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MutaREAL ACE Version 2.0 / April 2017 KF290032 KF290096 32 96 Nur für in-vitro Diagnostik Real-Time PCR Kit Real-Time PCR Kit für die Analyse des Insertions/Deletions Polymorphismus im ACE Gen auf Basis der FRET Technologie für den LightCycler® 1.5 und 2.0 ® Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Deutschland www.immundiagnostik.com Tel.: +49 (0)6251/ 701900 [email protected] Fax: +49 (0)6251/ 849430

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MutaREAL ACE

Version 2.0 / April 2017

KF290032

KF290096

32

96

Nur für in-vitro Diagnostik

Real-Time PCR Kit

Real-Time PCR Kit für die Analyse des Insertions/DeletionsPolymorphismus im ACE Gen auf Basis der FRET Technologie

für den LightCycler® 1.5 und 2.0

®

Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Deutschlandwww.immundiagnostik.com Tel.: +49 (0)6251/ [email protected] Fax: +49 (0)6251/ 849430

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© 2017 Immundiagnostik AG / Version 2.0

MutaREAL® ACE

Inhaltsverzeichnis

1 Verwendungszweck 3

2 Einleitung 3

3 Testprinzip 3

4 Kitbestandteile 4

5 Erforderliche Materialien 4

6 Lagerung und Haltbarkeit 4

7 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 4

8 Testdurchführung 5

8.1 PCR Produktherstellung 5

8.2 PCR Protokoll 6

9 Auswertung 6

10 Troubleshooting 7

11 Grenzen des Tests 7

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MutaREAL® ACE

1 Verwendungszweck

Das ACE Real-Time PCR-Kit ist ein FRET-basierter Test für die Untersuchung desInsertions/Deletions-Polymorphismus im ACE Gen.

2 Einleitung

Das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) stellt den wichtigsten Regulator im Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) dar. Es wandelt Angiotensin 1 in diephysiologisch aktive Form Angiotensin 2 um, welches eine stark vasokonstriktorische(gefäßverengende) Wirkung hat. Auf diese Weise erhöht ACE den Blutdruck. Der imACE-Gen vorhandene Insertions/Deletions-Polymorphismus ist mit der Menge anzirkulierendem ACE assoziiert und beeinflusst dadurch das Risiko für kardiovaskuläreErkrankungen. Referenzen:

Rahimi et al., J Nephropathol., 2012, 1(3):143-151

3 Testprinzip

Dieser sequenzspezifische Detektionsansatz basiert auf dem Fluoreszenz ResonanzEnergie Transfer (FRET). Der Assay beinhaltet zwei spezifische Primer, die dieZielsequenz flankieren und zwei Hybridisierungssonden, die benachbart an dieZielsequenz binden. Eine der Hybridisierungssonden ist mit einem Donor-Fluorophormarkiert und überträgt nach entsprechender Anregung seine Energie auf das Akzeptor-Fluorophor, mit welchem die andere Hybridisierungssonde markiert ist, wenn diese sich inunmittelbarer Nähe befinden. Nach dem Energietransfer emmitiert der Akzeptor-FarbstoffLicht mit einer längeren Wellenlänge. Ein Energietransfer kann nur stattfinden, wenn beideHybridisierungssonden an die Zielsequenz gebunden haben. Die Menge hybridisierterSondenpaare und damit das Fluoreszenzsignal steigt mit der Menge des amplifiziertenPCR Produktes. Hierbei ist das Fluoreszenzsignal proportional zur Menge des PCRProduktes.

Die Genotypisierung wird nach Abschluss der Amplifikation durch eineSchmelzkurvenanalyse durchgeführt. Hierfür wird nach einem Denaturierungsschritt dieTemperatur langsam erhöht und unter kontinuierlicher Messung der Fluoreszenz dasDissoziationsverhalten der Hybridisierungssonden erfasst. Eine derHybridisierungssonden bindet an einen Teil der Zielsequenz, der bei Wildtyp und derMutation vorliegt. Die zweite Hybridisierungssonde überspannt die Mutationsstelle. Beisteigender Temperatur dissoziieren die fehlgepaarten und damit weniger stabilen Sondenzuerst und die Fluoreszenz nimmt ab. Die perfekt gepaarten Hybridisierungssondendissoziieren aufgrund ihrer höheren Bindungsenergie erst später und somit nimmt dasFluoreszenzsignal erst bei einer höheren Temperatur ab.

