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MORFOGÊNESE. MEIOS DE CULTURA. PROBLEMAS NA CULTURA DE TECIDOS.
AF073 – BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi
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MORFOGÊNESE
Origem da forma da planta e sua organização que pode ser estudada nos níveis:
*Estrutural (organização funcional da célula)*Tecidos*Órgãos*Planta inteira
ENVOLVE CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO
A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, por meio da regulação e expressão gênica.
Mudanças quantitativas
Mudanças qualitativas
INTEGRAÇÃO ENTRE OS PROCESSOS DE DIVISÃOE ESPECIALIZAÇÃO CELULAR
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MORFOGÊNESE IN VITRO:
*Organogênese DiretaIndireta
*Embriogênese somática DiretaIndireta
Explante
Novos órgãos(organogênese)
Novos embriões(embriões)
Calo
Indireta
Direta
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ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE ABACATEIRO
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ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS CAULINARES DE MARACUJAZEIRO
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ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS RADICULARES DE CAQUIZEIRO
Segmento radicular
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Segmentos foliares
ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE CAQUIZEIRO
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ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE MIRTILEIRO
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EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA
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Embriogênese somática indireta
Massas celulares
Embriões globulares
Embriões cordiformes
Embriões torpedo
Embriões cotiledonares
Plantas
Explante
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EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA DO CAQUIZEIRO
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EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM TANGERINEIRA ‘PONKAN’
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Ferrari (2016)
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Ferrari (2016)
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Campo (2018)
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Fonte: Hering et el. (2014). Scientia Horticulturae, 179(24):284-292.
Embriogênese somática de pupunha em biorreator de imersão temporária
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CARTES R, P. et al. Encapsulated Somatic Embryos and Zygotic Embryos for Obtaining Artificial Seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean J. Agric. Res., v.69, n.1, p. 112-118, 2009.
Sementes sintéticas
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COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA:
1.SAIS MINERAIS:
Macronutrientes:
► Nitrogênio*Amônio (cátion)*Nitrato (ânion)*Concentração de amônio deve ser no máximo até 1/3 do N total.*Importante para o crescimento vegetal e embriogênese somática
► Fósforo*Absorvido da forma H2PO4
-
*Atua no metabolismo energético, na regulação de processos enzimáticos e na ativação de enzimas.
*Necessário para a síntese do ATP.*Na organogênese está envolvido na diferenciação da parte aérea, pois reverte
o efeito das auxinas.
MEIOS DE CULTURA
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► Potássio*Utilizado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto, mas absorvido como íon livre*Ativador de várias enzimas do metabolismo de carboidratos e proteínas. *É necessário para a embriogênese somática. *A deficiência de potássio pode conduzir a hiperhidricidade e decréscimo na
taxa de absorção de fosfato.
► Cálcio*Usado na forma de nitrato ou cloreto. *Está envolvido na divisão celular, uma vez que um dos componentes da
lamela média é o pectato de cálcio. *Importante para controle da necrose apical.
► Magnésio*Usado na forma de sulfato de magnésio. *Importante para formação da clorofila.*Co-fator importante para várias reações enzimáticas que atuam sobre
substratos fosforilados.
► Enxofre*Utilizado na forma de sulfato.*Envolvido no metabolismo energético na formação do fosfosulfato de
adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A.
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Micronutrientes:
► Ferro*Absorvido na forma de quelato com EDTA.*Envolvido nas reações de oxi-redução nos organismos vivos.*Essencial para a síntese da clorofila.
► Manganês*Essencial no metabolismo para a reação de Hill na fotossíntese, quando
a molécula de água é quebrada produzindo elétrons e oxigênio.
► Zinco*Importante nas reações de oxi-redução das plantas. *Co-fator de enzimas anidrase carbônica.
► Boro*Participa do metabolismo de carboidratos, transporte de açúcares, da
síntese de ácidos nucléicos (DNA e RNA), de fitohormônios, formação de paredes celulares e divisão celular.
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► Cobre*É um cátion que em dose acima do normal é fitotóxico às culturas. *Constituinte da enzima plastocianina que é importante componente do
transporte de elétrons.
► Molibdênio* Co-fator da redutase do nitrato.
► Cobalto*Está envolvido na expansão foliar.
► Cloro*É essencial para a fotossíntese, sendo requerido durante a reação de Hill.*Pode ser tóxico dependendo da concentração e da espécie.
► Iodo*Sem ação definida.
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2. SUBSTÂNCIAS ORGÂNICAS:
-Vitaminas: tiamina (B1), ácido nicotínico (niacina), piridoxina (B6)
-Aminoácidos: glicina
-Mio-inositol
-Adenina
3. CARBOIDRATOS:
-Sacarose (mais utilizado)
-Outros carboidratros: sorbitol; dextrose (glicose); maltose; galactose.
