一　624　一

二医大誌　54（6）：624～633，1996

Mono－Laspartyl　chlorin　e6による光線力学的治療時の

　　　　　　　　ヒト大動脈．血管内皮細胞への影響

東京医科大学内科学第三講座（指導：林　　徹主任教授）

　　　　　　高　　橋　　友　　乃

【要旨】病巣部位にある種の光感受性物質を投与した後にレーザー照射して，腫瘍や粥状動脈硬化巣を縮小

させる光線力学的治療（photodynamic　therapy：PDT）が研究されている．近年，新しく開発された光感受

性物質であるmono－L－aspartyl　chlorin　e6（ME2906）の使用により，　PDTの効果が更に高まるとともに副

作用を軽減できると報告されている．

　PDTは動脈硬化の治療や診断への応用も試みられ，動脈硬化の発現進展には血管内皮細胞の障害や凝固能

の充進などが関与することが示されている．しかし，PDTが血管内皮細胞機能におよぼす影響の詳細は未だ

明らかにされていない．そこで，ME2906を用いたPDTの血管内皮細胞への影響を培養ヒト大動脈血管内皮

細胞（human　aorta　endothelial　ce11：HAEC）を用いて検討した．

　HAECにME2906を10．0，100．0μg／ml添加し，3時間培養した場合のHAEC中のME2906濃度はそれ

ぞれ0．25，2．17μg／106cells，6時間培養したものは0．29，2．98μg／106　cellsであり，培養時間依存的かつ

ME2906添加濃度依存的に増加した．

　HAECにPDTを行なう前後の細胞数はME2906を3，0μg／ml添加しても非レーザー照射群では変化を

認めなかった．ME2906非添加群で，10　J／cm2レーザーを照射しても細胞数に変化を認めなかった．　ME2906

を3．0μg／ml添加直後にレーザー照射を行った群では残存細胞数は11．5±6．5％と有意に減少した．

　ME2906を無添加で，10　J／cm2レーザー照射のみではHAECの細胞数障害は認めなかったが，　ME2906添

加直後にレーザー照射を行った場合は添加濃度依存性にHAEC障害が認められ，　ME2906添加4時間後に

レーザー照射を行った場合は添加濃度が高濃度（3。0μg／ml以上）でHAEC障害が認められた．

　活性酸素のクエンチャーであるアスコルビン酸（AA）をME2906とともに添加した直後にレーザー照射

を行った場合はHAEC障害が見られたが，添加後4時間培養を行った後にレーザー照射を行った場合はA。

A濃度依存的にHAEC障害の改善が認められた．

　PDT施行前のHAEC表面のトロンボモジュリン（thrombomodulin：TM）活性は568．0±28．5　nmで，

ME2906を0．3，1．0μg／m1添加後4時間培養を行った後にレーザー照射をしてもTM活性は有意な変化を認

めなかった．しかしME2906とともにA．A，を添加した場合はA．A濃度依存的にTM活性は増加した．

　以上より，動脈硬化に対するME2906を用いたPDTはHAECに障害を与える場合もあり，生体でも正常

内皮細胞が障害される可能性もある．なおこの研究でA．A．の併用がME2906を用いたPDTの内皮障害の

軽減に有用であることが示唆された．今後はin　vivoで内皮細胞が障害されにくいPDTの条件の検：討が必要

と考えられた．

はじめに

　腫瘍に親和性を示す光感受性物質ヘマトポルフィ

リン誘導体（hematoporphyrin　derivative：HPD）

が合成1）されて以来，悪性腫瘍の光線力学的治療

（photodynamic　therapy：PDT）が試みられ，その

有効性が報告されている2”一3）．光感受性物質を静脈注

射し腫瘍に集積させ，その部位に光感受性物質の吸

収波長帯のレーザーを照射すると，光感受性物質は

光化学反応をおこし光エネルギーを吸収し励起状態

1996年9月11日受付，1996年10月18日受理キーワード：内皮細胞，光線力学的治療，粥状動脈硬化，アスコルビン酸，トロンボモジュリン．

（別刷請求先：〒160東京都新宿区西新宿6－7－1東京医科大学内科学第三講座　高橋友乃）

（1）

1996年11月 高橋：ME　2906によるPDT時のヒト大動脈血管内皮細胞への影響 一　625　一

となる．その際に，放出されるエネルギーにより病

