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MONITORIZAÇÃO EM TEMPO REAL DO PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO NEURAL IN VITRO A PARTIR DE
CÉLULAS ESTAMINAIS EMBRIONÁRIAS
Margarida Isabel Martins da Silva
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Biomédica
Júri
Presidente: Prof. Pedro Miguel Felix Brogueira
Orientador: Prof. Domingos Manuel Pinto Henrique
Co-orientador: Prof. António Alfredo Coelho Jacinto
Vogal: Rita Leonor Álvares Cabral de Figueiredo Fior
Setembro de 2007
2
3
AGRADECIMENTOS
Antes de qualquer dissertação sobre tema algum, gostaria de agradecer ao Professor
Domingos Henrique a oportunidade possibilitada de fazer parte, durante estes seis meses, da
Unidade de Biologia do Desenvolvimento (UBD) no Instituto de Medicina Molecular.
Agradeço ao Professor António Jacinto, cujos conselhos de microscopia foram preciosos e
revisão da tese extremamente enriquecedora, assim como a todas as pessoas da Unidade da
Morfogénese, companheira de laboratório da UBD.
Dentro da UBD, agradeço especialmente à Evguenia Bekman (Geni) e Elsa Abranches
grande parte do que sei de cultura de células. Após muitas correcções da parte delas na sala
escura da cultura as primeiras células estaminais e precursoras neurais apareceram como
queríamos.
Obrigada a todos os membros da UBD, sem no entanto esquecer quem passou pelo
laboratório, o Carlos Rodrigues, companheiro de Mestrado desde o primeiro dia.
Por ter conduzido a minha entrada no mundo da microscopia e me ter ajudado muito em
todos os aspectos de processamento das imagens, obrigada Ricardo Henriques. As tuas dicas e
tempo foram a ajuda de que necessitava em momentos onde nada ocorre à mente.
À Carina Santos o meu obrigada pelos conselhos preciosos para utilização dos
microscópios. A tua experiência em aquisições de imagens em tempo real foi essencial para a
optimização que desenvolvi.
Ao Nuno Moreno do Instituto Gulbenkian de Ciência agradeço a disponibilidade em partilhar
comigo o que sabia sobre detecção de cálcio em células animais.
À Ana Nery que acompanhou todos os meses do meu trabalho de laboratório e me apoiou
nos dias em que as células teimavam em morrer, o meu obrigada do fundo do coração.
Ao André Augusto, sempre presente, pelas tuas boleias a horas tardias ao laboratório
apenas para eu focar o microscópio.
Aos amigos de casa no mês de escrita intensa de tese: Alexandre Domingues, Maria João
Leitão e Pedro Monteiro, obrigada por terem compreendido que durante este tempo precisava de
espaço para pensar, e adorava um copo de leite com “Cheerios” no final da noite na vossa
companhia.
Ao Luís Santos agradeço as inúmeras correcções científicas, discussões relativas ao
trabalho que desenvolvi, e apoio na recta final de trabalho.
Aos meus pais e irmã que confiam incondicionalmente nas minhas capacidades e que,
mesmo à ingrata distância que separa Lisboa e o Fundão, têm sempre uma palavra amiga e um
beijo para enviar.
4
RESUMO
Apesar do conhecimento de mecanismos moleculares envolvidos na especificação dos
diferentes tipos celulares do tubo neural durante a embriogénese, a dinâmica celular da
diferenciação na linhagem neural e propagação estável deste tipo de células in vitro é ainda um
aspecto de forte investigação. A estratégia promissora de terapia celular no sistema nervoso para
tratamento de doenças degenerativas como a doença de Parkinson é um dos objectivos finais do
investimento neste campo.
O protocolo de diferenciação de precursores neurais em monocamada proposto por Austin
Smith e colaboradores (Ying et al., 2003) partindo de células estaminais embrionárias da linhagem
46C foi usado neste estudo, tendo sido definido como objectivo a monitorização em tempo real da
dinâmica dos precursores neurais em roseta, e confirmação da presença de movimento
intercinético nuclear característico de células neuroepiteliais, com consequente relação com os
estadios do ciclo celular das células envolvidas.
Abordagens iniciais de microscopia de fluorescência de campo claro e confocal não se
mostraram eficazes na obtenção de imagens para análise na medida em que comprometiam a
viabilidade e morfologia precursores.
Monitorização de microscopia em campo claro com luz visível revelou-se menos lesiva para
as culturas em questão, tendo sidas obtidas imagens de 16h do processo de diferenciação neural
mostrando que os precursores neurais apresentam movimentos intercinéticos nucleares,
decorrendo as mitoses na região apical da roseta.
Estratégias de microscopia apresentam-se assim promissoras na monitorização da
dinâmica celular deste tipo de células, podendo no futuro ser optimizadas condições para
observação de variados comportamentos celulares ou mesmo até ao nível molecular com recurso
a marcadores fluorescentes.
Conceitos-chave: neurogénese, precursores neurais, roseta, movimento intercinético nuclear,
microscopia em tempo real.
5
ABSTRACT
Despite the broad insight into the molecular mechanisms that specify neuronal cell type in
the neural tube during embryogenesis in vertebrates, cell behaviour underlying neuron production
and stable propagation in culture of neuronal progenitors is still largely unknown. Cell therapy in the
nervous system is a promising strategy to cure diseases like Parkinson’s or for nerve regeneration
in spinal cord lesions.
The protocol for conversion of 46C embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in
adherent monoculture, proposed by Austin Smith and collaborators (Ying et al., 2003), has been
used in this study. Our main goals were to follow the process of in vitro neuronal differentiation,
establishing whether Sox1-GFP positive neural progenitors reveal the classical interkinetic nuclear
movement (INM) of embryonic neuroepithelial cells, and, in addition, to correlate this movement
with the cell cycle stages of neural progenitors.
