Mut

ação

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Mal

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o –

IFSC

-U

SP

2

Mutação – Breve HistóricoIntrinsecamente ligada com a evolução das espécies

“survival of the fittest under selective pressure.” Darwin

1927 – Hermann Muller - Moscas e raios X – (Science)

1936 – Stadler – UV e milho (PNAS)

1940 – Auerbach & Robson – Moscas e Gás mostarda (Composto Químico Mutagênico)

Relação de doenças que são manifestações demutações, entre elas, câncer.

VANTAGEM OU DESVANTAGEM

3

Mutação - ConceitosMudança acidental na sequência de DNA ou RNA

Causas

- Radiação

- Vírus

- Transposons

- Compostos químicos mutagênicos

- Replicação do DNA

Efeito

Variável

4

Tipos de mutação

o Mutação Pontual (SNP)

o Inserção

o Deleção

Grande escala(Região cromossômica)

o Amplificação de região cromossômica

o Deleção

o Translocação

Fase - 1M K R S R R A T Q Q E D V M R A L K E G VQ A L S V S S A L S T K D L V C R G D H A RA I Q Q F L E D E K H H T M Q I F G M P GT G K T A T V N F A L A Q L V S R R G T

Fase - 2S G A G E R R S R R M Stop C G R S R K A CR R Stop V F R A R F P Q R T L F A E G T TH V Q Y S N S S K M R S I T R C R Y L E C LV P A R R R P Stop T L R W R N W Y RDE

5

Implicações do código DNA ser degenerado

6

Tipos de mutação pontual- SilenciosaNão há mudança no aminoácido

- “Missense” – NeutralHá mudança de aminoácidos

- “Nonsense” – Sem sentidoGera um Stop códon

TTC TTTPhe Phe

AGT AGASer Arg

CGA TGAArg Stop

Anemia falciformeFibrose cística

Câncer

Fibrose císticaTalassemia

Síndromes variadasCâncer

7

Tipos de mutação pontual – “Missense” Mutação conservativaMutação para um aminoácido com características semelhantes

Glu

GAA

Asp

GTA

Archives of Biochemistryand Biophysics489, p10-14 (2009)

Mudanças Kd do substratopara enzima em estudocom esta mudançaconservativa

8

Tipos de mutação pontual – “Missense”

Mutação não-conservativaMutação para um aminoácido com características diferentes

Val

GTA

Glu

GAA

Anemia Falciforme

9

Mecanismos de reparo

Importância da manutenção da integridade do DNA bem como dos sistemas de reparos (múltiplos)

Sistema de Reparo – E. coliBases mal emparelhadas

Outros sistemas de reparos –E. coli

Excisão de bases

Excisão de nucleotídeos

Reparo direto

Se tenho sistema dereparo, como podemocorrer mutações ???

10

Mutação – Como explorar ??

o Diante de uma manifestação fenotípica >> análisegenotípica (eg. resistência à um antibiótico)

o Mutação aleatória induzida (eg. exposição a UV, agentesmutagênicos químicos, PCR “error prone”)

o Mutação sítio-dirigida: explorar importância de resíduos:

- Atividade catalítica

- Afinidade de substrato/ligantes

- Interfaces entre subunidades – Fenômenos deoligomerização e interação entre proteínas

- Fenômenos de cooperatividade em enzimas

- Validação de hipóteses relacionadas ao papel de resíduosespecíficos

o Mutação sítio-dirigida: explorar importância de resíduos:

11

Mutação – Exemplo – GAPDH de T. cruzi

H2

Pd

Ácido anacárdico

Avaliação da Inibição

Pereira et al., Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, 8889–889512

Mutação – Exemplo – GAPDH de T. cruzi

-1/KMappapp

1/Vmax

[I]

13

Mutação – Exemplo – GAPDH de T. cruzi

Inibidornão-competitivo

14

Mutação – Exemplo – GAPDH de T. cruziEstudos cristalográficos

Lys101Ala101Glu101Gln101

TCA

15

Mutação sítio-dirigida StratageneQuikChange® Site-Directed

Mutagenesis Kit

Proposta: Como o próprio nome diz >> RápidoFundamento: Oligonucleotídeos auto-complementares contendoa mutação desejadaCondição: passos de alta eficiênciaProblema: Meu grupo de pesquisa trabalha com uma enzima(GAPDH) que catalisa a reação de transformação do gliceraldeído-3-fosfato para 1,3-bifosfoglicerato. Há sugestões que um resíduoserina posicionada no sítio ativo seja essencial para a atividadecatalítica. Quero avaliar por mutação sítio-dirigida.

