mr.sc. Željko Šundov drd
DESCRIPTION
Vrijednost imunohistokemijskog određivanja gustoće novostvorenih krvnih i limfnih žila, ciklooksigenaze-2 i matriks metaloproteinaze-2 u karcinomima kolona. Mr.sc. Željko Šundov dr.med. Epidemiologija. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Vrijednost imunohistokemijskog određivanja gustoće novostvorenih krvnih i limfnih žila,
ciklooksigenaze-2 i matriks metaloproteinaze-2 u karcinomima kolona
Mr.sc. Željko Šundov dr.med.
Epidemiologija
• Na 3. mjestu po učestalosti među zloćudnim novotvorinama kod muškaraca, a na 2. mjestu iza karcinoma dojke kod žena.
• Godišnje u svijetu umire oko 550 000 ljudi.1
• Incidencija raste sa starošću, nakon 40-te godine života, a doseže vrh u dobi od 50 do 75 godina.
• Stopa incidencije u RH za 2006. godinu iznosi 48,0/100 000.2
1 Jemal A i sur. CA Cancer J Clin, 2006.2 Strnad M i sur. Bilten HZJZ 2008.
Klinička slika
- abdominalna bol - rektalno krvarenje- promjene u pražnjenju stolice
Prognostički pokazatelji
- klinički stadij bolesti
- stupanj histološke diferencijacije tumora
- histološki tip
- broj metastazama zahvaćenih limfnih čvorova
- nalaz tumora u ekstramuralnim krvnim žilama
- perineuralna invazija
- peritumorska limfocitna infiltracija
- stanični i molekulski pokazatelji
Model kolorektalne kancerogeneze
• Kolorektalna je karcinogeneza stupnjevit proces u kojem kumulativne mutacije gena dovode do promjena na fenotipskoj razini koje se manifestiraju rastom crijevne sluznice, displastičnim promjenama i konačno invazivnim potencijalom neoplastične lezije.
Fearon E, Vogelstein B. Cell 1990.
Osnovne odrednice ishoda bolesti oboljelih od karcinoma kolona su:
• invazivnost tumora
• metastatski potencijal
Čimbenici uključeni u ove procese kandidati su za nove prognostičke pokazatelje.
Angiogeneza
Angiogeneza je uključena u:
• Tumorsku progresiju• Tumorsku invaziju• Metastaze
Folkman J. N Engl J Med, 1971.
1-2 mm debljine
Proangiogeni čimbenici Angiogeni inhibitori
VEGF- A-D
FGF-1,2
Angiopoietini-1,2
IL- 8
Estrogeni
Trombospondini-1,2
Angiostatin
Endostatin
Interferon
Vazostatin
Fumagillin/TNP-470
IL-12
NSAR-i
Vincent and Rafii, Cancer Cell, 2004
Limfangiogeneza
Različite uloge COX-1 & COX-2
Arachidonic Acid
COX-1(constitutive)
Homeostasis• Stomach/GI protection• Platelet aggregation• Renal blood flow
COX-2(inducible)
Pathophysiology• Inflammation, Pain• Fever• Cancer• Morbus Alzheimer• Ischemia (CNS)
CIKLOOKSIGENAZA (COX-1 i -2)
Interes za istraživanje COX pojavio se kad je u nekoliko epidemioloških studija zamijećena niža incidencija kolorektalnog karcinoma među ljudima koji su uzimali NSAR.
Giardiello FM. N Engl J Med, 1993., Giovannuccci E. Ann Intern Med, 1994.
Uloga COX-2 u progresiji karcinoma kolona
Normalniepitel
Karcinom
Rani adenom Kasni adenom
APCmutacija
TGFß IIRhMSH
K-rasmutacija
p53mutacija
- COX-2 +/- COX-2 ++ COX-2 +++ COX-2
Gubitak COX-2 genske
regulacije
COX-2 pojačana ekspresija
Porast PG
Sinicrope FA, Gill S. Cancer Metastasis Rev 2004;23:63-75
• Porast razine COX-2 nađen je u 40 % kolorektalnih adenoma i 60-80 % kolorektalnih karcinoma u ljudi
Ebehart i sur. Gastroenterology 1994
- Primjenom COX-2 inhibitora u FAP-u smanjenje broja polipa
Steinbach i sur. N Engl J Med, 2000.