Using brightfield and confocal microscopes we have tested screening approaches based on
fluorescence. However, these techniques compromise progenitor morphology in rosettes and
cellular viability.
Alternatively, we have optimized visible light microscopy conditions that enable maintenance
of cell viability during long period observations. Films with sixteen hours of duration show that
neural precursors exhibit INM, with mitosis images located in the rosette apical region. Moreover,
our results indicate that the somal position of cells varies with the cell cycle progression.
Strategies of microscopy might prove to be extremely useful in monitoring the cellular
dynamics in these in vitro conditions, with the possibility of optimizing specific conditions for the
observation of several cellular behaviours, even at the molecular level, by the use of fluorescent
reporters.
Key words: neurogenesis, neuronal precursors, rosette, interkinetic nuclear movement, live
imaging.
6
ÍNDICE
Agradecimentos.................................................................................................................................. 3
Resumo .............................................................................................................................................. 4
Abstract .............................................................................................................................................. 5
Lista de Figuras.................................................................................................................................. 9
Lista de Tabelas ............................................................................................................................... 12
1. Motivação ............................................................................................................................ 13
2. Introdução............................................................................................................................ 14
2.1. Desenvolvimento............................................................................................................. 14
2.1.1. Ferramentas conceptuais ........................................................................................... 14
Estadios de diferenciação......................................................................................................... 14
Expressão diferencial de genes................................................................................................ 15
2.1.2. Modelo animal usado: murganho ............................................................................... 16
2.1.3. Desenvolvimento do sistema nervoso........................................................................ 17
Origem embrionária do tecido neural........................................................................................ 18
Indução neural versus epidermal.............................................................................................. 18
Formação do tubo neural .......................................................................................................... 18
Polaridade dorso-ventral ........................................................................................................... 19
Movimento intercinético nuclear................................................................................................ 21
2.1.4. Células estaminais...................................................................................................... 24
Definição ................................................................................................................................... 24
Células estaminais em cultura .................................................................................................. 24
Vias envolvidas na auto-renovação .......................................................................................... 25
Sinalização Notch na aquisição de identidade neural .............................................................. 26
2.1.5. Diferenciação neural in vitro ....................................................................................... 27
2.1.6. Cálcio.......................................................................................................................... 30
Cálcio e o ciclo celular .............................................................................................................. 31
Cálcio e a Indução neural ......................................................................................................... 32
Indicadores de cálcio ................................................................................................................ 34
Exemplo de aplicação ............................................................................................................... 35
7
2.2. Microscopia ..................................................................................................................... 36
Princípios físicos ....................................................................................................................... 36
Câmaras CCD........................................................................................................................... 38
Fotomultiplicadores ................................................................................................................... 39
Electron Multiplying CCD (EMCCD) ......................................................................................... 39
2.2.1. Microscopia de luz transmitida ................................................................................... 40
Modelo de Abbe ........................................................................................................................ 40
Campo claro.............................................................................................................................. 41
2.2.2. Fluorescência ............................................................................................................. 41
Mecanismos de absorção/excitação......................................................................................... 42
Fontes de luz............................................................................................................................. 43
Filtros usados............................................................................................................................ 44
Construção da imagem............................................................................................................. 45
2.2.3. Microscopia confocal .................................................................................................. 45
Enquadramento histórico .......................................................................................................... 46
Implementação.......................................................................................................................... 46
2.3. Microscopia em tempo real de células ........................................................................... 47
2.3.1. Viabilidade celular....................................................................................................... 47
2.3.2. Fototoxicidade ............................................................................................................ 48
2.3.3. Setup de aquisição: maximização do signal to noise ratio (SNR).............................. 49
Fontes de ruído ......................................................................................................................... 49
Objectivas de imersão............................................................................................................... 50
3. Objectivos............................................................................................................................ 51
4. Materiais e Métodos ............................................................................................................ 52
4.1. Células estaminais.......................................................................................................... 52
4.2. Expansão de células estaminais embrionárias não diferenciadas ................................. 52
4.3. Diferenciação em monocamada ..................................................................................... 53
4.4. Replaqueamentos dia 4 e 8 de monocamada................................................................ 53
4.5. Substrato de diferenciação: PDL-Laminina .................................................................... 53
4.6. Quantificação por FACS de aquisição de destino neural ............................................... 54
4.7. Teste de micoplasma...................................................................................................... 54
8
4.8. Microscopia ..................................................................................................................... 55
4.9. Incorporação do indicador de cálcio ............................................................................... 58
4.10. Detecção de cálcio.......................................................................................................... 58
5. Resultados........................................................................................................................... 59
5.1. Fluorescência: widefield Axiovert 200M ......................................................................... 59
5.2. Fluorescência: Confocal LSM510................................................................................... 64
5.3. Campo claro: Axiovert 200M........................................................................................... 68
5.3.1. Análise de distâncias.................................................................................................. 72
5.3.2. Velocidades e ângulos ............................................................................................... 76
5.3.3. Tipo de divisão............................................................................................................ 77
5.4. Detecção de cálcio.......................................................................................................... 82
6. Discussão............................................................................................................................ 84
6.1. Optimização das condições de observação de progenitores neurais ............................ 84
6.2. Movimento intercinético nuclear ..................................................................................... 85
6.2.1. Mitose ......................................................................................................................... 86