巣組織内の酸素が励起され，一重項酸素などの活性

酸素が生じる4）．この一重項酸素が細胞に障害を与

え病巣組織に変性壊死をおこさせる反応を利用した

治療方法がPDTである．

　近年，HPDよりも腫瘍治療効果の高い光感受性

物質であるmono－L－aspartyl　chlorin　e6（ME2906）

が開発された5一’7）．本剤は粥状動脈硬化巣にも集積す

ることが報告され，ME2906の吸収波長帯である

664nmのレーザーを照射すると粥状動脈硬化巣が

退縮することが明らかとなっている8）．

　動脈硬化の発生・進展は血管内皮細胞が大きく関

与することが指摘され，1970年代に提唱された障害

反応仮説9）においては，血管内皮細胞の障害が粥状

動脈硬化発生の引き金であるとされている．しかし

PDTが血管内皮細胞の動態におよぼす影響につい

ては不明な点が多く，この点を明らかにすることは

動脈硬化に対するPDTの臨床応用を進めていく上

で重要である．

　そこで筆者は培養ヒト大動脈血管内皮細胞

（human　aorta　endothelial　cell：HAEC）　に

ME2906を用いたPDTを施行し，　ME2906のHAECへの取り込みや内皮細胞障害への関与につ

いて検討を行った．そして血管内皮細胞が有する抗

血栓形成機能に関与する物質であるトロンボモジュ

リン（thrombomodulin：TM）活性のPDT施行前

後での変化を検討した．さらに，活性酸素のクエン

チャーであるアスコルビン酸（ascorbic　acid：A．A．）

の投与により，内皮細胞障害性やTM活性がどのよ

うに変化するかについても検討した．

研究材料および方法

　正常ヒト大動脈血管内皮細胞（クラボウ，東京）

を，増殖培地ブレットキットEGM－MV添加セット

（三光純薬，東京）を用いて培養した．光感受性物質

はME2906（明治製菓，東京）を用いた．レーザー照

射には半導体レーザー（松下産業機器，大阪）を用

い，発振波長664nm，出力150　mW／cm2で行った．

　1．HAECへのME2906の取り込み

　直径10cmの培養用dish（FALCON）にHAEC　1．0×106個／wellを播種し，24時間培養後，

培地交換を行い，ME2906を10．0，100．0μg／mlに

なるように添加した．それぞれ30分から24時間培

養した後，PBS溶液で洗浄し，0．4％EDTA／50　mM

HEPES緩衝液（PH　7．4）2mlを加え，セルスクレ

イパーで細胞を剥離した．次に，HAEC浮遊液を超

音波破砕機で10分間細胞を破砕し，細胞破砕液：

EDTA／HEPES緩衝液：75％メタノールを1：0．5＝

7の割合で混和して遠心分離（1000rpm　5分間）を

行い細胞膜成分を沈降除去し，上清中のME2906濃

度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し

た．

　2．PDTによるHAECの障害性　24well　plate　（FALCON）に5．2×104個／well

のHAECを播種し，24時間培養後，培地交換を行

い，ME2906　をO．1から5．0μg／ml添加した．

ME2906添加直後に10　J／cm2のレーザー照射を行

った群と，ME2906添加後4時間培養した後に培地

を交換して10J／cm2のレーザー照射をおこなった

群で残存生細胞数を算出し，PDTによるHAECの

障害性を検討した．残存生細胞はトリプシン処理に

て剥離した後トリパンブルーにて染色し，トリパン

ブルーに染色されなかった細胞を残存骨細胞として

位相差顕微鏡にてカウントし，未処理の生細胞数

（100％）と処理後の残存生細胞数の比を計測した．

　さらに，ME29063．0μg／mlとともにA．A．を25

から200μg／ml添加し残存生細胞数の変化を検討

した．

　3．PDTによるHAEC表面のTM活性の測定　96well　plate（FALCON）に1．4×104個／wellの

HAECを播種し，24時間培養した後に培地交換を

行い，ME2906を0．3から3．0μg／m1添加して4時

間培養した後10J／cm2のレーザー照射をし，

HAEC表面のTM活性を測定した．　TM活性の測

定は，HAECをトロンビン，プロテインCおよびカ

