naosite: nagasaki university's academic output...

This document is downloaded at: 2020-02-07T22:19:13Z

Title ツバキ葉のサポニン分析法開発およびエラジタンニン代謝に関する研究

Author(s) 辻田, 高明

Citation Nagasaki University (長崎大学), 博士(薬科学) (2017-03-21)

Issue Date 2017-03-21

URL http://hdl.handle.net/10069/37162

Right

NAOSITE: Nagasaki University's Academic Output SITE

http://naosite.lb.nagasaki-u.ac.jp

博士論文

ツバキ葉のサポニン分析法開発および

エラジタンニン代謝に関する研究

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科

天然薬物学講座天然物化学研究室

辻田高明

2017 年

目次略語一覧緒論 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------1 第1章ツバキ (Camellia japonica)の成分分析 ----------------------------------------------------3 第 1節ツバキ花の成分分析-------------------------------------------------------------------------3

第 1項抽出と単離----------------------------------------------------------------------------------3

第 2項新化合物の構造解析----------------------------------------------------------------------4 第 2節茶ツバキ混合発酵茶の成分分析----------------------------------------------------------7

第 1項抽出と単離----------------------------------------------------------------------------------7

第 2項既知化合物の同定-------------------------------------------------------------------------8

第 3節ツバキ硬葉の成分分析----------------------------------------------------------------------8

第 1項抽出と単離----------------------------------------------------------------------------------8

第 2 項既知化合物の同定-----------------------------------------------------------------------10 第 4 節ツバキ油粕の成分分析--------------------------------------------------------------------10

第 1 項抽出と単離--------------------------------------------------------------------------------10

第 2 項既知化合物の同定-----------------------------------------------------------------------13

小括--------------------------------------------------------------------------------------------------------14

第 2 章ツバキサポニンの定量法--------------------------------------------------------------------15 第 1 節定量法の開発--------------------------------------------------------------------------------15 第 2 節定量法の検証--------------------------------------------------------------------------------17

第 3 節分析結果--------------------------------------------------------------------------------------18

小括--------------------------------------------------------------------------------------------------------19 第 3 章ツバキ葉エラジタンニンの季節変化と酸化反応--------------------------------------20 第 1 節ツバキ葉の成分変化-----------------------------------------------------------------------20

第2節 Pedunculaginの酵素酸化-------------------------------------------------------------------21

第1項 Pedunculaginの酵素酸化と酸化生成物の分離-------------------------------------21 第2項 Pedunculagin酸化生成物の構造解析-------------------------------------------------22 第 3項 Strictininの酵素酸化---------------------------------------------------------------------31 第 4項 Strictinin酸化生成物の構造解析------------------------------------------------------32

第 5 項ツバキ葉ホモジネートによる pedunculagin の酸化------------------------------37

第 6 項高分子フラクションの組成分析-----------------------------------------------------38 第 3 節ツバキ葉中のタンニン酸化生成物の探索--------------------------------------------42

第 1 項抽出と単離--------------------------------------------------------------------------------42 第 2 項新化合物の構造解析と既知化合物の同定-----------------------------------------42 第 4 節ツバキ新葉成分の比較--------------------------------------------------------------------47

第 1 項成分の分離--------------------------------------------------------------------------------47 第 2 項成長に伴い増加する高分子ポリフェノールの分析-----------------------------48 小括--------------------------------------------------------------------------------------------------------51 総括-----------------------------------------------------------------------------------------------------------52 謝辞-----------------------------------------------------------------------------------------------------------54 実験の部-----------------------------------------------------------------------------------------------------55 参考文献-----------------------------------------------------------------------------------------------------65

略語一覧

1H-NMR : Proton nuclear magnetic resonance 1H-1H COSY : Proton-proton homonuclear correlated spectroscopy 13C-NMR : Carbon-13 nuclear magnetic resonance Aq. : Aqueous

CD : Circular dichroism DFT: Density functional theory DMSO : Dimethyl sulfoxide

ECD : Electronic circular dichroism ESI-MS : Electrospray ionization mass spectrometry

EtOAc : Ethyl acetate EtOH : Ethanol FAB-MS : Fast atom bombardment mass spectrometry Fig. : Figure Fr. : Fraction Glc : Glucose HHDP : Hexahydroxydiphenoyl HMBC : Proton-detected heteronuclear multiple bond correlation HPLC : High performance liquid chromatography

HR-ESI-MS: High resolution electrospray ionization mass spectrometry HR-FAB-MS : High resolution fast atom bombardment mass spectrometry HSQC : Heteronuclear single quantum coherence IR : Infrared absorption spectrometry MeOH : Methanol n-BuOH : 1-Butanol ODS: Octa decyl silyl TDDFT: Time-dependent density functional theory TFA : Trifluoroacetic acid TLC : Thin-layer chromatography UV : Ultraviolet

- 1 -

緒論

ツバキ (Camellia japonica, ツバキ科) は、日本の比較的温暖な地方に分布する常緑広

葉樹で観賞植物として広く栽培され、多くの園芸品種も作出されている。ツバキの種子

から採れるツバキ油は、食用油、化粧品、整髪料などとして用いられており、ツバキが

多く自生する長崎の五島列島の製品は古くから高級ツバキ油として日本全国に出荷さ

れ、現在その生産量は伊豆大島と全国 1，2 位を競っている。長崎県は、五島地域の地

域活性化を目的としてツバキを使った観光客誘致と新たな農産加工品の開発を行って

おり、その中で産学官連携プロジェクトによる茶 (Camellia sinensis)とツバキの葉を混

合揉捻して製造する新しい機能性発酵茶を開発して現在販売している。この茶ツバキ混

合発酵茶は長崎県立大学での動物実験によって中性脂肪軽減および血糖値上昇抑制効

果を示すことが明らかにされており 1)、当研究室の研究によりその活性成分が茶カテキ

ン、theaflavin 類、theasinensin A などのポリフェノール類であることが明らかになって

いる 1,2)。そのような背景のもと著者は、ツバキのさらなる有効利用に資するため、ツ

バキの成分について検討を行った。

O

OOH

O

COOH

O

OHOO

OO

HO

HO

HOHO

OOH

HO

ROHO

OHHO

HO

camellioside A: R=Hcamellioside B: R=Ac

O

OR2

OH

OH

OH

OH

HOO

O

OH

HO

OR1

theaflavins (R1, R2= H or G)

OHO

OH

OHOH

OH

OG

OHHO

HOO OH

OHGO

theasinensin A

第 1 章では、花、葉、混合発酵茶、種子を搾油した後の油粕について成分研究を行っ

た。それぞれの成分についてはすでに検討されているが、これまでに報告されている主

要成分とは異なる画分を中心に成分分離を行った。花からは第 2 章で述べるサポニン定

量の標準品の分離を行った。第 2 章では、茶ツバキ混合発酵茶の品質管理の観点から、ツバキ葉サポニンの定量法

について検討した。混合発酵茶には、ツバキ葉に由来する独特のえぐ味がある。これは

ツバキ葉のサポニンである camellioside A とそのアセチル化体 (camellioside B)に起因し、

これらのサポニンには胃粘膜保護作用などの生物活性が報告されている 3-5)。このよう

なことから、ツバキ混合発酵茶の製品化に伴い製品中に含まれるサポニンを定量する必

要が生じた。しかし、サポニン類は微量しか含まれず、紫外吸収も非常に弱いためこれ

まで HPLC では検出することが出来なかった。また、混合発酵茶には HPLC で類似の挙

動をする茶葉由来のサポニンが多種含まれているので 6,7)、ツバキ葉サポニンを検出す

- 2 -

る方法は camellioside 類に特異的である必要がある。さらに、ここでは製品の品質管理

に応用できるよう簡便な方法であることも求められた。本研究ではこれらを満足する

HPLC 定量法開発を目的として研究を行った。第 3 章では、ツバキ葉成分の季節変動について化学的検討を行った。ツバキ混合発酵

茶を開発する過程で、ツバキの葉の成分が 4 月と 7 月で大きく異なることが当研究室で

の分析により明らかになった 8)。特に顕著な違いはエラジタンニンの pedunculagin で観

察され、4 月の柔らかい新葉では主成分として検出されるが、7 月の成長した硬葉では

ほとんど検出されない。ツバキ混合発酵茶に使用されるのは 7 月の硬葉であることから、

混合発酵茶にはpedunculaginに由来する構造不明の代謝物が含まれている可能性がある。

このツバキ葉の成長に伴う pedunculagin の代謝を解明することは、ツバキ混合発酵茶の

成分研究として重要であるだけでなく、植物生理学的にも興味深い。これまでに当研究

室で 7 月の硬葉から pedunculagin の代謝物を検出する検討がされたが成果はあがってい

なかった。そこで著者は、pedunculagin から生成する物質をツバキ葉から分離するので

はなく、純粋な pedunculagin を用いて試験管内で代謝反応機構を再現することにより、

代謝物の構造を明らかにすることとした。ツバキ葉のタンニン類としては主成分の

pedunculagin のほか、副成分として casuariin、camelliatannin A, B などが報告されている

が 9)、いずれも pedunculagin に関連する構造を持っている。したがって、pedunculaginの代謝機構を解明することはこれらのエラジタンニン類の生成機構とも関連する可能

性がある。

OO

O OHOO O

OH

OHOHHOHO

HO

OO

OHHO

HO

HOOH

HO

O

pedunculagin

OHO

OO

O O

OH

OHOHHOHO

HO

OO

OHHO

HO

HOOH

HO

O

casuariin

OHH

OHO

OO

O O

OH

OHOHHOHO

HO

OO

OHHO

HO

HOOH

HO

O

HO

OH

HO OH

OH

OH

camelliatannin A

OHO

OO

O O

OH

OHOHHOHO

HO

OO

OHHO

HO

HOOH

HO

O

HO

OH

OH

OH

HO

OH

camelliatannin B

- 3 -

本論

第 1 章ツバキ (Camellia japonica) の成分分析

ツバキは長崎県に広く自生しており、その新たな用途を検討するためにツバキ花、葉、

混合発酵茶、種子を搾油した後の油粕について成分研究を行った。ツバキ花、葉、油粕

の成分についてはすでに検討されているが、これまでに報告されている主要成分とは異

なる画分を中心に成分分離を行った。

第 1 節ツバキ花の成分分析

ツバキ花には、サポニンが含まれていることが報告されており、その含量は葉よりも

多い 3)。花でも葉と同様に主サポニンは camellioside A であり、そのアセチル化体であ

る camellioside B も含まれている。混合発酵茶のサポニンを定量する際に camellioside Aは標品として必須であることから、まず花から camellioside A の分離精製を行った。そ

の際、新規フラボノイドが分離できたのでその構造決定についても述べる。

第 1 項抽出と単離

ツバキの新鮮花部 1 kg を 1% TFA 含有 MeOH で抽出し、Diaion HP20SS (MeOH –H2O)

により 5 つの画分に分画した。次にサポニンを含む Fr. 5 (5.86 g) を Chromatorex ODS (H2O–MeOH) により 21 のフラクションに分画した。そのうち Fr. 5-15 (117 mg) を silica gel カラムクロマトグラフィー (CHCl3–MeOH–H2O) により分離したところ新化合物 2 (21 mg) が得られた。また、Fr. 5-18 (1.78 g) を silica gel カラムクロマト(hexane–acetone) で分離し、MeOH から再結晶することで化合物 1 (52 mg) を得た。化合物 1 は 1H-およ

び 13C-NMR データを文献値と比較して camellioside A (1)3)と同定した。

Fig. 1-1 Structure of 1

O

OOH

O

COOH

O

OHOO

OO

HO

HO

HOHO

OOH

HO

HOHO

OHHO

HO

camellioside A (1)

- 4 -

Fresh flower of Camell ia japonica (1 kg)

Extracted with MeOH (2 L)

extract

Diaion HP20SS (7×30)MeOH-H2O (0:100-100:0, v/v)

Fr. 5saponin(5.86 g)

Chromatorex ODS (3×30)MeOH-H2O (0:100–100:0, v/v)

Fr. 5-1 – Fr.5-14 Fr. 5-15(117 mg)

Fr. 5-16 Fr. 5-17 Fr. 5-18(1.78 g)

Fr. 5-19 – Fr. 5-21

silica gel (2×15)CHCl3:MeOH:H2O(85:15:1.5–80:20:2)

2(21 mg)

silica gel (2×25)hexane–acetone(90:10–70:30)

crystallized f rom MeOH

1(52 mg)

Fr. 1sugar

Fr. 2tannin

(8.01 g)

Fr. 4anthocyanin

(0.56 g)

Fr. 3f lavonoid(3.19 g)

Chart 1-1 Extraction and separation of constituents of C. japonica flower

第 2 項新化合物の構造解析

化合物 2 は、[α]D24 −118.9 (MeOH) の黄

色無結晶粉末として得られ、FAB-MS にお

いて m/z 625 に [M+H]+ピークを示した。こ

のことから分子量は 624 と推定された。ま

た、HR-FAB-MS で [M+H]+ピークが m/z 625.1583 に観察されたことから、2 の分子

式は C31H28O14 と決定した。この化合物は

IR スペクトルにおいて 3700～2500 cm-1に

広い吸収帯と 1700 cm-1 に強い吸収があり、

このことから水酸基とカルボニル基があ

ることが推測された。また、1H-NMR スペ

クトル (Table 1) は、δ 8.06 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2′, 6′), 7.42 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2′′, 6′′), 6.90 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3′, 5′), および 6.79 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3′′, 5′′) に 2 組の p-置換ベンゼ

ン環、δ 7.63 (1H, d, J=16.1 Hz, H-7′′) と 6.34 (1H, d, J=16.1 Hz, H-8′′)に trans 二重結合の水


OCH3HO O

OH

OO

OHHO

HO

O

OH

O

OOH

2

2

344a

8

6

8a 1'

2'4'

1''

2'' 4''glc-1

glc-6

A

B

C

- 5 -

素、δ 3.82 (3H, s) にメトキシ基、

さらに、δ 3.35 (1H, m, glc-H-5), 3.41 (1H, m, glc-H-4), 3.58 (1H, dd, J=12.1, 5.9 Hz, glc-H-6b), 3.64 (1H, m, glc-H-3), 3.79 (1H, d, J=12.1, 2.1 Hz, glc-H-6a), 5.03 (1H, dd, J=8.8, 8.3 Hz, glc-H-2),

および、5.72 (1H, d, J=8.3 Hz, glc-H-1) に糖のシグナルを示

した。この糖は J1, 2が約 8 Hz、J2, 3、J3, 4、および J4, 5がいずれ

も約 9 Hz でカップリングして

いるため、水素が全てアキシア

ル配置である β-glucose である

と推測された。13C-NMR スペ

クトル (Table 1) では、3 つの

ベンゼン環のシグナルに加え

て、δ 178.9 に二重結合とベン

ゼン環に挟まれたカルボニル

基 (C-4)、 δ 157.5, 134.4 に酸

素が結合した二重結合の炭素 (C-2, 3)、 δ 167.9 にエステル炭

素 (C-9′′)、δ 146.5, 114.7 にカル

ボニルと共役した sp2メチン炭

素 (C-7′′, 8′′)、1 つの糖、およ

びメトキシ基 (δ 61.4) のシグ

ナルが認められた。このことか

ら、この化合物はフラボノール

配糖体のエステルと考えられた。3 つのベ

ンゼン環のうち2つは 1H-NMRスペクトル

のシグナルを合わせて考えると p –ヒドロ

キシベンゼンであると考えられ、残り 1 つ

はケミカルシフト (Table 1: C4a, C5, C6, C7, C8, C8a) からフロログルシノール環と考え

られた。したがって、このフラボノールは

kaempferol であると推定した。次に、HMBC スペクトルを解析したとFig. 1-3 Important HMBC correlations for 2

OCH3HO O

OH

OO

OHHO

HO

O

OH

O

OOH

H

9'' 1''

8''4''

7''

2''

Position 1H2 - 157.53 - 134.44 - 178.94a - 105.35 - 157.86 6.20 (s) 99.57 - 157.78 - 128.58a - 149.81' - 122.42' 8.06 (d ,8.8) 131.73' 6.90 (d, 8.8) 116.34' - 161.15' 6.90 (d, 8.8) 116.36' 8.06 (d, 8.8) 131.7

Glc-1 5.72 (d, 8.3) 100.02 5.03 (dd, 8.8, 8.3) 75.33 3.64 (dd, 9.6, 8.9) 75.84 3.41 (dd, 9.8, 8.9) 71.15 3.35 (m) 78.36a 3.79 (dd, 12.1, 2.1) 62.06b 3.58 (dd, 12.1, 5.9) 62.01'' - 126.82'' 7.42 (d, 8.8) 130.83'' 6.79 (d, 8.8) 115.84'' - 160.85'' 6.79 (d, 8.8) 115.86'' 7.42 (d, 8.8) 130.87'' 7.63 (d, 16.1) 146.58'' 6.34 (d, 16.1) 114.79'' - 167.9

OCH3 3.82 (s) 61.4Measured in acetone-d 6

13C

Table 1 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) datafor 2 (δ in ppm, J in Hz).