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MutaREAL® ACE

4 Kitbestandteile

ACE Real-Time PCR-Kit Volumen

Reagenz 32er Kit 96er Kit

Enzyme Mix (blauer Deckel) 438 µL 3 x 438 µL

Detection Mix (gelber Deckel) 368 µL 3 x 368 µL

Positive Control (roter Deckel) 15 µL 45 µL

Negative Control (grüner Deckel) 50 µL 100 µL

5 Erforderliche Materialien

Benötigte Materialien - nicht mitgeliefert:Roche LightCycler® 1.5 oder 2.0 Real-Time PCR-Systemo Die CE Konformität besteht nur, wenn eins der genannten Gerät verwendet

wird.LightCycler® Kapillaren, Roche

LightCycler® Cooling Block, Roche

Pipetten (0,5 – 200 µl)o 0,5 - 10 µLo 10 - 200 µL

1,5 mL Reaktionsgefäße (steril)

6 Lagerung und Haltbarkeit

Alle Reagenzien sollen bis zum unmittelbaren Gebrauch bei -20 °C gelagertwerden.Mehrfache Gefrierzyklen sind zu vermeiden (wenn nötig, Aliquots herstellen).

Die Detektionsmixe unbedingt vor Lichteinwirkung schützen.

7 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen

Die Vorschriften und Grundsätze für molekularbiologisches Arbeiten müssen eingehaltenwerden.

Die Arbeitsschritte zügig durchführen.

Alle PCR Reagenzien während des Arbeitens kühlen.

Die Reinheit (A260/A280) der genomischen DNA sollte zwischen 1,8 und 2,0liegen.

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MutaREAL® ACE

8 Testdurchführung

8.1 PCR Produktherstellung

Alle Kitbestandteile schonend auftauen lassen, vorsichtig vor dem Benutzendurchmischen (nicht vortexen) und kurz anzentrifugieren. Den Detektionsmix vorLichteinwirkung schützen. Während der Arbeiten alle PCR Reagenzien und den PCRAnsatz kühlen.

Für die Amplifikation wird ein Reaktionsgefäß (Typ abhängig vom verwendeten Gerät) proProbe und zwei zusätzliche Reaktionsgefäße für die negative und die positive Kontrollebenötigt. Die folgende Tabelle zeigt die zu pipettiernden Volumen pro Probe. Für dieAnalyse wird empfohlen ein Mastermix für die Anzahl an Proben (inkl. negativer undpositiver Kontrolle) (N) plus 10 % herzustellen, um Ungenauigkeiten auszugleichen. DerMastermix wird wie im Folgenden beschrieben pipettiert:

Reagenz Volumen pro 25 µL-Reaktionsansatz

Master Mix Volumen

Detection Mix (gelber Deckel) 10,5 µL 10,5 µL * (N + 0,1)

Enzyme Mix (blauer Deckel) 12,5 µL 12,5 µL * (N + 0,1)

Den Mastermix vorsichtig durch auf- und abpipettierten oder durch Invertierendurchmischen und kurz anzentrifugieren. In jede Kapillare/Well 23 µL desMastermix vorlegen.Für die negative Kontrolle 2 µL von der mitgelieferten negativen Kontrolle (grünerDeckel) dazugeben.

Für die positive Kontrolle 2 µL von der mitgelieferten positiven Kontrolle (roterDeckel) dazugeben.

Für die zu analysierenden Proben jeweils 2 µL der Proben-DNA in dasentsprechende Reaktionsgefäß dazugeben.

Die Kapillaren mit den Deckeln verschließen, in das LightCycler® Karusel überführen undin der LightCycler® Zentrifuge abzentrifugieren (sollte eine Tischzentrifuge verwendetwerden die Kapillaren in den Einsätzen des Cooling Blocks bei 3000 rpm für 15 szentrifugieren). Anschließend das Karusel in den LightCycler® überführen und das unter8.2 beschriebene PCR Programm starten.

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8.2 PCR Protokoll

Schritt Temperatur [°C] Zeit [s] Heizrate [°C/s] Zyklen Acquisition

InitialeDenaturierung

94 120 max. 1 x keine

Denaturierung 94 10 max.

45 x

keine

PrimerAnlagerung

57 25 max. Single

Elongation 72 25 max. keine

Schmelzkurve

94 15 max. 1 x keine

40 15 max. 1 x keine

80 0 0,2 1 x Konstant

Kühlen 40 30 max. 1 x ---

9 Auswertung

Für die Auswertung der Schmelzkurven eine Analyse des Typs "Genotypisierung"hinzufügen. Hierdurch wird die Ableitung der Fluoreszenzkurve gebildet. DieDetektionswellenlänge liegt zwischen 610 nm und 640 nm (entsprechend desverwendeten Real-Time Geräts).

Temperatur Deletion: 50,0 °C (+/-2 °C)Temperatur Insertion: 59,0 °C (+/-2 °C)

Die folgende Grafik zeigt die typischen Ergebnisse für die möglichen Genotypen: blaueKurve - negative Kontrolle, schwarze Kurve - homozygote Insertion, rote Kurve -Heterozygot Deletion/Insertion, grüne Kurve - homozygot Deletion.

