
• Utilização de formatação padrão para troca de informações (e.g. GFF) e web services;
– Definição variável para alguns conceitos;• e.g. gene
– Dados altamente heterogêneos mas inter-relacionados;– Informação dinâmica e em constante atualização;
Soluções computacionais
• Cloud-based computing;• Ambientes computacionais heterogêneos;
– Integração de aceleradores especializados (GPUs);• Aumento do número de computadores;• Otimização de algoritmos;
Primeiros passos...
• Compreensão da natureza dos dados, ou seja, da sua magnitude e complexidade, e dos recursos disponíveis (memória, espaço,...);
• Compreensão dos algoritmos;• Compreensão das vantagens e desvantagens
das arquiteturas disponíveis;– A decisão não é sempre óbvia e muitas vezes
consiste em uma combinação delas;
Soluções no Brasil
O EMU (Equipamento MultiUsuário) é uma plataforma de alta-performance para análises computacionais aplicadas à genômica e à transcriptômica.
Financiamento: Programa Multiusuário da FAPESP de 2010, com uma contra-partida do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer.
Sequenciamento
Por quê sequenciar ? • Motivação
– Aplicações diversas: identificar sequências funcionais e caracterizar genomas ou transcriptomas;
• Da Genômica Comparativa à Medicina Genômica;
– Propósitos gerais;• Análogo às aplicações de um Computador
Pessoal (PC)
REVISÃO HISTÓRICAIntrodução
Marcos históricos
Darryl Leja , NHGRI
Experiments in Plant Hybridization
Leis da hereditariedade
1865
Gregor Johann MendelTermo Gene = unidade mendelianada hereditariedade
1909
Wilhelm Johannsen
DNA = caracter hereditário
1944
Oswald T. AveryColin M. MacLeod, Maclyn McCarty
Estrutura do DNA
1953
James Watson Francis Crick Maurice WilkinsRosalind Franklin Métodos para o
sequenciamento de DNA
1977
Walter GilbertFrederick Sanger
Banco de Dados de Sequências Biológicas
1982
NCBI GENBANK
Polymerase Chain Reaction
1985
Kary MullisSequenciador Semi-Automático e surgimento do primeiro sequenciador comercial (ABI)
1986
Leroy Hood
Início do PGH
• PGH - início em 1990• Mapeamento detalhado do genoma humano
– 5000 cientistas, de 250 diferentes laboratórios;– 15 anos.– 5 a 10 Bilhões de dólares (US$);– Otimismo exacerbado;– Para muitos pesquisadores um projeto irrealizável;– Para outros a oportunidade de transformar a Genética
em Big Science;
Projeto Genoma Humano
• The International Human Genome Sequencing Consortium • 13 anos (1990-2003)• U$3.000.000.000,00 (3 BILHÕES de DÓLARES!!!)• Avanços imediatos proporcionados
Identificação de ~25.000 genes (~20% material genético total); Possibilitou a descoberta de ~1.800 genes relacionados a doenças,
facilitando a identificação de outros genes; Permitiu o desenvolvimento de mais de 1.000 testes genéticos; Ao menos 350 produtos biotecnológicos resultantes deste conhecimento
já estão em testes clínicos; Desenvolvimentos de ferramentas para análise genômica, inclusive de
outras espécies de interesse biomédico e econômico; Promoveu discussões éticas, legais e implicações sociais em torno do
assunto; Consituição de uma base de conhecimento;
...no Brasil
Iniciativa pública Projeto Genoma Humano
Publicação do rascunhodo Genoma Humano
1990 2001
2000
Sequenciamento do Genoma da bactéria Xylella fastidiosa
1997Organization for Nucleotide Sequencing and Analysis
1999
...
2003Conclusão do Projeto Genoma Humano
1ª experiênciabrasileira:
2002
Desenvolvimento dos Computadores
1946
ENIAC, o 1° computador eletrônico
John Presper Eckert e John W. Mauchly
Z1, o 1° computador eletro-mecânico
1936
Konrad Zuze
1965
Gordon E. MooreLei de Moore
IBM PC (Personal Computer) 1981
Lei de Moore
...e dos Sistemas Computacionais
1991
GNU/Linux
1987
Linguagem de Programação Perl
http://www.bioperl.org/wiki/How_Perl_saved_human_genome
19721969
1971 UNIX – 1ª Versão
UNICS ,Ken Thompson, Dennis Ritchie e outros na Bell Labs.
Linguagem de Programação C Dennis Ritchie
1993
Linguagem Estatística R
Ross Ihaka eRobert Gentleman
Bioinformática• Bioinformática: Pesquisa, desenvolvimento, ou aplicação de ferramentas
computacionais e abordagens para expandir a utilização de dados biológicos, médicos, comportamentais e de saúde, incluindo a aquisição, o armazenamento, a organização, o arquivamento a análise ou visualização desses dados.