6.2.2. Velocidades de migração ........................................................................................... 87
6.2.3. Tipo de divisão dos progenitores neurais................................................................... 87
6.3. Detecção de cálcio.......................................................................................................... 89
7. Conclusão............................................................................................................................ 90
8. Referências Bibliográficas................................................................................................... 92
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Sumário dos transplantes possíveis específicos com base em células estaminais...... 13 Figura 2.1. Representação esquemática da localização dos folhetos embrionários e respectivos
órgão aos quais darão origem...................................................................................... 15 Figura 2.2. Gastrulação no embrião de rato .................................................................................... 17 Figura 2.3. Células da crista neural (preto) estão situadas entre a ectoderme neural (tracejado) e a
ectoderme epidermal (branco). .................................................................................... 19 Figura 2.4. Fotografia e representação esquemática da constituição do tubo neural. .................... 20 Figura 2.5. A transplantação de um notocórdio extra (vermelho) numa posição mais dorsal resulta
na proliferação adicional de neuroblastos (verde) ....................................................... 21 Figura 2.6. Divisão do tubo neural em região ependimal, marginal, e zona do manto.................... 21 Figura 2.7. A progressão temporal de crescimento do tubo neural e córtex cerebral depende de
padrões de divisões celulares especificos. .................................................................. 22 Figura 2.8. Movimento intercinético nuclear de progenitores neurais no tubo neural. .................... 23 Figura 2.9. Tipos de divisão simétrica e assimétrica em cortes de tubo neural de galinha............. 23 Figura 2.10. Vias de sinalização principais (LIF e BMP) envolvidas na auto-renovação de células
estaminais embrionárias. ............................................................................................. 26 Figura 2.11. Via de sinalização Notch.............................................................................................. 27 Figura 2.12. Expressão dos genes hes em secções transversais do tubo neural de galinha......... 27 Figura 2.13. Clusters de células estaminais embrionárias não diferenciadas observadas com luz
visível em campo claro................................................................................................. 28 Figura 2.14. Cultura de progenitores neurais no terceiro dia de monocamada em PDL-Laminina,
observadas com luz visível em campo claro................................................................ 29 Figura 2.15. Repórter Sox1-GFP para monitorização de diferenciação neural em monocamada.. 29 Figura 2.16. Hipótese de indução-sinalização por cálcio................................................................. 30 Figura 2.17. Dinâmica da sinalização por cálcio.............................................................................. 31 Figura 2.18. Imagens bidimensionais adquiridas em microscópio confocal de células estaminais
embrionárias de rato, incubadas com Fluo-4 AM. ....................................................... 32 Figura 2.19. Modelo de indução neural e epidermal em embrião de Xenopus laevis. .................... 33 Figura 2.20. Novo modelo de indução neural em Xenopus laevis................................................... 33 Figura 2.21. Obtenção de Fluo-4, fluorescente e impermeável na membrana celular (direita) a
partir da esterificação de um outro composto (esquerda), não fluorescente e
permeável celular. ........................................................................................................ 34 Figura 2.22. Modificações estruturais da molécula de BAPTA para formação dos compostos Fluo
...................................................................................................................................... 35 Figura 2.23. Movimento celular é acompanhado de flutuações de cálcio. A. Representação em
função do tempo das alterações de fluorescência devido a níveis de cálcio de uma
célula em migração; B. Direcção e distância percorrida pela mesma célula durante
10
cada minuto do ensaio de medição de níveis de cálcio. Imagens da migração foram
adquiridas a cada 30s durante 45min, após incubação das células com 1mM de Fluo-
3 (Adaptado de Komuro et al., 1996). .......................................................................... 35 Figura 2.24. Representação do processo de formação de uma imagem com uma lente convexa. 36 Figura 2.25. Representação de uma onda electromagnética, com as suas componentes eléctrica e
magnética ..................................................................................................................... 37 Figura 2.26. Princípio de funcionamento de uma câmara CCD ...................................................... 38 Figura 2.27. Princípio de funcionamento de um fotomultiplicador ................................................... 39 Figura 2.28. Estrutura da GFP, com a localização da parte fluorescente evidenciada no seu
interior........................................................................................................................... 42 Figura 2.29. Diagrama de Jablonski. ............................................................................................... 43 Figura 2.30. Espectros de emissão das lâmpadas de Mercúrio e Xénon ....................................... 43 Figura 2.31. Representação esquemática de um espectro de excitação e emissão de um fluoróforo
genérico........................................................................................................................ 44 Figura 2.32. Representação esquemática da disposição de todos os constituintes de um sistema
de aquisição de microscopia de fluorescência............................................................. 44 Figura 2.33. Discos de Airy como uma medida do poder de resolução. ......................................... 45 Figura 2.34. Representação esquemática da disposição espacial dos componentes principais num
microscópio confocal. ................................................................................................... 47 Figura 2.35. Efeito de binning na aquisição de uma imagem. ......................................................... 50 Figura 2.36. Influência da utilização de objectivas de ar ou de imersão no percurso óptico da luz.50 Figura 4.1. Microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M ........................................ 56 Figura 4.2. Microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM 510 ..................................................... 56 Figura 4.3. Espectro de excitação (centrado em 488 nm) e emissão (centrado em 510 nm) do
indicador de cálcio Fluo-4 ............................................................................................ 58 Figura 5.1. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em
monocamada (dia 5/4/07) num microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert
200M............................................................................................................................. 60 Figura 5.2. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em
monocamada (dia 5/4/07) num microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert
200M............................................................................................................................. 61 Figura 5.3. Imagem de rosetas de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 23/4/07) num
microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M. ..................................... 62 Figura 5.4. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em
monocamada (dia 24/4/07) num microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert
200M............................................................................................................................. 62 Figura 5.5. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em
monocamada (dia 30/4/07) num microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert
200M............................................................................................................................. 62 Figura 5.6. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/4/07) num
11
microscópio confocal da varrimento Zeiss LSM510..................................................... 65 Figura 5.7. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 21/5/07) num
microscópio confocal da varrimento Zeiss LSM510..................................................... 65 Figura 5.8. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula
indicada a azul na Figura 5.7. A célula, que se afasta do centro da roseta, mantém um
movimento aproximadamente radial (desvio padrão de 2º85’), com velocidade média
de 0,135�m/min. .......................................................................................................... 66 Figura 5.9. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 6/6/07) num
microscópio confocal da varrimento Zeiss LSM510..................................................... 66 Figura 5.10. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula
indicada a azul na Figura 5.9. ...................................................................................... 67 Figura 5.11. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 26/6/07) num
microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM510..................................................... 68 Figura 5.12. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/6/07) num
microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 69 Figura 5.13. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/6/07) num
microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 69 Figura 5.14. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) num
microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 70 Figura 5.15. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) num
microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 71 Figura 5.16. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em
monocamada (dia 28/7/07) nunca ligadas ao centro da roseta durante a aquisição. . 72 Figura 5.17. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em
monocamada (dia 28/7/07) sempre ligadas ao centro da roseta e que nunca dividem.