4. AGENTES SOLIDIFICANTES
-Agar: polissacarídeo de algas marinhas (6 a 7%)
-Gomas: polímeros produzidos por bactérias (2 a 3%)
*Gelrite® - Kelco Division of Merck & Co
*Phyta-gel® - Sigma Chemical Co
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5. ÁGUA
-Destilada
-Deionizada
-Sistema ‘Milli-Q’: filtros de carvão ativado, colunas de troca iônica e
filtros de acetato de celulose.
6.SUBSTÂNCIAS COMPLEXAS
-Água de coco
-Extrato de levedura
-Extrato de malte
-Caseina hidrolisada
-Banana
Conjunto de aminoácidos
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Alguns componentes orgânicos da água de coco (Krikorian, 1991).
AminoácidosAspárticoGlutâmico
SerinaAminobutíricoAsparagina
Glicina ß-AlaninaTreonina Histidina
GlutaminaArgininaLisinaValina
MetioninaTirosinaProlina
HomoserinaFenilalanina
Hidroxiprolina
Vitaminas Acido nicotínico
Acido pantotênicoBiotina, Riboflavina
Ácido fólico Tiamina
Piridoxina Acido ascórbico
Substâncias de crescimentoAuxina
GiberelinaZeatina
1,3-DifenilureaGlicosideo de zeatinaRibosideo de zeatina
Outros compostos nitrogenados
Amônio,Etanolamina
Dihidroxifenilalanina
Ácidos orgânicosChiquímico
QuinicoPirrolidona-carboxilico
SuccínicoMálico
Cítrico e desconhecidos
Outros compostosARN-Polimerase
UraciloAdenina
LeucoantocianinasFosfatase ácida
DiastaseDeshidrogenase
PeroxidaseCatalase
AçúcaresSacaroseGlicoseFrutose
Álcoois de açúcarSorbitol
m-InositolSiloinositol
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7. REGULADORES VEGETAIS
-Auxinas
*Ácido indolacético (AIA)*Ácido indolbutírico (AIB)*Ácido naftalenoacético (ANA)*2,4-D*Picloran
-Citocininas
*Cinetina*Benziladenina (BAP)*Zeatina*2iP
-Giberelinas
*Ácido giberélico (GA3)
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Divisão celularAlongamento celularDiferenciação celular
REGULADORES VEGETAIS
Auxinas naturais Auxinas artificiais
AUXINAS
Principalmente utilizadas para Enraizamento de brotaçõesIndução da embriogênese somática
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Divisão celularDiferenciação celular
Citocininas naturais
Citocininas artificiais
CITOCININAS
Principalmente utilizadas para Proliferação de brotações axilaresDiferenciação de gemas adventícias
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Skoog and Miller (1957).
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Alongamento celular Divisão celular
GIBERELINAS
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OUTROS REGULADORES:
Brassinosteróides:-Mais de 60 conhecidos-Alongamento de caules; crescimento do tubo polínico; desenrolamento defolhas de gramíneas
Poliaminas:-Encontradas em plantas e animais-Tipos: putrescinas;espermidinas; esperminas-Divisão e alongamento celular; enraizamento; formação de tubérculos
Ácido jasmônico:-Formação de tubérculos; amadurecimento de frutos; formação depigmentos; sinalizador de estresse
Ácido salicílico:-Estimula a floração; floração em plantas termogênicas; mecanismo dedefesa.
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959,25
4,63
306
0,010,103
Água Sacarose
Ágar Sais
Substâncias orgânicas Reguladores de crescimento
Composição de 1 litro do meio de cultura MS em gramas.
Proporção entre os componentes do meio de cultura em g / litro.
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Componentes MS NN WPM QL
Macronutrientes mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM
NH4NO3 1650 20612,12 720 8994,39 400 5000,00 400 5000,00
KNO3 1900 18791,41 950 9396,64 - - 1800 17802,36
K2SO4 - - - - 990 5680,40 - -
KH2PO4 170 1249,17 68 499,67 170 1249,70 270 1983,96
Ca(NO3)2.4H2O - - - - 556 2354,40 1200 5080,80
CaCl2.2H2O 440 2992,59 - - 96 652,93 - -
CaCl2 - - 166 1495,30 - - - -
MgSO4.7H2O 370 1501,01 185 750,51 370 1501,10 360 1460,45
Micronutrientes
Fe2SO4.7H2O 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00
Na2EDTA 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20
H3BO3 6,20 100,26 10,00 161,71 6,20 100,26 6,20 100,26
MnSO4.H2O - - 18,90 111,83 - - - -
MnSO4.4H2O 22,30 99,97 - - 22,30 99,97 1,00 4,48
ZnSO4.7H2O 8,60 29,91 10,00 34,77 8,60 29,91 8,60 29,91
KI 0,83 5,00 - - - - 0,08 0,4 8
Na2MoO4.2H2O 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03
CoCl2.6H2O 0,025 0,10 - - - - 0,025 0,10
CuSO4.5H2O 0,025 0,10 0,025 0,10 0,25 1,00 0,025 0,10
Composição de alguns meios de cultura.