- 6 -

ころ、C-4′′は H-2′′, H-3′′, H-5′′, H-6′′と相関があり、これらが同じベンゼン環に存在して

いることが示された。また、trans 二重結合上の水素 H-8′′は C-1′′, C-9′′と相関があり、

カルボニル基と共役した trans 二重結合が p-ヒドロキシベンゼンに結合していることが

示された。また C-9′′は glc-H-2 とも相関を示しており、C-9′′エステルカルボニル基は

glucose の 2 位と結合していることが推定された。これらの相関から、2 には

2-O-p-coumaroyl-β-glucose の部分構造があることが示された。一方、グルコースの H-1 (δH 5.72, d, J=8.3 Hz) は C-3 (δC 134.4) と相関を示しており、glucose が kaempferol の 3 位に

配糖体結合していることも分かった。次にメトキシ基の結合位置については、kaempferol の A 環の水素シグナルがシングレ

ット (δ 6.26) として観察されることから、A 環の 6 位または 8 位と考えられた。C-6 と

C-8 は 13C-NMR スペクトルにおいて δ 99.5, δ 128.5 にシグナルを示している。類似の構

造を持つ化合物の論文において、C-6 にメトキシ基が結合する場合は、C-6 (132.5), C-8 (92.2) 10); C-6 (129.3), C-8 (100.1) 11); C-6 (130.7), C-8 (93.7) 12)であるのに対して、C-8 にメ

トキシ基が結合する場合は、C-6 (99.8), C-8 (131.6) 10); C-6 (98.9), C-8 (127.4) 13); C-6 (99.0), C-8 (127.7) 14)であった。すなわち、メトキシ基が結合していないメチン炭素が C-6 の場

合 δC 99 付近にシグナルが観察されることから、2 は C-8 位にメトキシ基が結合してい

ると推定された。しかし、文献 11 は C-6 位にメトキシ基、C-8 位にメチン基の化合物

で、C-8 メチン炭素が δC 100 と報告されている。そこで、メトキシ基の結合位置を確認

するために加水分解して、アグリコン 2a を得た。化合物 2 のアグリコン 2a は 1H-NMR スペクトル

(DMSO-d6) で、δ 3.80 (3H, s), δ 6.26 (1H, s), δ 6.95 (2H, d), δ 8.06 (2H, d) にシグナルを示した。一方、文献記載の1H-NMR スペクトル (DMSO-d6) では、 6-methoxykaempferol は δ 3.77 (3H, s), δ 6.56 (1H, s), δ 6.94 (2H, d), δ 8.05 (2H, d) にシグナルを示し 14)、8-methoxykaempferolは δ 3.82 (3H, s), δ 6.28 (1H, s), δ 6.94 (2H, d), δ 8.05 (2H, d) にシグナルを示した 8)。これらの値を 2a のものと比較し

て 2 のアグリコンは 8-methoxykaempferol であると結論した。

Glucose の絶対配置については、HPLC により決定した 15)。まず、2 を加水分解して

生成した glucose と L-cysteine methylester を pyridine 中で反応させ、次に UV 吸収を持つ

4-dimethylamino-1-naphthyl isothiocyanate を結合させた。生成物の HPLC での保持時間を

D-および L-glucose から同様に合成した 2 つのジアステレオマーと比較した結果、化合

物 2 の glucose は D 体であることが判明した。以上より、2 は 8-methoxykaempferol (2′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside であると決

定した。8-methoxykaempferol をアグリコンとする配糖体の p-クマル酸エステルは天然

に稀であり、ツバキの特徴的成分として位置づけられる。

Fig. 1-4 Structure of 2a

OCH3HO O

OH

OOH

OH

2a

- 7 -

第 2 節茶ツバキ混合発酵茶の成分分析

ツバキ葉にはアルドース還元酵素阻害活性を持つエラグ酸誘導体硫酸エステルが含

まれている 16)。その物質がツバキ混合発酵茶（茶葉：ツバキ葉=9：1）にも含まれてい

るか確認するために成分分離を行った。

第 1 項抽出と分離

ツバキ混合発酵茶（茶葉：ツバキ葉＝9：1）を 90 °C の精製水 (6 L) で 4 分間抽出し

て得たエキスを Sephadex LH-20 カラムで分画し水で溶出する糖を主成分とする Fr. 1 を

得た。Fr. 1はDiaion HP-20カラムで糖を除き、芳香族化合物を多く含むFr. 1-2 (9.54 g) をChromatorex ODS によりさらに分離して 11 のフラクションを得た (Chart 1-2)。

Chart 1-2 Extraction and separation of constituents of fermented mixed tea

Fermented mixed tea made from green tea and Camellia japonica leaves (200 g)


Fr. 1-2-7(1.4 g)

6 fractions 4 fractions

silica gel (2×15)CHCl3-MeOH-H2O (9:1:0.1, 8.5:1.5:0.15, 8:2:0.2, 7:3:0.5, 6:4:1, 5:5:1, v/v)

Fr.1-2-7-1 3(6 mg) 4 fractions fr. 1-2-7-7

(367 mg)3 fractions

silica gel (2×15)CHCl3-MeOH-H2O (9:1:0.1, 8:2:0.2, 7:3:0.5, v/v)

Fr. 1-2-7-7-1 Fr. 1-2-7-7-2(250 mg)

Fr. 1-2-7-7-3


4(6 mg)

extracted with 90 °C waterfilteredSephadex LH-20 (5×30)MeOH-H2O (0:100–100:0, v/v), 60% aq. acetone

Fr. 1 2 fractions

Diaion HP20SS (5×21)MeOH-H2O (0:100–100:0, v/v)

Fr. 1-1 Fr. 1-2(9.54 g)

Fr. 1-3

- 8 -

そのうち Fr. 1-2-7 (1.4 g) を silica gel カラムクロマト (CHCl3：MeOH：H2O) により分離

して化合物 3 (6 mg) を得た。Fr. 1-2-7-7 (367 mg) は silica gel カラムクロマトで同様に

分離し、Fr. 1-2-7-7-2 (250 mg) を Chromatorex ODS により精製して化合物 4 (6 mg) を得た。

第 2 項既知化合物の同定

分離した 2 種の既知化合物は、1H- および 13C-NMR スペクトルデータを文献記載の

値と比較して vladinol F (3) 17) および 3, 3′, 4-tri-O-methylellagic acid 4′-sulfate potassium salt (4) 18)と同定した。化合物 4 は植物成分としては比較的稀な硫酸エステルで、アルド

ース還元酵素阻害作用を持つことが報告されている。長崎県の産学官プロジェクトでこ

の物質がツバキ葉から初めて分離された際には分離過程で分解することが示唆されて

いたが、揉捻加熱乾燥工程を経て製造されるツバキ混合発酵茶に 4 が残存していること

が確認できた。

HO

OCH3

O

HO

OCH3

OH2

33a4

7 7a

8

9

10

1'3'

4'

11

O

O

OCH3

OCH3

KO3SO

H3COO

O

3 4 Fig. 1-5 Structures of 3 and 4

第 3 節ツバキ硬葉の成分分析

ツバキ葉の成分のうち特にサポニンなど比較的疎水性の成分が混合発酵茶を特徴づ

ける成分として重要と考えられた。そこでツバキ硬葉の成分分析を行った。


ツバキ硬葉 (1.0 kg) を 60% acetone (5 L)で抽出してろ過を行い、ろ液と残渣に分けた

(Chart1-3)。この残渣をさらに MeOH (5 L)で抽出し、ろ過して残渣とろ液に分けた。ろ

液は合わせて濃縮し、Sephadex LH-20 (20-100% MeOH, ついで 60% acetone) により分離

した。溶出液のうち TLC 希硫酸噴霧後加熱して赤褐色に呈色するサポニンを含む画分

を集めて濃縮した。このサポニン画分 (12.1 g) を silica gel (CHCl3 : MeOH : H2O)により

分離して 3 つの画分を得た。そのうち Fr. 3 (2.6 g) はサポニン（camelliosides A と B の

- 9 -

混合物）であった。Fr. 2 (3 g) は Diaion HP-20 (0-100% MeOH) により 5 つの画分に分画

した。そのうち Fr. 2-2 (826 mg) は Chromatorex ODS (0-80% MeOH) により分離して、

Fr. 2-2-1～3 に分画した。さらに Fr. 2-2-3 を Toyopearl butyl (0-100% MeOH) で分離する

ことにより、Fr. 2-2-3-2 から化合物 5 (18 mg) を得た。Fr. 2-2-3-3 はさらに Toyopearl butyl (0-100% MeOH) により精製し化合物 6 (4 mg) を得た。Fr. 2-3 (306 mg) は silica gel (CHCl3: MeOH: H2O) 、ついで Toyopearl butyl (0-100% MeOH) で分離して化合物 7 (21 mg) を得た。

Chart 1-3 Extraction and separation of constituents of C. japonica leaves

Fresh leaves of Camell ia japonica (1 kg)

extracted with 60% aq. acetone 5 Lfiltered

filtrateresidueextracted with MeOH 5 Lf iltered

residue f iltrate

Sephadex LH-20 (5×30)MeOH-H2O (20:80–100:0, v/v), 60% aq. acetone

saponin f raction the other f raction

silica gel (5×40)CHCl3-MeOH-H2O (7:3:0.5, 6:4:1, v/v)

Fr. 1 Fr. 2(3 g)

Fr. 3saponin(2.6 g)

Diaion HP-20 (2×20)MeOH-H2O (0:100–100:0, v/v)

Fr. 2-1 Fr2-2(826 mg)

Fr. 2-3(306 mg)

2 fractions


2 fractions Fr. 2-2-3 Fr. 2-2-4

Toyopearl butyl (2×20)MeOH-H2O (0:100–100:0, v/v)

5(18 mg)

6(4 mg)

silica gel (2×20)CHCl3-MeOH-H2O (9:1:0.1,8:2:0.2,7:3:0.5, v/v)

Fr. 2-3-1

Toyopearl butyl (2×20)MeOH-H2O (0:100–100:0, v/v)

7(4 mg)

- 10 -

第 2 項既知化合物の同定

分離した 3 種の既知化合物は 1H- および 13C-NMR スペクトルデータを文献値と比較

することで quercetin 3-O-α-L–arabinopyranoside (5) 19)、isoquercitrin 6′′-O-p-hydroxybenzoate (6) 20)、および quercetin (7) と同定した。

Fig. 1-6 Structures of 5—7

第 4 節ツバキ油粕の成分分析

長崎県ではツバキ油の生産が盛んである。ツバキ油はツバキの種子から採取されるが、

その際に大量のツバキ油粕が生じる。このツバキ油粕の産業的利用はいまだ十分ではな

く、著者は新たな利用法を検討する目的でツバキ油粕の成分分離を行った。水溶性の高

い画分はフラボノール配糖体と花や葉と異なるサポニン類が含まれているので 8)、ここ

では比較的脂溶性が高い画分の成分分析を行った。


ツバキ油粕 (2.1 kg) を hexane で脱脂し、残渣を MeOH で抽出して抽出液を濃縮した。

濃縮物は水に懸濁し EtOAc と n-BuOH で順次溶媒分配した (Chart 1-4)。EtOAc 画分は、

別途ツバキ油粕から分離していた CHCl3 可溶画分と組成が類似していたことから両者

を合わせて、さらに hexane と MeOH で溶媒分配を行った 21)。MeOH 可溶画分は Sephadex LH-20 カラムクロマトにより 7 つのフラクションに分離した。さらに繰り返し Chart 1-4に示すように分離精製して、6 種の化合物を単離した。

- 11 -

Fr. Ac2

Diaion HP-20 (3×20)MeOH-H2O (0:100-100:0, v/v)

Toyopearl Butyl (2×20)MeOH-H2O (0:100-100:0, v/v)

Fr. Ac2-2-1

Fr. Ac2-2-1-1

Diaion HP-20 (4×20)MeOH-H2O-TFA (80:20:1-100:0:1, v/v/v)

8(60 mg)

silicagel (3×30)CHCl3-MeOH-H2O (90:10:1, v/v/v)

Fr. Ac2-1 Fr. Ac2-2(593 mg)

Oil cake of Camellia japonica (2.1 kg)

extracted with hexane 3 Lconcentrated

The cake hexane extract

extracted with MeOH 5 Lconcentratedpartitioned between H2O, EtOAc and n-BuOH

H2O fraction n-BuOH f raction (80 g) EtOAc f raction (14 g)

extract withMeOH–CHCl3 (1:3) 800 mL

partitioned between MeOH and hexane

MeOH layer (10 g) The oil

Sephadex HP20 (4×30)EtOH, MeOH-CHCl3 (50:50, v/v)

Fr. Ac6(487 mg)

Fr. Ac7(69 mg)

Fr. Ac3(1.89 g)

Fr. Ac5(0.83 g)

Fr. Ac1(1.76 g)

Fr. Ac2(2.03 g)

Fr. Ac4(1.19 g)

Oil cake of Camellia japonica (302.95 g)

extracted with MeOH 600 mL

MeOH extract residue

partitioned with H2O 300 mL

CHCl3 L. (11.44 g) MeOH and H2O L.

a part of CHCl3 L. (6.44 g)

- 12 -

Chart 1-4 Extraction and separation of constituents of C. japonica seed oil cake


2 fractions

10(30 mg)


Fr. Ac3-3-1

9(20 mg)


11(9 mg)

Chromatorex ODS(2×15)MeOH-H2O(10:90-60:40, v/v)

Fr. Ac3-6(166.5 mg)

Chromatorex ODS (2×15)MeOH-H2O (20:80-40:60, v/v)


Fr. Ac3-4-1

Fr. Ac3-5(235.7 mg)

12(30 mg)

Fr. Ac3

Fr. Ac3-3(160.4 mg)

Fr. Ac3-4(106.3 mg)

Fr. Ac4


Fr. Ac4-1

Fr. Ac4-2-1 Fr. Ac4-2-2

silica gel (3×30)CHCl3-MeOH-H2O (90:10:1-70:30:5, v/v/v)


13(7 mg)

Fr. Ac4-2(409 mg)

2 f ractions

- 13 -

第 2 項既知化合物の同定分離した 6 種の既知化合物は、1H-および 13C-NMR スペクトルデータを文献値と比較

することにより oleic acid (8) 22)、C-veratroylglycol (9) 23)、protocatechualdehyde (10) 24)、

p-hydroxybenzoic acid (11)、vanillin (12)、および 3,3′-bisdemethylpinoresinol (13) 25) と同定

した。今回分離した化合物はいずれも含量が低かったが、比較的収量の多かった 12 は

香料成分として知られる。化合物 12 などの低分子芳香族化合物は木材を加熱する際に

リグニンが分解して生成することが知られている。ツバキ油を種子から搾油する際にも

強い圧力によって非常に高温となることから、油粕から得られた 9-13 はリグニンが分

解して生成したともの推測される。

Fig. 1-7 Structures of 8—13

8

9 10 11 12

13

COOH

OHOH

OHO

HO

CHO

OHOH

COOH

OH

CHO

OHOCH3

O

O

OH

OHHO

HO

H

H

- 14 -

小括

ツバキの花の成分を分離した結果、主要なサポニンである camellioside A (1) と新化合

物である 8-methoxykaempferol (2′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (2) が得られた。

Camellioside A は第 2 章でツバキサポニンを定量する際の標品として用いる。化合物 2 は天然に稀な 8-methoxykaempferol をアグリコンとする配糖体の p-クマル酸

エステルであり、ツバキの特徴的成分として位置づけられる。ツバキ茶の成分を分離した結果、アルドース還元酵素阻害活性を持つエラグ酸誘導体

硫酸エステル (4) が得られた。ツバキ葉からは既知化合物であるフラボノールとその配糖体を分離した。ツバキ油粕からは 6 種の既知化合物を単離した。このうち芳香族化合物はいずれも微

量成分であるが、搾油時の加熱によりリグニンが分解して生成した可能性が示唆された。

- 15 -

第 2 章ツバキサポニンの定量法

前に述べたように、当研究室では長崎県との共同研究でツバキ葉と茶葉を混合揉捻し

て製造する発酵茶を開発しており、長崎県立大学による動物実験では血中中性脂肪軽減

効果などがあることが明らかになっている 1,2)。また、原料のツバキ葉は血小板凝集作

用や胃粘膜保護作用などの機能性が報告されているサポニンを含み 3-5)、混合発酵茶は

わずかではあるがサポニンによる特徴的なえぐ味を呈する。このようなことから、機能

性と品質管理の観点から混合発酵茶製品中のサポニン含量を把握する必要が生じた。そ

こで著者はツバキサポニンの簡便な HPLC 分析定量法開発を企図した。サポニンは紫外吸収が弱く、多量のポリフェノールが共存すると汎用される紫外吸収

検出器による検出はできない。また、茶葉にも特有のサポニンが多種存在し 6,7)、それ

らの HPLC での保持時間はツバキサポニンのものと類似している。しかし、ツバキサポ

ニンは特徴的な C-28 ノルトリテルペノイドをアグリコンとしていることから、著者は

その反応性に着目してツバキサポニンを特異的に検出する方法を開発することとした。

第 1 節定量法の開発

ツバキ葉のサポニンは主に camellioside A (1) とそのアセチル化体（camellioside B、構

造式は緒論に示す）である。ツバキ葉抽出物を Diaion HP-20 カラムクロマトで分離して

得られたサポニン画分の HPLC を Fig. 2-1 に示す。このクロマトは 210 nm で検出した

もので、ツバキ葉

抽出エキスをそ

のまま測定して

も、共存物質のピ

ークに隠れてこ

れらサポニン由

来のピークは検出できない。さらに前述の混合発酵茶でのツバキ茶と茶葉の混合比は

1:9 であり、茶葉の方が圧倒的に多い。茶葉のサポニン含量は少ないが種類が多く、紫

外吸収を持つものもあることから 6,7)、混合発酵茶中に含まれるツバキサポニンをその

まま紫外吸収検出器で分析定量することは困難である。しかし、ツバキサポニンはその

特異な構造に由来する茶葉サポニンとは異なる反応性を有する。すなわち、camellioside A (1)にはケトンに隣接する C-17 位に 3 級水酸基があり、1 を酸と加熱すると配糖体の

加水分解と 17-18 位間での脱水反応が起こり、共役ケトン構造を持つ maragenin II (14) が生成する (Fig. 2-2) 3)。この化合物 14 は λmax 292 nm に強い紫外可視吸収を持ち、共存

するポリフェノール類とは保持時間が大きく異なるため検出が容易である。また、この

反応は camellioside 類に特有の反応であり茶葉サポニン類が共存していても障害となら

1 acetate of 1

Fig. 2-1 HPLC (210 nm) of saponin fraction of C. japonica leaves

- 16 -

ない。そこで、14 の生成量から、ツバキサポニンの総量を見積もることとした。

HO

OO

OOH

O

COOH

O

OHOO

OO

HO

HO

HOHO

OOH

HO

HOHO

OHHO

HOaq. H2SO4–dioxane,100 °C, 1 h

1 14

Fig. 2-2 Hydrolysis of camellioside A (1)