...................................................................................................................................... 72 Figura 5.18. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em
monocamada (dia 28/7/07) que se dividem no centro da roseta com retracção do
corpo celular aproximadamente uma hora antes da divisão........................................ 74 Figura 5.19. Análise de distâncias relativamente ao centro da roseta, ângulos com a horizontal, e
velocidade de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07). ...................... 76 Figura 5.20. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num
microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 78 Figura 5.21. Imagem de anafase de uma célula 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07)
num microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ....................................... 79 Figura 5.22. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num
microscópio de fluorescência invertido Axiovert 200M. ............................................... 80 Figura 5.23. Imagens de cultura de células S25 em monocamada (dia 5/8/07) num microscópio
confocal de varrimento Zeiss LSM 510 após incubação com Fluo-4. ......................... 82
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Índices de refracção de alguns meios usados em cultura de células........................... 38 Tabela 5.1. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio de fluorescência invertido
Zeiss Axiovert 200M de imagens de culturas em monocamda de células 46C Sox1-
GFP. ............................................................................................................................. 59 Tabela 5.2. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio confocal de varrimento Zeiss
LSM510 de imagens culturas em monocamada de células 46C Sox1-GFP............... 64 Tabela 5.3. Dados relativos a células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) que se
dividem no centro da roseta com movimento de retracção. ........................................ 75 Tabela 5.4. Valores de velocidades média e máxima, e valor médio de ângulo com a horizontal
das células-mãe em divisão e filhas 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07). 77 Tabela 5.5. Dados do tipo de divisão referentes à cultura de células 46C Sox1-GFP em
monocamada................................................................................................................ 81
13
1. MOTIVAÇÃO
Um elevado número de terapias com células estaminais estão já estabelecidas, embora
grande parte delas envolva apenas intervenções a nível experimental ou de elevado custo. Num
futuro próximo será possível o uso de tecnologias derivadas da investigação de células estaminais
humanas embrionárias e de adulto no sentido da cura de doenças como o cancro, Parkinson,
diabetes mellitus tipo 1 ou doenças degenerativas musculares e nervosas. Contudo, a
investigação neste campo terá de evoluir bastante de modo a esclarecer todos os mecanismos
subjacentes à maquinaria de funcionamento dos processos de diferenciação das linhagens de
interesse a partir de células estaminais. Estão aqui incluídas a escolha da fonte mais adequada de
células estaminais, o modo de obtenção de culturas puras no tipo desejado de células
diferenciadas, bem como o nível de organização das últimas de modo a reterem o seu potencial
proliferativo, que permita a obtenção de enxertos efectivos (Figura 1.1).
Figura 1.1. Sumário dos transplantes possíveis específicos com base em células estaminais.
Purificação de células estaminais hematopoiéticas a partir da medula óssea e subsequente transplantação poderão
reconstituir o sistema sanguíneo para tratamento de cancro, doenças imunológicas ou metabólicas são possíveis
exemplos. Neurónios dopaminérgicos derivados de células embrionárias estaminais poderão também ser transplantadas
para tratamento da doença de Parkinson (Adaptado de Mayhall et al., 2004).
É neste contexto que vários grupos tentam desenvolver metodologias de controlo de
diferenciação neural in vitro. No laboratório da Unidade de Biologia do Desenvolvimento no
Instituto de Medicina Molecular foi estabelecido um protocolo de diferenciação neural in vitro em
culturas aderentes em monocamada partindo de células estaminais embrionárias. Esta ferramenta
constitui a base de trabalho para o estudo detalhado da cinética dos progenitores neurais nestas
condições experimentais. Nos estudos efectuados até ao momento não há referência à
monitorização do comportamento in vitro dos progenitores neurais, nem aos passos intermédios
que levam à aquisição de polaridade e migração de células, como descrito in vivo no tubo neural.
Todos estes aspectos constituíram uma forte motivação para a realização deste estudo.
14
2. INTRODUÇÃO
2.1. DESENVOLVIMENTO
O desenvolvimento de um organismo multicelular a partir de uma célula única, o ovo, com a
criação de estruturas morfológica e fisiologicamente tão distintas é uma conquista importante na
evolução que levanta ainda muitas questões à comunidade científica. Vários organismos modelo
são usados como objecto de estudo dos princípios da embriogénese e desenvolvimento. Dos
organismos para os quais existe maior variedade de metodologias disponíveis e conhecimentos
estabelecidos destacam-se entre os invertebrados a mosca da fruta Drosophila melanogaster e o
nemátodo Caenorhabditis elegans, e entre os vertebrados a rã (Xenopus sp.), o peixe-zebra
(Danio rerio), galinha (Gallus gallus) e murganho (Mus musculus).
