métodos dispersivos
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Métodos dispersivosDispersión a bajos ángulos (SAS)
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Resumen teórica ● Conceptos básicos
– Dispersión– ¿Qué obtenemos de un experimento SAS?– Principios físicos
● Sección Experimental● Análisis de Datos
– Introducción– Ejemplos
• Presente y Futuro de las técnicas dispersivas
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Dispersión dinámica vs dispersión estática
laser
Partículas pequeñas
Partículas grandes
Tiempo
Fuente
objeto
Plano de detección
Espectroscopia de correlación Dispersión estática
N (
d)
diametro
S.W. Provencher: Comput. Phys. Commun. 27, 229 (1982)
Pro
pie
dad
es d
e d
ifu
sió
n
Se recolecta la intensidad de “partículas” (fotones, neutrones, etc) durante un periodo temporal.
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Dispersión: ¿con qué longitud de onda queremos “ver”?
escala µm
λ=850 nm
λ= 1.54 ǺEnergía=8 keV
escala Ǻ- nm
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Dispersión a bajo ángulo (SAS)
Forma
Tamaño
Estructura
La dispersión a bajo ángulo es un grupo de técnicas de baja resolución espacial (nm-μm)
Debería complementar con otras técnicas
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Dispersión a bajo ángulo (SAS)Rayos X: Small angle X-ray scattering (SAXS)
Neutrones:Small angle neutron scattering (SANS)
En radiación X, los fotones interaccionan con los electrones.
En neutrones, la dispersión está dada por los núcleos o por electrones desapareados que interactúan con el campo magnético del neutrón (dispersión magnética)
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Dispersión a bajo ángulo (SAS)
Nº Fotones/Neutrones dispersados por segundo en dΩ
Φ dΩ
¿Qué medimos?
ikdΩ
dS
ddd
tNº Fotones/Neutrones dispersados por segundo en dΩ Φ
Φ= numero de fotones/neutrones incidentes por unidad de área y por segundo
Sección eficaz (cross section) diferencial
Sección eficaz total
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Dispersión a bajo ángulo (SAS)¿Qué medimos?
ikdΩ
dS
absorcióninelásticoelásticot
Contribución de interés en el presente curso
Información: Fonones y estructura electrónica (RX)Contribución importante en neutrones, en RX no tanto (cae con Z-2) Es función de la energía de la onda incidente
Tener en cuenta en el diseño experimental
estructura electrónica. Importante cuando hay metales
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Dispersión a bajo ángulo (SAS)
Rayos X: Small angle X-ray scattering (SAXS)
Neutrones:Small angle neutron scattering (SANS)
¿Por qué hay dispersión?
ρo
ρmedioLa dispersión se debe a inhomogeneidades en el sistema
ρ= densidad electrónica
ρ ∝ Z
Se denomina contraste a la diferencia de densidades entre el objeto dispersor y el medioΔρ2
=
Principio de Babinet
Elemento
ρc (x10-15 m)
H -3.73
D 6.67
C 6.64
Si 4.15
O 5.80
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Dispersión a bajo ángulo (SAS)
Trabajar con neutrones permite variar fácilmente el contraste entre objeto dispersor con el medio.
Muestra original ρsolvente= ρcore ρsolvente= ρshell
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Técnicas basadas en la interacción de la radiación x con la materia
Existen diversas técnicas asociadas a la interacción de la radiación X con la materia. Entre ellas se destacan las técnicas de absorción, fluorescencia, XPS, dispersión elástica o inelástica, difracción, etc.
Fotoelectrón
Auger
Fluorescencia
Elástica
Inelástica
Rayos X:Radiación electromagnética
E ~ 1-100 keVλ ~ 1-0.01 nm
Procesos Resonantes
Procesos no Resonantes
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Dispersión de Rayos X
Longitud de onda, λ
Los rayos X son ondas propagantes
]2[exp)( 00 tiEtE
Dispersión elástica:Ei=E’
Dispersión inelástica:Ei≠E’
El campo eléctrico de la onda genera una oscilación del electrón
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Dispersión de Rayos X
La física involucrada en la técnica de dispersión de rayos X a bajos ángulos, al igual difracción de rayos X, se expresa con un formalismo matemático descripto por Fourier.
