Fachtagung “Lasermethoden in der Strömungsmesstechnik”5. – 7. September 2006, Braunschweig

MULTI-PLANE PARTICLE IMAGE VELOCIMETRYIM EMBRYONALEN HÜHNERHERZEN

Peter Vennemann, Ralph Lindken, Jerry WesterweelDelft Technical UniversityLab. for Aero- and HydrodynamicsLeeghwaterstraat 21NL-2628 CA Delft

Abstract

Strömungsmechanische Reize spielen eine wichtige Rolle während der Genese und in der Pathologie des Blutgefäßsystems. Eine eindeutige Beziehung zwischen strömungsme-chanischer Ursache und molekularbiologischer Wirkung lässt sich oft nur erkennen, wenn die Strömungsverhältnisse in vivo vermessen werden können. In diesem Artikel werden erste Particle Image Velocimetry (PIV) Messungen in mehreren, parallelen Ebenen des embryona-len Hühnerembryos vorgestellt. Ziel der Messungen ist die Identifikation von Gebieten hoher und Gebieten niedriger Wandschubspannung.

Einleitung

In der biomedizinischen Forschung stellt sich vermehrt die Frage wie strömungsme-chanische Reize das kardiovaskuläre System beeinflussen. le Noble et al, 2005, zeigen dass Strömungsverhältnisse die Differenzierung von Kapillaren in Arterien und Venen während der Angiogenese maßgeblich beeinflussen. Hove et al, 2003, identifizieren strömungsindu-zierte Wandschubspannungen als signifikanten Einflussfaktor während der Kardiogenese. Gnasso et al, 1997, finden eine Beziehung zwischen erniedrigter Wandschubspannung und Atherosklerose.Strömungsmechanische Ursachen und biomedizinische Effekte lassen sich oft nur dann eindeutig einander zuordnen, wenn die Strömungsverhältnisse in vivo hinlänglich vermessen werden können. Bei der Bestimmung der Wandschubspannung beinhaltet das die Messung der räumlichen Geschwindigkeitsverteilung. Die Wandschubspannung τ entspricht dem Pro-dukt aus dynamischer Viskostität η und dem aus dem Geschwindigkeitsfeld gewonnenen und zur Wand senkrechten Geschwindigkeitsgradienten ∂u/∂z│r=R .Zur Blutgeschwindigkeitsbestimmung verbreitet eingesetzte Ganz-Feld-Messmethoden wie Scanning Laser Doppler Anemometrie, Laser Speckle Interferometrie oder Kernspintomo-graphie liefern in der Regel keine Information über die Richtung der Geschwindigkeit. Partic-le Image Velocimetry (PIV) ermöglicht die Bestimmung zweier Geschwindigkeits-komponenten in einer zwei-dimensionalen Messebene. Wenn die Messebene parallel zur Strömungsrichtung ausgerichtet wird, kann mit Hilfe der PIV die Schubspannung auf der Ge-fäßwand ermittelt werden. Bei nicht paralleler Strömung kann die fehlende, dritte Geschwin-digkeitskomponente – unter bestimmten Randvorraussetzungen – aus der zwei-dimensiona-len Messung in parallelen Ebenen ermittelt werden (Robinson und Rockwell, 1993).Das langfristige Ziel der in diesem Beitrag vorgestellten Messungen ist die Identifikation von Gebieten niedriger oder hoher Wandschubspannungen im embryonalen Herzen. Die Ergeb-

nisse werden mit der drei-dimensionalen Visualisierung schubspannungsabhängig auf- und abregulierten Genexpressionen verglichen (Abbildung 1). Auf diese Weise könnten charakte-ristische Strömungsmuster bestimmten Genexpressionen zugeordnet werden.