• Computational Biology: O desenvolvimento e aplicação de métodos teóricos e analíticos, incluindo modelagem matemática e aplicação de técnicas de simulações computacionais para o estudo de sistemas biológicos, sociais ou comportamentais.
Biomedical Information Science and Technology Initiative Consortium (BISTI - NIH)
Repositórios de Dados Biológicos
• 1965 – Atlas of Protein Sequences and Structure (Dayhoff et al.) - ~1Mb
• 1982 – GenBank – 1988 – NCBI – National Center for Biotechnology Information
• 1997 – EMBL – European Molecular Biology Laboratory
• 1986 – DDBJ – DNA Data Bank of Japan
International Nucleotide Sequence Database Colaboration
200898.868.465 seqüências99.116.431.942 bases
1982606 seqüências2.427 bases
Era “Pós-Genoma”
"O PGH aumentou a capacidade de compreensão da complexidade que é a transmissão dos caracteres genéticos” (José Roberto Goldim, UFRGS)
• Genômica Estrutural– Construção de mapas genéticos, físicos e de transcrição de
um organismo.
• Genômica Funcional– Caracterização das propriedades funcionais dos genes e
determinação de Assinaturas Moleculares de Expressão Gênica.
Projetos “-omas”x
Pesquisa Clássica em Genética e Bioquímica
Science 291:1221. 2001
Genômica
Transcritômica
Proteômica
Epigenômica
Metabolômica
…
Genômica Funcional: Análise de Expressão Gênica
Genômica Funcional = Métodos de obtenção de dados em larga escala
+ Métodos de Bioinformática
(Genome-wide expression “profiling”)
Revolução dos projetos “-omas”
Mayo Clin Proc. 2004 May;79(5):651-8
Biologia Sistêmica
• Estudo das interações entre as componentes de um sistema biológico, e como essas interações fazem emergir função e comportamento no sistema;
"Systems Biology is the science of discovering, modeling, understanding and ultimately engineering at the molecular level the dynamic relationships between the biological molecules that define living organisms “
Leroy Hood
Últimos anos
2006
...
Next-Generation Sequencing Revollution
2003
Conclusão do Projeto Genoma Humano
2008
1000 GenomesProject
2005 2007
Sequenciamento do Genoma Diplóide de um único indivíduo (Craig Venter)
The diploid genome sequence of an individual human.(Levy, S. et al. 2007)
Legião de SequenciadoresABI 3730 no JCVI
Genoma James D. WatsonSequenciamento com 454
NEW GENERATION SEQUENCINGAND APPLICATIONS
Introdução
Nova Geração de Sequenciadores de DNA
Roche/454 FLX Illumina/Solexa GA ABI SOLiDABI 3730xl
ABI 3730xl Roche/454 FLX Illumina/Solexa GA ABI SOLiD
Método Sanger Pirosequenciamento Sequenciamento por Síntese
Sequenciamento por Ligação
• Aumento na quantidade de Dados • IlluminaHiSeq 2000 (~1 Tb/run - >600Gb Q30 – Tamanho 100bp)
• Redução no tempo relativo para obtenção dos dados ( genoma 3Gb (8x) em questão de poucos dias);• Aumento gradual do tamanho das sequências (curtas ~36pb – 400pb);• Redução do custo por base sequenciada;
PLATÔTECNOLOGIA
Resumo das plataformas
• http://www.illumina.com/• http://www.my454.com/• http://www.appliedbiosystems.com.br/
Trade-offs in Next Generation Sequencing technologies
NHGRI Current Topics in Genome Analysis 2010Elliott Margulies, Ph.D
Revisão: Métodos de sequenciamento de nova geração
James Watson’s Genome
Genoma Neandertal
99,7% identidade humano modernoDe 1% a 4% do genoma humano (2% de seus genes) provêm do homem de Neandertal
Detecção de Variantes Genômicas• Detecção de Variações (Padrão normal de variações)
– Single Nucleotide Variants (SNVs)– Small Insertions/Deletions – Structural variants (Large Insertions/Deletions/Inversions)– Copy-Number Variants (CNVs)
Catálogo de Mutações Somáticas• Sequenciamento de diferentes tipos de câncer
– Cancer Driver mutations – mutações responsáveis pelo desenvolvimento do câncer (Cancer Genes);
COSMIC
• Catálogo de Mutações Somáticas em Câncer, resultado também de sequenciamentos completos de diversos cânceres;
Novas promessas
• HeliScope– Helicos BioSciences
• ION Torrent– Applied Biosystems
• PacBio RS– Pacific Biosciences
2008
2010
2010
$1000 genome• Re-sequenciamento genoma humano completo (3000 Mb)
– 454 sequencing (average read length=300-400 bases): 10-fold coverage– Illumina and SOLiD sequencing (average read length=50-100 bases): 30-fold coverage
• Valores nos últimos anos– Julho 2010 (~U$31.125,00)– Julho 2011 (~U$10.500,00)
National Human Genome Research Institute (NHGRI)
Produtividade
[Stratton MR, et al. 2009]
Gordon Moore´s Genome
Sequence Read Archive
“(…) In mid-September 2010, the
SRA contained >500 billion reads consisting of 60 trillion base pairs available for download (…) Almost 80% of the sequencing data are derived from the Illumina GA platform. The SOLiD™ and Roche/454 platforms account for 15% and 5% of submitted base pairs, respectively.(…)”
[Leinonen R et. al., 2011]
“We’re currently at 8.5 Terabases (Tb) of biological sequence under management. We’re growing by about 1 Tb/month.”