2.1.1. FERRAMENTAS CONCEPTUAIS
ESTADIOS DE DIFERENCIAÇÃO
O desenvolvimento de um organismo multicelular pode ser separado conceptualmente em
cinco processos: divisão celular inicial, formação de padrões, morfogénese, diferenciação celular e
crescimento. A fertilização é seguida de um período de rápidas divisões celulares, ou clivagens,
onde o ovo se divide num número finito de células mais pequenas.
A fase de formação de uma estrutura embrionária organizada começa com a definição do
mapa corporal, por definição dos dois eixos fundamentais que separam regiões anteriores e
posteriores, ventrais e dorsais. Em animais, o eixo antero-posterior é aquele que passa desde a
cabeça até à cauda. Estruturas dorsais são aquelas atrás do plano frontal, sendo ventrais as
estruturas à frente deste.
Após definição do mapa corporal, ocorre a alocação das células em diferentes regiões do
organismo, dando origem aos diferentes folhetos embrionários: ectoderme (no pólo animal),
endoderme (no pólo vegetal) e mesoderme, espacialmente entre os anteriores (Figura 2.1). Em
cada uma destas zonas, as células adquirem uma identidade própria, resultante de uma
expressão diferencial, e neste ponto mensurável, de um determinado conjunto de genes. Ao
movimento de migração celular que permite esta divisão de folhetos com formação de uma
cavidade interna é chamado de gastrulação.
15
Figura 2.1. Representação esquemática da localização dos folhetos embrionários e respectivos órgão aos quais darão
origem
(Adaptado de Wolpert et al., 2002).
A diferenciação celular ocorre apenas a partir deste momento. Sendo um processo gradual,
inicialmente as células dividem-se algumas vezes antes de se começarem a diferenciar estrutural
e funcionalmente.
A última etapa consiste no crescimento da estrutura delineada até aqui, passível de
acontecer por vários processos: aumento do tamanho celular, multiplicação, ou deposição de
material extra celular.
EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES
Todas as células somáticas de um organismo são derivadas do ovo fertilizado por
sucessivas séries de divisões mitóticas, como tal, salvo raras excepções, todas contêm o mesmo
património genético. Deste modo, os diferentes tipos celulares são gerados por alterações na
actividade de transcrição ou tradução de determinados genes, que conduzem à síntese de várias
proteínas.
O ponto fulcral do desenvolvimento é a activação e inibição da transcrição de determinados
genes nas células correctas e no momento certo. Na medida em que a actividade de um gene é
determinada em grande parte por factores de transcrição que se ligam a regiões reguladoras, são
estas peças que controlam este processo complexo. Neste aspecto há que ter cuidado em não
considerar o desenvolvimento como um mero mecanismo de controlo da regulação genética, dado
que a expressão genética é apenas um dos primeiros passos de cascatas de sinalização e
influência celulares.
16
2.1.2. MODELO ANIMAL USADO: MURGANHO
Todos os embriões de vertebrados passam por um conjunto muito semelhante de estadios
de desenvolvimento. Durante a gastrulação movimentos celulares resultam na formação dos três
folhetos embrionários. Uma das primeiras estruturas reconhecíveis nesta fase é o notocórdio, que
pertence à mesoderme e é formado ao longo do eixo anterio-posterior do embrião. A partir dos
sómitos, que ladeiam o notocórdio, originam-se a coluna vertebral, músculos do tronco e
membros. O cérebro e a espinal-medula são derivados do tubo neural, uma estrutura na
neuroectoderme localizada imediatamente acima do notocórdio. Os aspectos que mais diferem no
desenvolvimento dos embriões dos diferentes vertebrados até ao estado de gastrulação referem-
se ao modo de nutrição do mesmo. A forma do embrião está directamente relacionada com a
quantidade de vitelo presente no ovo e, no caso dos mamíferos, com as estruturas adjacentes
formadas, nomeadamente a placenta. No entanto, após a fase de gastrulação, todos os embriões
de vertebrados passam por um estadio filotípico, onde em traços gerais, todos se assemelham
(Haeckel, 1875).
O murganho tem um ciclo de vida de 9 semanas, período relativamente pequeno para um
mamífero e que o torna, em parte, o modelo preferencial de estudo para o desenvolvimento de
vertebrados. Um outro ponto importante é o facto de ser facilmente manipulável com as
ferramentas genéticas clássicas, permitindo a criação de mutantes específicos. Contudo, o seu
desenvolvimento é intra-uterino, não sendo facilmente acessível para manipulação experimental
ou observação contínua, apesar de poder ser cultivado fora do ambiente materno por curtos
períodos de tempo.
O óvulo é fertilizado no oviducto, onde as clivagens ocorrem, levando à formação de uma
estrutura, mórula, de células altamente compactadas. Uma característica particular do
desenvolvimento de mamíferos é o aparecimento de dois grupos de células após as primeiras
clivagens: trofoectoderme, no exterior da estrutura e que originará a placenta e estruturas extra-
embrionárias, e massa celular interna numa localização mais interna. Neste estadio, a 3 dias e
meio de gestação, a trofoectoderme expande devido à internalização de fluido para o interior do
blastocisto agora formado, criando-se uma cavidade interna contendo a massa celular interna
numa extremidade. Nas 24 horas seguintes, a massa celular interna divide-se em endoderme e
ectoderme primitivas (podendo a última ser designada também de epiblasto), enquanto ocorre a
implantação do embrião na parede uterina. Aqui, a trofoectoderme parietal, em contacto com o
epiblasto, forma os tecidos extra-embrionários na forma primitiva de cone ectoplacental. No dia 6
após fertilização, ocorre um alongamento do epiblasto e o desenvolvimento da cavidade
proamniótica. Meio-dia depois começa a gastrulação e a definição de uma estrutura espacialmente
organizada. Num ponto não específico da endoderme visceral ocorre o espessamento da parede,
definindo um sulco que migra para a futura região anterior do embrião. As células em proliferação
do epiblasto deslocam-se lateral e anteriormente a partir dele, entre a ectoderme e a endoderme
visceral, formando o folheto da mesoderme (Figura 2.2). Na região anterior desta estrutura forma-
17
se então uma região com maior condensação de células denominada de nódulo de Hensen
(revisto em Wolpert et al. 2002).