El “espacio recíproco” o “espacio de Fourier” está relacionado por con el espacio real por una transformación matemática: Transformada de Fourier
drerfqF iqr)(2
1)(
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Dispersión de Rayos X
rendija
Haz monocromático paralelo
Pla
no
de
de
tecc
ión
Ejemplo de curso de física inicial
intensidad
Experimento 1
Experimento 2
2)sin(
xx
I
Propiedades de la transformada de Fourier
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Dispersión de Rayos XPropiedades de la transformada de Fourier D: Diametro partículaλ: Longitud de onda
D<< λ D≈ λ
D> λD>> λ
ik
ik
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Dispersión de Rayos XPropiedades de la transformada de Fourier
FT ¡Invariante frente a traslaciones!
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Problema de las fases
2)exp(.).exp(.*.
)exp(.
AiAiAI
iA
Instrumentalmente solo se puede medir cantidad de fotones. Es decir intensidad dispersada. La intensidad se relaciona con el cuadrado de la amplitud de la onda. Es decir se pierde la fase.
Descripción genérica de una onda
PROBLEMA: Como se observa en el ejemplo la fase contiene la mayoría de la información.
En consecuencia los resultados que se obtienen por SAS no poseen interpretación única. Conocimientos previos de la muestra son necesarios.
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Consecuencias en la determinación estructural (problema mal condicionado)
De manera similar, es muy difícil de reconstruir la estructura real a través de la sombra de un objeto (existen múltiples soluciones posibles)
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Dispersión isotrópica y anisotrópica
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Estructura Transformada de Fourier Experimental
drqr
qrsenrpqI
)()(4)( )()( qNPqI
Factor de forma: transformada de Fourier del objeto:
qx,qy,qzrx,ry,rz
Dispersión de Rayos X
qr
qre rqi sin.
)(4 sen
Dispersión de un objeto aislado (o diluido)
En caso de muestras isotrópicas
r rderqA rqi
.).()( 2)()( qAqI
Donde N: # partículas
P(q): Factor de forma
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Dispersión de Rayos XSistemas concentradosMuestras monodispersas
)()()( qSqNPqI Aparece una nueva función llamada factor de estructura: S(q)S(q): Fenómenos de interferenciaExisten pocos factores de estructura analíticos.
Muestras Polidispersas o con anisotropía geométrica
0.01 0.10.1
1
S HS (
q)
q (Å-1)
Existen aproximaciones adecuadas para tomar en cuenta el factor de estructura en sistemas con diversos grados de polidispersidad y/o anisotropía geométrica.
Para el estudio de proteínas en solución se debe estudiar en condiciones diluidas.
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Reducción de datos
)(qId
d
QhP
Vectores de ondaVector de dispersion
)(4 sen
qq Módulo del vector de
dispersión
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Inte
nsid
ad (
u.a.
)
q (nm-1)
Integrando en función del angulo φ
φ
Contraste: la diferencia entre la densidad electronica del solvente y de la fase dispersa genera el fenomeno
continuodisperso
22
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Dispersión de Rayos X
¿ En qué consiste un experimento de SAS completo?
Ejecución del experimento
Reducción de los datos
Interpretación
Tipo de muestraPreparación de muestraGeometría adecuada
Análisis cualitativoCálculo de invariantesPropuesta de modelosExtracción de información útil
NormalizaciónSustracción parásitoEscala absoluta
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¿Qué podemos obtener de un experimento SAS?
Información estructural
Sistemas diluidos: - Forma y tamaño (distribución de tamaño)-Volumen de objetos dispersores-Área- Masa molecular
Sistemas concentrados: -Estructuras periódicas largo alcance- Arreglos supra moleculares- distancia entre dispersores- etc
SAS son técnicas no destructiva que se emplean para caracterizar diversos sistemas condensados
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Experimental
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Dispersión: Diseño experimental
Neutrones: Reactores nucleares (de reacciones en cadena o subcríticos)Rayos X: Fuentes convencionales (ánodos metálicos) y sincrotrones
PinholesEspejosMonocristalesetc
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Fuentes de Radiación X
Fuentes convencionales: Emisión de Rayos X por acelerar electrones sobre un target metálico.