- Ekspresija COX-2 povezana je s kliničko-patološkim osobitostima povezanih s lošijom prognozom
Masunaga i sur. Clin Canc Res, 2000.
Matriksne metaloproteinaze (MMP)
MMP-e su proteolitički enzimi koji imaju glavnu ulogu u diseminaciji malignih tumora. Poremećena regulacija ovih enzimskih sistema povezana je s tumorskom progresijom.
Egebald M.Nat Rev Cancer, 2002.
Gelatin (collagen)Membrane-type MMP-1MMP-14/MT1-MMP
Collagens I, II, IIICollagenase 3MMP-13
ElastinMacrophage elastaseMMP-12
alpha1-proteinase inhibitor, (not ECM)
Stromelysin 3MMP-11
FibronectinStromelysin 2MMP-10
Collagen IV, VGelatinase BMMP-9
Collagen INeutrophil collagenaseMMP-8
Syndecan-1 (lung)MatrilysinMMP-7
Collagen IV (not I), Fibronectin, Laminin
Stromelysin 1MMP-3
Collagen IVGelatinase A MMP-2
Collagens I, II, IIICollagenase 1 MMP-1
SubstratesFamilyMMP Number
MMP-4 through MMP-6 do not exist.
Matrix Metalloproteinases and Substrates
Nagase et al., Matrix Suppl. 1: 421-424, 1992
Matriks metaloproteinaza 2 (MMP-2)
- MMP-2 pripada porodici gelatinaza
- Cijepa kolagen tip IV, sudjeluje u remodeliranju epitelnih i vaskularnih bazalnih membrana pri čemu nastaju proteolitički fragmenti koji potiču mobilnost stanica.
Nakajima i sur. Cancer Res,1988.
- Cijepa i laminin 5 koji je neophodan za invaziju i metastaziranje.
Egebald i sur. Nat Rev Cancer, 2002.
Problematika istraživanja
In vitro studije i studije na životinjskim modelima objašnjavaju moguću ulogu COX-2 i MMP-2 proteina u nastanku karcinoma:
1. poticanjem angiogeneze,
2. inhibicijom apoptoze,
3. poticanjem stanične proliferacije i
4. povećanjem invazivnosti tumorskih stanica degradacijom i remodeliranjem staničnog matriksa.
Gustoća novostvorenih krvnih žila –mean vascular density (MVD)
U karcinomima kolona broj novostvorenih krvnih žila uglavnom povezan sa uznapredovalim kliničkim stadijem, pojavom metastaza i kraćim preživljavanjem.
Guetz GD i sur. 2006.
• Osnovni nedostatak studija:– neujednačena metodologija– primjena antitijela različite specifičnosti,– brojenje krvnih žila unutar tumora a ne na invazivnim rubovima
tumora.
Gustoća novostvorenih limfnih žila - lymphovascular density (LVD)
• Vrijednost gustoće novostvorenih limfnih žila (LVD) kao potencijalnog prognostičkog pokazatelja u karcinomima kolona neistražena je.
• Samo jedna studija u kojoj je nađena povezanost LVD-a primjenom imunohistokemijskog bojenja preparata tumora antitijelom LYVE-1 s metastazama u limfne čvorove i kraćim preživljavanjem.
Duff SE i sur. Colorectal Dis,2007.