NCBI’s staff scientist Martin Shumway in 2007
I nternationalN ucleotideS equenceD atabaseC ollaboration
• SRA (NCBI Sequence Read Archive): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra• ENA (EBI European Nucleotide Archive): http://www.ebi.ac.uk/ena/• DRA (DDBJ Sequence Read Archive): http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/index_e.shtml
1000 Genomes• Consórcio Internacional (2008)
– Catálogo completo e detalhado de Variantes Genômicas Humanas (SNPs e variações estruturais)
• Projeto Genoma Humano• HapMap
– Catálogo das variações genéticas mais comuns (SNPs c/ freq. > 5%) em diferentes populações humanas;
• 2500 genomas de 25 populações– Mínimo de cobertura:
• 3x - Genoma completo;• 20x – exome capture;
• Suporte financeiro– Wellcome Trust Sanger Institute (Inglaterra);– Beijing Genomics Institute (China);– National Human Genome Research Institute (EUA);
Publicação Fase piloto
UK10K Genomes
• Objetivo: identificação de variantes raras (freq. alélica abaixo de 0.1%)
• Associação com fenótipos extremos em condições específicas (ex.: doenças relacionadas ao desenvolvimento neurológico e obesidade)
• Sequenciamento– 4000 genomas (6x)– 6000 exomas
…e outros
• i5K – 5000 genomas de insetos
• importância especialmente para a agricultura;
• Genome10K – 10000 genomas de vertebrados
• diversidade genética entre vertebrados;
• 1001 Genomes– 1001 cepas de Arabdopsis thaliana
• planta modelo, base de estudos;
• 1KP– 1000 genomas de plantas
• desenvolvimentos de produtos biotecnológicos;
Genome-Wide Association Studies
• Estudos que procuram identificar a associação entre genótipos e fenótipos (e.g. doenças, resposta a medicamentos, etc.);• Identificar a fatores genéticos de risco para o
desenvolvimento ou progressão de determinadas doenças;• Catálogo de associações
• dbGaP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gap)
“Counting Experiments”
Análise RNA-SeqRNA-Seq“Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”High-Throughput sequencing of cDNA
RNA-Seq – Quantificação da expresão dos genes no transcriptoma de camundongos
Myf6 - m
yogenic factor 6
Expressão específica em células m
usculares
Análise ChIP-SeqChIP-SeqChIP – Chromatin ImunoPreciptationHigh-Throughput sequencing
ChIP-Seq – Estudo da estrutura da cromatinaPadrão de metilação de histonas no genoma humano
Uma das primeiras publicações utilizando Illumina 1G Genome Analyzer
Reproducibilidade r = 0.906 (p-value < 2.2e-16).