Energy (keV)
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Equipos de laboratorio
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Fuentes radiación x
Fuente de Luz Sincrotrón:
Una partícula cargada acelerada emite radiación electromagnética.
Los sincrotrones son grandes facilidades. Generan radiación de alta energía como consecuencia de acelerar electrones a velocidades cercanas a la velocidad de la luz.
http://www.lightsources.org/
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Dispersión de objetos homogéneos
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SAXS: figuras geométricas homogéneas
3)()cos()sin(
)(3),(qR
qRqRqRRVRqA esf
El objeto más sencillo de representar es una esfera homogénea. La amplitud es una función analítica sencilla.
Un incremento en el radio de la esfera desplaza el patrón la dispersión a ángulos menores.
RR
drqrqr
rdrqrqr
rrRqA0
2
0
2 sin4
sin)(4),(
En coordenadas esféricas
2221 ),()()( RqANqI
b
a
b
a
b
adxvuuvudxv '|'
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SAXS: figuras geométricas homogéneas
3)()cos()sin(
)(3),(qR
qRqRqRRVRqA esf
2221 ),()()( RqANqI
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SAXS: figuras geométricas homogéneas
Esfera sólida
Esfera hueca
“Pesas”
Discos planos
Cilindros
Log I(q)
q – nm-1
Intensidad relativa de SAXS para diversas figuras geométricas.
Ecuaciones en Pedersen (2002)
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SAXS: Efecto de polidispersidad de tamaños
3)()cos()sin(
3),(qR
qRqRqRRqA
Caso de estudio: Esferas homogéneas con distribución de tamaños Gaussiano
0
22 ),()()()( dRRqARVRNqI esf
3
34
)( RRVesf
2
2
2)(
exp2
1)(
RR
RN
Partículas grandes poseen mayor peso
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SAXS: Efecto de polidispersidad de tamaños
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¿Es una figura homogénea una buena representación de una nanopartícula?
2/
0
2/
0
2
.sincos.2/.
)cos.2/.sin(
sinsin.2/.
)sinsin.2/.sin(
cossin.2/.
)cossin.2/.sin(2
dd
aq
aq
aq
aq
aq
aqPcubo
Las partículas, coloides, proteínas, están compuestos por átomos (sistemas discretos). Los modelos de dispersión calculados anteriormente exhiben los patrones de dispersión para figuras geométricas homogéneas (continuo).
Red cúbica Red cúbica centrada en el cuerpo (BCC)
a= 4 nm
Se proponen dos cubos (a=b=c) de similar tamaño con motivos diferentes de partículas esféricas (¿átomos?)
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2 Å
3 Å
¿Es una figura homogénea una buena representación de una nanopartícula?
Se simularon partículas nanométricas cúbicas compuestas por esferas de 1 Å de radio cada una.
Hay que tener en cuenta que la simetría en cada caso es diferente, pero sobre todo la distancia entre unidades esféricas.
Los patrones de dispersión son similares en ambos casos y el cubo homogéneo ajusta perfectamente las curvas.
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2 Å
3 Å
¿Es una figura homogénea una buena representación de una nanopartícula?
En un experimento de dispersión de rayos X a bajos ángulos se analizan las frecuencias espaciales bajas (q->0). Para poder estimar las diferencias entre las nanopartículas habría que estudiar la intensidad registrada a ángulos altos (experimento de difracción).
Conclusión: En un experimento de dispersión se analiza la densidad electrónica media!
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Algunos cuidados experimentales
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Efectos de la concentración
¿Qué concentración emplear?