Versuchsaufbau

Abbildung 2 zeigt ein Hühnerembryo, wie es für die Messungen verwendet wird. Die Vitellin-Gefäße außerhalb des Embryos entsprechen in ihrer Funktion den embryonalen Gefäßen der Plazenta von Säugetieren. Das Herz hat einen maximalen, inneren Durchmesser von etwa 200 µm.Aufgrund der geringen Abmessungen des Strömungsfeldes wird ein Mikro-PIV-Aufbau mit Volumenbeleuchtung (Meinhart et al, 1999) verwendet. Abbildung 3 zeigt eine vereinfachte Schemazeichnung des Versuchsaufbaus. Fluoreszierende Tracer Partikel und eine di-chromatische Spiegel/Filter Kombination ermöglichen die weitgehende Trennung der Partikelbilder vom Hintergrund. Polystyrol Tracer Partikel mit einem Durchmesser von 500 nm sind mit einer bio-kompatiblen Polyethylen-Glykol (PEG) Beschichtung versehen. Die Partikel werden etwa eine halbe Stunde vor den Messungen mit Hilfe einer Mikropipette in ein Vitellin-Gefäß injiziert. Im geöffneten Ei ist das Embryo durch ein aufgelegtes Mikroskop-Deckglas vor Feuchtigkeitsverlust geschützt. Ein Wasserbad temperiert das Embryo auf 38 Grad Celsius. Das Ei befindet sich in einem geschlossenen Behälter mit einer dem Sichtfeld

Abb. 1: Lokalisierung der wandschubspannungsabhängig regulierten Faktoren KLF-2, ET-1 und NOS-3 im embryonalen Hühnerherzen nach Groenendijk et al, 2004 (im embryonalen Entwicklungsstadium HH 18, nach Hamburger und Hamilton, 1951).

Abb. 2: Hühnerembryo im embryonalen Entwicklungsstadium HH 17. Die Inkubationszeit be-trägt zu diesem Zeitpunkt etwa 70 Stunden. Die Elektronenmikroskop-Aufnahme von Män-ner, 2000, zeigt die Außenseite des primitiven Herzens. Die kleinere PIV-Aufnahme im Vordergrund veranschaulicht die ungefähre Lage der Messebenen.

100 µm

Kopf

Herz

Wirbelsäule

Vitellin Gefäße

des Mikroskops angepassten Öffnung. Die Befeuchtung der das Ei umgebenen Luft durch das Wasserbad verhindert zuätzlich das Absinken des Flüssigkeitsspiegels im Ei. Damit wird die Translation des Embryos entlang der optischen Achse verhindert. Die Kamerafrequenz von 10 Hz genügt zur Auflösung der Herzfrequenz von etwa 2 Hz. In früheren Messungen (Vennemann et al, 2006) wurde das PIV System mit der Herzfrequenz synchronisiert. Um die Messdauer zu minimieren, wird auf die Synchronisation in aktuellen Messungen verzichtet. Wachstum limitiert die Zeit, während der das Herz als unverändert betrachtet werden kann, auf wenige Stunden. Um in verschiedenen Ebenen messen zu können, wird das Mikroskop relativ zum Embryo motorisch bewegt. Die Positionierung wird mit einer Auflösung von 1 µm elektronisch abgefragt. Die ungefähre Position der Messebenen ist in Abbildung 2 illustriert. Die Elektronenmikroskop-Aufnahme auf der rechten Seite zeigt die äußere Form des Herzens. Die darüber liegende, kleinere PIV-Aufnahme zeigt die Tracer Partikel im inneren des Herzens. Insgesamt wurde die Geschwindigkeitsverteilung in neun parallelen Ebenen in einer 110 µm dicken Schicht vermessen.