3’5’5’3’

SerTCA

GCA ACA

Ser

Ala Thr

Construção em pET28a

AGT

16

Mutação sítio-dirigida StratageneProtocolo

Planejamento dos Oligonucleotideos (Primers)

- Auto-complementares perfeitos;

- Ter entre 25-45 bases e um Tm ≥ 78° C (usando fórmula própria para o cálculo);

- Mutação deve ficar no meio do primer, tendo 10-15 bases corretas de cada lado;

- Conteúdo de GC em torno de 40%;

- Não há necessidade de serem fosforilados mas precisam ser purificados via HPLC;

- Manter a quantidade de primer em excesso (Variações);

17

Mutação sítio-dirigida Stratagene

Primer pair PARA ALA ** Forward: 5' CGGATCTCCCATGGGGCGCGCTTGGTGTGGAGTACG 3' Reverse: 5' CGTACTCCACACCAAGCGCGCCCCATGGGAGATCCG 3' ** GC content: 66.67% Location: 284-319 Melting temp: 84.2°C Mismatched bases: 2 Length: 36 bp Mutation: Substitution 5' flanking region: 17 bp Forward primer MW: 11165.32 Da 3' flanking region: 17 bp Reverse primer MW: 10961.24 Da

18

Mutação sítio-dirigida StratageneProtocoloReação de Síntese – PCR

Detalhes Técnicos:- DNA Polimerase >> Pfu;

- Quantidade de material molde baixo (5-50 ng);

- Número de ciclos baixo (12-18 ciclos);

Reação de PCR

Tampão de Reação

Primer Senso (“Forward”)

Primer Antisense (“Reverse”)

DNA molde

dNTP

Pfu (DNA polimerase)

95 ° C55 ° C68 ° C

X ciclos

19

Mutação sítio-dirigida StratageneProtocoloReação de Síntese – PCR

3’5’5’3’

SelvagemMutante

3’5’

5’3’

5’3’

3’5’

3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’

1 ° ciclo

2 ° ciclo

20

Mutação sítio-dirigida StratageneProtocoloTratamento com endonuclease – DPN I

3’5’

5’3’

3’5’

5’3’

3’5’

5’3’

Mistura de espécies

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Mutação sítio-dirigida StratageneProtocoloTratamento com endonuclease – DPN I

3’5’

5’3’

Grupo Metil

37 ° C – 1 hora

5’3’ DNA parental digerido

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Mutação sítio-dirigida Stratagene - Resumo

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Mutação sítio-dirigida StratageneProtocolo

Transformação da produto tratado em células competentes- Células Quimiocompetentes- Células Eletrocompetentes( Passo importante)

Obtenção dos mutantes- A presença do plasmídeo é confirmada pelo crescimento em meio seletivo

Confirmação da mutação- Sequenciamento

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Mutação sítio-dirigida Stratagene - Confirmação

Ser

ACCThr

SerSer

AGC

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Mutação sítio-dirigida Stratagene - Confirmação

26

Mutação sítio-dirigida Stratagene - Confirmação

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Mutação sítio-dirigida PhusionDiferenças

- Phusion (DNA polimerase)

- Primers não são autocomplementares, são fosforilados e de alta pureza (HPLC)

- Apenas um dos primers que contém a mutação desejada

- Quantidades muito pequenas de DNA molde para a reação, não havendo necessidade de destruir o DNA parental em uma etapa posterior

- Sequenciamento de pelo menos 5 colônias para obtenção de um mutante

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Mutação sítio-dirigida PhusionProtocolo

29

Mutação sítio-dirigida PhusionProtocolo

Tratamento- T4 DNA ligase

Opção: T4 DNA kinase+T4 DNA ligase

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Mutação sítio-dirigidaExemplo 2Proteína fluorescente (GFP – “Green FluorescenceProtein”)Prêmio Nobel 2008

- Muito antiga (milhões de anos) – presente Aequoreavictoria

- Serve como sonda (microscópio) – gene reporter

- Posso acompanhar a localização de proteínas

- Produção de proteínas

- GFP Y66H – ↑ fluorescência

a