まず、1 を酸処理する際の加熱温

度と時間について検討した。密閉容

器中で 1 を 5% aq. H2SO4、10% aq. H2SO4、または、15% aq. H2SO4－

1,4-dioxane 等量混合物に溶かし、

90 °C、100 °C、110 °C で 1 時間、

または 2 時間加熱した。その結果、

10% aq. H2SO4－1,4-dioxane 等量混

合物に溶かし、100 °C で 1 時間加熱

の時に加水分解が完全に進行して

14 の生成量が最大となったので、こ

の条件で加水分解を行うこととした (Fig. 2-3)。次に、生成した 14 の安定

性について検討した。密閉容器中で

14 を 10% aq. H2SO4－1,4-dioxane 等量

混合物に溶かし、100 °C で 3 時間加

熱し、経時的に HPLC で 14 の残存量

を比較した (Fig. 2-4)。その結果、14の分解はほとんど考慮しなくてよい

ことが分かった。以上の検討をもとに、定量法の検討

を行った。当初は葉の MeOH 抽出エキスを作成し、それを加水分解する方法を検討し

たが、再現性の良い数値を得ることが出来なかった。そこで、粉末にした葉をそのまま

加水分解に供することとした。まず、ワーリングブレンダーで乾燥葉を粉砕して正確に

秤量し、10% aq. H2SO4–1,4-dioxane (1:1) を加え、100 °C で 1 時間加熱した。その後、

0

500000

1000000

1500000

2000000

0 50 100 150 200

peak

are

a (m

AU

・s)

reaction time (min)

Fig. 2-4 Stability of 14

0

500000

1000000

1500000

2000000

0 1 2 3 4 5

peak

are

a(m

AU

・s)

reaction time (h)

Fig. 2-3 Time-course of reaction of 1

- 17 -

HPLC により 14 の生成量を分析した。第一章で得た 1 の標準品についても試料と同様

の操作を行って検量線を作成し、それをもとに試料中の camellioside A 含有量を求めた。

第 2 節定量法の検証

まず、ツバキの葉、茶ツバキ混合発酵茶（ここではツバキ:茶＝1:2 のものを用いた）、

および緑茶を試料として、それぞれ前節で示した方法により加水分解を行い、HPLC で

分析した (Fig. 2-5)。その結果、ツバキの葉、ツバキ混合発酵茶では 14 由来のピークが

観察されたが、緑茶ではそのピークが認められなかった。このことから、今回開発した

方法で camellioside A (1)由来の 14 を特異的に検出できることが分かった。次に、ツバキの花

（凍結乾燥）、ツバキ

の葉（凍結乾燥）、ツバキの葉（加熱乾燥）、ツバキ混合発酵茶

（ツバキ:茶＝1:9）に

ついてツバキサポニ

ンの定量を行った。

その結果、ツバキの

花の方が葉よりもサ

ポニンを多く含んで

いることを確認でき

た (Table 2)。また、

ツバキ混合発酵茶の

サポニンの量がツバ

キの葉のおよそ 10分の 1 という結果が得

られ、ツバキ混合発

酵茶におけるツバキ

葉と茶葉の混合比率

と一致した。

Table 2 The content of camelliosides A and B (g/100 g)Contents　(g/100 g sample)

10% mixed tea 0.18 ± 0.09leaf (heat dry) 1.20 ± 0.15leaf (freeze dry) 1.69 ± 0.15flower (freeze dry) 3.18 ± 0.72

Fig. 2-5 HPLC profiles (292 nm) of the mixtures after hydrolysis.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0

0

10000

20000

30000

40000

Inte

nsit

y [µ

V]

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0

0

10000

20000

30000

40000

Inte

nsit

y [µ

V]

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0

0

10000

20000

30000

40000

Inte

nsit

y [µ

V]

C. japonica leaves

green tea

mixed tea (1:2)

14

- 18 -

次に、ツバキの葉（凍結乾燥）から実際にサポニンを分離して分析値の妥当性を検証

した。ツバキの葉 (10 g) を MeOH で抽出し、Chart 2-1 に示すように分画すると

camellioside A と B を含むサポニンフラクション (182 mg) が得られた。この値は定量

により得られた 1.69 ± 0.15 (g/100 g sample) とほぼ一致していたことから、この定量法

の正確さが裏付けられた。

第 3 節分析結果

緑茶製造設備を用いて製造された混合発酵茶（新鮮葉の混合比率 1:1、1:2、1:5、1:9）と、使用したツバキ新鮮葉を加熱乾燥した試料について分析を行った。結果を Table 3に示す。得られた結果は、混合比率から推定される数値とほぼ一致した。これらの結果

は、製造過程でサポニンがほとんど変化していないことを示唆している。

Chart 2-1 Separation of saponin fraction from dried C. japonica leaves

Freeze dried leaves of Camellia japonica (10 g)

Extracted three times with MeOH under reflux 3 hConcentrated

extract (3.20 g)

Fr. B Fr. C


Fr. E

MCI GEL CHP 20P (3×20)MeOH-H2O (40:60-100:0, v/v)

Fr. A Fr. D(200 mg)

saponin(182 mg)

1　(g/100 g dried tea) estimated valueb

C. japonica leaves 0.86 ± 0.08mixed fermented tea 1:1a 0.54 ± 0.05 0.57

mixed fermented tea 1:2a 0.37 ± 0.03 0.43

mixed fermented tea 1:3a 0.22 ± 0.04 0.25

mixed fermented tea 1:4a 0.13 ± 0.02 0.15green tea 0.00 0.00black tea 0.00 0.00aMixing ratio (C. japonica : green tea) was based on fresh weight.bCalculated based on the amount of 1 in the C. japonica leaves.

Table 3 The content of camelliosides A and B (g/100 g dry weight) in tea products.

- 19 -

小括

混合発酵茶はツバキサポニンによる特有のえぐ味を呈する。また、ツバキサポニンに

は血小板凝集作用や胃粘膜保護作用が報告されている 3)。このため機能性評価と品質管

理の観点から定量法の開発を行った。混合発酵茶中にはポリフェノールや茶サポニンな

ど様々な成分が共存するため、ツバキサポニンをそのまま検出することは不可能である

が、著者はその反応性に着目し、酸性条件下加熱することで生成する強い紫外吸収を持

つ物質を HPLC で分析定量する特異的かつ簡便な方法を開発した。実際に分離して得ら

れるサポニン量と定量結果を比較することで妥当性の検証を行った後、茶葉とツバキ葉

を様々な割合で混合発酵して製造された製品中のサポニン量の定量を行った。

第

茶

が明

富に含

では

第 1

ツバ

葉が

増し

主成分

の葉

によ

およ

伴っ

カテ

Pedun細な検

3 章ツバ

ツバキ混合

らかになっ

含まれてい

この pedunc

節ツバキ

バキは常緑

次々に展開

、日光が強

分として含

が展開し始

り比較した

び前年に展

て減少して

キン類は酸

nculagin (15検討を行っ

F

バキ葉エ

合発酵茶の開

た 8)。顕著

いるが、7 月

culagin の分

キ葉の成分

緑樹であり、

していく。

くなる 7 月

含まれるエラ

始めた 4月下

た。4 月に伸

展開し越年し

いることが

酸化されやす

5) の減少も

た。

Fig. 3-1 HPLC

ラジタン

開発過程で、

な違いは、

の葉にはほ

分解機構を解

分変化

冬を越した

展開し始め

には硬さが

ラジタンニン

旬に葉が展

長した部分

した硬葉を Hが分かった (すい物質であ

も同様に酵素

profiles of 60%

- 20 -

ンニンの季

ツバキ葉の

4 月の葉に

とんど検出

解明すべく研

た前年の葉を

めの葉は柔ら

が前年葉と同

ンの peduncu展開してから

分の先端の最

HPLC 分析で

(Fig. 3-1)。同

あることから

素による酸化

% ethanol extrac

季節変化と

成分が 4 月

はエラジタ

出されないこ

研究を行った

をつけた枝の

らかいが、葉

同程度になる

ulagin (15) がらの時期が異

最も若い葉、

で比較したと

同時に catecら酸化的分解

化分解であ

cts of the leave

と酸化反応

と 7 月で大

ンニンの pことであった

た。

の先に、4 月

葉が大きくな

る。この過程

が減少する。

異なる葉の成

先端から 2ところ 15 の

hin (16) も減

解である可能

る可能性が

s of C. japonica

応

大きく異なる

pedunculaginた。そこで、

月～5 月頃新

なるにつれ硬

程で 4 月の新

。そこで、ツ

成分をHPLC2 枚目と 4 枚

の量が葉の成

減少してい

能性が高い

があると考え

a.

ること

n が豊

本章

新しい

硬さも

新葉に

ツバキ

C分析

枚目、

成長に

るが、26)。

えて詳

- 21 -

Fig. 3-2 Structures of polyphenols contained in C. japonica leaves

第 2 節 Pedunculagin の酵素酸化第 1 項 Pedunculagin の酵素酸化と酸化生成物の分離

ツバキ葉の成長に伴うエラジタンニン pedunculagin (15)の減少が酸化的な代謝による

ものと仮定して、15 を強いポリフェノール酸化活性を持つナシ果実ホモジネートで処

理する実験を行った。ナシ果実ホモジネートを用いた理由は、当研究室におけるポリフ

ェノール酸化機構に関わる研究において最も強い酸化活性を示すことが示され、それ自

体 HPLC でバックグラウンドピークを示さず、また、大きいスケールでの実験が容易で

あるからである 27)。まず、15 を単独でナシ果実ホモジネートで処理したが、15 はほと

んど変化しなかった (Fig. 3-3 ○)。そこで、エラジタンニンと同様に葉が成長するにし

たがって減少する catechin (16)を反応液中に共存させ

て 15 の変化を HPLC によ

り分析した。その結果 Fig. 3-3 に－●－で示すように、

16 を共存させると 15 の量

が速やかに減少すること

が分かった。そこで、15がどのように変化してい

るかを調べるために反応

後の溶液から分解生成物

を分離することにした。ツバキ葉から分離した

Fig. 3-3 Decrease in the level of 15 on treatment with polyphenol oxidase.

○: 15 + polyphenol oxidase, ●: 15 + 16 + polyphenol oxidase

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 10 20 30

rela

tive

peak

are

a (m

ax a

bs)

reaction time (min)

15

15 + 16

- 22 -

15 (1.08 g) と 16 (0.2 g) を含む水溶液 (100 mL) にナシ果実ホモジネートを加えて 2 時

間撹拌した。その後、EtOH を加えて酵素を失活させ、ろ過をして、カラムで分画した

ところ、原料である 15 (388 mg)と 16 (104 mg)を分離するとともに化合物 18 (7 mg) と化

合物 19 (47 mg) が得られた (Chart 3-1)。

MCI gel CHP20P (2×20)MeOH-H2O (0:100-100:0, v/v)

Pedunculagin + catechin

Fr. 3-1(104 mg)

Fr. 3(331 mg)

19(47 mg)

+ Japanese pear homogenatestirred at r.t. f or 2 h+ EtOHf iltrationconcentration


Sephadex LH-20 (3×25)MeOH-H2O (40:60-100:0, v/v)

Fr. 3-2(84 mg)


18(7 mg)

15(388 mg)

16(104 mg)

Chart 3-1 Separation of reaction products of pedunculagin

第 2 項 Pedunculagin 酸化生成物の構造解析

化合物 18 は、[α]D31 +16.6 (MeOH) の褐色無

結晶粉末として得られ、FAB-MS において m/z 799 に [M+H]+ピークを示したことから分子量

は 798 と推定された。また、元素分析の結果、

および 13C-NMRスペクトル (Table 4) における

シグナルの数、さらに、18 が 15 由来の化合物

であることから分子式は C34H22O23と決定した。

IR スペクトルにおいて 3500～3000 cm-1の広い

吸収帯と 1745, 1729, 1716 cm-1に強い吸収があ

り、このことから水酸基とカルボニル基がある Fig. 3-4 Structure of 18

- 23 -

ことが推測された。 1H-NMR スペクトルと13C-NMR スペクトル (Table 4)は、15 のものと

良く類似していたが、hexahydroxydiphenoyl (HHDP) 基の一方のベンゼン環のシグナルが

大きく変化していた。さらに HMBC、HSQC、1H-1H COSY による検討を行ったところ、4 位

に結合したアシル基の部分以外は 15 と同じ構

造であると決定した (Fig. 3-4)。これにより、

glucose の 4 位に結合したアシル基の Fig. 3-4の破線で囲んだ部分は C7H2O5で構成されてい

ると考えた。この部分は 13C-NMR スペクトル

より 3 つのカルボキシル基 (δ 160.7, 161.5, 164.3) と 4 つの二重結合炭素 (δ 108.6, 130.1, 130.2, 145.8, 150.1) から構成されていることが

分かった（α, β平衡のためシグナルが複数出現）。

また、HMBC スペクトルの相関から、glucoseの 4 位に結合したアシル基の構造は 2 種類の構

造 18 または 18a と推定された (Fig. 3-6)。このアシル基の水素シグナルは 1H-NMR スペ

クトルにおいて δ 7.06 (1H, s, H-α-6′′′) と 7.02 (1H, s, H-β-6′′′) に観察され、HSQC スペク

トルでこの水素のシグナルは δ 108.6 (C-6′′′) のシグナルと相関を示した。類似の構造の

2,3,4-tricarbomethoxy-2-pyrone ではメチン炭素のケミカルシフトは δ 122.7 であった 28) (Fig. 3-7)。また、18a の構造の場合、HMBC スペクトルにおいて 4J にあたる H-6′′′から

C-3′′′に相関が出ていることになる。一方、Fig. 3-6 の 18 の構造の場合、類似の構造をも

つ bis(2-{[(cholest-5-en-3-yloxy)carbonyl]oxy}ethyl) 2-oxo-2H-pyran-4,6-dicarboxylate にお

いて、メチン炭素

のシグナルは δ 108.5 であった 29)

(Fig. 3-7)。また、

HMBC スペクト

ルにおいてはす

べての相関が 2Jから 3J で無理な

く説明できる。以

上の検討をもと

に、glucose の 4 位

に結合したアシ

ル基の構造は Fig.

Fig. 3-6 Plausible structures of 18

Fig. 3-5 Important HMBC correlations for 18

18 18a

Fig. 3-7 Structures of 2,3,4-tricarbomethoxy-2-pyrone and bis (2-{[(cholest-5-en-3- yloxy)carbonyl]oxy}ethyl) 2-oxo-2H-pyran-4,6-dicarboxylate

2,3,4-tricarbomethoxy-2-pyrone

bis (2-{[(cholest-5-en-3-yloxy)carbonyl]oxy}ethyl) 2-oxo-2H-pyran-4,6-dicarboxylate

O

O

CO2MeCO2Me

MeO2C

δ 122.7

O

O

NH

R:O

O

CO2R

CO2R

δ 108.5

O

O

HO

O

OO

O

OHO

O1'''2'''

3'''

4'''

5'''6'''

7'''

1'''2'''3'''

4'''

5'''6'''

7'''

4J

- 24 -

3-6 に示す 18 の構造と考えられた。 C–D 環の間のアトロプ異性については、glucose の H-5、6a、6b の結合定数 (βアノマ

ー：J5,6a =2.3 Hz; J5,6b =6.9 Hz) が 4,6-(R)-HHDP をもつ neostrictinin (J5,6a =9.8 Hz; J5,6b =5.6 Hz)のものよりも 4,6-(S)-HHDP をもつ strictinin (J5,6a <2 Hz; J5,6b =6.3 Hz) のものと類似

していたことから、アトロプ異性は S 配置であると推測された 30)。化合物 18 の構造をさらに確かめるため、可能性のある 4 種類の構造 [(S)-18, (R)-18,

(S)-18a, および (R)-18a]について、NMR ケミカルシフトの density functional theory (DFT)計算を行った。それぞれの構造について配座探索を MMFF94 力場計算により行い、6 kcal/mol 以内の安定配座を B3LYP/6-31G (d,p)レベルで最適化した。(S)-18, 18a および

(R)-18, 18aの最安定配座をFig. 3-8に示す。 (S)-18および (R)-18の最安定配座について、

グルコース部分の立体配座は strictininおよび neostrictininのものとよく類似していた 30)。

得られた安定配座のうち、Boltzmann 分布において存在率が 1%を超えるものについて、

mPW1PW91/6-311+G (2d,p)レベルでの NMR ケミカルシフト計算を行った 31-33)。得られ

たNMRケミカルシフト計算値と実測値との相関関係を解析することで重相関係数 (R2)、最大絶対誤差 (CMaxErr)、および平均絶対誤差 (CMAE)が得られた。その結果、1H-NMRと 13C-NMRケミカルシフトのいずれにおいても (S)-18 のR2が最も1に近い値を示し、

CMaxErr と CMAE が一番低い値であったことから、(S)-18 の計算結果が実測値と最も

よく一致していると考えられた (Table 5, 6)。さらに DP4 34) および DP4+ 35) 解析を行っ

た結果、いずれも (S)-18 の構造が 100.0%であった。以上の結果から、18 の構造は(S)-18であると結論し、pedunculagin Ox-1 と命名した。

- 25 -

Table 4 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data for 18 (δ in ppm, J in Hz).

1: α-form 1: β-form 1: α-form 1: β-form1 5.41 (d, 3.7) 5.04 (d, 8.2) 91.1 94.72 5.03 (m) 4.82 (dd, 9.3, 8.2) 74.9 77.53 5.44 (t, 9.6) 5.23 (dd, 9.8, 9.3) 75.2 77.24 5.02 (m) 4.97 (dd, 9.8, 9.7) 71.2 70.85 4.64 (ddd, 10.0, 7.0, 2.9) 4.30 (ddd, 9.7, 6.9, 2.3) 66.2 71.36a 5.29 (dd, 12.7, 7.0) 5.35 (dd, 12.9, 6.9) 63.8 63.66b 3.86 (dd, 12.7, 2.9) 3.92 (dd, 12.9, 2.3)

1' - - 126.1a 126.0a

2' - - 114.5 114.43' - - 145.0 145.04' - - 136.1 136.15' - - 144.1 144.16' 6.59 (s) 6.59 (s) 107.4 107.47' - - 168.9 169.0

1'' - - 125.9a 126.0a

2'' - - 114.3 114.33'' - - 145.0 145.04'' - - 136.1 136.05'' - - 144.1 144.16'' 6.38 (s) 6.36 (s) 107.1 107.27'' - - 169.3 169.3

1''' - - 143.7 143.82''' - - 129.2 129.23''' - - 159.3 159.34''' - - 160.6 160.65''' - - 149.6 149.66''' 7.03 (s) 6.97 (s) 108.0 108.07''' - - 163.8 163.8

1'''' - - 124.6a 124.6a

2'''' - - 112.1 112.13'''' - - 146.9 146.94'''' - - 136.5 136.55'''' - - 145.4 145.56'''' 6.72 (s) 6.71 (s) 107.7 107.87'''' - - 168.1 168.1

Measured in acetone-d 6 + D2O. a Assignments may be interchanged.