Auswertung der Experimente

Pro Messebene wurden 1000 PIV-Bilder in jeweils 100 Sekunden aufgenommen. Da das Messsystem, um die Messdauer zu minimieren, nicht mit dem Herzrhythmus synchronisiert wurde, müssen die Daten nach der Messung einem Phasenwinkel des Herzzyklus zugeord-net werden. Dazu werden alle PIV Aufnahmen mit grober räumlicher Auflösung ausgewertet und die mittlere Partikelverschiebung bestimmt. Danach werden die zeitlichen Geschwindig-keitsspitzen in der Reihe der Einzelauswertungen detektiert. Die Genauigkeit der Bestim-mung der zeitlichen Positionen der Geschwindigkeitsmaxima wird durch eine parabolische Fitfunktion erhöht. Auf Basis ihres zeitlichen Abstandes zwischen zwei Maxima werden die Einzelmessungen ihrem Phasenwinkel zugeordnet. Abbildung 4 zeigt einen räumlichen Sta-pel PIV-Aufnahmen desselben Phasenwinkels. Der auf diese Weise rekonstruierte Herzzy-klus wird durch eine dichte Folge von 1000 Einzelmessungen beschrieben. Die Einzel-messungen werden in 20 Zeitabschnitte mit jeweils etwa 50 Doppelbildern zusammengefasst

Abb. 3: PIV Versuchsaufbau. Das Wechselobjektiv des Mikroskops ermöglicht das schnelle Umschalten zwischen Stereo- und Monoeinstellung. Stereosicht wird benötigt um eine Mikropipette zur Injektion der Tracer Partikel zu positionieren. Die PIV Bilder werden mit dem höher auflösenden Mono-Objektiv (numerische Apertur: 0,5) aufgenommen.

und gemeinsam bei einer Auflösung von 16x16 Pixeln (10x10 µm) ausgewertet. Dabei be-stimmt die Summe der Korrelationsfunktionen der Einzelmessungen, die Partikelverschie-bung während eines Zeischrittes (Meinhart et al, 2000).

Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt erste in vivo Multi-Plane PIV Messungen im schlagenden Herzen eines Hühnerembryos. Farbkodiert ist der Betrag der Geschwindigkeit in der x-y-Ebene. In Wandnähe kann der Geschwindigkeitsgradient bei einer Korrelationsfenstergröße von 16x16 Pixeln (10x10 µm) bestimmt werden. Tiefer im Herzen verhindern optischen Störungen der Blutzellen eine scharfe Abbildung der Tracer-Partikel. Abbildung 6 zeigt exemplarisch Details der Messung 80 µm unter der obersten Ebene, bei einem Phasenwinkel von π/5. Die ma-ximale, projizierte Geschwindigkeit in dieser Ebene erreicht beinahe 8 mm/s. Entlang des eingezeichneten Geschwindigkeitsprofils wird die Strömungsrichtung als parallel zur Messebene angenommen. Bei Annahme einer effektiven, dynamischen Viskosität von 4,2 mPa s (Chien, 1970) ergibt sich an der Wand eine Schubspannung von 560 mPa. Physiolo-gisch sind Werte bis zu 7000 mPa (Malek et al, 1999).

Zusammenfassung und Ausblick

Mit Hilfe der Multi-Plane PIV konnte die Geschwindigkeitsverteilung parallel zur Messebene in einer 110 µm dicken Schicht des embryonalen Hühnerherzens mit einer Auflösung von 10 µm bestimmt werden. Auf dem Weg zur Ableitung der räumlichen Wandschubspannungsver-teilung ist als nächster Schritt die Rekonstruktion der dritten Geschwindigkeitskomponente unter der Annahme des Massenerhalts (Robinson, 1993) geplant.

Abb. 4: Beispiel für einen räumlichen Stapel PIV-Aufnahmen. Der Unschärfegrad des sta-tionären, hellen Teilchens an der oberen Wand gibt einen intuitiven Eindruck der räumlichen Position der jeweiligen Messebene.

z = 0 µm z = -15 µm z = -28 µm

z = -43 µm z = -55 µm z = -69 µm

z = -83 µm z = -96 µm z = -110 µm

φ = 2 π/10100 µm

Abb. 6: Beispiel für die Geschwindigkeitsverteilung in einer Ebene des embryonalen Herzens (Position: -80 µm, Phasenwinkel: π/5). Die Größe der Auswertefenster betägt 16x16 Pixel oder etwa 10x10 µm.