Figura 2.2. Gastrulação no embrião de rato
(Adaptado de Wolpert et al., 2002).
Neste ponto, a 8 dias e meio após fertilização, ocorre o enrolamento da estrutura,
formando-se assim as estruturas definitivas do embrião, tal como o tracto gastrointestinal, o
coração e o fígado. Aproximadamente no nono dia é terminada a gastrulação, apresentando já o
embrião cabeça e membros definidos. A organogénese continua a partir deste ponto.
2.1.3. DESENVOLVIMENTO DO SISTEMA NERVOSO
Apesar da grande diversidade de organismos que possuem sistema nervoso, os princípios
subjacentes ao seu desenvolvimento foram conservados ao longo da evolução.
O sistema nervoso central de um mamífero adulto é composto por quatro tipos celulares
distintos: neurónios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia (Kitner, 2002), sendo os três últimos
tipos considerados células da glia. O modo como estas linhagens celulares são formadas durante
o desenvolvimento é uma das questões fundamentais da neurobiologia, na medida em que todos
estes tipos celulares têm uma origem embrionária comum: as células neuroepiteliais. Estas células
estão dispostas numa estrutura tubular denominada tubo neural, formando um epitélio colunar
pseudo-estratificado. A expressão diferencial no tempo e no espaço de moléculas ao longo do
tubo neural é um factor importante na determinação do destino das células neuroepiteliais. Por
outro lado, e nalguns casos, a produção de neurónios ou células da glia parece ser regulada pela
existência de limites intrínsecos do número de divisões celulares dos progenitores, funcionando
este aspecto como um “relógio celular” (Sanes et al., 2006). Em última instância, o nível de
proliferação e o número de células produzidas poderão ser controladas pela libertação de sinais
extracelulares mitogénicos, ou de sinais inibidores de divisão, levando a que os progenitores
saiam do ciclo celular (Sanes et al. 2006). Contudo, o número total de células dum determinado
tipo é também influenciado pelo nível de morte celular, havendo casos em que uma super-
18
produção neuronal leva a uma reprogramação dos mecanismos de apoptose por parte das
células.
ORIGEM EMBRIONÁRIA DO TECIDO NEURAL
Enquanto a maior parte dos órgãos internos do corpo são originados a partir da mesoderme
(são disso exemplo rins, tecido sanguíneo e coração), é a partir da ectoderme que se diferenciam
tecidos neural e epitelial. Nos vertebrados, através de processos altamente conservados, células
da ectoderme embrionária originam progenitores epidermais na região ventral e progenitores
neurais na zona dorsal, onde as células se distinguem das restantes pela aquisição de uma
morfologia colunar, originando uma região denominada de placa neural. Neste ponto, o embrião
atinge o estado de neurula. Segue-se a formação do tubo neural a partir do tecido da placa neural
por invaginação do mesmo para o interior do embrião. O tubo neural permitirá o desenvolvimento
da espinal-medula e do cérebro na sua porção anterior.
INDUÇÃO NEURAL VERSUS EPIDERMAL
Experiências em anfíbios (Spemann et al., 1924) revelaram que a indução neural é iniciada
após libertação de determinados factores a partir da mesoderme dorsal, sendo neste ponto que se
dá a separação entre destino neural e epidermal. Como consequência, uma gama de moléculas
foram catalogadas como indutores neurais, os quais: i) são expressos num local preciso
(mesoderme dorsal) e numa janela temporal bem definida (no estado de gástrula inicial); ii) actuam
apenas na ectoderme dorsal apesar de serem secretados na mesoderme dorsal, e iii) o têm um
efeito directo, induzindo diferenciação de estruturas neurais sem características de mesoderme
(revisto em Moreau et al., 2004). Por exemplo, Noggin, Chordin, Follistatin, XnR3 e Cerberus estão
já descritos como obedecendo a todos estes requisitos (Sasai et al., 1997). No entanto, a acção
destes factores potenciadores de neuralização é acompanhada pela inactivação de mecanismos
com acção ventralizante relacionados com a presença de Bone Morphogenetic Proteins (BMPs)
no meio de cultura, apesar de estes serem factores necessários mas não suficientes para o
processo de neuralização em detrimento do destino epidermal (ver Secção 2.1.6).
FORMAÇÃO DO TUBO NEURAL
A formação do tubo neural acontece por dois processos de neurulação: primária e
secundária, sendo o primeiro bastante semelhante em anfíbios, pássaros e mamíferos. Durante a
neurulação primária, a ectoderme é dividida em três conjuntos de células: (1) o tubo neural
posicionado centralmente, (2) a epiderme localizada externamente e (3) células da crista neural
localizada entre as anteriores, originando no futuro neurónios periféricos, células da glia e células
pigmentadas da pele.
19
Figura 2.3. Células da crista neural (preto) estão situadas entre a ectoderme neural (tracejado) e a ectoderme epidermal
(branco).
a. placa neural; b. formação dos enrolamentos neurais (em murganho); c. estadio intermédio de fecho do tubo neural; d.
tubo neural já fechado (Adaptado de Hall et al., 1991).