COX-2 i MMP-2 vs. MVD/LVD
• Prema početnim istraživanjima COX-2 i MMP-2 povezani su s porastom MVD-a
• Povezanost s LVD do sada nije istraživana
U prikazanom istraživanju prvi puta je ispitivana:
• povezanost imunohistokemijskog profila COX-2/MMP-2 proteina s angiogenezom i limfangiogenezom mjerenom (MVD i LVD)
• povezanost ovih biomarkera s kliničkopatološkim osobitostima tumora
Ciljevi istraživanja
1. Odrediti imunohistokemijski profil COX-2/MMP-2
2. Odrediti stupanj angiogeneze (MVD) i limfangiogeneze (LVD)
3. Odrediti povezanost imunohistokemijskog profila COX-2/MMP-2 sa MVD i LVD
4. Odrediti povezanost COX-2/MMP-2 i MVD i LVD s kliničko-patološkim osobitostima karcinoma kolona
5. Povezanost COX-2/MMP-2 profila, MVD i LVD s dužinom preživljavanja (uzimajući u obzir primijenjene metode liječenja)
6. Procijeniti vrijednost COX-2/MMP-2 profila, MVD i LVD kao potencijalnih nezavisnih prognostičkih pokazatelja
Hipoteza
Određivanjem imunohistokemijskog COX-2/MMP-2 profila i gustoće novostvorenih krvnih i limfnih žila (MVD i LVD) uz definiranje granične vrijednosti broja krvnih/limfnih žila izdvojit će se skupina bolesnika sa:
- biološki agresivnijim karcinomom kolona- povećanim rizikom nastanka recidiva - pojavom limfogenih i hematogenih metastaza
posebice bolesnika u terapijski i dijagnostički najslabije definiranom kliničkom stadiju Dukes B.
Ispitanici
- Oboljeli od karcinoma kolona operirani na Klinici za kirurgiju KB Split od 1997. do 2000. godine
- Iz povijesti bolesti i protokola liječenja prikupljeni su klinički podaci: dob, spol, datum operacije, lokalizacija tumora, postojanje udaljenih metastaza i klinički stadij.
- Prema dobnim skupinama bolesnici su svrstani u dvije kategorije : ≤60 i >60 godina.
- Prema lokalizaciji karcinoma bolesnici će biti svrstani u pet kategorija : cekum, uzlazni kolon, poprečni kolon, silazni kolon i sigma
Isključeni su bolesnici s karcinomom kolona:
- kod kojih je učinjen palijativni kirurški zahvat
- kod kojih je pregledano manje od 6 limfnih čvorova
- koji su prije operacije zračeni ili su primali kemoterapiju
- bolesnici u kliničkim stadijima Dukes A, C i D
- bolesnici kod kojih je karcinom bio lokaliziran u rektumu.
Patohistološka analiza
Iz patohistološkog izviješća prikupljeni su patohistološki podaci:
- kliničko-patološki stadij- veličina tumora- histološki tip- stupanj diferencijacije- nalaz vaskularne invazije- tip limfocitnog upalnog infiltrata- broj tumorom zahvaćenih limfnih čvorova/broj izoliranih
limfnih čvorova.
KLASIFIKACIJA DUKES
Stupanj diferencijacije
Niski gradus ( 50% žlijezda) Visoki gradus (< 50% žlijezda)
Vaskularna invazija
Nakupine tumorskih stanica unutar endotelom obloženih prostora
na invazivnom rubu tumora.
• Podatke o primijenjenom onkološkom liječenju dobili smo uvidom u povijesti bolesti bolesnika liječenih u Centru za onkologiju KBC Split.
• Bolesnici kod kojih je uz kirurško primjenjivano i adjuvantno liječenje svrstani su prema primijenjenom liječenju u dvije kategorije:
– adjuvantna kemoterapija,– liječenje metastaza.
• Podatke o preživljavanju dobili smo iz povijesti bolesti, uvidom u smrtne listiće i direktnim kontaktom s liječnicima bolesnika.
• Periodom praćenja dužine bolesti smatrano je vrijeme od datuma operacije (datum postavljanja dijagnoze) do datuma zadnje kontrole ili datuma smrti (do 31.12.2007.)