Position1H (J , Hz) 13C

- 26 -

Pedunculagin (15)の酸化反応で 18 と共に生成した化合物 19 は、[α]D31 +1.2 (MeOH) の

褐色無結晶粉末として得られ、FAB-MS において m/z 799 に [M+H]+ピークを示したこ

とから分子量は 798 と推定された。また、HR-FAB-MS で [M+Na]+が m/z 821.0443 に観

察されたことから、19 の分子式は C34H22O23 と推測され、これは 18 のものと同じであ

った。この化合物は IR スペクトルにおいて 3700～2500 cm-1に広い吸収帯、1739, 1730,

Fig. 3-8 Optimized lowest-energy conformers of (R)-18, (S)-18, (R)-18a and (S)-18a at the B3LYP/6-31G

(d,p) level in acetone (PCM).

(S)-18 (S)-18a (R)-18 (R)-18a

Table 5 Statistical parameters of calculated 1H-NMR chemical shifts of 18 (ppm).

Table 6 Statistical parameters of calculated 13C-NMR chemical shifts of 18 (ppm).

R 2 CMaxErr CMAE(R )-18 0.9386 0.57 0.20(S )-18 0.9759 0.31 0.13

(R )-18a 0.9686 0.44 0.13(S )-18a 0.9581 0.43 0.18

R 2 : coefficient of determination; CMaxErr: corrected maximum absolute errorwith respect to the linear fit; CMAE: corrected mean absolute error with respect tothe linear fit

R 2 CMaxErr CMAE(R )-18 0.9921 7.0 2.1(S )-18 0.9945 5.2 1.7

(R )-18a 0.9876 9.2 2.5(S )-18a 0.9889 10.6 2.0


- 27 -

1714 cm-1 に強い吸収を示し、このことから水酸基とカルボニル基があることが推測さ

れた。1H-NMR スペクトルと 13C-NMR スペクトル (Table 7) は 18 のものと非常に良く

類似しており、HMBC (Fig. 3-10)、HSQC、1H-1H COSY を検討することにより、18 の

glucose の 4 位に結合しているアシル基部分が 19 では 6 位側に結合していると考えられ

た。化合物 19 のグルコース部分の 1H-NMR ケミカルシフトならびに 6 位メチレン水素の

結合定数 (βアノマー：J5,6a =1.6 Hz; J5,6b =6.8 Hz) は 18 のものとよく類似していたこと

から、C-D 環のアトロプ異性は 18 と同様に S であると考えられた。そこで、18 の場合

と同様に可能性のある 4 種類の構造 [(S)-19, (R)-19, (S)-19a, および(R)-19a (Fig. 3-11)]について NMR ケミカルシフト計算を行った。その結果、(S)-19 の計算結果が実測値と最

もよく一致していた (Table 8, 9)。さらに、(S)-19 の構造について DP434)では 97.4%, DP4+35)では 100.0%であったことから、化合物 19 の構造は (S)-19 であると結論し、

pedunculagin Ox-2 と命名した。

Fig. 3-9 Structures of 19 and 19a


OO

O OHOO O

OH

OHOHHOHO

HO

OOO

OH

O

123

46

1'

2'3' 4'

5'

6'7'1''

2''6''

7''1'''

2'''

4'''

6'''

7'''

1''''2''''3''''

4''''

5''''6''''

7''''O

O OH

HO

HO

OO

R2

O

R1HO

O

1919a

- 28 -

1: α-form 1: β-form 1: α-form 1: β-form1 5.38 (d, 3.7) 4.97 (d, 8.2) 91.0 94.52 5.02 (dd, 9.2, 3.7) 4.79 (dd, 9.0, 8.2) 75.1 77.63 5.38 (dd, 9.8, 9.2) 5.19 (dd, 10.1, 9.0) 75.1 76.84 5.09 (t, 9.8) 5.08 (t, 10.1) 70.0 69.75 4.18 (ddd, 9.8, 6.8, 1.8) 4.55 (ddd, 10.1, 6.8, 1.6) 71.2 66.26a 3.96 (dd, 12.8, 1.8) 4.02 (dd, 13.0, 1.6) 65.1 65.06b 4.98 (m) 4.98 (m)

1' - - 124.1a 124.1a

2' - - 114.2 114.33' - - 144.0 144.04' - - 136.0 136.05' - - 144.8 144.86' 6.58 (s) 6.57 (s) 107.2 107.27' - - 169.0 169.1

1'' - - 125.6a 125.6a

2'' - - 114.0 114.13'' - - 144.0 144.04'' - - 135.9 135.95'' - - 144.8 144.86'' 6.33 (s) 6.33 (s) 106.9 106.97'' - - 169.7 169.7

1''' - - 125.7a 125.7a

2''' - - 112.1 112.13''' - - 145.1 145.14''' - - 136.5 136.55''' - - 146.5 146.56''' 6.53 (s) 6.55 (s) 106.9 106.97''' - - 168.1 168.1

1'''' - - 146.0 146.02'''' - - 125.1 125.13'''' - - 161.9 161.94'''' - - 163.5 163.55'''' - - 155.6 155.66'''' 7.03 (s) 7.02 (s) 105.8 105.87'''' - - 165.0 165.1

Measured in acetone-d 6 +D2O. a Assignments may be interchanged.

Position1H (J , Hz) 13C


- 29 -

Fig. 3-11 Optimized lowest-energy conformers of (R)-19, (S)-19, (R)-19a and (S)-19a at the B3LYP/6-31G (d,p) level

in acetone (PCM).

(R)-19 (S)-19 (R)-19a (S)-19a

Table 8 Statistical parameters of calculated 1H-NMR chemical shifts of 19 (ppm).

Table 9 Statistical parameters of calculated 13C-NMR chemical shifts of 19 (ppm).

R 2 CMaxErr CMAE(R )-19 0.8890 0.85 0.22(S )-19 0.9435 0.52 0.17

(R )-19a 0.8909 0.57 0.28(S )-19a 0.9039 0.60 0.25


R 2 CMaxErr CMAE(R )-19 0.9917 7.3 2.2(S )-19 0.9917 7.1 2.3

(R )-19a 0.9823 13.5 2.7(S )-19a 0.9870 12.8 2.5


- 30 -

Pedunculagin (15)からの 18 および 19 の生成機構については以下のように推定してい

る。ナシ果実ホモジネートは 16 を速やかに酸化して重合物を与えることはすでに明ら

かになっている 27)。Pedunculagin (15)の酸化は、15 単独では進行せず 16 を加えること

で初めて反応が進行したことから (Fig. 3-3)、ポリフェノール酸化酵素によってまずカ

テキン B 環のカテコールが酸化されて o-キノンとなり、それが酸化剤となって 15 のピ

ロガロール環を酸化していると考えられた。また、カテキンが酸化される際に酸素が還

元されて過酸化水素が生成することが報告されており 36-38)、15 のキノンの開裂にはそ

の過酸化水素も関与しているのではないかと推測された (Fig. 3-12)。本実験では 4，6位の HHDP 基が酸化されたものが分離されたが、これらの収量は少なく (Chart 3-1)、2，3 位の HHDP 基が酸化されたものも生成している可能性が高いと考えている。ただ、4，6位のHHDP基の方がピラノース環との間の大環状ラクトン環のフレキシビリティーが

高く、立体的に酸化されやすい可能性はある。

Fig. 3-12 Plausible oxidation mechanism of 15

O

O

OH

OH

O2H2O2

H2O2

polyphenoloxidase

15

HO

HO

HO

O

O

HO

O

O

O

O

O

O

HO2C

OHOHO

H H+

O

HO

OHO2C

H+

HO2CHO H

H2O

18, 19

16

- 31 -

第 3 項 Strictinin の酵素酸化

つぎに、より単純構造のエラジタンニン

を用いて実験を行った。ここでは glucoseの 4,6 位に (S)-HHDP 基を持ち、アノマー

位に galloyl 基をもつ strictinin (20)を基質

として用いることで、15 と同様の HHDP基の酸化が起こるのか、また galloyl 基の

酸化が起こるのかを検討した。 Strictinin (20) とナシ果実ホモジネ

ートとを混合した (Fig. 3-14 ○)。すると、15 は 16 の共存下でしか酸化されなかった

が、20 は 16 を加えなくても酸化された。ただし 16 を加えると反応速度は大きくなっ

た (Fig. 3-14 ●)。つぎに、反応後の溶液から反応生成物の分離をすることとした。 Strictinin (20) (0.5 g) を精製

水 50 mL に溶かし、ナシ果実

ホモジネートを加えて 30 分

間撹拌した。その後、acetone 500 mL を加えて反応を止め、

ろ過後、ろ液の有機溶媒を減

圧下で除去し、 Sephadex LH-20 により分離した結果、

化合物 21 (6 mg) と化合物 22 (15 mg) が得られた。また、

原料である 20 (396 mg) が回

収された。


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 10 20 30

rela

tive

peak

are

a (m

ax a

bs)

reaction time (min)

Fig. 3-14 Decrease in the level of 20 on treatment with polyphenol oxidase.

○: 20 + polyphenol oxidase, ●: 20 + 16 + polyphenol oxidase

Chart 3-2 Separation of reaction products of strictinin

Fr. 1(33 mg)

Fr. 2(49 mg)

Reaction mixture

+ acetonef iltrationconcentrationSephadex LH-20 (3×20)MeOH-H2O (0:100-60:40,v/v)

20(396 mg)

Sephadex LH-20 (2×20)H2O

Sephadex LH-20 (2×20)H2O

21(6 mg)

22(15 mg)

- 32 -

Pedunculagin (15)の場合と異なり strictinin (20) の酸化で 16 を加えなくても反応が進

んだ理由は、2,3-HHDP 基が無いために立体障害が少なく、4,6-HHDP が直接酸化酵素に

よる酸化を受けたと推測している。また、16 を加えたことで反応が加速した理由は、

4,6-HHDP 基よりも 16 が酸化を受けやすいく、16 の酸化により生成したキノン体が

4,6-HHDP 基の酸化に寄与しているからだと考えている。この実験では galloyl 基が酸化

された生成物は確認できなかった。

第 4 項 Strictinin 酸化生成物の構造解析

化合物 21 は、[α]D30 −68.5 (MeOH) の褐色無晶

形粉末として得られ、HR-ESI-MS において m/z 647.0556 (Calcd for C27H19O19:647.0526) に [M–H]–ピークを示したことから分子量は 648、分子

式は C27H20O19であることがわかった。IR スペク

トルにおいて 3500～3000 cm-1の幅広い吸収帯と

1713 cm-1に強い吸収があり、このことから水酸

基とカルボニル基があることが推測された。1H-NMR スペクトルと 13C-NMR スペクトル (Table 10) は、前駆体である 20 のものと比

べて、B 環由来のシグナルを除いてよく類似していた。Pedunculagin (15)の場合と同様

の反応が起きていると推測して、21 の B 環

の 1H および 13C-NMR シグナルを 18 の C 環

のそれらと比較したところよく一致した。

HMBC スペクトルでは、δH 7.10 (H-6′′)と δH 4.72 (glc-H-4) の水素シグナルが δC 164.7 (C-7′′) のカルボキシル炭素シグナルと相関

していたことから、glucose の 4 位に結合し

たアシル基が酸化されたと決定した。B-C 環

のアトロプ異性については、glucose の H-5、6a、6b の結合定数 (βアノマー：J5,6a =1.7 Hz; J5,6b =6.9 Hz) が 18, 19 と類似していた

ことから、S 配置であると推定した。化合物 22 は、褐色無晶形粉末として得

られ、負の旋光度を示した ([α]D30 −19.4)。

ESI-MS においては m/z 647 に負のイオン

ピークが観察されたことから分子式は

C27H20O19 で構成されていると推測され、

21




- 33 -

これは 21 のものと同じであった。1H- および 13C-NMR スペクトルも 21 のものと非常

によく類似していたことから、分子の構成ユニットは同じであると考えられた。HMBCスペクトルでは、δH 6.98 (H-6′′′), 4.93 (glc-H-6), および 3.92 (glc-H-6) の水素シグナルが

いずれもδC 165.2 (C-7′′′) のカルボキシル炭素シグナルと相関していたことから、glucoseの 6 位に結合したアシル基が酸化されていると決定した。化合物 22 の B-C 環のアトロ

プ異性については、glucose の H-5、6a、6b の結合定数 (J5,6a =2.3 Hz; J5,6b =6.9 Hz)をstrictinin (J5,6a <2 Hz; J5,6b =6.3 Hz)、neostrictinin (J5,6a =9.8 Hz; J5,6b =5.6 Hz)と比較し、

strictinin の結合定数と類似していたことからから S 配置であると推測された 30)。


Position δH (J , Hz) δC

1 5.62 (d, 8.1) 95.22 3.65 (dd, 9.4, 8.1) 72.93 3.87 (t, 9.4) 74.24 4.72 (dd, 9.8, 9.4) 73.35 4.17 (ddd, 9.8, 6.7, 1.8) 71.66a 3.77 (dd, 13.3, 1.8) 63.56b 5.24 (dd, 13.3, 6.7)

1' - 119.42' 7.10 (s) 110.13' - 145.54' - 139.65' - 145.56' 7.10 (s) 110.17' - 166.0

1'' - 146.02'' - 125.43'' - 162.04'' - 163.85'' - 155.46'' 7.10 (s) 105.87'' - 164.7

1''' - 124.62''' - 112.43''' - 146.34''' - 136.35''' - 145.46''' 6.59 (s) 107.57''' - 168.4

Measured in CD3OD.

Glucose

C-Ring

B-Ring

Galloyl

- 34 -

化合物 21 および 22 の B-C 環のアトロプ異性を確認するため、ECD スペクトルの

TDDFT 計算を行った 39,40)。化合物 21 および 22 のアトロプ異性が S 配置および R 配置

の構造について、配座探索および DFT 最適化により最安定配座を得た (Fig. 3-18,19)。得られた最安定配座について ECD スペクトルの TDDFT 計算 (CAM-B3LYP/6-31G(d,p)レベル) を行い、実測スペクトルと比較した。その結果、21 および 22 いずれも S 配置

の計算スペクトルの方が実測スペクトルとよく類似していたことから、B-C 環のアトロ

プ異性は S 配置であると結論し、strictinin Ox-1、Ox-2 と命名した (Fig. 3-20)。


Position δH (J , Hz) δC

1 5.63 (d, 8.1) 95.42 3.69 (dd, 9.0, 8.1) 73.43 3.84 (dd, 10.0, 9.0) 74.04 4.88 (dd, 10.5, 10.0) 72.75 4.12 (dd, 10.5, 6.0) 71.86a 3.92 (d, 12.8) 65.16b 4.93 (dd, 12.8, 6.0)

1' - 119.42' 7.11 (s) 110.13' - 145.64' - 139.65' - 145.66' 7.11 (s) 110.17' - 166.0

1'' - 124.52'' - 112.43'' - 146.1a

4'' - 136.45'' - 146.46'' 6.73 (s) 107.47'' - 168.4

1''' - 145.0a

2''' - 125.13''' - 162.04''' - 163.55''' - 156.06''' 6.98 (s) 105.57''' - 165.2

Measured in CD3OD. a )Assignments may be interchanged.

Glucose

C-Ring

B-Ring

Galloyl

- 35 -

Fig. 3-18 Lowest-energy conformers of (S)-21 and (R)-21 at the B3LYP/6-311+G (2d, p) level in MeOH (PCM).

Fig. 3-19 Lowest-energy conformers of (S)-22 and (R)-22 at the B3LYP/6-311+G (2d, p) level in MeOH (PCM).

(S)-21

(R)-21

(S)-22

(R)-22

- 36 -

Fig. 3-20 Experimental and calculated ECD spectra of 21 and 22.

The calculations for the ECD spectra were performed at the TD-CAM-B3LYP/6-311+G (2d, p) level in MeOH

-30

-20

-10

0

10

20

30

200 250 300 350 400 450

∆ε

wavelength [nm]

22 (exptl)(S)-22 (calcd)(R)-22 (calcd)

-20

-10

0

10

20

30

40

200 250 300 350 400 450

∆ε

wavelength [nm]

21 (exptl)(S)-21 (calcd)(R)-21 (calcd)

- 37 -

第 5 項ツバキ葉ホモジネートによる pedunculagin の酸化

第 1 項では pedunculagin の酵素酸化反応にナシ

果実ホモジネートを用いた。本項では、同様の反

応がツバキ葉の酵素でも起こるかを検討した。ツ

バキ葉には多くのポリフェノール類が含まれてお

り、葉のホモジネートをそのまま酵素液として用

いることはできない。そのため、Polyclar AT を用

いてツバキ葉からポリフェノールを除去した後に

酵素液として用いることとした。ツバキ葉 (80 g) を Polyclar AT と水 900 mL でホモジナイズしろ過

した。その結果、大部分のポリフェノールが

Polyclar AT に吸着されて除去され、酵素液 500 mLが得られた (Fig. 3-21)。この酵素液に pedunculagin (1.0 g) と catechin (300 mg) を加え、7 時間撹拌し

た後、EtOH 1.5 L を加えて反応を止めた。反応液

を減圧下で濃縮し、300 mL になったところで生成

していると推測されるカルボン酸塩を遊離型にす

るため trifluoroacetic acid を加えて酸性にした。この溶液を各種クロマトグラフィーによ

り分離したところ、18 (19 mg) および 19 (98 mg) が得られた。以上のことから、ツバキ

葉ホモジネートでも pedunculagin の酵素酸化が起こることが分かった。

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time

-0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

Inte

nsi

ty

CH-09 [MaxABS (200.0--550.0 nm)]

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time

-0

100000

200000

300000

400000

500000

Inte

nsi

ty

CH-09 [MaxABS (200.0--550.0 nm)]

15

16 17

H2O extract of the leaves

of C. japonica

H2O extract of the leaves of C. japonica

+ Polyclar AT

Chart 3-3 Separation of reaction products of pedunculagin.