ルシウム存在下に培養したときに生じる活性型プロ

テインCの産生量を合成基質の水解量から標準メ

チルクマリンアミドの螢光強度（螢光光度計：励起

波長380nm／螢光波長460　nm）　に対応させて求め

た10～11）．

　さらに，ME29060．3μg／mlとともにA．A．を

100．0また200．0μg／ml添加し，4時間培養した後

に10J／cm2のレーザー照射を施した場合のTM活

性を測定した．

【略語表】

PDT：photodynamic　therapy

ME2906：mono－L－aspartyl　chlorin　e6

（2）

一　626　一 東京医科大学雑誌 第54巻第6号

HAEC：human　aorta　endothelial　cell

TM：thrombomodulinA．A．：ascorbic　acid

HPD：hematoporphyrin　derivative

結 果

　1．HAECへのME2906の取り込み

IME2906を10．0μg／ml添加した場合のHAEC

中のME2go6濃度をFig．1白四角で示してある．

（ug／106cells）

　　　　4

　　3

鴇

g　2ct

1

o

ME2906・10ptg／ml

ME2906100ptg／ml

O．5　1 3　　6慧一　培養時間（hrs．）

Hg．1HAECへのME　2906の取り込み．

ME2906の濃度は30分後で0．16μg／106　cells，6時

間後には0．29μg／106cellsで，後述する100．0μg／

ml添加とは異なりほぼ一定であった．

　一方，ME2906　を100．0μg／ml添加した場合の

HAEc中のME2906濃度をFig．1黒丸で示してあ

る．HAEC中のME2906濃度は，30分後で1．55μg／

106cells，6時間で2．98μg／106　cells，24時間後で

4．10μg／106cellsとなり，培養時間依存的に増加し

た（Fig．1）．

　2．PDTによるH：AECの障害

　Fig．2は縦軸に細胞数で，横軸にME2go6の投与

量を示してある．Fig．2aはME2906添加直後にレ

ーザー照射を行った群で，Fig．2bはME2906添加

後4時間後にレーーザー照射した群を示してある．

ME2906を3．0μg／ml添加しレーザー照射を行わ

ない群の残存生細胞率は80．9±6．4％（平均±標準

偏差），ME2906を添加せず10　J／cm2レーザー照射

のみを行った群の残存生細胞率は89．4±10．0％で

あった．この結果はコントロールと有意差がなく，

高濃度のME2906添加およびレーザー照射のみで

はHAECの障害を認めなかった（Fig．2a）．

　ME2906をO．1から3．0μg／m1添加した直後に

（o／o）

100

細　　80

胞

数60

40

20

o

P〈O．Olr一一一’一一一一一一一一一一一一一一一i　n＝＝4

髪

霧。髪

　　　　　　M±SD

ロレーザー照射なし．

國レーザー10J／cm2照射．

P　〈　O．Ol

（％）

100

細

　80胞

数

rny一一一一一一一m一一一一一一　n＝4

髪

拶

嚢

嚢

蕪

髪

物

髪

霧

髪、

霧

ぢア

霧

。　　o

｛t2，？｛va．．t

O．1　O．5　1．0　3．0　3．O

ME2906　（yg／ml）

60

40

20

o

　　aFig．2PDTによるHAECの障害性．

M±SDロレーザー照射なし．

囲レーザー10J／cm2照

難曲

〆・1ζ

Z三・

ﾖ馨

形liζ

]笏

！「」，

霧

O　O．1　O．3　1．0　3．0　10．0　10．O

　　　　ME　2906　（ptg／ml）

　　　　　　　b

（a）：ME2906添加直後に，レーザーを10　J／cm2照射を施した群

（b）ME2906添加4時間後，レーザー10　J／cm2照射を施した群

（3）

1996年11月 高橋：ME　2906によるPDT時のヒト大動脈血管内皮細胞への影響 一　627　一

10J／cm2レーザー照射を行った場合，濃度依存的に

残存生細胞率は有意に減少した．ME2906を3．0

μg／ml添加した直後にレーザー照射した後の

HAECを顕微鏡下に観察すると，一部の細胞は原型