COX-2
Imunoreaktivnost na COX-2:
- nalaz smeđe obojenosti citoplazme tumorskih stanica
- analiziran je intenzitet bojenja i postotak obojenih stanica.
MMP-2
Pozitivna ekspresija MMP-2 proteina smatrana je:
- citoplazmatska i/ili membranska obojenost više od 10% tumorskih stanica
MVD i LVD
• Novostvorene krvne ilimfne žile obilježene su antitijelima na CD34 i LYVE-1, a područja najgušće neovaskularizacije na invazivnim rubovima tumora tzv. vruće točke određena su pregledom histoloških preparata pod malim povećanjem (x40).
• Potom su brojene na površini od 0,25mm2 pod povećanjem od 200x.
• MVD i LVD izraženi kao broj novostvorenih krvnih i limfnih žila na površini od 0,25mm2
Imunohistokemijski profil
1. MMP-2 – / COX-2 –
2. MMP-2 + / COX-2 –
3. MMP-2 – / COX-2 +
4. MMP-2 + / COX-2 +
Statistička obrada
- χ2 test povezanosti varijabli- multipla logistička regresija- analiza preživljavanja (Kaplan-Meierova krivulja, Log rank test)- univarijatna Cox-ova regresija ( Cox stepwise
Forward: Wald)- multivarijatna Cox-ova regresija (Cox stepwise
Forward: Wald)- razina značajnosti p < 0,05- statistička obrada s programom SPSS for Windows
REZULTATI
Multipla logistička regresija
Cox-2
61vs 87 mj
MMP-2
45 vs 100 mj
MVD
<25 - 92 mj25-38 – 7739-52 – 64≥53 – 40
LVD
<6 - 94 mj6-10 - 8611-17 - 57≥18 - 45
ZAKLJUČCI
1. Primjenom metode imunohistokemije u karcinomima kolona kliničkog stadija Dukes B pronađena je pozitivna ekspresija COX-2 proteina u 66 % karcinoma, a MMP-2 proteina u 55 % karcinoma
2. Medijan gustoće novostvorenih krvnih žila (MVD) iznosio je 39,5, medijan gustoće novostvorenih limfnih žila iznosio je 11,5 u 0,25 mm2
3. Pozitivna ekspresija COX-2 i MMP-2 povezana je s porastom MVD-a i LVD-a
4. Pozitivna ekspresija MMP-2, visoki stupanj (high grade) diferencijacije tumora, porast MVD-a povezani su s nalazom vaskularne invazije (VI) tumora
5. Analizom preživljenja (Log rank test) kraći interval bez bolesti (DFS) imali su: muški spol, ekspresija MMP-2, profil MMP-2+/COX-2+, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a
6. Analizom preživljenja (Log rank test) kraće vrijeme preživljenja (OS) imali su: dob >60 g, ekspresija MMP-2, profil MMP-2+/COX-2+, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a
7. Cox regresijskom univarijatnom analizom s kraćim intervalom bez bolesti (DFS) povezani su: dob>60 g, ekspresija MMP-2, profil MMP-2+/COX-2+, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a
8. Cox regresijskom univarijatnom analizom s kraćim preživljenjem (OS) povezani su: muški spol, dob>60 g, ekspresija MMP-2, ekspresija COX-2, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a
9. Cox regresijskom multivarijatnom analizom kao NEZAVISNI PREDIKTORI za DFS pokazali su se: ekspresija MMP-2 i vaskularna invazija, a kao NEZAVISNI PREDIKTORI za OS: ekspresija MMP-2, vaskularna invazija, visoki stupanj diferencijacije i porast MVD-a
10. Navedeni pokazatelji mogu pomoći u izdvajanju biološki agresivnijih karcinoma kolona u kliničkom stadiju Dukes B koji bi imali koristi od adjuvatne terapije
HVALA NA PAŽNJI