ChIP
-Seq
X G
MAT
(Gen
ome-
wid
e M
appi
ng T
echn
ique
)
Análise Methyl-SeqMethyl-SeqDNA treatment with methyl-sensitive restriction enzymes (HpaII - não metilada, MspI - indiferente)High-Throughput sequencing
Methyl-Seq – Estudo de padrões de metilação do DNA em hESCs, células derivadas de hESCs e fígado fetal humano
methylation status: presence or absence of HpaII tags: average tag count > 1 unmethylated
AUC = 0.94Methyl-Seq x Illumina Infinium
Análise microRNA-SeqmicroRNA-Seqsmall RNA library (mirVana miRNA Isolation Kit) High-Throughput sequencing
microRNA-Seq – Caracterização dos miRNAs expressos em tecido gástrico humano (cardia - estômago)
Plataforma SOLiD
qRT-PCR2 -∆Ct
Pearson correlation (SOLiDxqRTPCR)r2 = 83.9 (p-value < 0.05)
Resumo de AplicaçõesCategory Examples of applications
Complete genome resequencing Comprehensive polymorphism and mutation discovery in individual human genomes
Reduced representation sequencing Large-scale polymorphism discovery
Targeted genomic resequencing Targeted polymorphism and mutation discovery
Paired end sequencing Discovery of inherited and acquired structural variation
Metagenomic sequencing Discovery of infectious and commensal flora
Transcriptome sequencingQuantification of gene expression and alternative splicing; transcript annotation; discovery of transcribed SNPs or somatic mutations
Small RNA sequencing microRNA profiling
Sequencing of bisulfite-treated DNA Determining patterns of cytosine methylation in genomic DNA
Chromatin immunoprecipitation– sequencing (ChIP-Seq) Genome-wide mapping of protein-DNA interactions
Nuclease fragmentation and sequencing Nucleosome positioning
Molecular barcoding Multiplex sequencing of samples from multiple individuals
[Shendure, J & Ji, H, 2008]
EXEMPLO DE ABORDAGEMIntrodução
Breast Cancer Sequencing Project
• Objetivo: Catálogo completo de mutações somáticas na linhagem celular de tumor de mama (HCC1954) utilizando como base de comparação uma linhagem celular linfoblastóide obtidas de um mesmo paciente (HCC1954BL).
http://lgmb.fmrp.usp.br/bcsp/
Sequenciamento• gDNA
– Whole Genome Sequencing• Shotgun and paired-end sequencing
– Exome Capture• cDNA
– Whole Transcriptome Sequencing• Shotgun and paired-end sequencing
~ 350GB dados
Publicações
• Zhao Q et al., 2009. Transcriptome-guided characterization of genomic rearrangements in a breast cancer cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Feb 10;106(6):1886-91. Epub 2009 Jan 30. PubMed PMID: 19181860;
• Zhao Q et al., 2010. Systematic detection of putative tumor suppressor genes through the combined use of exome and transcriptome sequencing. Genome Biol. 2010;11(11):R114. Epub 2010 Nov 25. PubMed PMID: 21108794;
• Galante PA et al., 2011. Distinct patterns of somatic alterations in a lymphoblastoid and a tumor genome derived from the same individual. Nucleic Acids Res. 2011 Aug;39(14):6056-68. Epub 2011 Apr 14. PubMed PMID: 21493686;
HCC1954Representative SKY Karyotypepseudotetraploid cell line
Linhagem celular derivada de carcinoma ductal de mama (estágio IIA, grau 3 invasivo, sem metástase nos linfonodos)extraído de uma paciente (Mulher, 61 anos, indiana)
[Gazdar AF , et al., 1998]
http://www.path.cam.ac.uk/~pawefish/BreastCellLineDescriptions/HCC1954.html
HCC1954BL
• HCC1954BL is an Epstein-Barr virus (EBV)-transformed lymphoblastoid cell line derived from the same patient. – Both cell lines received similar treatments in terms
of the timing of establishment and in vitro propagation (36 passages);
Objetivo
• Catalogar as mutações somáticas encontradas nas linhagens HCC1954 e HCC1954BL em busca de padrões que possam caracterizar as alterações genéticas que ocorrem em um determinado tumor e que direcionam a tumorigênese (driver mutations) em relação às mutações passageiras (passenger mutations);– Motivação: Primeiro trabalho a caracterizar as mutações
somáticas presentes na linhagem não tumoral e tumoral de um mesmo paciente (outros estudos focados apenas nas mutações somáticas do tumor);
Dados• gDNA paired-end sequencing
– Illumina GAII• gDNA exome capture (Nimblegen Sequence Capture 2.1M Human Exome
array)– Roche 454 GS FLX
HCC1954 HCC1954BL
Capture sequencing Paired-end sequencing Capture sequencing Paired-end
sequencingTotal number of reads
5,996,389 381,274,888 6,265,250 347,891,568
Dados de Referências
• Genoma referência– NCBI build 36.1/hg18;
• Regiões com haplótipos alternativos e o loci de imunoglobulinas foram excluídos;
– UCSC Genome Browser • dbSNP version 130;• RefSeq (mRNAs e ncRNAs);