Die mitgelieferte positive Kontrolle enthält ein Template, das für den Insertions/Deletions-Polymorphismus heterozygot ist.

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10 Troubleshooting

Problem Lösung

Kein oder schwacheFluoreszenz bei derPositivkontrolle oder denProben

Überprüfung des PCR Programms des Real-Time-PCR-Systems und Wiederholung der Analyse mit demkorrigierten Protokoll.

Die PCR Reagenzien haben mehr als zwei Gefrierzyklenoder wurden länger als vier Tage bei 2-8 °C gelagert.Wiederholen sie die Analyse mit einem frischen Aliquotoder neuen PCR Reagenzien.

Die Qualität der Ausgangs-DNA ist nicht ausreichend.Nutzen sie frisch extrahierte DNA und bestimmen Sie dieKonzentration/Reinheit vor der Nutzung.

Die Detektionsmixe wurden nicht vor Lichteinwirkunggeschützt. Wiederholen sie die Analyse mit einemfrischen Aliquot oder neuen PCR Reagenzien.

11 Grenzen des Tests

Das Ergebnis wird dem behandelnden Arzt als unterstützendes Material zur Verfügunggestellt und sollte niemals ausschließlich zur Diagnostik oder zuBehandlungsempfehlungen herangezogen werden. Die Diagnose sowie dieeinzuleitenden Behandlungsentscheidungen bleiben in der vollen Verantwortung desArztes.

Die Genauigkeit von genetischen Tests beträgt nicht 100 %. Es wurde jedoch eineGenauigkeit von über 98 % basierend auf den Validierungsdaten für diesen Testfestgestellt. Weiterhin müssen Ergebnisse von genetischen Tests im Kontext derklinischen Repräsentation des Patienten sowie bekannten familiären Risiken im Umfelddes Patienten betrachtet werden.

Der Test analysiert nur eine Auswahl an Markern. Daher schließt ein negativesTestergebnis des Patienten ein Risiko jedweder Art nicht vollständig aus.


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Eppendorf Reference · 3 Reference variabel / Reference variable 0.1 – 2.5 µl 0.5 – 10 µl 2–20µl 10 – 100 µl 20 – 200 µl 100 – 1000 µl 500 – 2500µl Reference

In vivo sledování doxorubicinu ve svalové tkáníweb2.mendelu.cz/af_239_nanotech/data/phd/2.seminar.pdf · Chicken muscle tissue ... Max intensity 50 µl 400 µl 100 µl 150 µl

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20202017 ALEXMK2 Quick Guide A4...ALEX2 Stop Solution 8 Min 100 µL 400 µL 100 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL Title 20202017_ALEXMK2_Quick_Guide_A4 Created Date 2/17/2020

1 mL Distilled water · 1 mL-10 µL-10 µL Triglycerides (mg/dl) = Reagent R1 Distilled water Calibrator Sample Blank 300 µL 3 µL-300 µL--3 µL Standard 300 µL 3 µL - - TRGG

Thermo Scientific ClipTip Pipetting System · When Thermo Scientific ... • F1-ClipTip 12-ch 1-10 µL 1-10 µL 0.02 µL 4661220N 12.5 Ext µL Tips* Packaging

2. * 2009 6 · 450 nm 440 nm 460 nm 630 nm 30 1A, (1B) 1C 1F 1G 12H 1 101 2 50 µL 50 µL 50 µL 3 1 15 30 1 4 5 5 50 µL 50 µL 6 2 15 30 1 7 5 8 50 µL 9 15 30 30 10 50 µL 11 450

U N O- NCOL M O M G I Y PD1/PD-L1 BINDING ASSAY · Inhibitor Tag1-PD-L1 Tag2-PD1 Anti-Tag1- Cryptate Anti-Tag2- XL665 Diluent Detection buffer Sample 2 µL 4 µL 4 µL 5 µL 5 µL

PapilloCheck - GBO · Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu4 0,5 µL - 10 µL 0,5 µL - 20 µL 10 µL - 100µL 10µL - 200 µL 100 µL - 1000 µL 765 288 774 288 772 288

MultiPurpose Sampler MPS MPS robotic MPS liquid · MultiPurpose Sampler MPS MPS robotic MPS roboticpro MPS liquid. 2 ... 50 µL 100 µL 250 µL 500 µL ... 500 l 1100111-805-00

1.Set up 110 µl mix for each primer/DNA combo on ice! 1.1.1 µl 100x F primer (1 pMol/µl = 1µM final []) 2.1.1 µl 100x R primer 3.11 µl 10x PCR buffer 4.2.2