をとどめずに破砕されていた（Fig．2a）．

　ME2906添加し4時間培養した後にレーザー照射

を行った場合（Fig．2b），　ME2906を。．1から1．o

μg／mlの濃度で添加しても残存生細胞率は有意な

変化を示さなかった．しかし，3．0μg／ml以上の濃度

のME2906を添加しレーザー照射を施行すると，残

存生細胞率は有意に減少した．

　Fig．3は縦軸に細胞数で，横軸にA．A．の投与量を

示してある．Fig．3aはA．A．とME2906添加直後

にレーザー照射を行った群で，Fig．3bはA．A．と

ME2906添加後4時間後にレーザー照射した群を示

してある．ME29063．0μg／mlとどもにA．A添加直

後にレーザー照射を行った群では，A．A．濃度依存的

に残存生細胞率は減少する傾向を認めたが有意差は

認めなかった（Fig．3a）．一方，　ME2906を添加し

4時間培養した後にレーザー照射を行うと残存生細

胞率は38．3±6．2％に減少したが，ME2906ととも

にA．A．を添加すると，　A．A．濃度依存的に細胞数の

減少が抑制された．A．A．200．0μg／m1添加時には

残存生細胞率は，85．1±10．0％と非添加時に比べ有

意に高値であった（Fig．3b）．

　3．PDTによるH：AEC表面のTM活性の測定

　Fig．4では縦軸に螢光強度で，横軸にME2906の

投与量を示してある．未処置のHAECのTM活性

は568．0±28．5nmであった．　HAECにME2906を

0．3または1．0μg／m1添加し4時間培養した後に

10J／cm2レーザー照射を行った場合のTM活性は

それぞれ609．0±49．8nm，563．0±27．4nmで有意

な変化を認めなかった（Fig．4）．

　一方，Fig．5では縦軸に螢光強度で，横軸にA．A．

の投与量を示してある．HAECにME29060．3μg／

m1とともにA．A．を100．0また200．0μg／ml添加し

て4時間培養した後に10J／cm2レーザー照射を行

った場合のTM活性は，それぞれ805．5±52．4nm，

細

（o／o）

100

80

胞60

数

40

20

o

P　〈　O．Ol

rr一’一一”一一一’一’N一’一’一d”’一”一一一一一一一一’一一’1

国

88無添加

n＝4

M±SD

ロレーザー照射なし．

國レーザL10J／cm2照射．

懸

！i・UZ2．

（o／o）

細

100

80

胞60

数

40

20

O　O　25　50　100　200　アスコルビン酸（μg／ml）

o

　　　　P　〈　O．Ol

n＝＝4

M±SD「一ロレーザー照射なし．

工臨bδ

國レーザー10J／cm2照射． 7iζ

ﾔ鳴く◎「

8 弼客z ≧8①

羅　，ノ・…抽Eゐ　’」、、

無添加

ノノ’・

俄ﾌ 1加縫！FC

名＝∴を”

∠

雛ζ4％づ鵜才二形

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裟：…篇∠惚髭難擁

髪雛

雛 〃7”霧’膨

嚢　’　　ノ ‘客’”

√F乞．　ノ，・u・z

魏

霧　1’

o

　　　　aFig．3PDTによるHAEcの障害性とA．A．の効果

O　25　50　100　200　O　200　アスコルビン酸（μg／ml）

　　　　　b

（a）ME29063．0μg／mlとA．A，を0～200μg／ml添加直後，レーザー10　J／cm2照射

を施した群

（b）ME29063．0μg／mlとA．A．を0～200μg／ml添加4時間後，レーザー一　10　J／cm2

照射を施した群

（4）

一　628　一

（nm）

600

螢

光　400強度

200

東京医科大学雑誌

　n＝4

M±SD

　o　　　　O　O．3　1．O　　　　　　ME2906　（ptg／ml）

Fig．4PDTによるHAEc表面のTM活性．　ME2906を0，3，1．0μg／ml添加4時間後，レー

　ザー　10J／cm2照射を施した群

ロレーザー照射なし．

□ レーザー10J／cm2照

〆

；二つ’雛

笏勿　『・1・：’吻彰，．F，　＝’・

多選易’・『饗

�Sv劣’、ンμ・／、

惣：饗％吻

鰍笏・1ンリ　’

卿iん’∴ノ惣勿笏

；繊iｰ∫勿勿’”「’∠．’〆’