Alinhamento
• gDNA paired-end sequencing– Illumina GAII (Bowtie [Langmead B et al., 2009])
• gDNA exome capture– Roche 454 GS FLX Titanium (BLAT [Kent WJ, 2002])
HCC1954 HCC1954BL
Capture sequencing Paired-end sequencing Capture sequencing Paired-end
sequencingTotal number of reads
5,996,389 381,274,888 6,265,250 347,891,568
Mapped reads 5,212,428 254,326,859 5,106,763 237,886,727Percentage of mapped reads
86.9 66.7 81.5 68.4
Total number of nucleotides
3,143,589,263 19,392,752,128 3,252,428,887 15,693,171,704
Mapped nucleotides
2,257,027,363 13,432,965,012 2,175,120,803 11,166,288,816
Percentage of mapped nucleotides
71.8 69.3 66.7 71.1
Pré-processamento
• Leituras duplicadas mapeadas em coordenadas idênticas foram fundidas;
• Leituras com mapeamento ambíguo foram desconsideradas;
Estratégia para Detecção de Mutações
A zigosidade e as regiões com perda deheterozigozidade (LOH)foram estimadas por HMMusando dados públicos de microarranjos de SNPs(Affymetrix SNP array)e confirmadas com osdados de Exoma
Análise de SNVs
• Independentemente para cada linhagem em relação ao genoma referência;– 3 leituras com qualidade >= 20 suportando a variação;– Análise de mutações somáticas
• Profundidade na cobertura de ao menos 5 leituras em ambas as linhagens;
• Leituras suportando a variação devem constituir ao menos 20% do número total de leituras;
• Variações comuns ao dbSNP foram desconsideradas para a;• Variações comuns às duas linhagens foram excluídas;• Falsas chamadas de mutação residindo em regiões onde há
perda de heterozigose (LOH);
SNVsHCC1954 HCC1954BLN (%) in dbSNP N (%) in dbSNP
Substitutions 82355 (92.68) 83474 (93.60) Coding 11717 (90.92) 12373 (93.84) Intronic 60314 (92.53) 61428 (93.77) UTR 3419 (92.57) 3570 (94.04) ncRNA 256 (96.87) 260 (96.92) Intergenic 6649 (91.84) 5843 (90.86)Indels 689 (52.10) 587 (52.81) Coding 38 (50.00) 31 (51.61) Intronic 595 (52.43) 506 (54.15) UTR 30 (46.66) 26 (42.30) ncRNA 1 (100.00) 1 (0.00) Intergenic 25 (52.00) 23 (39.13)
Single nucleotide variations identified in the HCC1954 and HCC1954BL genomes
three reads with base quality ≥20
Maioria delas comuns a ambas as linhagens
92% descritasno dbSNP
8% novos SNVs[Bentley, DR et al., 2008][Wheeler, DA et al., 2008]
Comparação com SNP Array
• Affymetrix Mapping 250K Sty2 SNP Array– GEO: GSE12019 and GSE13373
• Correspondência com as regiões de detecção (sequenciada ao menos 1 vez)
– 93.7% HCC1954 – 97.8% HCC1954BL
• Detecções corretamente identificadas– 80.8% HCC1954– 83.3% HCC1954BL
» Diferença de performance entre as linhagens não significante (p-value=0.69, χ2=0.16, df=1)
Análise de Variações Estruturais
• Dados desconsiderados– Leituras que mapearam em regiões altamente repetitivas
(1Mb);– Leituras onde os pares maperam dentro da distância
esperada porém, uma das leituras em orientação incorreta;• Requisitos
– 5 pares de leituras suportando a variação em HCC1954 e nenhuma em HCC1954BL;
• Rearranjos intercromossomos: leituras em pares mapeadas unicamente em cromossomos distintos;
• Rearranjos intracromossomos:– Deleções: distância maior do que a esperada (average+4*SD);– Duplicação in tandem: orientação e distância não esperada;
Sequenciamento em pares
• Sequenciamento em pares– mate-pair– paired-ends
(Kor
bel e
t al.
, 200
7)
>SOLEXA01:1:1:27:1992#0/1 >SOLEXA01:1:1:27:1992#0/2
Referência:~ 128 bp a ~428 bp
paired-ends
36 bp 36 bp
Referência:
36 bp 36 bp
Mutações somáticasSomatic variations HCC1954 HCC1954BL
N (%) N (%)Point mutations 274 (100) 173 (100) Coding 64 (23.36) 30 (17.3) Nonsense 2 (0.73) 3 (1.7) Missense 45 (16.42) 15 (8.7) Synonymous 17 (6.20) 12 (6.9) Non-coding 14 (5.11) 15 (8.7) UTR 13 (4.74) 13 (7.5) ncRNA 1 (0.36) 2 (1.2) miRNA 0 (0) 0 (0) Intronic 179 (65.33) 114 (65.9) Splice site 0 (0) 0 (0) Other intronic 179 (65.33) 114 (65.9) Intergenic 17 (6.20) 14 (8.1)Structural variations 94 (100) 4 (100) Interchromosomal 49 (52.1) 0 (0) Intrachromosomal 45 (47.9) 4 (100) Deletions 30 (31.9) 2 (50.0) Inversions 11 (11.7) 2 (50.0) Duplications 4 (4.3) 0 (0)
Somatic point mutations and structural variations in the HCC1954 and HCC1954BL genomes
HCC1954 dNs/dS = 2.8HCC1954BL dNs/dS = 1.5
Diferença significativaentre as taxas(p=0.031; χ2=4.68; df=1)
38 regiões gênicas22 já descritas[Stephens, PJ et al., 2009][Zhao, Q et al., 2009]
Mutações pontuais e variações estruturais
Circos plot representing somatic point mutations and structural variations in the (A) HCC1954 and (B) HCC1954BL genomes.