Depende de varios factores instrumentales, características de la muestra, etc
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Daños por radiación
Efectos de agregación por incidencia de la radiación X
Otra vez la zona de porod no se ve afectada. Como el error experimental va como:
Se puede promediar la zona de altos angulos para mejorar la calidad del patrón de dispersión
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Análisis de Datos
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2
2 ),(),(1
j j
jj qFqI
MN
Estrategias de análisis: Modelos físicos-Ajuste por mínimos cuadrados
Extraer información de los patrones de SAXS a través de modelos físicos implica generalmente optimizar ecuaciones no lineales. La figura de mérito que suele emplearse para calcular la bondad del ajuste es el χ2
Existen diversos programas disponibles para realizar el análisis de los patrones de dispersión:SASfit, SASview, Irena (plataforma Igor), IsGISAXS, etc.
Para sistemas biológicos: ATSAS
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Estrategias de análisis: Invariantes
0
221
22 )(2)(1 dqqIqV
QPrimer análisis sobre curvas SAXS
Fracción de Constraste volumen
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Estrategias de análisis: Invariantes
Guinier (1938): En ángulos muy pequeños, la dispersión es independiente de la forma de la partícula; solo depende del tamaño.
3exp)(
22
0Grq
IqI1. GrqPara la condición:
OJO SI LA MUESTRA ES POLIDISPERSA
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J.Appl.Cryst.(2010) 43, 101–109
Estrategias de análisis: Mw
Obtenido de GNOM (ATSAS)
Una de las estrategias (hay otras)
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Estrategias de análisis: Invariantes
AVqIqq
.)(2)( 24 Límite de porod
A posee mayor límite de Porod que B
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Estrategias de análisis: p(r)
Se invierte la ecuación:
El fin es obtener la función de distribución radial p(R)
drqr
qrsenrpqI
)()(4)(
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Estrategias de análisis: Construcción de partículas
Programa DAMMIN
Es posible construir partículas a través de elementos más pequeños que lo constituyan. (como el ejemplo del cubo).
Esta estrategia es muy empleada en programas como el DAMMIN que se emplea para determinar la forma de proteínas en solución
ji ij
ijsph qR
qRNqAqI
)sin(2)()( 2
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Ab initio program DAMMINSe emplean algoritmos de Montecarlo (simulated annealing) que busca la forma compacta que minimiza:
Donde es la figura de mérito a minimizar, P(X) es la penalidad que asegura que la figura sea compacta, >0 el peso (multiplicador de Lagrange)
)()],(),([)( exp2 XPXsIsIXf
compactcompact
looseloose
disconnecteddisconnected
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Ab initio program DAMMIN
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EjemplosEjemplos
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0.00 0.05 0.10 0.15
0.1
1
Dimer I - 2=1.32
Dimer II - 2=2.76
Monomer - 2=8.02
Raw data
Inte
nsi
ty (
u.a
.)
q (Å-1
)
Crystal Structure of the Dimeric Phosphoenolpyruvate Carboxykinase (PEPCK) from Trypanosoma cruzi at 2 Å Resolution
Stefano Trapani, Jutta Linss, Samuel Goldenberg, Hannes Fischer, Aldo F. Craievich and Glaucius OlivaJ. Mol. Biol. (2001) 313, 1059-1072
Dimer I Dimer IIMonomer
PDB
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Presente y Futuro de las técnicas dispersivasPresente y Futuro de las técnicas dispersivas
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Ultra Small Small Angle Scattering USAS
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SAXS coherenteX-Ray Photon Correlation Spectroscopy (XPCS)
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Conclusiones● SAS es un grupo de herramientas muy útiles y
Complementarias de otras técnicas: RMN, DRX, CryoEM
● SAXS es una técnica robusta y no requiere muchos recaudos para realizar un experimento.
● Se pueden obtener información de la forma, tamaño, peso molecular.
● La técnica es flexible como para adoptar diversas simetrías y en un amplio espectro de muestras.
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ContactoCristián Huck Iriart : [email protected] de Cristalografía Aplicada: [email protected]
Curso de postgrado: “Large scale structures using SANS and reflectometry: from bio-sciences to solid state”
Dra. Giovanna Fragneto (ILL-Francia)Dr. Michael Fitzsimmons (Oak Ridge National Laboratory, USA)
28 de octubre al 8 de noviembre de 2019. UNSAM