Logo após formação da placa neural, as suas extremidades tornam-se mais espessas e
movem-se para cima, formando as pregas neurais, enquanto um sulco se forma no centro,
dividindo o embrião nas suas futuras regiões direita e esquerda. Contrariamente ao que acontece
em galinha, cujo tubo neural começa por fechar inicialmente ao nível do futuro mesencéfalo e
prossegue a partir daí por um mecanismo semelhante a um fecho éclair em ambas as direcções, a
ligação de células do tubo neural em mamíferos é iniciada em vários locais ao longo do eixo
antero-posterior. A contribuição dos dois tipos de neurulação para a formação do tubo neural
definitivo é variável nos diferentes vertebrados, sendo sabido que, em peixes a neurulação é
exclusivamente secundária, enquanto que em galinha as porções anteriores do tubo neural são
formadas por neurulação primária, sendo a parte caudal formada por neurulação secundária. No
que toca a mamíferos, em rato, e provavelmente em humano também, a neurulação secundária
começa ao nível do sómito 35, equivalente à região mais caudal.
Na neurulação secundária, o tubo neural é criado a partir de um cilindro sólido de células, o
denominado cordão medular, que posteriormente cavita no centro (Gilbert, 2000).
POLARIDADE DORSO‐VENTRAL
Mesmo sem técnicas de marcadores moleculares muito desenvolvidas, por mera
observação de morfologia, é evidente a polarização dorso-ventral do tubo neural em duas regiões
espacialmente distintas (Figura 2.4). Estudos iniciais de neurogénese baseados em contagens de
mitoses em cortes histológicos levados a cabo por Viktor Hamburguer em 1948, revelaram dados
preliminares de que a proliferação celular no tubo neural de embriões de galinha era controlada
pela polaridade dorso-ventral adquirida. Por mera contagem de núcleos em mitose por unidade de
área nas regiões basal (ventral) e alar (dorsal) foi reportado que o número de mitoses na região
basal em estados iniciais de desenvolvimento era superior ao da região alar, situação invertida em
estados de desenvolvimento mais tardios. Relacionado com esta dinâmica, está o aparecimento
mais precoce de neurónios motores na região ventral, seguindo-se, temporalmente, a
20
diferenciação em interneurónios e neurónios sensoriais das células da região dorsal. Uma possível
explicação é a que diferenças na densidade mitótica são reflexo de diferenças na duração do ciclo
celular nessas regiões. Por outro lado, pode também especular-se quanto à diferente proporção
de células proliferativas nas regiões basal e alar (Hollyday, 2001).
Esta característica é reflectida na estrutura madura que é a espinal-medula, na medida em
que na região dorsal se situam as conexões entre neurónios espinhais e sensoriais, e na região
ventral estão alojados os neurónios motores.
A parte mais dorsal do tubo neural (roof plate) apresenta-se como uma região bastante
estreita de uma monocamada de células cujos núcleos estão localizados na periferia. Na medida
em que estas células são precursoras de células radiais da glia, não está referenciada a presença
de neuroblastos nesta zona. No pólo ventral, o soalho do tubo neural (floor plate) tem uma
estrutura semelhante mas é mais largo em extensão.
a. b.
Figura 2.4. Fotografia e representação esquemática da constituição do tubo neural.
a. Secção transversal (2μm) de tubo neural de embrião de uma ave. As células em divisão da zona ventricular (vz) e as da
zona do manto (mz) são claramente distintas. Células do floor plate (localizadas entre as linhas a tracejado) são também
facilmente distinguíveis de todas as outras em seu redor. Escala = 50μm (Adaptado de Wilson et al., 2003);
b. Representação esquemática da constituição do tubo neural.
A região intermédia é constituída por elevada densidade de neuroblastos, havendo a
formação de duas protuberâncias menos densas em cada lado do tubo neural perto da
extremidade ventral.
A polaridade do tubo neural é induzida por sinais provenientes de todos os tecidos
envolventes: o padrão dorsal maioritariamente imposto pela epiderme, enquanto que o ventral
induzido pela presença do notocórdio. Foi baseado neste último que, no início do século XX, as
primeiras experiências e deduções neste campo foram obtidas. Extracção do notocórdio em
embriões teve como resultado a não diferenciação do tubo neural. Contudo, uma transplantação
de um outro para uma localização mais dorsal levou à indução de um segundo floor plate (Figura
2.5) e aparecimento de motorneurónios nessa mesma região. Assim, esta estrutura não neuronal
é necessária e suficiente para a determinação do eixo dorso-ventral da espinal-medula.
21
Figura 2.5. A transplantação de um notocórdio extra (vermelho) numa posição mais dorsal resulta na proliferação adicional
de neuroblastos (verde)
(Adaptado de revisão de Wilson et al., 2005).
MOVIMENTO INTERCINÉTICO NUCLEAR
A divisão do tubo neural em camadas radiais foi proposta inicialmente pelo alemão Wilhelm
His: região ependimal (perto dos ventrículos), zona do manto e região marginal (zona de
concentração de neurónios pós-mitóticos) (Figura 2.6). Figuras mitóticas foram descritas na região
ependimal – a mais interior no tubo neural. Terminologia mais recente concatena as duas regiões
mais internas no conceito de região ventricular.
Figura 2.6. Divisão do tubo neural em região ependimal, marginal, e zona do manto.
As figuras de mitose foram identificadas na região ependimal da estrutura, estando a posição dos núcleos dos progenitores
neurais correlacionada com a fase do ciclo celular dos mesmos (Adaptado de Sanes et al, 2006).