mutações somáticas pontuais: pontos (preto: NS; vermelho S);cobertura do genoma: região em verde;rearranjos cromossômicos: linhas conectando dois cromossomos;deleções: linhas azuis;inversões: linhas pretas;duplicações: linhas cinzas;
Frequência de substituições
• Espectro similar de substituições
Predominância de transições
Validação
• Mutações pontuais– PCR e Sequenciamento com o método de Sanger (ABI3130)
• HCC1954 (47 mutações Ns)– 33 (70.2%) já descritas na literatura;– 12/14 (85.7% ) foram validadas (Sanger);
– 45 mutações Ns válidas» 42 (93.3%) em resíduos de aminoácidos conservados evolutivamente
(10 espécies distintas);
• HCC1954BL (18 mutações Ns)– 12 (66.6%) foram validadas (Sanger);
– 12 mutações Ns válidas» 11 (91.6%) em resíduos de aminoácidos conservados evolutivamente
(10 espécies distintas);
Análise de Vias Biológicas
KEGG ID KEGG annotation Number of genes in the pathway Gene Name P-value
HCC1954 hsa05222 Small cell lung cancer 3 ITGA6 TP53 TRAF2 0.0003
hsa05410 Hypertrophic cardiomyopathy 2 ITGA6 MYH7 0.0167
hsa04210 Apoptosis 2 TP53 TRAF2 0.0169 hsa05414 Dilated cardiomyopathy 2 ITGA6 MYH7 0.0191 hsa04010 MAPK signaling pathway 3 ARRB1 TP53 TRAF2 0.0237
hsa00770 Pantothenate and CoA biosynthesis 1 DPYD 0.0325
hsa04360 Axon guidance 2 CFL2 SEMA3A 0.0335 hsa04614 Renin-angiotensin system 1 LNPEP 0.0372 hsa05200 Pathways in cancer 3 ITGA6 TP53 TRAF2 0.0375HCC1954BL
hsa03440 Homologous recombination 1 EME1 0.0234
hsa00310 Lysine degradation 1 SETD2 0.0382 hsa04740 Olfactory transduction 2 OR51E2 OR2D2 0.0421
Vias metabólicas/regulatórias relacionadas com a tumorigênese
Simulação de Monte Carlo (1000 conjuntos aleatórios 45 e 12 genes)Todos os genes conhecidos e 200 vias metabólicas/regulatórias do KEGG
Interações entre Proteínas
• PPI DBs– MINT, BIOGRID, INTACT, HPRD, BIND, DIP
• HCC1954
–25/45 (55.5%)
• HCC1954BL
–8/12 (66.7%)
• Não há diferença significativa em termos de representação– (p=0.729; χ2=0.12; df=1)
Análise de Interações entre Proteínas
proteínas com mutações NS validadasproteínas com interação com 3 proteínas mutadasporteínas com interação com 2 proteínas mutadas
Protein–protein interactions networks for mutated genes in
HCC1954 (A) and HCC1954BL (B).