Fig. 3-21 HPLC profiles of H2O extract of theleave of C. japonica and the extract treatedwith Polyclar AT.

Fr. 1(2.38 g)

Fr. 2(12.16 g)

Fr. 3(0.41 g)

Fr. 4(0.63 g)

Sephadex LH-20 (2×24)EtOH

16(90 mg)

Diaion HP-20 (3×36)MeOH-H2O (0:100–100:0), 70% aq. acetoneChromatorex ODS (2×20)MeOH-H2O (0:100–100:0)Sephadex LH-20 (2×24)MeOH-H2O (60:40–100:0)MeOH-70% aq. acetone (4:1, 3:2, 2:3)

19(98 mg)

18(19 mg)

15(116 mg)

Fresh leaves of C. japonica (80 g)

homogenized with Polyclar AT (80 g) and H2O (90 mL)filtration

crude enzyme (500 mL)

+aq. solution (400 ml) of pedunculagin (15) (1.0 g) and catechin (16) (300 mg)stirred f or 7 h at r. t.+EtOH (1.5 L)filtration and concentration

Sephadex LH-20 (6×30)MeOH-H2O (0:100–100:0), 70% aq. acetone

第 6

第

液の

質の

と 15その後

を分

15 と

子を構

Fig. 3-

0

200000

400000

600000

800000

1000000

Inte

nsit

y [µ

AU

]

項高分子

1 項におい

HPLC 分析

生成が推定

5 (1.0 g) と e後、反応液

画した (Ch17 に由来す

構成してい

-22 HPLC prof

Fig. 3-2

0.0 10.0

子フラクシ

て、pedunc析でベースラ

定された (Figepicatechin (をろ過、濃縮

hart 3-4)。高

するシグナル

いると考えら

file of oligomer

23 13C-NMR sp

20.0 30.0 Retention Time [min]

C

ションの組成

ulagin (15)ライン上の盛

g. 3-22)。そ

(17) (0.2 g) 縮してカラ

高分子フラク

ルが確認さ

られた (Fig.3

from 15 and 17

pectra of oligom

40.0 50.0 6

H-09 [MaxABS (200.0--550.0 n

- 38 -

成分析

をナシ果実

盛り上がり

こで次にそ

を 2 時間撹

ムクロマト

クションは 1

れたことか

3-23)。

7. Chart 3-4

mer fractions of

60.0

nm)]

Reaction mix

SephaMeOH

4 fractions

o

f iltereconce

extract

実ホモジネー

として検出

その分離を行

撹拌し、アセ

グラフィー13C-NMR に

から、この 2

Separation of r

f reaction mixtur

xture of 15 and 17 w

adex LH-20 (6×30)H-H2O (0:100–100:0

Fr. 5(328 mg)

ligomer f raction(56 mg)

edentrated

Sephadex Lacetone-7 Mremoval of

2 f ra

ートで反応さ

出される高分

行った。ナシ

トンを加えて

ーにより高分

による分析を

つの化合物

eaction product

re and Camellia

with Japanese pear ho

0), 70% aq. acetone

LH-20 (2×45)M urea (3:2, v/v, adju

urea by Diaion HP2

actions

させた際に、

分子と思われ

シのホモジネ

て反応を止

分子フラクシ

を行ったとこ

物が重合して

ts of peduncula

a leaves.

omogenate

usted to pH 2 with co20ss column chroma

反応

れる物

ネート

めた。

ション

ころ、

て高分

agin.

onc. HCl)atography

- 39 -

ツバキ葉中でも同様の反応が起こっていると考えて、ツバキ葉からの高分子ポリフェ

ノールの分離を行った。pedunculagin (15)が減少した 7 月のツバキの硬葉 (1.0 kg) を60%含水アセトン、次いでメタノールで抽出し濃縮後に不溶物をろ去した。ろ液を Chart 3-5 に示す各種クロマトグラフィーで分離することで、高分子ポリフェノールを得た (Fig. 3-25)。13C-NMR により分析すると、15 と 17 の反応により得られた高分子のシグ

ナルとよく似たシグナルを示した (Fig. 3-23)。

ellagic acid

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time [min]

0

200000

400000

600000

800000

1000000

Inte

nsit

y [µ

AU

]

CH-09 [MaxABS (200.0--550.0 nm)]

Fig. 3-25 HPLC profile of oligomer from Camellia leaves.

Chart 3-5 Separation of constituents of Camellia leaves

2% H2SO4

100 °C, 12 h

Fig. 3-24 Acid hydrolysis of 15

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time [min]

0

50000

100000

150000

200000

Inte

nsit

y [µ

AU

]

ellagic acid

Fig. 3-26 HPLC analysis of acid hydrolysis products ofoligomer of Camellia leaves.

15

Fresh leaves of Camellia japonica (1.0 kg)

extracted with 60% aq. acetone and MeOHconcentrated and f iltered

extract

Sephadex LH-20 (5×33)MeOH-H2O (0:100-100:0, v/v), 60% aq. acetone

Fr. 1 Fr. 2

Diaion HP20SS (5×21)MeOH-H2O (0:100-100:0, v/v), 60% aq. acetone

Fr. 2-1(31.92 g)

Fr. 2-2(12.13 g)

a part of Fr. 2-1(10.0 g)

Sephadex LH-20 (4×50)acetone-7 M urea (3:2, v/v, adjusted to pH 2 with concentrated HCl)

Fr. 2-1-1 2 f ractions

Diaion HP20SS (4×20)MeOH-H2O (0:100-80:20, v/v)

Fr. 2-1-1-1(740 mg)


Fr. 2-1-1-1-1oligomer f raction

(530 mg)

- 40 -

さらに、加水分解とチオール分解による構成成分の分析を行った。高分子ポリフェノー

ルにHHDP基が残存すれは加水分解するとエラグ酸が生成するはずである（Fig. 3-24）。そこで高分子ポリフェノールを酸加水分解して HPLC 分析したところ、エラグ酸のピー

クが検出された (Fig. 3-26)。したがって高分子ポリフェノールの構成ユニットにはエラ

ジタンニンが含まれていると推測された。一方、プロアントシアニジンはチオール類と共に酸性条件下で加熱すると、フラバン

3-オールの構成ユニットに断片化することができる 41) (Fig. 3-27)。そこで、ツバキ葉か

ら得られた高分子画分について、メルカプトエタノールを用いてチオール分解した結果、

主に 16、17 およびこれらのチオエーテルが生成した (Fig. 3-28)。以上の検討により、ツバキ葉の高分子ポリフェノールはエラジタンニンと 16 と 17 を

構成ユニットとするプロシアニジンであると推測され、ツバキ葉中の 15 の減少の一部

は 16 や 17 と高分子を形成することによると示唆された。

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

HSOH

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

+

SOH

HSOH

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

SOH

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

SOH

Fig. 3-27 Thiol degradation of oligomeric polyphenols of Camellia leaves.

dil. HCl 70 °C, 12 hr

catechin 4-thioether

catechin (16)

epicatechin 4-thioether

epicatechin (17)

Camellia leaves Fr. 2-1-1-1-1

dil. HCl 70 °C, 12 hr

procyanidins

- 41 -

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time

-0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

Inte

nsi

ty

CH-09 [MaxABS (200.0--550.0 nm)]

Fig. 3-28 HPLC analysis of thiol degradation products of oligomer of Camellia leaves.

17

16

catechin 4-thioether epicatechin 4-thioether

reagent

- 42 -

第 3 節ツバキ葉中のタンニン酸化生成物の探索

第 2 節において、pedunculagin (15) の酵素酸化により 18 と 19 が生成物として得られ

た。この反応がツバキ葉中でも実際に起こっているかを確かめるために、15 が減少し

始める 5 月のツバキ葉の成分分析を行った。


新鮮なツバキの新葉 1.0 kg を 70%含水アセトンで抽出した。得られたエキスはアセト

ンを留去後、不溶物をろ過して除き、Sephadex LH-20 により Fr. 1~Fr. 12 に分画した (Chart 3-6)。このうち Sephadex LH-20 の分離の際に 18 および 19 と類似の挙動を示す物

質をターゲットとしてさらにクロマト分離を繰り返して精製したところ、2 種類の化合

物が得られた。

第 2 項新化合物の構造解析と既知化合物の同定

化合物 23 は、[α]D30 −100.9 (MeOH) の褐色無結晶粉末として得られ、ESI-MS におい

て m/z 1085 に [M−H]−の擬分子イオンピークを示した。また、元素分析の結果、および13C-NMR スペクトルにおけるシグナルの数から分子式は C49H34O29と推測された。IR ス

ペクトルにおいて 3500～3000 cm-1の幅広い吸収帯と 1737 cm-1に強い吸収があり、この

ことから水酸基とカルボニル基があることが推測された。1H-NMR スペクトルは

flavan-3-ol 由来のシグナル δ 6.81 (1H, d, J=2.1 Hz, H-2′), δ 6.77 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5′), δ

Chart 3-6 Separation of constituents of C. japonica leaves

Fresh leaves of Camell ia japonica (1.0 kg)

homogenized with 70% aq. acetoneconcentrated and f ilteredSephadex LH-20MeOH-H2O (0:100–100:0), 60% aq. acetone

Chromatorex ODS0–100% MeOH

MCI gel CHP20P0–100% MeOH

23(42 mg)

24(87 mg)

6 fractions Fr. 7(1.44 g)

5 fractions

Fr. 7-1(135 mg)

Fr. 7-2(154 mg)

- 43 -

6.63 (1H, dd, J=8.4, 2.1 Hz, H-6′), δ 5.90 (1H, s, H-6), δ 4.84 (1H, d, J=6.9 Hz, H-2), δ 4.04 (1H, m, H-3), δ 2.70 (1H, dd, J=16.4, 7.2 Hz, H-4), δ

2.51 (1H, dd, J=16.4, 5.2 Hz, H-4) と

C-glucosidic ellagitannin由来のシグナル δ 6.66 (1H, s, G-ring H), δ 6.53 (1H, s, F-ring H), δ 6.46 (1H, s, E-ring H), δ 5.51 (1H, dd, J=3.3, 1.0 Hz, Glc H-3), δ 5.09 (1H, dd, J=8.7, 3.3 Hz, Glc H-4), δ 4.83 (1H, d, J=1.0 Hz, Glc H-2), δ 4.76 (1H, s, Glc H-1), δ 4.70 (1H, dd, J=12.3, 3.2 Hz, Glc H-6), δ 4.03 (1H, m, Glc H-5), δ 3.70 (1H, d,

J=12.3, Glc H-6) が観察された。糖の部分はその結合定数から開環型の glucose であるこ

とが示唆され、その H-1 と H-2 位の結合定数は J＜1 Hz で小さい値であったことから

glucose の 1 位は R 配置であると推定された 42) 。また、flavan-3-ol ユニットの H-2 と H-3との結合定数は J= 6.9 Hz を示したことから 23 の flavan-3-ol 部分は catechin (16)である

ことが推測された。Glucose の 2 位、3 位、4 位、6 位はケミカルシフトからそれぞれア

シル基がエステル結合していると考えられ

た。13C-NMR スペクトルにおいても catechinと ellagitannin 由来のシグナルが観察された。

Ellagitannin ユニットの 4 つの芳香環のうち 3つは HHDP 基と同様のケミカルシフトを示

した。一方、D 環部分 (Fig. 3-29)由来のシグ

ナルとして、酸素が結合したメチン炭素 δ 86.8 (CD-6)、アセタール炭素 δ 100.1 (CD-5)、1組の二重結合炭素 δ 137.9と 132.1 (CD-1, 2) 、2 つのカルボキシル炭素 δ 168.5, 162.7 (CD-4, 3) が観察された。次に HMBC、HSQC、1H-1H COSY スペクトルによる構造の検討を行

った。主要な HMBC スペクトルの相関を Fig. 3-30 に示す。HMBC スペクトルでは、δH 4.76 (Glc H-1)から δC 159.2 (catechin C-7), δC 152.1 (catechin C-8a), δC 137.9 (CD-1), δC 100.1 (CD-5), δC 86.8 (CD-6) に相関が認められた。また、δH 4.84 (catechin H-2)は δC 152.1 (catechin C-8a) と相関していた。このことから、glucose の 1 位と catechin の 8 位が C-C結合していることと D 環の構造が Fig. 3-29 に示すものであることが明らかになった。

また、catechin の A 環のケミカルシフト δ 103.0 (C-4a), δ 158.6 (C-5), δ 90.8 (C-6), δ 159.2 (C-7), δ 104.9 (C-8), δ 152.1 (C-8a) は camelliatannin G9) のものとよく類似しており、

catechin の 7 位と D 環の 6 位がエーテル結合していると推測された。D 環の 6 位の絶対

配置については、S 配置の分子モデルでは高度なひずみが生じるため、R 配置であると

決定した。また、CD スペクトルにおいて 257 nm に負のコットン効果、236 nm に正の


23


- 44 -

コットン効果が観察されたことから glucose 4, 6 位に結合する HHDP 基は S 配置である

ことが分かった。また、D-E 環のアトロプ異性については、R 配置では高度なひずみが

生じるため S 配置であると結論した。 D 環 C-5 の立体配置はスペクトルデータから決定できなかったため、(5R)-23 および

(5S)-23 の 13C-NMR ケミカルシフトについて DFT 計算を行った。配座探索および DFT最適化後、存在率が 1%を超える安定配座について 13C-NMR ケミカルシフト計算を行っ

た。その結果、(5R)-23 および (5S)-23 の計算結果いずれも実測値とよく一致しており、

違いは非常に小さかった (R2 = 0.9963 for 5R, R2 = 0.9962 for 5S)。しかし、DP434)では (5R)-23 の構造が 61.0%、DP4+35)では (5R)-23 の構造が 72.2%という結果が得られた。さ

らに、D 環部分について実測値と計算値との間の誤差を調べた結果、C-3, C-5, C-6 は

(5S)-23 よりも (5R)-23 の方が小さかった (Fig. 3-31)。以上の結果から、D 環 C-5 の立体

配置は R であると結論し、この化合物の構造を決定するとともに camelliatannin I と命名

した。

Fig. 3-31 Differences between experimental and calculated 13C-NMR chemical shifts of the D-ring moiety in 23. Δδ (ppm) = δcalcd. – δexptl. Calculations of NMR chemical shifts were performed at the mPW1PW91/6-311+G (2d, p) level in MeOH (23) (PCM) and linearly corrected for the experimental data.

-4

-2

0

2

4

6

δ cal

cd− δ e

xptl

(ppm

)

1 2 34 5

67

(5R)-23(5S)-23

- 45 -

Table 12 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data for 23 (δ in ppm, J in Hz).Position 1H 13C Position 1H 13C

1 4.76 (s) 50.6 1 - 125.7 b

2 4.83 (d, 1.0) 78.7 2 - 116.5

3 5.51 (dd, 3.3, 1.0) 75.5 3 - 144.8 a

4 5.09 (dd, 8.7, 3.3) 77.3 4 - 137.6

5 4.03 (m) 69.3 5 - 145.8 a

6a 3.70 (d, 12.3) 68.4 6 6.66 (s) 109.16b 4.70 (dd, 12.3, 3.2) 7 - 170.9

1 - 137.9 2 4.84 (d, 6.9) 82.22 - 132.1 3 4.04 (m) 68.03 - 162.7 4 2.51 (dd, 16.4, 7.2) 27.34 - 168.5 2.70 (dd, 16.4, 5.2)5 - 100.1 4a - 103.06 - 86.8 5 - 158.67 - 166.4 6 5.90 (s) 90.8

7 - 159.21 - 127.2 b 8 - 104.9

2 - 112.4 8a - 152.1

3 - 146.9 d 1' - 131.7

4 - 137.2 2' 6.81 (d, 2.1) 114.1

5 - 147.9 d 3' - 146.1

6 6.46 (s) 106.4 4' - 146.17 - 168.5 5' 6.77 (d, 8.4) 116.5

6' 6.63 (dd, 8.4, 2.1) 120.9

1 - 125.1 b

2 - 116.0

3 - 145.8 c

4 - 137.0

5 - 144.7 c

6 6.53 (s) 107.77 - 169.1

Measured in CD3OD. a–d )Assignments may be interchanged.

F-Ring

G-Ring

Catechin

Glucose

D-Ring

E-Ring

- 46 -

ツバキ葉から得られたもう一種の化合物 24 は、1H-および 13C-NMR スペクトルデー

タを文献値と比較することにより camelliatannin G9)と同定した。この化合物の D 環の 3位については絶対配置が決定されていなかったため、23 の場合と同様に 13C-NMR ケミ

カルシフト計算による C-3 の立体配置の決定を行った。(3R)-24 の場合と比べて、(3S)-24の計算結果の方が実測値とよく一致していた (R2 = 0.9954 for 3S; R2 = 0.9930 for 3R)。さ

らに、DP434)および DP4+35)においても (3S)-24 の構造が 100.0%という結果が得られた。

さらに、D 環部分について計算値と実測値との間の誤差を調べた結果、C-2 および C-5は明らかに (3S)-24 の方が小さい誤差であった (Fig. 3-33)。以上の結果から、C-3 の立

体配置は S であると結論した。


Fig. 3-33 Differences between experimental and calculated 13C-NMR chemical shifts of the D-ring moiety in 24. Δδ (ppm) = δcalcd. – δexptl. Calculations of NMR chemical shifts were performed at the mPW1PW91/6-311+G (2d, p) level in acetone (24) (PCM) and linearly corrected for the experimental data.