（nm）

1200

1000

　800螢光

強600度

400

第54巻第6号

　　　　＊＊「一一一一一騨一一目凹一一願一一一で

r．m　一一　一一一　＝　し

　　　＊＊「■■一一噌冒一■一一一一一一’1

r　一　m　“nyl

　　　　／7（［・　　／／一一・

／Zf／

　　／

／／fi．・－

亥／・ti

一　Control一　e一　ME2906　O．3ptg／ml

一一 ﾁ一一ME29061．0μg／ml

　＊＊　P〈O．O1

1129．75±93．9nmでA。A．濃度依存的に有意に増

加した．またME29061．0μg／mlとともにA．A．を

添加した場合もTM活性はA．A濃度依存的に有意

に増加した（Fig．5）．

考 察

　1。PDTと動脈硬化

　PDTは主に悪性腫瘍の治療法として研究されて

きた．粥状動脈硬化巣に対するPDTの試みは1985

年頃よりLitvackら12）がコレステロール食により

作成した動脈硬化家兎にHPDを投与後レーザー照

射をした報告に始まる．血管内カテーテルを介して

胸部大動脈にPDTを行い粥状動脈硬化部位を観察

した．肉眼的観察では粥状動脈硬化巣部位が一部で

減少し黄味をおび，光学顕微鏡を用いた組織学的検

討ではPDTを行った部位は内膜がきれいに消失し

中膜には損傷が認められなかったと報告している．

それ以降PDTによる粥状動脈硬化巣の治療効果に

ついては軽度改善から著効例まで種々の報告がなさ

れている13～15）．

　近年，従来より使用されているHPDよりも長波

長側に吸収帯を持ち励起効率も高い物質である

　　　　　　　　　　100　200　　　　　アスコルビン酸（μg／ml）

Fig．5PDTによるHAEc表面のTM活性とA．　A．の効果．

ME2906が開発され研究に用いられるようになっ

た．ME2906はテトラピロール環のD鎖にある二重

結合が一つ解裂したクロリン系の炭素17位置にア

ミド結合によりアスパラギン酸塩を一つ側鎖につけ

た構造をもち，分子量は799．7kDである．クロリン

はアルブミンと1：1で結合し，この構造をもつ

ME2906は生体内ではアルブミンと1：1で結合す

ることが知られている16）．さらに，ME2906はリボ

蛋白には1：3で結合し，吸収されても代謝産物にな

らずそれ自体が活性体である．

　HayashiらはHPDに比べME2906が動脈硬化部位の内膜に選択的に取り込まれること，レーザー

照射後にはプラークの扁平化や色調の変化，動脈硬

化巣の消失などが認められることを報告してい

る17～19）．また，ME2906は粥状動脈硬化の治療のみ

ならず，光CTを用いた粥状動脈硬化部位診断にも

用いられている20）．HPD投与後の正常動脈壁と粥状

動脈硬化壁との濃度比は，投与6時間後で1：2．6，

24時間後で1：3．1であるが，ME2906投与後の濃度

比は投与6時間後で1：10．1，24時間後では1：20．8

と高く，ME2906はHPDに比べ粥状動脈硬化壁へ

の集積性は高い8）．またME2906の664　nmの吸収ピ

ークを単純に比較すると，664nmのレーザーを照射

（5）

1996年11月 高橋：ME　2906によるPDT時のヒト大動脈血管内皮細胞への影響 一　629　一

した時の同一濃度でのHPDの吸収度を1とすると

ME2906は8．8となり，　ME2906は吸収特性が優れ

ていることが明らかである．以上の結果から

ME2906を用いてPDTを行うと，　HPDに比べ効率

よく活性酸素を生じさせることができ，治療効果が

高いと思われる．

　さらに，従来の光感受性物質よりもME2906は副

作用が少ない17）．すなわちHPDの吸収帯は

360～410nmの紫外線近位に存在するが，400　nm付

近には赤血球中のヘモグロビン等の吸収帯も存在す

るためPDTにより赤血球が崩壊する可能性があ

る．しかしME2906の治療に用いる吸収帯は664

nmであり，これはヘモグロビンの吸収波長帯から

離れた波長である．しかも血漿中ではME2906は血

清アルブミンに強く結合した形で存在しているた

め，PDTによる赤血球崩壊などは起こしにくい16）21）．またME2906の正常組織からの排泄率が高

いことから皮膚光線過敏症を起こしにくい．

　以上のことより，ME2906は従来のHPDに比べ

治療効果が高いうえに副作用の発現も少ないため，

従来行われてきた血管内視鏡を利用しての体内から

のレーザー照射だけでなく，体外からのレーザー照