MS – Murashige & Skoog (1962)NN – Nitsch & Nitsch (1969)WPM – Lloyd & McCown (1986)QL – Quoirin & Lepoivre (1977)
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PROBLEMAS NA CULTURA DE TECIDOS IN VITRO
1.DECLÍNIO DO VIGOR
● Produção de substâncias fenólicas.● Hiperhidricidade● Habituação dos cultivos● Maturidade dos explante● Erros no balanço nutricional do meio de cultura● Utilização de fitorreguladores inadequados● Demora para repicagem dos cultivos
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2.NECROSE APICAL
● Deficiência de cálcio● Temperaturas elevadas que favorece a diferença entre crescimento
e translocação do nutriente● Alta umidade que reduz a transpiração e a translocação dos íons
pelo xilema● Reguladores de crescimento ● Longo intervalo entre subcultivos● Gases tóxicos produzidos pela chama do bico de bussen para a
flambagem● Altas taxas de CO2 produzido pela própria planta in vitro
Formas para reduzir a necrose:► Elevar a concentração de cálcio no meio de cultura► Aumentar a concentração de boro► Trocar a flambagem com gás por esterilizadores
elétricos► Utilizar tampas que permitam as trocas gasosas
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3.OXIDAÇÃO
Formas de controle:● Adição de antioxidantes como cisteína, PVP, ácido ascórbico e ácido cítrico● Adição de carvão ativado (adsorve os fenóis)● Cultivo inicial no escuro● Troca frequente do meio de cultura● Redução da concentração de ferro e cobre no meio de cultura● Adequação do tipo e concentração dos reguladores de crescimento● Uso de meios líquidos
Reação do oxigênio com íons metálicos dos outros compostos do meio de cultura. Os explantes podem liberar exudatos que tornam o
meio de cultivo escuro pela liberação de fenóis.
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Meio de cultura sem carvão ativado Meio de cultura com carvão ativado
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4.HIPERHIDRICIDADE
Induzida por:● Meio líquido● Alta concentração de citocininas (BAP)● Elevada umidade in vitro● Altas temperaturas● Baixa irradiância luminosa ou manutenção no escuro
Estado fisiológico que a planta apresenta elevado teor de água no interior das células e tecidos com
aspecto translúcido.
VR043-43 Normal VR043-43 Vitrificado
Folhas translúcidas, alongadas, túrgidas,
frágeis, aquosas e com aparência de vidro
Vitrificação
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Lavanda normal Lavanda hiperhidrica
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Formas de controle:
► Aumento da concentração de ágar no meio de cultura► Utilização de meio dupla fase (meio líquido e sólido)► Redução da umidade no ambiente in vitro► Em meio líquido, utilizar suportes porosos para sustentação dos
explantes (ponte de papel)► Adição de ácidos orgânicos (citrato, succinato ou malato) ao meio de
cultura para auxiliar a assimilação do NH4+► Redução da concentração de íons de amônio no meio de cultura► Aumento da luminosidade► Redução da concentração de citocininas► Evitar o uso do BAP► Transferência da cultura para um meio de cultivo ausente de
fitorreguladores► Fazer subcultivos mais frequentes► Substituição da sacarose por frutose ou galactose
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5.CONTAMINAÇÃO
Ocorrência de● Bactérias● Fungos● Leveduras● Formigas
Geralmente exógenos
Geralmente endógenos
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Contaminação bacteriana provavelmente endógena
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Contaminação bacteriana provavelmente endógena
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Contaminação fungica por manipulação indequada
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Contaminação fungica por manipulação indequada
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Contaminação fungica por manipulação indequada
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Formas de controle:
► Controle fitossanitário das plantas matrizes► Assepsia adequada► Imersão dos explantes em fungicidas► Uso de antibióticos no meio de cultura► Limpeza das câmaras de fluxo laminar► Higienização das mãos► Cuidados durante o manuseio dos explantes e subcultivos► Esterilização correta dos meios de cultura e materiais de trabalho► Limpeza do laboratório► Retirar os frascos contaminados da sala de crescimento► Subcultivos frequentes
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6.VARIAÇÃO SOMACLONAL
● Mudanças cariotípicas numéricas*Euploidia: haploidia, poliploidia*Aneuploidia
● Mudanças caritípicas estruturais*Deleções*Duplicações*Inversões*Translocações
● Mutações no DNA citoplasmático
Variabilidade genética que ocorre nos cultivos in vitro.
Larkin, P.J.; Scowcroft, W.R.Somaclonal variation – a novelsource of variability from cellcultures for plant improvement.Theor. Appl. Genet. 60:197-214. 1981).
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Causas:
► Genótipos menos estáveis► Explantes com polissomatismo► Estresse in vitro► Diferenciação via rotas indiretas de morfogênese (calo)► Concentrações elevadas de reguladores vegetais► Multiplicação via gemas adventícias► Elevado número de subcultivos
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