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

δ cal

cd− δ e

xptl

(ppm

)

12

34 5

67

(3S)-24(3R)-24

第 4

ツバ

章第

展開

分画

第 1

4 月

それ

去し

節ツバキ

バキ葉のエ

1 節)。エラ

して間もな

を行い、得

項成分の

月の新鮮なツ

ぞれ 70%エ

た後に一旦

キ新葉成分

ラジタンニ

ラジタンニン

ない先端部と

得られたフラ

の分離

ツバキの新葉

エタノールと

旦凍結乾燥し

Chart

分の比較

ニンの主成分

ンの代謝の全

、先端より

ラクションの

葉を、先端か

と 70%アセ

し、Diaion HP

t 3-7 Separati

- 47 -

分である 15全体像につい

りも成長して

の重量を比較

から 3 枚目ま

トンで抽出

P20SS で Fr

on of constituen

は、葉の成

いて検討する

ている葉に分

較した。

までの葉とそ

出した。得ら

r. 1~4 に分画

nts of Camellia

成長とともに

るため、4 月

分け、全く同

それより幹側

れた抽出液

画した (Cha

a leaves

に減少する月のツバキ新

同じ条件で抽

側の葉に分

液は有機溶媒

art 4-1)。

(第 3新葉を

抽出、

けて、

媒を留

- 48 -

得られた画分は TLC と HPLC 分析により、Fr. 1 は糖、Fr. 2 はエラジタンニン、Fr. 3 は

カテキンとプロシアニジン、Fr. 4 はサポニンとフラボノイドが主成分であることを確認

した。それぞれの画分の重さを比べたところ、成長した幹側の葉ではエラジタンニンを

含む Fr. 2 が減少し、カテキンとプロシアニジンを含むフラクションが増加していた。

この増加したフラクションにエラジタンニンの代謝物が含まれていると考え、TLC と

HPLC 分析した結果、増えた成分は高分子ポリフェノールであると推定された。そこで

さらに分離・精製を行って高分子ポリフェノール (Fr. 3-3-1) を分離した。

第 2 項成長に伴い増加する高分子ポリフェノールの分析

幹側のツバキ新葉から得られた葉の成長に伴い増加する高分子ポリフェノール (Fr. 3-3-1) の 13C-NMR スペクトルを測定した結果、カテコール型カテキン由来のシグナル

が認められた (Fig. 3-34)。高分子の構成ユニットがカテキン類と考えられたため、チオ

ール分解による分析を行った。チオール分解した結果、主にエピカテキン、カテキンお

よびそのチオエーテルが生成した (Fig. 3-36)。以上のことから、幹側のツバキ新葉の Fr. 3-3-1 はエピカテキン、カテキンを主な構成ユニットとするプロシアニジンであること

が分かった。

Fig. 3-34 13C-NMR spectrum for oligomer of Camellia leaves.

O

OR1OH

HO

OH

OH

HO

OH

O

OR2

OH

OH

O

OR1OH

HO

OH

OH

n

23

4

4a1ʹ

2ʹ3ʹ4ʹ

5ʹ

8a 6

6ʹ75

8

Measured in acetone-d6 + D2O

8

62

4

1ʹ8a

5ʹ

7 2ʹ

4a

1ʹ

5ʹ

2ʹ2

4

4a

8

67

2

34

4a

1ʹ

2ʹ

3ʹ4ʹ

5ʹ8a

6

6ʹ

75

8

- 49 -

Fig. 3-35 Thiol degradation of oligomeric polyphenols of Camellia leaves.

Fig. 3-36 HPLC analysis of thiol degradation products of oligomer of Camellia leaves.

dil. HCl

70 °C, 12 hr

dil. HCl

70 °C, 12 hr


catechin (16)


epicatechin (17)

Fr. 3-3-1



epicatechin-3-O-gallate 4-thioether

4-thioether of 17

4-thioether of 16

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

HS OH

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

+

S OH

HSOH

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

SOH

O

OH

O

OHOH

OH

HO

OH

OH

OH

OHHO

SOH

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time

-0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

Inte

nsi

ty

CH-09 [MaxABS (200.0--550.0 nm)]

17

reagent

16

- 50 -

Fr. 3-3-1 を加水分解し HPLC で分析を行ったところ、エラグ酸のピークが検出された (Fig. 3-38)。このことから 13C-NMR スペクトルでは確認は出来なかったが、Fr. 3-3-1 に

も微量ではあるがエラジタンニンが含まれていることが分かった。この実験で得られた

高分子ポリフェノールのスペクトルの特徴及びチオール分解の結果は、第 3 章第 2 節第

6 項で得られた高分子ポリフェノール (Fig. 3-25)のものと異なっていたが、その理由は

この実験で分離した高分子はDiaion HP20SSによる分離過程でより極性の低い画分から

得たためであると推測している。高分子ポリフェノールは HPLC でベースライン上の

20 分から 50 分までの幅広い盛り上がりとして検出されるが、その溶出位置によって組

成は異なる可能性がある。この高分子ポリフェノールについては今後さらに検討が必要

である。

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time

-0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

Inte

nsity

CH-09 [MaxABS (200.0--550.0 nm)]

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Retention Time

-0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

Inte

nsi

ty

CH-09 [MaxABS (200.0--550.0 nm)]

Fig. 3-37 HPLC profile of oligomer from Camellia leaves.

ellagic acid

Fig. 3-38 HPLC analysis of acid hydrolysis products

of oligomer of Camellia leaves.

- 51 -

小括

ツバキのエラジタンニンは葉の成長に伴って減少していることが分かった。このタン

ニンの代謝を化学的に解明すべく、ツバキ新葉の主要なエラジタンニンである

pedunculagin (15) を強いポリフェノール酸化酵素活性を持つナシ果実ホモジネートに

より酸化した。Pedunculagin (15) はナシ果実ホモジネートだけではほとんど反応しなか

ったが、ツバキ葉で共存する catechin (16) を加えると速やかに反応し減少した。反応生

成物を分離精製し、各種 NMR の手法を用いることで 15 の酸化生成物の構造を決定し、

pedunculagin Ox-1 (18)、pedunculagin Ox-2 (19) と命名した。この反応はナシ果実ホモジ

ネートの代わりにツバキ葉ホモジネートを用いた場合でも同様に起こった。 Strictinin (20) とナシ果実ホモジネートとを混合すると、15 の時とは異なり、16 を加

えなくても酸化が起こった。この理由は、2,3-HHDP 基がないために立体障害が少なく、

4,6-HHDP が直接酸化酵素による酸化を受けたと推測している。ここでも catechin (16) を加えると 20 の酸化速度が速くなった。Pedunculagin (15)の酸化に 16 が必須であり、

20 でも 16 の共存で反応が加速した理由は、4,6-HHDP 基よりも 16 が酸化を受けやすい

く、16 の酸化により生成した o-キノンが実際の酸化剤として 4,6-HHDP 基の酸化に寄与

しているためと考えられた。また、15 の酸化生成物と同時に生成していた高分子ポリフェノールは、ツバキ葉か

ら分離した高分子ポリフェノールと 13C-NMR スペクトルでよく類似した特徴を示して

おり、ツバキ葉中の高分子ポリフェノールの少なくとも一部はエラジタンニンとカテキ

ン・プロシアニジンが結合したものにより構成されていると推測され、ツバキ葉中の

15 の減少の一部は 16 や 17 とともに高分子を形成するからであると考えられたツバキ葉から 18 と 19 は分離されなかったが、ピロガロール環が同様の酸化開裂を起

こした化合物 23 と 24 が分離された。これらは分子内で glucose が HHDP 基と C-配糖体

型結合を形成し、カテキンの A 環と結合した後、酸化が起こって生成したものと考え

られ、高分子ポリフェノール生成時のプロシアニジンとの結合との関連が示唆された。ツバキ葉のエラジタンニンの代謝の全体像を理解するために展開して間もない先端

部と、より成長した幹側の部位に分け成分の比較をした。予想通り幹側の葉は先端の葉

に比べエラジタンニン類を含む画分は減少しており、カテキンを含む画分は増加してい

た。カテキンを含む画分の分離を行い、幹側の増加していた画分である高分子が得られ

た。この高分子画分の組成を調べたところ、主に 16 と 17 から構成されており、ツバキ

葉中では成長に伴って catechin類が重合し、プロシアニジンが増量することが分かった。

また、この高分子画分から微量のエラジタンニンも検出された。

- 52 -

総括

長崎県では五島地域の産業振興と地域活性化を目的としたツバキの産学官連携研究

を展開しており、その一環として茶葉とツバキ葉を用いた混合発酵茶が開発された。そ

の発酵茶には優れた血中中性脂肪軽減効果のあることが明らかにされている。本研究で

は、ツバキの成分に関する知見を広げるため、混合発酵茶中のツバキサポニンの定量と

ツバキ葉におけるエラジタンニン代謝の解明を目的として研究を行った。

第 1 章では、サポニン定量の標品として用いる camellioside A の分離精製を目的にツ

バキ花の成分分離を行った。サポニンは最終的に結晶化して精製し NMR スペクトルデ

ータを文献値と比較することにより camellioside A (1) と同定した。サポニン分離の過程

で新しいフラボノール配糖体 1 種を単離し、二次元 NMR スペクトルの解析と化学的検

討の結果に基づいて 8-methoxykaempferol (2′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (2)と決

定した。また、第 1 章ではツバキ葉に含まれアルドース還元酵素阻害活性を持つエラグ

酸誘導体硫酸エステル (4)がツバキ混合発酵茶に含まれていることを確認するととも

に、今後のツバキの資源植物としての利用を考えてこれまで精査されていないツバキ葉

とツバキ種子搾油滓のフラクションについて成分検討を行い、ツバキ葉からフラボノー

ルとその配糖体 3 種を、種子搾油滓からリグニン分解生成物等を分離した。

第 2 章ではツバキのサポニンを特異的に定量する方法を確立した。サポニンはえぐ味

を呈し胃粘膜保護作用などの機能性も有することから、茶ツバキ混合発酵茶の品質を管

理する上でサポニンの定量は重要である。ツバキ葉の主要なサポニンは camellioside Aであるため、混合発酵茶中の camellioside A を特異的にかつ簡便に定量する方法を開発

することを目標とした。Camellioside A は加水分解することで maragenin II となる。

Maragenin IIは 292nmに強い UV吸収を示すため、HPLCにより検出することができる。

この定量法により算出したツバキ葉のサポニン量は、実際にツバキ葉から抽出、分離し

たサポニンの量とほぼ一致したことから信頼性が高いと考えられる。また、操作が簡便

であることからツバキを用いた商品の品質管理にも応用できると考えられる。

第 3 章では、ツバキ葉におけるエラジタンニン代謝について研究を行った。ツバキの

葉の成分は 4 月と 7 月で大きく異なる。特に 4 月の若葉で主成分の pedunculagin (15) は成長に伴って減少し 7 月にはほとんど検出されない。その減少は葉が展開し始めてから

数週間のうちに起こっていることが明らかになった。その現象のメカニズムを化学的に

理解するために、15 が酸化的に分解していると推測して酵素酸化実験を行った。まず

15 を強いポリフェノール酸化酵素活性を持つナシ果実ホモジネート処理したが減少し

なかった。しかし、ツバキ葉で 15 と共に減少する catechin (16)を反応液中に共存させる

- 53 -

と 15 は速やかに減少した。次に反応混合物から生成物 2 種を分離し、2 次元 NMR スペ

クトルの解析や DFT 計算などの結果をもとに構造を決定して pedunculagin Ox-1 (18) とpedunculagin Ox-2 (19) と命名した。いずれも 15 の HHDP 基の芳香環が酸化的に開裂し

た物質であった。また、16 を加えたことで初めて 15 が酸化された理由は、HHDP 基よ

りも 16 が酸化を受けやすく、16 の酸化により生成した o-キノンが実際の酸化剤となっ

て HHDP 基の酸化に寄与しているためと考えられた。この反応はナシ果実ホモジネー

トの代わりにツバキ葉ホモジネートを用いた場合でも同様に起こった。 Strictinin (20) とナシ果実ホモジネートとを混合すると、15 の場合とは異なり、16 を

加えなくても反応が起こった。この理由は、2,3-HHDP 基がないために立体障害が少な

く、4,6-HHDP が直接酸化酵素による酸化を受けたと推測している。Catechin (16) を加

えると反応は加速された。 Pedunculagin (15) の酸化生成物と同時に生成する高分子ポリフェノールは、ツバキ葉

から分離した高分子ポリフェノールと類似する 13C-NMR スペクトルを与え、ツバキ葉

の高分子ポリフェノールの一部はエラジタンニンとカテキン・プロシアニジンが結合し

て生成していると推測された。したがって、ツバキ葉中の 15 の減少の一部は 16 や 17と高分子を形成することによることが示唆された。成長したツバキ葉に 18 と 19 が存在するかどうか検討したが検出できなかった。その

代わり、15 にカテキンが縮合した後に芳香環が類似の酸化開裂を起こした化合物 23 と

24 が分離された。このうち 23 は新化合物であり、camelliatannin I と命名した。ツバキ

葉中でもメカニズムは異なるが酸化的に 15 が減少していることが示唆された。エラジ

タンニンは非常に多くの植物に含まれているため、エラジタンニンの代謝過程を明らか

にすることは植物生理学的にも非常に重要な意義を持つと考える。また、ツバキ葉の成

長段階の異なる葉を用いて成分の比較を行った。成長した葉ではエラジタンニンの画分

が減少しており、カテキン類を含む画分が増加していた。さらに分析を進めると、増加

しているのは高分子ポリフェノールであることが分かった。その組成を 13C-NMR とチ

オール分解を用いて分析した結果、(+)-catechin (16) と(−)-epicatechin (17) を主な構成ユ

ニットとするプロシアニジン類が増加していることが分かった。また、この高分子から

も微量ではあるが、エラジタンニンの存在も確認された。

以上、著者はツバキの成分、ツバキサポニンの定量法の開発、ツバキエラジタンニン

の代謝について研究を行った。ツバキ葉、花の特徴的な機能性成分であるツバキサポニ

ンの定量法は、今後ツバキを有効利用する上で有用な手法と考えている。また、本研究

でツバキ葉の成長に伴ってエラジタンニンが代謝されることが明らかとなり、それが酸

化的代謝やプロシアニジン類との結合によるものであると推定したが、エラジタンニン

の生合成や代謝、さらに植物における本来の機能については未解明な点が多く残されて

いることから、今回著者が明らかにした知見は植物化学的にも意義がある。

- 54 -

謝辞

終わりに臨み、本研究の機会を賜り、終始御墾篤な御指導と御鞭撻を賜りました長崎

大学大学院医歯薬総合研究科河野功名誉教授および田中隆教授に衷心よりお

礼申し上げます。併せて、本研究の計画、実験、考察全般につきまして懇切な御指導および御助言をい

ただきました長崎大学大学院医歯薬総合研究科齋藤義紀准教授、松尾洋介助教に心か

ら感謝致します。特に、エラジタンニンの構造解析に当たって量子化学計算をしていた

だいた松尾洋介助教には重ねてお礼申し上げます。本論文の作成にあたり、貴重なご教示を賜りました尾野村治教授および田中正一教

授に感謝いたします。また、ツバキの採集にご協力いただき、混合発酵茶の材料を提供

していただいた長崎県農林技術開発センターの久林高市博士、田嶋幸一氏、宮田裕次博

士に深謝致します。さらに、本研究で数々の御協力をいただきました本学医歯薬学総合研究科山田耕史

准教授、前田一博士、並びに本学天然物化学研究室の諸氏に感謝致します。また、CD スペクトルの測定に御便宜をいただいた本学医歯薬学総合研究科田中正

一教授、核磁気共鳴スペクトル、質量分析スペクトルおよび元素分析を測定していただ

いた本学共同研究交流センター先端科学研究支援部門の稲田勝博氏、山口憲昭氏、津

田信明氏、地福寿史博士に感謝致します。本研究における計算の一部は、九州大学情報基盤研究開発センターの研究用計算機シ

ステムを利用させていただきました。ここに感謝致します。

平成 29 年 2 月辻田高明

- 55 -

実験の部

1H-および 13C-NMR スペクトルは Varian Unity plus 500 spectrometer (1H: 500 MHz, 13C:

125 MHz), JEOL JNM-AL400 spectrometer (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz) で測定した。ケ

ミカルシフトは溶媒ピーク (acetone-d6: δH 2.04, δC 29.8; pyridine-d5: δH 8.71, δC 149.9; CD3OD: δH 3.30, δC 49.0; CDCl3: δH 7.24, δC 77.0) を基準とする δ値 (ppm) で表し、結合

定数 J はHzで表した。シグナルの表示は次の略号で示した (s: singlet, d: doublet, t: triplet, dd: double doublet, m: multiplet, br: broad)。

FAB-MS は JEOL JMS-700N mass spectrometer で測定した。マトリックスは glycerol または m-nitrobenzyl alcohol を用いた。元素分析は Perkin-Elmer 2400 II analyzer を用いて測定した。IR スペクトルは JASCO

FT/IR-410 spectrophotometer、UV スペクトルは JASCO V-560 spectrophotometer、旋光度

は JASCO P-1020 digital polarimeter、CD スペクトルは JASCO J-725 spectropolarimeter を用いて測定した。

カラムクロマトグラフィーは Diaion HP-20 および MCI gel CHP20P (Mitsubishi Chemical Co.), Sephadex LH-20 (75-150 μm, Pharmacia Fine Chemical Co.), Chromatorex ODS (100-200 mesh, Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan), Silica gel 60 (Merck), TOYOPEARL

Butyl-650C (Tosoh Co.)を用いて行った。 TLC は Silica gel 60 F254 プレート (0.2 mm, Merck) [展開溶媒 : toluene-ethyl

formate-formic acid (1:7:1 or 1:5:2), CHCl3-MeOH-H2O (9:1:0.1 or 8:2:0.2 or 7:3:0.5),

hexane-acetone (1:1)] およびCellose F254プレート (0.1 mm, Merck) [展開溶媒 : 2% AcOH] を用いた。検出は UV ランプおよび 2% FeCl3-EtOH 試薬、または 5% H2SO4試薬で行っ

た。 HPLC による分析は Cosmosil 5C18-AR II カラム (250×4.6 mm, Nacalai Tesque Inc.,

Japan) を用い、検出は JASCO photodiode array detector MD-910 を用いて行った。本研究におけるコンピューターを用いた計算は、原則として下記の通り行った。配座

探索は Spartan′14 (Wavefumction, Inc., Irvine, CA)を用いて、MMFF94 力場を用いたモン

テカルロ法により行った。得られた 6 kcal/mol 以内の安定配座について、Gaussian 09 43)

を用いて DFT 最適化を行った [B3LYP/6-31G (d,p) level (PCM)]。ECD スペクトルの計

算は、Boltzman 分布において存在率 1%を超える配座にについて、TDDFT 計算 [CAM-B3LYP/6-31G (d,p) level in MeOH (PCM)] を行い相対ギブス自由エネルギーに基

づく Bolzman 分布にしたがって平均化した。NMR ケミカルシフトの計算も、Bolzmann分布において存在率が 1%を超える配座について GIAO 法を用いた DFT 計算 [mPW1PW91/6-311+G (2d,p) (PCM)] を行い、相対ギブス自由エネルギーに基づく Bolzmann 分布にしたがって平均化した。立体構造の図示には GaussView 44) を用いた。

- 56 -

第 1 章

第 1 節に関する実験

ツバキの花部 1 kg を MeOH (1% TFA) 2 L で抽出し、Chart 1-1 に示すカラムクロマト

グラフィーで分画精製した結果、1 (52 mg)および 2 (21 mg) が得られた。

Camellioside A (1) Colorless fine crystals (MeOH); Anal. Calcd for C53H84O247H2O: C, 51.70; H, 8.02. Found: C, 51.51; H, 8.39. 1H-NMR (pyridine-d5): δ 5.80 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1′′), 5.75 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1′′′), 5.15 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1′′′′), 4.88 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1′), 3.22 (1H, dd, J=11.5, 3.9 Hz, H-3), 1.30, 1.27, 1.20, 1.07, 0.94, 0.86, 0.78 (3H each, all s, H3-27, 23, 26, 24, 30, 29, 25).