Alto grau de interações em HCC1954 (33.2)(P=0.0017, Monte Carlo simulation)Baixo grau de interações em HCC1954BL (5.1)(P=0.875, Monte Carlo Simulation)
Tumorigenesis pathways:apoptosis (TP53, TRAF2, SLC25A5)MAPK signaling (TP53, ARRB1, TRAF2)cell adhesion (ITGA6)cytoskeleton organization (PCNT, CLIP1) cell cycle (RFC4, PCNT)
Key Cancer Genes: BRCA1, CDC42, CHECK1, MDM2, MAP3K1/3 SMAD2/3
Atuação Sinergística na Tumorigênese
• Proteínas mutadas com parceiros de interações em comum => atuação sinergística no desenvolvimento do tumor [Bredel M. et al., 2009];
• HCC1954– (17/25 – 68%) ao menos 1 parceiro em comum (64 parceiros)
• Diferente do esperado ser ao acaso (p < 0.0001, Monte Carlo simulation)
• HCC1954BL– (0/5 – 0%) nenhum
• Diferença do esperado ser ao acaso pouco significativa (p = 0.855, Monte Carlo simulation)
• Diferença na média de parceiros de interações em comum?– 1000 conjuntos aleatórios (5) em ambas as linhagens x PPI
• (3.3 versus 0) (P=0.0245, Monte Carlo simulation)
Redes funcionais em outros tipos de tumor
References Tumor type
Number of genes with non-synonymous mutations
Number of mutated genes with PPI information (%)
Average number of interactions for mutated genes (P-value)
Number of mutated genes with common partner (%) (P-value)
Number of common partners (P-value)
Pleasance et al. Lung 90 50 (56) 11.6 (0.2692) 33 (66) (0.0001)
42 (0.0870)
Pleasanceet al. Melanoma 188 100 (53) 8.3 (0.8344) 69 (69) (0.0001)
103 (0.3130)
Ding et al. Breast basal
29 17 (59) 8.1 (0.2210) 7 (41) (0.0001)
7 (0.0132)
Shah et al. Breast lobular
32 16 (50) 32.5 (0.0034) 7 (44) (0.0001)
28 (0.0011)
Clark et al. GBM 110 40 (36) 12.9 (0.7269) 18 (45) (0.0001)
13 (0.1896)
Galante et al. Breast HCC1954
45 25 (56) 33.2 (0.0017) 17 (68) (0.0001)
64 (0.0001)
Discussão (1)• Caracterização das mutações somáticas
– linhagens celulares (mesmo indivíduo)• tumor e de células linfoblastóides
• Padrões complexos de rearranjos cromossômicos no genoma do tumor afetando regiões gênicas;
– [Michor F et al., 2005]• O mesmo espectro de mutações encontrado nas duas linhagens;
– Ding L et al., 2010 – tumor de mama metastático fenótipo basal– Shah SP et al., 2009 – tumor lobular de mama
• Ação de agentes mutagênicos endógenos e erros na replicação– Número de mutações identificadas em ambos os genomas é compatível com a taxa de mutação
espontânea para células humanas normais [Albertini RJ et al., 1990] suportando a hipótese de que não há neste caso um fenótipo “causador de mutação” em HCC1954;
• (274/173=1.58) – devido a um maior conteúdo de DNA na linhagem tumoral;
– Evidências de tumores sem evidência de agentes mutagênicos externos;• Existência de mutações resultates da cultura in vitro e transformação EBV (HCC1954BL);
– 36 passagens;– Critérios estringentes;– Estudos com evidências de que mutações pontuais clonais são raras [Jones S et al., 2008]
• Caracterização das mutações somáticas– linhagens celulares (mesmo indivíduo)
• tumor e de células linfoblastóides
• Padrões complexos de rearranjos cromossômicos no genoma do tumor afetando regiões gênicas;
– [Michor F et al., 2005]• O mesmo espectro de mutações encontrado nas duas linhagens;
– Ding L et al., 2010 – tumor de mama metastático fenótipo basal– Shah SP et al., 2009 – tumor lobular de mama
• Ação de agentes mutagênicos endógenos e erros na replicação– Número de mutações identificadas em ambos os genomas é compatível com a taxa de mutação
espontânea para células humanas normais [Albertini RJ et al., 1990] suportando a hipótese de que não há neste caso um fenótipo “causador de mutação” em HCC1954;
• (274/173=1.58) – devido a um maior conteúdo de DNA na linhagem tumoral;
– Evidências de tumores sem evidência de agentes mutagênicos externos;• Existência de mutações resultates da cultura in vitro e transformação EBV (HCC1954BL);
– 36 passagens;– Critérios estringentes;– Estudos com evidências de que mutações pontuais clonais são raras [Jones S et al., 2008]
• Caracterização das mutações somáticas– linhagens celulares (mesmo indivíduo)
• tumor e de células linfoblastóides
• Padrões complexos de rearranjos cromossômicos no genoma do tumor afetando regiões gênicas;
– [Michor F et al., 2005]• O mesmo espectro de mutações encontrado nas duas linhagens;
– Ding L et al., 2010 – tumor de mama metastático fenótipo basal– Shah SP et al., 2009 – tumor lobular de mama
• Ação de agentes mutagênicos endógenos e erros na replicação– Número de mutações identificadas em ambos os genomas é compatível com a taxa de mutação