Abb. 5: Multi-Plane PIV-Messungen im embryonalen Hühnerherzen (drei von zwanzig Zeitschritten). Die Farbkodierung gibt den Betrag der Partikelverschiebung parallel zur Messebene an. Die Auflösung (Größe der Auswertefenster) beträgt 10 µm. Tiefere Schicht-en konnten nur am Gefäßrand bei dieser Auflösung ausgewertet werden.

φ=0 φ=π/10 φ=2π/10

Dankesworte

Dieses Forschungsprojekt wird von der Stichting Technische Wetenschapen (STW) der Niederlande finanziert.

Literatur

Chien, S., 1970: Shear dependence of effective cell volume as a determinant of blood viscosity, Sci-ence, 168, pp. 977-979

Gnasso, G., Irac, C., Carallo, C., De Franceschi, M.S., Motti, C., Mattioli, P.L., Pujia, A.A., 1997: In vivo association between low wall shear stress and plaque in subjects with asymmetrical carotid atheroscle-rosis, Stroke, 28, pp. 993-998

Groenendijk, B.C., Hierck, B.P., Gittenberger-de Groot, A.C., Poelmann, R.E., 2004: Development-relat-ed changes in the expression of shear stress responsive genes KLF-2, ET-1, and NOS-3 in the develop-ing cardiovascular system of chicken embryos, Dev Dyn, 230, pp. 57-68

Hamburger, V., Hamilton, H.L., 1951: A series of normal stages in the development of the chick embryo, J Morphol, 88, pp. 49-92

Hove, J.R., Köster, R.W., Forouhar, A.S., Bolton, G.A., Fraser, S.E., Gharib, M., 2003: Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis, Nature, 421, pp. 172-177

Lindken, R., Vennemann, P., Kiger, K.T., Hierck, B.P., Ursem, N.T.C., Stekelenburg-deVos, S., ten-Hagen, T.L.M., Poelmann, R.E., Westerweel, J., 2004: In vivo Micro Particle Image Velocimetry (μ-PIV) Messungen in dem Herzen eines Hühnerembryos, 12. Fachtagung "Lasermethoden in der Strö-mungsmechanik", Karlsruhe, Germany, book of abstracts, pp 40.1-40.7

Malek, A.M., Alper, S.L., Izumo, S., 1999: Hemodynamic shear stress and Its role in atherosclerosis, J Am Med Assoc, 282, pp. 2035-2042

Männer, J., 2000: Cardiac looping in the chick embryo: a morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process, Anat Rec: 259, pp. 248-262

Meinhart, C.D., Wereley, S.T., Santiago, J.G., 1999: PIV measurements of a microchannel flow, Exp Fluids, 27, pp. 414-419

Meinhart, C.D., Wereley, S.T., Santiago, J.G., 2000: A PIV algorithm for estimating time-averaged veloc-ity fields, J Fluid Eng, 122, pp. 285-289

le Noble, F., Moyon, D., Pardanaud, L., Yuan, L., Djonov, V., Matthijsen, R., Bréant, C., Fleury, V., Eich-mann, A., 2004: Flow regulates arterial-venous differentiation in the chick embryo yolk sac, Develop-ment, 131, pp. 361-375

Robinson, O., Rockwell, D., 1993: Construction of three-dimensional images of flow structure via particle tracking techniques, Exp Fluids, 14, pp. 257-270

Vennemann, P., Kiger, K.T., Lindken, R., Groenendijk, B.C.W., Stekelenburg-de Vos, S., ten Hagen, T.L.M., Ursem, N.T.C., Poelmann, R.E., Westerweel, J., Hierck, B.P., 2006: In vivo micro particle image velocimetry measurements of blood-plasma in the embryonic avian heart, J Biomech, 39, pp. 1191-1200