8-Methoxykaempferol (2′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (2) Yellow amorphous powder. [α]D

24 -118.9 (c=0.20, MeOH). IR (dry film) cm-1: 3385, 2938, 1701, 1653, 1606, 1514, 1444. UV λmax (MeOH) nm (log ε): 360 (4.05), 315 (4.50), 275 (4.42), 223 (4.43), 206 (4.59). FAB-MS m/z: 625 [M+H]+. HR-FAB-MS m/z: 625.1553 (Calcd for C31H29O14: 625.1552). Anal. Calcd for C31H28O141.5H2O: C, 57.15; H, 4.80. Found: C, 57.07; H, 4.55. 1H-NMR and 13C-NMR data: see Table 1.

2 の加水分解と glucose の絶対配置の決定化合物 2 (10 mg) をマイティーバイアル内で MeOH と 2% aqueous H2SO4それぞれ 1

mL ずつに溶かし、2 時間、80 °C で加熱した。その後加熱後常温まで室温放置したのち

EtOAc を 2 mL 加えて転倒混和し、下層部分を Ba(OH)2で中和後、濃縮乾燥した。その

残渣、L および D-glucose に L-cysteine methyl ester (5 mg) を pyridine 1 mL に溶かしたも

のを加え、60 °C で 1 時間加熱した。その後、4-dimethylamino-1-naphthyl isothiocyanate (5 mg) をpyridine 0.5 mLに溶かしたものを各試料に加え、さらに60 °Cで1時間加熱した。

反応液をそれぞれ HPLC により測定した。HPLC の測定条件：カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4:96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)], 流速 0.8 mL/min、カラム温度 35 °C、検出波長：250 nm。試料溶液は 10 μL を注入する。その

結果、2 から得られた glucose の保持時間が 25.427 分、L-glucose が 25.253 分、D-glucoseが 25.453 分であった。これにより 2 の glucose を D-glucose と決定した。


ツバキ混合発酵茶 (茶葉：ツバキ葉=9：1) から得た Fr. 1-2 (9.54 g) を、Chart 1-2 に示

- 57 -

すカラムクロマトグラフィーで分画精製した結果、3 (6 mg)と 4 (6 mg) が得られた。

Vladinol F (3) Brown amorphous powder; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 6.99 (1H, d, J=2.0 Hz, H-4), 6.80 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5′), 6.78 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.72 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2′), 6.65 (1H, dd, J=8.3, 2.0 Hz, H-6′), 4.81 (1H, d, J=5.4 Hz, H-2), 4.27 (1H, m, H-3), 3.84 (2H, m, H-11), 3.54 (2H, t, J=6.8 Hz, H-10), 2.59 (2H, t, J=7.4 Hz, H-8), 1.78 (2H, m, H-9), 3.79 (3H, s, -OCH3), 3.77 (3H, s, -OCH3).

3, 3′, 4-Tri-O-methylellagic acid 4′-sulfate potassium Salt (4) Brown amorphous powder; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 8.31 (1H, s, H-5′), 7.70 (1H, s, H-5), 4.27 (3H, s, -OCH3), 4.13 (3H, s, -OCH3), 4.03 (3H, s, -OCH3).


ツバキ硬葉 (1.0 kg) を 60% acetone (5 L)で抽出してろ過を行い、ろ液と残渣に分けた。

残渣はさらに MeOH (5 L)で抽出し、ろ過を行い残渣とろ液に分けた。ろ液は合わせて

濃縮し Chart 1-3 に示すようなカラムクロマトグラフィーで分画精製した結果、5 (18 mg), 6 (4 mg), および 7 (21 mg)が得られた。

Quercetin 3-O-α-L–arabino-pyranoside (5) Yellow amorphous powder; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 7.74 (1H, d, J=2.2 Hz, H-2′), 7.56 (1H, dd, J=8.4, 2.2 Hz, H-6′), 6.85 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5′), 6.38 (1H, d, J=1.7 Hz, H-8), 6.18 (1H, d, J=1.7 Hz, H-6), 5.15 (1H, d, J=6.6 Hz, ara-H-1), 3.89 (1H, dd, J=8.4, 6.6 Hz, ara-H-2), 3.82 (1H, m, ara-H-4), 3.82 (1H, m, ara-H-5a), 3.64 (1H, dd, J=8.5, 3.2 Hz, ara-H-3), 3.44 (1H, m, ara-H-5b); 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz): δ 179.4 (C-4), 166.0 (C-7), 163.0 (C-5), 158.7 (C-2), 158.4 (C-8a), 149.9 (C-3′), 145.9 (C-4′), 135.6 (C-3), 123.0 (C-6′), 122.9 (C-1′), 117.4 (C-5′), 116.2 (C-2′), 105.6 (C-4a), 104.6 (ara-C-1), 99.8 (C-6), 94.7 (C-8), 74.1 (ara-C-2), 72.9 (ara-C-3), 69.1 (ara-C-4), 67.0 (ara-5).

Isoquercitrin 6′′-O-p-hydroxybenzoate (6) Yellow amorphous powder; 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.55 (2H, d, J=8.8 Hz H-2′′, 6′′), 7.51 (1H, br, H-2′), 7.51 (1H, br d, J=8.5 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5′), 6.69 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3′′, 5′′), 6.36 (1H, d, J=1.7 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 5.56 (1H, d, J=7.3 Hz, gal-H-1), 4.34 (1H, br d, J=10.3 Hz, gal-H-6a), 4.08 (1H, dd, J=11.8, 6.3 Hz, gal-H-6b), 3.42 (1H, m, gal-H-5), 3.33 (1H, m, gal-H-3), 3.30 (1H, m, gal-H-4), 3.27 (1H, m, gal-H-2); 13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz): δ 177.4 (C-4), 165.2 (C-7′′), 164.2 (C-7), 161.8

- 58 -

(C-4′′), 161.2 (C-5), 156.2 (C-2), 156.2 (C-8a), 148.5 (C-4′), 144.9 (C-3′), 132.9 (C-3), 131.1 (C-2′′, 6′′), 121.5 (C-6′), 121.0 (C-1′), 120.1 (C-1′′), 116.0 (C-5′), 115.2 (C-2′), 115.2 (C-3′′, 5′′), 103.8 (C-4a), 100.5 (gal-C-1), 98.8 (C-6), 93.5 (C-8), 76.4 (gal-C-3), 74.4 (gal-C-5), 74.0 (gal-C-2), 70.0 (gal-C-4), 63.2 (gal-C-6).

Quercetin (7) Brown amorphous powder; 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.67 (1H, br, H-2′), 7.53 (1H, br d, J=8.3 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5′), 6.40 (1H, br, H-8), 6.18 (1H, br, H-6).


ツバキ油粕 (2.1 kg) を hexane (3 L)により脱脂し、得られた残渣を MeOH (5 L)で抽出し

て濃縮した。濃縮液は H2O に懸濁して EtOAc と n-BuOH で順次溶媒分配した。EtOAc溶出画分に以前分離したツバキ油粕の CHCl3画分 (6.44 g) [ツバキ油粕 (302.95 g) をMeOH 600 mL と CHCl3: MeOH (3:1) 800 mL で順次抽出し、H2O 300 mL を加えて H2O 層

と CHCl3 層 (11.44 g)]を加え、hexane と MeOH で溶媒分配を行った。得られた MeOH画分を Chart 1-4 に示すようにカラムクロマトグラフィーで分画精製した結果、8 (60 mg), 9 (20 mg), 10 (30 mg), 11 (9 mg), 12 (30 mg), および 13 (7 mg) が得られた。

Oleic acid (8) Yellow oil; 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 5.32 (2H, m, H-9, 10), 2.31 (2H, t, J=7.5 Hz, H-2), 1.99 (4H, m, H-8, 11), 1.60 (2H, m, H-3), 1.24 (20H, m, H-4, 5, 6, 7, 12, 13, 14, 15, 16, 17), 0.85 (3H, t, J=7.1 Hz, H-18).

C-Veratroylglycol (9) Brown amorphous gum; [α]D

23 +141.4 (c=0.20, MeOH). FAB-MS m/z: 235 [M+Na]+. 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 7.57 (1H, dd, J=8.1, 2.2 Hz, H-6), 7.56 (1H, d, J=2.2 Hz, H-2), 6.87 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 5.10 (1H, dd, J=5.1, 3.9 Hz, H-8), 3.90 (3H, s, -OCH3), 3.88 (1H, dd, J=11.5, 3.9 Hz, H-9), 3.73 (1H, dd, J=11.5, 5.1 Hz, H-9); 13C-NMR (CD3OD,100 MHz): δ 199.6 (C-7), 153.8 (C-3), 149.2 (C-4), 128.1 (C-1), 125.1 (C-6), 115.9 (C-5), 112.5 (C-2), 75.5 (C-8), 66.2 (C-9), 56.4 (-OCH3).

Protocatechualdehyde (10) Brown amorphous powder; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 9.67 (1H, s, CHO), 7.29 (1H, br d, J=7.1 Hz, H-6), 7.28 (1H, br, H-2), 6.90 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5); 13C-NMR (CD3OD,100 MHz): δ 193.1 (CHO), 153.7 (C-4), 147.2 (C-3), 130.8 (C-1), 126.4 (C-6), 116.2 (C-5), 115.4 (C-2).

- 59 -

Paraben acid (11) Brown amorphous powder. 1H-NMR (acetone-d6,): δ 7.86 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2, 6), 6.80 (2H, d, J=8.6 Hz, H-3, 5).

Vanillin (12) yellow amorphous powder; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 9.73 (1H, s, CHO), 7.42 (1H, br, H-2), 7.42 (1H, br d, J=8.3 Hz, H-6), 6.93 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5), 3.90 (3H, s, -OCH3).

3,3′-Bisdemethylpinoresinol (13) Brown amorphous powder; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 6.79 (2H, d, J=1.8 Hz, H-2, 2′), 6.73 (2H, d, J=8.1 Hz, H-5, 5′), 6.67 (2H, dd, J=8.1, 1.8 Hz, H-6, 6′), 4.62 (2H, d, J=2.6 Hz, H-7, 7′), 4.19 (2H, m, H-9, 9′), 3.78 (2H, dd, J=9.0, 3.2 Hz, H-9, 9′), 3.07 (2H, m, H-8, 8′); 13C-NMR (CD3OD,100 MHz): δ 146.4 (C-3, 3′), 146.1 (C-4, 4′), 133.9 (C-1, 1′), 118.9 (C-6, 6′), 116.2 (C-5, 5′), 114.5 (C-2, 2′), 87.5 (C-7, 7′), 72.6 (C-9, 9′), 55.3 (C-8, 8′).

第 2 章


Camellioside A の加水分解時間の検討 Camellioside A (11.28 mg) を 10% aqueous H2SO4–1,4-dioxane (1: 1) 溶液 37.6 mLに溶解

した。この溶液を 7 つのスクリュー瓶に 5 mL ずつ分注し、1 つをコントロールとし、

それぞれ 100 °C で 0.5、1、2、3、4、5 時間加熱したのち HPLC で分析した。HPLC の

測定条件：カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 (CH3CN–50 mM H3PO4=70:30—100:0—100:0—70:30, 0 min—15 min—25 min—30 min)、流速 0.8 mL/min、カラム温度 35 °C。試料溶液は 10 μL を注入した。

Maragenin II の合成 Camellioside A (300 mg) に 7% aqueous H2SO4–1,4-dioxane (1:1) 溶液 5 mL を加え還流

下で 18 時間加熱した。その後、CHCl3で 3 度溶媒分配し、CHCl3層を Na2SO4で除水し、

ろ過した後、濃縮乾燥した。抽出物を silica gel [hexane–acetone (90:10—70:30)] により分

画し、maragenin II (52 mg) を得た。

Maragenin II の安定性の検討 Maragenin II (0.5 mg) に 10% aqueous H2SO4–1,4-dioxane (1:1) 溶液 5 mL を加えたもの

を7つ準備し、1つをコントロールとし、6つのサンプルをそれぞれ15, 30, 60, 90, 120, 180 分加熱したのち HPLC で分析した。HPLC の測定条件：カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6

- 60 -

mm×250 mm), 溶媒: グラジエント溶媒 (CH3CN–50 mM H3PO4=70:30—100:0—100:0— 70:30, 0 min—15 min—25 min—30 min)、流速 0.8 mL/min、カラム温度 35˚C。試料溶液は

10 μL を注入した。


ツバキサポニンの定量法試料をワーリングブレンダーで粉砕し、1 mm2の目のふるいにかけた。この試料粉末

100 mg に対して 10% aqueous H2SO4–1,4-dioxane (1:1) 溶液 5 mL を加えバイアル中に密

閉し、100 °C で 1 時間加熱した。その後、メンブランフィルターでろ過をして HPLCにより分析した。HPLC の測定条件：カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒: グラジエント溶媒 (CH3CN–50 mM H3PO4=70:30—100:0—100:0—70:30, 0 min—15 min—25 min—30 min)、流速 0.8 mL/min、カラム温度 35˚C。試料溶液は 10 μL を分析し

た。

サポニンフラクションの分画凍結乾燥したツバキの葉 10 g を還流下 MeOH 200 mL で 3 回抽出し、濃縮後、MCI gel

CHP20P [MeOH–H2O (40:60—100:0)] により 5 つの画分に分画した。そのうちのサポニ

ンを含む Fr. 4 (200 mg) を Chromatorex ODS [MeOH–H2O (50:50—100:0)] により精製し

てサポニンフラクション (182 mg) を得た。

第 3 章


HPLC によるツバキの葉の成分分析ツバキの葉 (2013/4/25 採集：Fig. 6) を 4 つの部位に分けて採取し、それぞれを 0.5 g/ 10 mL 60% EtOH で抽出し、HPLC により分析した。HPLC の測定条件：カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4:96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)]、流速 0.8 mL/min、カラム温度 35 °C、検出波長：250 nm。


Pedunculagin の酵素酸化反応 Pedunculagin (21.6 mg) を H2O 2 mL に溶解し、 2 つのバイアル瓶に 0.5 mL ずつ分注

し、一方には H2O 0.5 mL 一方には catechin 2.0 mg/ 2 mL H2O の溶液 0.5 mL を加え、さ

- 61 -

らに両方にナシ 30 g に 30 mL H2O を加えてミキサーにかけたものの濾液 1 mL を加え

て撹拌した。0 分、2 分、5 分、10 分、20 分、30 分後に 200 μL とり、400 μL の EtOHを加えてコスモナイスフィルターでろ過をして HPLC で分析した。HPLC の測定条件：

カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4:96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)]、流

速 0.8 mL/min、カラム温度 35 °C、検出波長：250 nm。

生成物 18、19 の分離 Pedunculagin 水溶液 1.08 g/ 100 mL H2O と catechin 水溶液 0.2 g/ 100 mL H2O とナシ果

実 100 g に H2O 100 mL を加えてミキサーにかけたものの濾液 100 mL を混ぜて撹拌し

た。2 時間後に acetone 900 mL を加えてから吸引ろ過をした。濾液を減圧下で 100 mLになるまで濃縮し、この溶液を Chart 3-1 に示すようにカラムクロマトグラフィーで分

画精製した結果、18 (7 mg)、19 (47 mg) が得られた。

Pedunculagin Ox-1 (18) Brown amorphous powder. [α]D

31 +16.6 (c=0.20, MeOH). IR (dry film) cm-1: 3418, 1745, 1729, 1716, 1616, 1358, 1189. UV λmax (MeOH) nm (log ε): 341 (3.42), 254 (4.04), 216 (4.36), 204 (4.35). FAB-MS m/z: 799 [M+H]+. Anal. Calcd for C34H22O233.5H2O: C, 47.04; H, 3.39. Found: C, 47.11; H, 3.18. 1H-NMR and 13C-NMR data: see Table 4.

Pedunculagin Ox-2 (19) Brown amorphous powder. [α]D

20 +1.15 (c=0.20, MeOH). IR (dry film) cm-1: 3390, 1739, 1730, 1714, 1614, 1359, 1182. UV λmax (MeOH) nm (log ε): 325 (3.87), 255 (4.33), 215 (4.60). FAB-MS m/z: 799 [M+H]+. HR-FAB-MS m/z: 821.0444 (Calcd for C34H22O23Na: 821.0443). 1H-NMR and 13C-NMR data: see Table 5.

