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LA TRASCRIZIONE
• processo nel quale il DNA stampo viene copiato in una molecola di RNA
• La molecola di RNA è identica in sequenza all’elica codificante e complementare a quella stampo.
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La trascrizione è simile alla replicazione ma esistono alcune importanti differenze
1. L’RNA è costituito da ribonucleotidi 2. L’RNA è sintetizzato dalla RNA polimerasi 3. La RNA polimerasi non necessita di un primer
e può iniziare la trascrizione de novo 4. L’RNA prodotto non rimane appaiato allo
stampo di DNA (solo in un breve tratto) 5. Sebbene accurata, la trascrizione è meno
fedele della replicazione 6. La trascrizione copia solo alcune parti del
genoma, ma molte centinaia o migliaia di volte
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Procarioti Eucarioti
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Unità trascrizionale
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Le subunità delle RNA polimerasi
α2bb’ω + s Assemblaggio dell’enzima e
riconoscimento del promotore
Legame nucleotidi
Legame stampo
Specificità del promotore
Oloenzima
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Modello a chela di granchio
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2 ioni Mg, 1 strettamente legato, il secondo introdotto ad ogni ciclo con il NTP
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Attività delle topoisomerasi
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La trascrizione può essere divisa in quattro stadi:
1. Riconoscimento
2. Inizio
3. Allungamento
4. Terminazione
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Elementi cis-agenti
Fattori trans-agenti
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TATAAT TTGACA 5-9 basi 16-19 basi
-10 -35
Sequenza -35 Pribnow box Sito di inizio
della trascrizione
+1
Un tipico promotore di E.coli è costituito da tre componenti: le sequenze consenso -35 e -10, e il sito d’inizio
I promotori procariotici
La “forza” di un promotore descrive la frequenza con cui l’RNA polimerasi inizia la trascrizione, ovvero il numero di trascritti che produce in un determinato tempo.
La “sequenza consenso” è una sequenza ideale che rappresenta le basi che più frequentemente si trovano in una determinata posizione
Coinvolta nel melting o separazione delle eliche del DNA
Coinvolta nel riconoscimento iniziale da parte della RNA polimerasi
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Promotori procariotici
L’elemento UP è presente in alcuni promotori forti (rDNA) e migliora il legame della RNA polimerasi
L’elemento -10 esteso compensa la mancanza dell’elemento -35
Il discriminatore controlla il legame della RNA polimerasi
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CONSENSUS SEQUENCE APPROACH TO THE IDENTIFICATION
OF GENETIC SIGNALS
• I motivi TTGACA and TATAAT sono i segnali che vengono
riconosciuti dalla subunita’ sigma70 della polimerasi.
• La “forza” relativa di un promotore e’ proporzionale alla sua similarita’ ad una specifica sequenza consenso.
• Mutazioni nelle regioni -10 and –35 alterano la “forza” del promotore.
• Esperimenti tipo footprinting confermano la loro attivita’.
• I geni che hanno bisogno di essere espressi più di altri hanno una
sequenza molto più vicina a quella consenso
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Scelta delle condizioni per avere un solo taglio per molecola
Il Footprint (impronta) con DNasi I
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Saggio EMSA (Eletrophoretic Mobility Shift Assay)
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Il fattore sigma
regione 4 motivo elica-giro-elica
siti di legame del fattore sigma al DNA
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Il fattore sigma lega il DNA (interazione di una α-elica con il solco maggiore)
interazione del fattore sigma con il filamento non stampo
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Le regioni 2 e 4 riconoscono gli elementi -10 e -35 del promotore
le quattro regioni della subunità s
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La regione N terminale del fattore sigma
• σ70 cambia la sua struttura liberando le regioni di contatto con il DNA quando si associa al complesso dell’oloenzima
• σ70 lega sia l’elemento –35 che l’elemento –10
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INIZIO DELLA
TRASCRIZIONE
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Inizio della trascrizione (fase abortiva)
passaggio transiente: l’RNA polimerasi va avanti e indietro a bruco: prevede l’esistenza di un elemento flessibile accartocciamento: l’enzima tira dentro di sé il DNA
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Associazione e dissociazione del fattore sigma
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La velocità con cui l’RNA polimerasi si lega ai promotori è troppo grande per essere dovuta alla diffusione casuale (non esiste oloenzima libero)
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Fattori Sigma di E.coli
70,000
32,000
54,000
28,000
TTGACA
CNCTTGAA
CTGGNA
TAAA
rpoD
rpoH
rpoN
flal
Gene Sequenza -35
Sequenza -10
generale
shock termico
carenza azoto
flagellare
TATAAT
CCCCATNT
TTGCA
GCCGATAA
16-18 bp
13-15 bp
6 bp
15 bp
Massa Uso SeparazioneSigma
s
s
s
s
70
H
N
F
Fattori sigma diversi legano promotori diversi
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Ci sono più tipi di fattori sigma ognuno specifico per una classe diversa di promotori. Lo shock da calore aumenta la quantità di fattore sigma 32
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ALLUNGAMENTO
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La bolla di trascrizione
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il pirofosfato è aggiunto di nuovo al nucleotide errato
Meccanismi di “Proofreading” dell’RNA polimerasi
Gre (fattore procariotico) fa invertire la direzione della sintesi
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Riattivazione dell’RNA polimerasi in stallo
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TERMINE DELLA TRASCRIZIONE
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Rho indipendente
Rho dipendente
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La terminazione Rho indipendente richiede due sequenze adiacenti nella regione terminale del DNA trascritto
Termine Rho indipendente
Questi elementi non hanno effetto fino a che non vengono trascritti dalla RNA polimerasi
•Una sequenza ripetuta e inversa di circa 20 nucleotidi (ricca in G:C)
•Una sequenza di circa 8 basi ricca in coppie A:T
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La ripetizione inversa permette la formazione di una struttura a forcina nell’RNA trascritto che rallenta la RNA polimerasi. La sequenza ricca in A:U nell’ibrido RNA-DNA favorisce la dissociazione dell’RNA (minori legami idrogeno e interazione di stacking) e il distacco dell’enzima
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Legame di rho sul sito rut (sequenza presente nella parte terminale del DNA trascritto)
Termine Rho dipendente
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Sito rut ricco in citosine
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Maturazione degli RNA nei procarioti
• Nei tRNA alcuni nucleotidi sono rimossi dalla estremità 5’ in una reazione catalizzata dalla RNasi P
• Le RNase II, RNasi PH e T (le ultime due per gli ultimi due nucleotidi terminali) cooperano per rimuover nucleotidi alla estremità 3’ dei tRNA
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Inibitore Enzima bersaglio Azione dell'inibitore
Rifamicina Streptolidigina Actinomicina D
a -Amanitina
oloenzima proc. nucleo enz. proc. pol I eucariotica pol II eucariotica
lega b e inibisce inizio lega b e inibisce allungamento lega il DNA e inibisce allungamento lega la RNA polimerasi II
Inibitori delle RNA polimerasi