espontânea para células humanas normais [Albertini RJ et al., 1990] suportando a hipótese de que não há neste caso um fenótipo “causador de mutação” em HCC1954;
• (274/173=1.58) – devido a um maior conteúdo de DNA na linhagem tumoral;
– Evidências de tumores sem evidência de agentes mutagênicos externos;• Existência de mutações resultates da cultura in vitro e transformação EBV (HCC1954BL);
– 36 passagens;– Critérios estringentes;– Estudos com evidências de que mutações pontuais clonais são raras [Jones S et al., 2008]
• Caracterização das mutações somáticas– linhagens celulares (mesmo indivíduo)
• tumor e de células linfoblastóides
• Padrões complexos de rearranjos cromossômicos no genoma do tumor afetando regiões gênicas;
– [Michor F et al., 2005]• O mesmo espectro de mutações encontrado nas duas linhagens;
– Ding L et al., 2010 – tumor de mama metastático fenótipo basal– Shah SP et al., 2009 – tumor lobular de mama
• Ação de agentes mutagênicos endógenos e erros na replicação– Número de mutações identificadas em ambos os genomas é compatível com a taxa de mutação
espontânea para células humanas normais [Albertini RJ et al., 1990] suportando a hipótese de que não há neste caso um fenótipo “causador de mutação” em HCC1954;
• (274/173=1.58) – devido a um maior conteúdo de DNA na linhagem tumoral;
– Evidências de tumores sem evidência de agentes mutagênicos externos;• Existência de mutações resultates da cultura in vitro e transformação EBV (HCC1954BL);
– 36 passagens;– Critérios estringentes;– Estudos com evidências de que mutações pontuais clonais são raras [Jones S et al., 2008]
• Caracterização das mutações somáticas– linhagens celulares (mesmo indivíduo)
• tumor e de células linfoblastóides
• Padrões complexos de rearranjos cromossômicos no genoma do tumor afetando regiões gênicas;
– [Michor F et al., 2005]• O mesmo espectro de mutações encontrado nas duas linhagens;
– Ding L et al., 2010 – tumor de mama metastático fenótipo basal– Shah SP et al., 2009 – tumor lobular de mama
• Ação de agentes mutagênicos endógenos e erros na replicação– Número de mutações identificadas em ambos os genomas é compatível com a taxa de mutação
espontânea para células humanas normais [Albertini RJ et al., 1990] suportando a hipótese de que não há neste caso um fenótipo “causador de mutação” em HCC1954;
• (274/173=1.58) – devido a um maior conteúdo de DNA na linhagem tumoral;
– Evidências de tumores sem evidência de agentes mutagênicos externos;• Existência de mutações resultates da cultura in vitro e transformação EBV (HCC1954BL);
– 36 passagens;– Critérios estringentes;– Estudos com evidências de que mutações pontuais clonais são raras [Jones S et al., 2008]
Discussão (2)
• Diferenças entre o conjunto de genes mutados em ambas as linhagens:– Mutações não-sinônimas mais frequentes HCC1954;– Mutações no genoma do tumor não estão distribuídas
aleatóriamente;• Afetam preferencialmente genes “HUB” nas interações com outros genes;• Afetam vias biológicas relacionadas com a tumorigênese;• Mutações no genoma do tumor são co-selecionadas;
– Ação sinergística de mutações na tumorigênese;» Observação em outros tumores;
• Observação: • Se a célula tumoral requer somente um número pequeno de
alterações genéticas “fortes” para a tumorigênese;• Não seria esperado uma associação funcional dos genes mutados
no tumor, pois a maioria das mutações seriam passageiras;
Discussão (3)
• Modelo sugerido: o genoma do tumor tem poucas mutações “fortes” e muitas mutações “fracas” que atuam em sinergia para desestabilizar as vias relacionadas à tumorigênese;– Associação funcional marcante entre os genes
mutados no tumor;– Modelo já proposto na literatura (e.g. [Bredel M et
al., 2009])
CONCLUSÃOConclusão
Conclusão
• New-Generation Sequencing (NGS)– Avanços sem precedentes
• Obter informações genômicas em curto tempo a um custo razoável;– Flexibilidade para ser aplicada em uma série de estudos genômicos;
» Genômica de organismos não-modelos;» Regulação gênica em determinadas situações e condições biológicas;» Caracterização da relação evolutiva entre genomas ancestrais (Comparative and
Evolutionary Genomics);» Elucidação dos eventos moleculares que direcionam a tumorigênese (Cancer
Genomics);– Redução da distância em direção a uma medicina personalizada;
– Desafios• Infraestrutura de sistemas de informação tecnológica (TI)
– BIG Data» transferência de dados, armazenamento, controle de qualidade, sistemas
computacionais eficientes (algoritmos e hardware);