射によっても治療効果があげる可能性があると思わ

れる．さらに粥状動脈硬化壁への集積性が高いこと

から動脈硬化に対するPDTにME2906を用いた場

合の有用性が期待される．しかし，今までにin　vitro

での検討がないため今回HAECを用い動脈硬化の

観点から，検討を行った．

　2．HAECとPDT一動脈硬化の観点から

　HAECへのME2906の取り込みを高速液体クロ

マトグラフィーを用いて検討すると，取り込みは24

時間まで培養時間依存的に増加した．ME2906が

HAECにいかにして取り込まれるか，どの細胞内器

官に取り込まれるかは不明で今後の検討が必要であ

る．腫瘍を移植したBALB／cマウスの細胞内器官に

おけるME2906の取り込みの検討では，核膜，ミト

コンドリア，ミクロゾームに集積していることが示

され22“’24），とくに腫瘍細胞内のミトコンドリア分画

には強い集積が認められる．一方，腫瘍細胞への

HPDの取り込み機序に関しては，著しい増殖性を

維持するために癌細胞膜にLDL受容体が発現増強

され，油と水の両方にとける両溶媒性のHPDが

LDL受容体に選択的に結合し細胞内にとりこまれ

ると考えられている25）．動脈硬化巣の内皮細胞膜で

はLDL受容体のみならず酸化LDLやアセチル化

しDLを取り込む受容体が存在することが知られて

いることから26），HPDと同様にME2906は内皮細

胞膜の各種LDL受容体を介しME2906が細胞内に

取り込まれる可能性がある．

　今回の検討では，細胞外に存在するME2906の

HAECへの影響を検討する系としてME2906添加

後ただちにレーザー照射する群を，細胞内に取り込

まれたME2906のHAECへの影響を検討する系と

してME2906を添加し4時間培養した後に培地を

交換しME2906を除去してレーザー照射する群を

用いた．その結果，PDTを施行した場合には細胞外

に存在するME2906は濃度依存的にHAECを障害

し，また細胞内に取り込まれたME2906は高濃度の

場合にのみHAECを障害することが明らかとなっ

た．またME2906が3．0μg／ml以上の濃度ではその

存在が細胞内外に関係なくHAECを障害すること

が示された．すなわち，細胞外に存在するME2906

がH：AECを障害する可能性が示されたわけである

が，in　vivoにおいては血流やME2906と結合しや

すい脂質，アルブミンなどが血液中に存在するため

投与したME2906が血中に持続的に高濃度に存在

しうるか不明である．従って，今後は実験的にin

vivoにおけるME2906の内皮細胞への取り込みや

障害性を動物実験などで検討し，内皮細胞に障害を

与えないME2906濃度，レーザー照射量などの設定

について解析する必要があろう．

　3．A．A．がPDTにともなうHAEC障害におよ

　　ぼす影響

　ついで一重項酸素のクエンチャーであるA．Aが

PDTにともなうHAEC障害におよぼす影響について検討した．A．A．は生体内では細胞質に存在し水

素供与体として抗酸化的に働き，とくに膜内脂質の

ラジカル発生にともなう酸化反応を抑制することが

知られており27～30），PDTにともなうHAEC障害を

軽減する作用が期待される．今回はA．A．を投与直後

にPDTを施行した群，すなわちAA。が細胞外に存

在している系と，A，A．を投与後4時間培養した後に

PDTを施行した群，すなわち細胞質内にAA．を取

り込ませた系で比較検討を行ったが，細胞質内にA．

A．を取り込ませた系でHAEC障害がA．A．濃度依

存的に抑制されたことより，細胞質内にとりこまれ

たA．A．がPDTにより生じた活性酸素を消去し細

胞を保護したと考えられた．結果は示さなかったが，

（6）

一　630　一 東京医科大学雑誌 第54巻第6号筆者の実験では，スーパーオキシドのクエンチャー

であるスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を細

胞に添加すると，有意なHAEC障害抑制効果は得

られなかった．PDTによって発生する活性酸素は主

に一重項酸素であるため，スーバ一町キシドジスム

ターゼではPDTによるHAEC障害の有意な抑制効果が得られなかったと推測された．

　4．抗凝固四一特にTM活性とPDT

　一方，動物実験において腫瘍に対してPDTを施

行すると，レーザー照射直後に腫瘍中の微小血管が

白色血栓により閉塞し，腫瘍が壊死を起こし縮小す

