MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI

MUTAGÉNAz emberi szervezetre, annak természetes és mesterséges környezetéből nagyszámú toxikus tényező fejtheti ki hatását, melyek egy része a sejtek genetikai állományát is károsítja!

Egyik lehetséges mód: MUTÁCIÓ

Watson és Crick 1953: DNS kettős spirálszerkezetének és önreprodukciós képességének kimutatása

DNS kettős spirál szerkezete

Szemikonzervatív replicatio: DNS sejtosztódás előtti megkettőződéseSzemikonzervatív, mert az egyik lánc az eredeti DNS molekulából származik a másik újonnan szintetizálódikDNS replicatio során létrejöhetnek „hibák” mutációk következő megkettőződéssel továbbadódik, ha nem keletkezik ellentétes mutáció (reserv) Mutáció a genom megváltozásaGyakorlati szempontból: pontmutáció, kromoszóma aberratioA legtöbb mutáció spontán és váratlan

DNS-molekula

szemikonzervatív

replicatioja

Benignus polimorfizmusA kimutatott mutációnak ‘nincs’ klinikai

relevanciájaGenetikai értelemben akkor használjuk, amikor

olyan mutációt takar, amelyek genetikailag még nem mutathatók ki azon egyéneknél akiknél a klinikai relevanciák megtalálhatók

Kockázati mutációA betegség kialakulását nem okozza, de a

betegség kialakulásához hozzájárul a jelenléte

Mutáció szűrési módszerekA mutáció szűrési eljárások során keressük a betegséget /

szindrómát okozó mutációt, vagyis a mutáció elváltozás / betegség kapcsolatot derítjük fel!

Linkage analízis: Eltérő DNS polimorfizmusokat keresünk a beteg és a kontroll DNS-ében

Ismert mutáció kimutatása: annak eldöntésére végezzük, hogy az illető a kérdéses megbetegedésben szenved-e, vagy annak kockázatát hordja-e a génszerkezetében

Ez a leggyakrabban használt eljárásA betegségért felelős mutáció keresése:Keressük az adott

betegségben szenvedők adott génjében azokat a mutációkat, amelyek csak a betegeknél mutathatók ki

A betegségért felelős mutáció(k) keresési

stratégiájaA gén adott szakaszait PCR reakcióval amplifikáljuk

Az így nyert DNS-ben mutáció szűrési eljárásokkal mutációt keresünk

A mutációt nukleotid szekvencia analízissel azonosítjuk

Vizsgáljuk, hogy a talált mutáció benignus polimorfizmus, vagy betegségért felelős mutáció

Vizsgáljuk a mutáció hatását a DNS szekvenciára, aminosav összetételre, fehérje szerkezetre

Mutáció szűrési eljárásokDGGE: Denaturáló grádiens gél elektroforéziseTGGE: Hőmérséklet grádiens gél elektroforéziseSSCP: Egyszálú DNS konformációs változataiHeteroduplex analízisCFLP:Heteroduplexek vágása

1.Kémiai módszerrel történő vágás 2.Enzimatikus módszerrel történő vágás 3.Speciális enzimmel történő vágás

Mismatch binding proteinek kötődésén alapuló eljárásPTT

TGGE: Hőmérséklet grádiens gél elktroforézise

SSCP: Egyszálú DNS konformációs változatai

A mutáció azonosítása nukleotid szekvencia analízissel

1.A kérdéses gén szakaszról PCR segítségével másolatot készítünk

2.A PCR azonosságát és tisztaságát ellenőrizzük

3.Nukleotid szekvencia meghatározás4.A szekvenálást mindkét irányból el kell

végezni5. A mutáns és kontroll szekvenciájának

összehasonlítása

PCR: polimeráz láncreakció

Heterozigóta mutáció kimutatás PCR-SSC, nukleotid szekvencia analízissel

Pedigre

PCR-SSCP analízis

Heterozigóta mutáns szekvencia

Vad nukleotid szekvenciája

PCR-SSCP

Felhasznált irodalom: Dr. Papp Zoltán: Klinikai genetika DE-OEC: Alapvető Molekuláris

Biológiai Módszerek (Debrecen 2003.) Kép: Internet

Készítette: Kolocsán Tünde Biológia-környezetvédelem II. évfolyam

Nyíregyháza, 2004. November 13.

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!