Strictinin の酵素酸化反応 Strictinin (20.0 mg) を H2O 2 mL に溶解し、 2 つのバイアル瓶に 0.5 mL ずつ分注し、

一方には H2O 0.5 mL 一方には catechin 2.0 mg/ 2 mL H2O の溶液 0.5 mL を加え、さらに

両方にナシ 30 g に 30 mL H2O を加えてミキサーにかけたものの濾液 1 mL を加えて撹

拌した。0 分、2 分、5 分、10 分、20 分、30 分後に 200 μL とり、400 μL の EtOH を加

えてコスモナイスフィルターでろ過をして HPLC で分析した。HPLC の測定条件：カラ

ム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4:96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)]、流


- 62 -

生成物 21、22 の分離 Strictinin 水溶液 0.5 g/ 50 mL H2O とナシ果実 50 g に H2O 50 mL を加えてミキサーにか

けたものの濾液 50 mL を混ぜて撹拌した。30 分後に acetone (500 mL)を加えてから吸引

ろ過をした。濾液を減圧下で濃縮し、この溶液を Chart 3-2 に示すようにカラムクロマ

トグラフィーで分画精製した結果、21 (6 mg)と 22 (15 mg) が得られた。また、原料であ

る 20 (396 mg) が回収された。

Strictinin Ox-1 (21) Brown amorphous powder. [α]D

30 −68.5 (c=0.10, MeOH). IR (dry film) cm-1: 3413, 1713, 1616, 1509, 1450, 1324, 1203, 1046. UV λmax (MeOH) nm (log ε): 280 (4.51), 216 (4.91). ESI-MS m/z: 647 [M − H] −. HR-ESI-MS m/z: 647.0556 (Calcd for C27H19O19: 647.0526). CD (MeOH): ∆ε294 –4.31, ∆ε216 +27.2. 1H-NMR and 13C-NMR data: see Table 6.

Strictinin Ox-2 (22) Brown amorphous powder. [α]D

30 −19.4 (c=0.10, MeOH). IR (dry film) cm-1: 3399, 1712, 1613, 1453, 1616, 1361, 1201, 1044. UV λmax (MeOH) nm (log ε): 281 (4.47) , 219 (4.84). ESI-MS m/z: 647 [M − H] −. HR-ESI-MS m/z: 647.0522 (Calcd for C27H19O19: 647.0526). CD (MeOH): ∆ε331 –2.16, ∆ε280 +0.86, ∆ε215 +17.5. 1H-NMR and 13C-NMR data: see Table 7.

ツバキ葉の酵素による酸化反応新鮮なツバキの葉 80 g と Polyclar AT 80 g に精製水 (900 mL)を加えてミキサーにかけ、

得られた抽出液をろ過した。そのろ液のうち 500 mL に pedunculagin (15) 水溶液 1.0 g/ 200 mL H2O と catechin 水溶液 (16) 0.2 g/ 200 mL H2O を加えて 7 時間撹拌した後、1 Lの EtOH を加えて反応を止めた。反応液を減圧下で濃縮し、300 mL になったところで

TFA を 3 mL 加えた。この溶液を Chart 3-3 に示すカラムクロマトグラフィーで分画精製

した結果、15 (116 mg)、16 (90 mg)、18 (19 mg)、および 19 (98 mg) が得られた。

Pedunculagin の酵素酸化反応による生成物の高分子の分離 Pedunculagin 1.0 g/ 100 mL H2Oと epicatechin 0.2 g/ 100 mL H2Oとナシ果実 100 gに 100

mL H2O を加えてミキサーにかけたものの濾液を混ぜて撹拌した。2 時間後に acetone (900 mL) を加えてから吸引ろ過をした。濾液を減圧下で 100 mL になるまで濃縮し、こ

の溶液を Chart 3-4 に示すようにカラムクロマトグラフィーで分画精製した結果、高分

子の画分 (56 mg) が得られた。

Pedunculagin の酵素酸化反応による高分子生成物 Brown amorphous powder. IR (dry film) cm-1: 3390, 1730, 1615, 1517, 1446, 1325, 1230, 111, 1041. UV λmax (MeOH) nm : 269 (sh), 204.

- 63 -

ツバキ葉から高分子画分の分離ツバキ硬葉 (1.0 kg) を 60% acetone (5 L)で抽出してろ過を行い、ろ液と残渣に分けた。

この残渣をさらに MeOH (5 L)で抽出し、ろ過を行い残渣とろ液に分けた。分離したろ

液は合わせて濃縮し、Chart 3-5 に示すようにカラムクロマトグラフィーで分画精製した

結果、高分子の画分 (530 mg) が得られた。

ツバキ葉の高分子画分 (Fr. 21111) Brown amorphous powder. IR (dry film) cm-1: 3417, 1731, 1615, 1519, 1454, 1286, 1204, 1114, 1043. UV λmax (MeOH) nm : 274 (sh), 204.

ツバキ葉の高分子画分の加水分解試料 5 mg/ 3 mL 15% aq. H2SO4-dimethyl sulfoxide (1:2, v/v) を 90 °C で 5 時間加熱し、

コスモナイスフィルターでろ過をして HPLC で分析した。HPLC の測定条件：カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4:96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)]、流速 0.8 mL/min、カラム温度 35 °C、検出波長：250 nm。

ツバキ葉の高分子画分のチオール分解試料 5 mg を 1 mL 60% aq. EtOH に溶かし、その内 0.3 mL に ME 試薬 (2-mercaptoethanol-EtOH-dilute HCl-H2O, 2.5:27.5:4:16) 1.2 mL を加えて 70°C で 16 時間加

熱し、コスモナイスフィルターでろ過をして HPLC で分析した。HPLC の測定条件：カ

ラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4: 96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)]、流



ツバキ葉からの 23 と 24 の分離ツバキ新葉 1 kg を 70% acetone 4 L で 3 度抽出し、ろ過した後、ろ液を水になるまで

濃縮、ろ過をし、ろ液を Chart 3-6 に示すカラムクロマトグラフィーで分画・精製した

結果、23 (42 mg) と 24 (87 mg) が得られた。

Camelliatannin I (23) Brown amorphous powder. [α]D

30 −100.9 (c=0.10, MeOH). IR (dry film) cm-1: 3432, 1737, 1621, 1515, 1450, 1321, 1224, 1097, 1047. UV λmax (MeOH) nm (log ε): 279 (sh, 4.57), 234 (sh, 4.99), 212 (5.19). ESI-MS m/z: 1085 [M−H]−. HR-ESI-MS m/z: 1085.1114 [M−H]− (Calcd for C49H34O29: 1085.1113). CD (MeOH): ∆ε311 –3.39, ∆ε281 +3.06, ∆ε257 –14.4, ∆ε236 +16.8.

- 64 -

1H-NMR and 13C-NMR (CD3OD) data: see Table 6.

Camelliatannin G (24) Brown amorphous powder. 1H-NMR (CD3OD): δ 7.00 (1H, d, J=1.7 Hz, H-2′), 6.76 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5′), 6.72 (1H, dd, J=8.1, 1.7 Hz, H-6′), 6.69 (1H, s, HB), 6.48 (1H, s, HA), 6.44 (1H, s, HC), 5.91 (1H, s, H-6), 5.73 (1H, br, glc-H-2), 5.52 (1H, br d, J=4.1 Hz, glc-H-3), 5.10 (1H, dd, J=8.4, 4.1 Hz, glc-H-4), 5.06 (1H, br, H-2), 4.78 (1H, s, glc-H-1), 4.67 (1H, dd, J=12.3, 2.7 Hz, glc-H-6), 4.20 (1H, m, H-3), 4.04 (1H, dd, J=8.4, 2.7 Hz, glc-H-5), 3.58 (1H, d, J=12.3 Hz, glc-H-6), 2.84 (1H, dd, J=16.4, 4.5 Hz, H-4), 2.59 (1H, dd, J=16.4, 4.9 Hz, H-4).


ツバキ葉から高分子画分の分離 4 月の新鮮なツバキの新葉を、先端から 3 枚目までの葉とそれより幹側の葉に分けて、

それぞれ 70%含水エタノールと 70%含水アセトンで抽出した。得られた抽出液は水ま

で濃縮した後に凍結乾燥した。その後、各種カラムクロマトグラフィーで分画・精製し

た結果 (Chart 4-1)、幹側の葉から高分子画分 (242 mg) が分離された。

ツバキ葉から得られた高分子画分 (Fr. 331) Brown amorphous powder. IR (dry film) cm-1: 3392, 1615, 1521, 1445, 1362, 1285, 1246, 1207, 1112. UV λmax (MeOH) nm : 280, 204.

ツバキ葉の高分子のチオール分解試料 (5 mg) を 60% aq. EtOH 1 mL に溶かし、その内 0.3 mL に ME 試薬 (2-mercaptoethanol-EtOH-dilute HCl-H2O, 2.5:27.5:4:16) 1.2 mLを加えて 70 °Cで 16時間加

熱し、コスモナイスフィルターでろ過をして HPLC で分析した。HPLC の測定条件：カ

ラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4:96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)]、流


ツバキ葉の高分子の加水分解試料 (5 mg)を 15% aq. H2SO4-dimethyl sulfoxide (1:2, v/v) 3 mL に溶かし，90 °C で 5 時

間加熱し、コスモナイスフィルターでろ過をして HPLC で分析した。HPLC の測定条件：

カラム Cosmosil 5C18 AR II (4.6 mm×250 mm), 溶媒：グラジエント溶媒 [CH3CN–50 mM H3PO4 (4:96—30:70—75:25—75:25—4:96, 0 min—39 min—54 min—55 min—60 min)]、流


- 65 -

参考文献 1) Tamaru, S., Ohmachi, K., Miyata, Y., Tanaka, T., Kubayashi, T., Nagata, Y., Tanaka, K., J.

Agric. Food Chem., 61, 5817–5823 (2013). 2) Miyata, Y., Tamaru, S., Tanaka, T., Tamaya, K., Matsui, T., Nagata, Y., Tanaka, K., J. Agric.

Food Chem., 61, 9366–9372 (2013). 3) Yoshikawa, M., Morikawa, T., Asao, Y., Fujikawa, E., Nakamura, S., Matsuda, H., Chem.

Pharm. Bull., 55, 606–612 (2007). 4) Nakamura, S., Moriura, T., Park, S., Fujimoto, K., Matsumoto, T., Ohta, T., Matsuda, H.,

Yoshikawa, M., J. Nat. Prod., 75, 1425–1430 (2012). 5) Nguyen, T. P. T., Tran, M. H., To, D. C., Jin, C. K., Eun, H. K., Seong, E. J., Min, K. N.,

Young, M. L., Young, H. K., Jae, S. C., Byung, S. M., Bioorg. Med. Chem. Lett., 20, 7435–7439 (2010).

6) Kobayashi, K., Teruya, T., Suenaga, K., Matsui, Y., Masuda, H., Kigoshi, H., Phytochemistry, 67, 1385–1389 (2006).

7) Scoparo, C. T., de Souza, L. M., Dartora, N., Sassaki, G. L., Gorin, P. A. J., Iacomini,

M., J. Chromatogr. A., 1222, 29–37 (2012). 8) 川内美也子, 長崎大学大学院医歯薬学総合研究科修士論文 (2008).

9) Han, L., Hatano, T., Yoshida, T., Okuda, T., Chem. Pharm. Bull., 42, 1399–1409 (1994). 10) Aboutabl, E. A., Hashem, F. A., Sleem, A. A., Maamoon, A. A., Afr. J. Trad. CAM., 5, 18–

26 (2008). 11) Bonina, F., Puglia, C., Ventura, D., Aquino, R., Tortora, S., Sacchi, A., Saija, A., Tomaino,

A., Pellegrino, M. L., de Caprariis, P., J. Cosmet. Sci., 53, 321–335 (2002). 12) Fuchino, H., Satoh, T., Tanaka, N., Chem. Pharm. Bull., 44, 1748–1753 (1996). 13) Rychlinska, I., Gudej, J., Acta Pol. Pharm., 59, 53–56 (2002). 14) Prinz, S., Ringl, A., Huefner, A., Pemp, E., Kopp, B., Chem. Biodivers., 4, 2920–2931

(2007).

15) Tanaka, T., Nakashima, T., Ueda, T., Tomii, K., Kouno, I., Chem. Pharm. Bull., 55, 899–901 (2007).

16) Ueda, H., Kawanishi, K., Moriyasu, M., Biol. Pharm. Bull., 27, 1584–1587 (2004). 17) Tan, R. X., Jakupovic, J., Jia, Z. J., Planta Med., 56, 475–477 (1990). 18) Terashima, S., Shimizu, M., Nakayama, H., Ishikura, M., Ueda, Y., Imai, K., Suzui, A.,

Morita, N., Chem. Pharm. Bull., 38, 2733–2736 (1990). 19) Simon, A., Chulia, A. J., Kaouadji, M., Allais, D. P., Dlage, C., Phytochemistry, 32, 1045–1049

(1993).

20) Mohamed, S. M., Fatma, A. M., Eman, G. H., Magda, T. I., Osama, A. B., Phytother. Res. 20,

200–205 (2006).

- 66 -

21) 前田一, 公立林業試験研究機関研究成果選集, 11, 81–82 (2014).

22) Pinheiro, M. L. B., Xavier, C. M., de Souza, A. D. L., Rabelo, D. M., Batista, C. L., Batista, R. L., Costa, E. V., Campos, F. R., Barison, A., Valdez, R. H. Ueda-Nakamura, T.,

Nakamura, C. V., J. Braz. Chem. Soc., 20, 1095–1102 (2009). 23) Kijjoa, A., Pinto, M. M. M., Anantachoke, C., Gedris, T. E., Herz, W., Phytochemistry, 40, 191–

193 (1995).

24) Kang, H. S., Choi, J. H., Cho, W. K., Park, J. C., Choi, J. S., Arch. Pharm. Res. 27 742–750

(2004).

25) Waibel, R., Benirschke, G., Benirschke, M., Achenbach, H., Phytochemistry, 62, 805–811

(2003).

26) Zhou, Z. H., Zhang, Y. J., Xu, M., Yang, C. R., J., Agric. Food Chem., 53, 8614–8617 (2005).

27) Tanaka, T., Mine, C., Inoue, K., Matsuda, M., Kouno, I. J., Agric. Food Chem., 50, 2142–2148 (2002).

28) Michinobu, T., Hiraki, K., Fujii, N., Shikinaka, K., Katayama, Y., Masai, E., Nakamura, M.,

Otsuka, Y., Ohara, S., Shigehara, K., Bull. Chem. Soc. Jpn., 84, 667–674 (2011). 29) Menashe, N., Shvo, Y., J. Org. Chem., 58, 7434–7439 (1993). 30) Era, M., Matsuo, Y., Shii, T., Saito, Y., Tanaka, T., Jiang, Z. H., J. Nat. Prod., 78, 2104–

2109 (2015).

31) Lodewyk, M. W., Siebert, M. R., Tantillo, D. J., Chem. Rev., 112, 1839–1862 (2012). 32) Willoughby, P. H., Jansma, M. J., Hoye, T. R., Nat. Protoc. 9, 643–660 (2014). 33) Grimblat, N., Sarotti, A. M., Chem. Eur. J. 22, 12246–12261 (2016).

34) Smith, S. G., Goodman, J. M., J. Am. Chem. Soc. 132, 12946–12959 (2010). 35) Grimblat, N., Zanardi, M. M., Sarotti, A. M., J. Org. Chem. 80, 12526–12534 (2015). 36) Subramanian, N. Venkatesh, P., Ganguli, S., Sinkar, V. P., J. Agric. Food Chem., 47, 2571–

2578 (1999). 37) Nakayama, T., Ichiba, M., Kuwabara, M., Kajiya, K., Kumazawa, S., Food Sci. Technol.

Res., 8, 261–267 (2002). 38) Akagawa, M., Shigemitsu, T., Suyama, K., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2632–2640

(2003).

39) Nugroho, A. E., Morita, H., J. Nat. Med., 68, 1–10 (2014). 40) Li, X. C., Ferreira, D., Ding, Y., Curr. Org. Chem., 14, 1678–1697 (2010). 41) Tanaka, T., Takahashi, R., Kouno, I., Nonaka, G., J. Chem. Soc. Perkin. Trans., 1, 3013–

3022 (1994).

42) Hatano, T., Shida, S., Han, L., Okuda, T., Chem. Pharm. Bull., 39, 876–880 (1991). 43) Frisch, M. J., Trucks, G. W., Schlegel, H. B., Scuseria, G. E., Robb, M. A., Cheeseman, J. R.,

Scalmani, G., Barone, V., Mennucci, B., Petersson, G. A., Nakatsuji, H., Caricato, M., Li, X.,

- 67 -

Hratchian, H. P., Izmaylov, A. F., Bloino, J., Zheng, G., Sonnenberg, J. L., Hada, M., Ehara, M.,

Toyota, K., Fukuda, R., Hasegawa, J., Ishida, M., Nakajima, T., Honda, Y., Kitao, O., Nakai, H.,

Vreven, T., Montgomery, J. A. Jr., Peralta, J. E., Ogliaro, F., Bearpark, M., Heyd, J. J., Brothers,

E., Kudin, K. N., Staroverov, V. N., Kobayashi, R., Normand, J., Raghavachari, K., Rendell, A.,

Burant, J. C., Iyengar, S. S., Tomasi, J., Cossi, M., Rega, N., Millam, M. J., Klene, M., Knox, J.

E., Cross, J. B., Bakken, V., Adamo, C., Jaramillo, J., Gomperts, R., Stratmann, R. E., Yazyev,

O., Austin, A. J., Cammi, R., Pomelli, C., Ochterski, J. W., Martin, R. L., Morokuma, K.,

Zakrzewski, V. G., Voth, G. A., Salvador, P., Dannenberg, J. J., Dapprich, S., Daniels, A. D.,

Farkas, O., Foresman, J. B., Ortiz, J. V., Cioslowski, J., Fox, D. J., Gaussian 09, Revision C.01,

Gaussian, Inc.: Wallingford, CT, (2010).

44) Dennington, R., Keith, T., Millam, J. GaussView, Version 5.0.9.

naosite: nagasaki university's academic output...

Documents