ることが最近明らかにされ31），PDTにより血小板や

血管内皮細胞などが活性化され凝固充進状態が生じ

ている可能性が示された．また動脈硬化を基礎とす

る脳梗塞や心筋梗塞では凝固能が充刑しているとい

う報告があり31），PDTを施行することで凝固能がさ

らに促進されると逆に動脈硬化の進展につながる可

能性がある．そこで内皮細胞の抗凝固作用の中心的

役割を果しているTM活性がPDTによりどのよ

うに変化するか検討した．TMは内皮細胞膜上に存

在し，トロンビンと1：1の複合体を形成することに

よりトロンビンのもつ凝固作用を消失させるととも

に，トロンビンによるプロテインCの活性化を著し

く高め，内皮細胞上における凝固促進状態を抑制す

る．今回の検討では，HAECが死滅しない条件下で

（ME2906濃度：1．0μg／ml以下かつレーザー照射：

10J／cm2）PDTを施行した場合のTM活性には影

響がみられなかったが，A．A．を併せて投与した場

合にはTM活性が増加した．　A．A．併用投与による

TM活性増加機序は不明である．丸山らはdouble

Strand　c－AMPを添加して内皮細胞を培養すると

2～3時間後より細胞表面のTM発現が150～200％

増加することを明らかにし，mRNAレベルも増加

していることからTM発現増強は転写促進による

と考察している32～33）．一方A．A．はHAEC中のミト

コンドリアでのチロシンの代謝経路，とくにTCA

サイクルを活性化し。－AMPが増える酵素反応の活

性化における共同因子として重要であることが明ら

かにされている．以上のことより，A．A．は。－AMPを

増やし細胞表面のTMを発現増強した可能性が考

えられる．

　これらの結果は，少なくともHAECが死滅しな

い条件下でのME2906を用いたPDT施行に際して

は，A．A．の併用が抗凝固作用を活性化しPDTによ

る動脈硬化進展を抑制すると考えられた．今後，

PDT施行にともなう組織因子，エンドセリン，組織

プラスミノーゲンアクチベーターなどの内皮細胞

の凝固に関する各種分子の変化の検討が必要である

と思われる．

　画期的な腫瘍の治療法として研究されてきた

PDTは，現在，動物実験レベルでは粥状動脈硬化の

治療にも有効性が確認されている．しかし，PDTに

より正常内皮細胞が障害される可能性もあり，今後

は正常内皮細胞に影響を与えないME2906の投与

濃度や障害を抑制する方法などの検討が必要であ

る．

結 論

　HAECを培養して，新しい光感受性物質ME2906

を用い，レーザー照射し，その影響を種々の条件で

検討を行った．

　1．ME2906は濃度依存的，培養時間依存的に

HAECへ取り込まれた．

　2．in　vitroではME2906投与後レーザー照射を

行うと，細胞外に存在するME2906は濃度依存的に

HAECを障害し，また細胞内に取り込まれたME

2906は高濃度の場合にのみHAECを障害すること

が明らかとなった．

　3．ME2906が3．0μg／ml以上の濃度ではその存

在が細胞内外に関係なくHAECを障害することが

示された．

　4．細胞質内にA．A．を取り込ませた系でHAEC

障害がA．A．濃度依存的に抑制されたことより，細

胞質内にとりこまれたA．A．がPDTにより生じた

活性酸素を消去し細胞を保護したと考えられた．

　5．HAECが死滅しない条件下で（ME2906濃度：

1．0μg／ml以下かつレーザー照射＝10　J／cm2）PDT

を施行した場合のTM活性には影響がみられなかった．

　6．HAECが死滅しない条件でかつ細胞質内に

A．A．を取り込ませた系ではTM活性は増加し，

PDT施行の時にA．A。を併用することは，　PDTに

よる動脈硬化進展を抑制すると考えられた．

　謝辞　稿が終わるに臨み，御懇篤な御指導，御校閲を賜

りました林徹第三内科主任教授に深甚なる謝意を表

します．また，本研究にあたり直接御指導，御教示

を頂きました會沢勝夫第二生理学教授，ならびに調

（7）

1996年11月 高橋：ME　2906によるPDT時のヒト大動脈血管内皮細胞への影響 一　631　一

進一郎博士，明治製菓薬総研斉藤光一研究員に深く

感謝致します．

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Influence　of　mono－L－aspartyl　chlorin　e6　upon　endothelial　cells　in

　　　　　　　　　　human　aorta　during　photodynamic　therapy

Tomono　TAKAHASHI

Third　Department　of　lnternal　Medicine，　Tokyo　Medical　College

　　　　　　　　　　（Director：Professor　Toru　Hayashi）

　　Photodynamic　therapy　（PDT），　in　which　a　tumor　or　atherosclerotic　lesion　is　reduced　in　size　by　laser

irradiation　after　administration　of　certain　photosensitive　substances　to　the　lesion，　was　investigated．　ln

recent　years，　it　has　been　reported　that　the　use　of　mono－L－aspartyl　chlorin　e6（ME2906），aphotosensitive

substance，　can　enhance　the　beneficial　effects　of　PDT　and　reduce　its　adverse　effects　at　the　same　time．

Although　PDT　has　also　been　applied　to　the　treatment　and　diagnosis　of　arteriosclerosis，　and　it　has　been

shown　that　disorders　of　vascular　endothelial　cells　and　accelerated　blood　coagulation　capacity　involve　the

development　and　aggravation　of　arteriosclerosis，　the　detailed　effects　of　PDT　on　endothelial　cells　have

remained　obscure．　Thus　we　carried　out　the　present　study　to　investigate　the　effects　of　PDT　with　ME2906

0n　cultured　human　aorta　endothelial　cells　（HAEC）．

　　ME2906　concentration　in　HAEC　was　found　to　be　O．25　and　2．17pt　g／106　cells　after　incubation　with

ME2906　at　10．0　and　100．0＃g／ml　for　3　hours，　respectively，　and　O．29　and　2．98　pt　g／106　cells　after

incubation　with　ME2906　at　the　same　doses　for　6　hours，　respectively，　revealing　incubation－time－dependent

and　ME2906－dose－dependent　increases．　　　　　　　I

　　The　number　of　surviving　cells　remained　unchanged　after　addition　of　ME2906　at　3．0＃g／ml　without

laser　irradiation，　or　after　laser　irradiation　at　10J／cm2　without　addition　of　ME2906．　On　the　other　hand，

the　number　of　serviving　cells　significantly　decreased　when　laser　irradiation　was　performed　immediately

after　addition　of　ME2906　at　3．0　＃g／ml．　No　damages　to　HAEC　was　observed　after　addition　of　ME2906

0r　laser　irradiation　at　10J／cm2　alone，　whereas　HAEC　were　damaged　in　the　ME2906－dose－dependent

manner　when　laser　irradiation　was　performed　immediately　after　addition　of　ME2906．　When　laser

irradiation　was　performed　4　hours　after　addition　of　ME2906　HAEC　could　be　damaged　if　ME2906　was

added　at　3．0　pt　g／ml　or　more．

（9）

1996年11月 高橋：ME　2906によるPDT時のヒト大動脈血管内皮細胞への影響 一　633　一

　　When　laser　irradiation　was　performed　immediately　after　addition　of　ascorbic　（A．A．），　a　quencher　of

active　oxygen，　together　with　ME2906，　HAEC　were　damaged．　However，　HAEC　damages　was　reduce　A．

A．一dose－dependently　when　laser　irradiation　was　per｛brmed　a丘er　incubation　with　A．A。　and　ME2906　fbr

4　hours．

　　The　activity　of　thrombomodulin　on　the　surface　of　HAEC　was　found　to　be　568．0±　28．5　nm　before　PDT，

and　this　activity　showed　no　significant　change　after　laser　irradiation　following　incubation　with　ME2906

at　O．30r　l．0μg／mHbr　4　hours．　However，　the　activity　of　thrombomodulin　increased　in　the　A．A．一dose－

dependent　manner　when　A．A．　was　added　together　with　ME2906．

　　These　results　revealed　that　the　concomitant　administration　of　A．A．　is　beneficial　to　PDT　with　ME2906．

However，　the　possibility　of　damages　to　the　normal　endothelial　cells　by　PDT　requires　further　studies　to

find　out　in　vivo　conditions　of　PDT　which　can　more　effectively　protect　endothelial　cells．

〈Key　words＞ Endothelial　cells，　Photodynamic

bomodulin．

theapy，　Atherosclerosis，　Ascorbic　acid，　Throm一

（10）