Nos estadios iniciais do desenvolvimento, o tubo neural apresenta-se apenas como
neuroepitélio simples com simetria bilateral, ocupando cada célula um raio da estrutura (Wilcock et
al., 2007). Cada célula tem contacto com ambas as regiões basal e apical e apresenta ao longo do
seu ciclo de vida, movimentos radiais entre estas duas zonas, inicialmente identificados em
secções de tubo neural incubadas com timidina tritiada e posteriormente fixadas (Sauer et al.,
1959). Durante a transição da fase S para mitose, o núcleo das células neuroepiteliais movimenta-
se da zona basal para a apical e a célula adquire uma forma mais redonda nos instantes
precedentes à citocinese. Após divisão, as células-filhas retomam a morfologia fusiforme inicial do
progenitor.
A distinção entre divisão simétrica e assimétrica está relacionada com o destino que as
22
células-filhas adquirem depois da divisão. Divisões simétricas são aquelas onde ambas as células-
filhas seguem o mesmo destino: ou ambas continuam como progenitores neurais ou se tornam
neurónios pós-mitóticos. Neste último caso, chama-se divisão simétrica terminal. Nas divisões
assimétricas, são originados um progenitor neural e uma célula neuronal pós-mitótica.
Esta população de células mitoticamente activas e assíncronas está unida fisicamente por
junções aderentes na superfície apical. Esta ligação é bastante forte quando estão envolvidos
progenitores sendo, contudo, atenuada durante a diferenciação terminal (Pearson et al., 2005).
Dependendo do estado de progressão da neurogénese no embrião, existe uma maior ou menor
percentagem de divisões terminais. No início do desenvolvimento do tubo neural, a maior parte
das divisões são proliferativas e originam dois novos progenitores, enquanto que nos estadios
finais da neurogénese se verifica uma predominância de divisões simétricas terminais com a
formação de duas células diferenciadas.
Figura 2.7. A progressão temporal de crescimento do tubo neural e córtex cerebral depende de padrões de divisões
celulares especificos.
Antes da neurogénese, divisões simétricas têm como objectivo único o aumento do número de precursores neurais
(Adaptado de Fishell et al., 2003).
Por outro lado, uma característica relevante das divisões na região apical das células
neuroepiteliais é a orientação do plano de clivagem na citocinese relativamente à superfície apical
do neuroepitélio. Planos de clivagem orientados aproximadamente entre 45-90º relativamente à
superfície luminal são referidos como verticais, sendo as divisões com planos de clivagem entre 0-
45º denominadas de horizontais (Figura 2.9).
Trabalhos efectuados por Chenn e McConnel em 1995 (revisto em Chenn et al., 1998)
indicam que a existência de divisões simétricas ou assimétricas depende da orientação do plano
de clivagem da célula-mãe. Uma divisão horizontal coloca uma célula numa região mais apical e a
outra numa posição mais basal levando a que a segunda entre em G0, constituindo assim uma
divisão assimétrica. Pelo contrário, uma separação vertical estabelece uma herança igual de
porções de membrana basal e apical das células-filhas (Figura 2.8), constituindo uma divisão
simétrica que dá origem a duas células-filhas com o mesmo destino: dois progenitores ou dois
neurónios em diferenciação terminal.
23
Figura 2.8. Movimento intercinético nuclear de progenitores neurais no tubo neural.
Durante a fase inicial de desenvolvimento do tubo neural os progenitores dividem por divisões simétricas. A posição dos
núcleos difere de acordo com as fases do ciclo celular. A síntese de DNA (S) ocorre com os núcleos na região mais basal
do tubo neural. Via fase G2 as células procedem à mitose (M) na região ventricular (V), originando duas células filhas que
re-entram no ciclo celular. Durante a neurogénese, divisões assimétricas geram duas células filhas, uma das quais pode re-
entrar no ciclo celular em G1, podendo seguir a outra para diferenciação por migração da zona ventricular (VZ) para a zona
marginal (MZ), onde os neurónios pós-mitóticos se acumulam (Adaptado de Yoshikawa, 2000).
Estudos posteriores (Wilcock et al., 2007) em tubo neural de galinha revelam que a
orientação do plano de clivagem aquando da divisão não tem relação directa com a aquisição de
um determinado destino neural, podendo ocorrer divisões horizontais simétricas e verticais
assimétricas (Figura 2.9). No entanto, é referido que as divisões verticais originam
maioritariamente duas células com o mesmo destino neural.
Figura 2.9. Tipos de divisão simétrica e assimétrica em cortes de tubo neural de galinha.
Uma célula (a tracejado branco) divide segundo um plano vertical (tracejado a rosa) com formação de um neurónio
(tracejado a vermelho) e um progenitor (tracejado a verde). Ambos os núcleos das células formadas migram em direcção à
superfície basal (a tracejado azul). O núcleo de uma célula (tracejada a vermelho) retrai a sua membrana apical, enquanto
a outra (a tracejado verde) continua em direcção à superfície apical e divide de novo numa divisão horizontal
(Adaptado de Wilcock et al., 2007).
Para o estudo in vitro de diferenciação celular, células estaminais têm sido amplamente
usadas na medida em que a sua capacidade de diferenciação terminal em determinadas linhagens
celulares permite um estudo detalhado de todos os processos envolvidos.
24
2.1.4. CÉLULAS ESTAMINAIS
Nas últimas três décadas assistiu-se a um grande avanço no conhecimento dos
mecanismos subjacentes a este tipo celular e nas potenciais aplicações que terapias celulares
poderiam ter. É neste ponto que a perspectiva de restabelecimento da função normal de tecidos
humanos danificados por doenças se apresenta como finalidade de todo o esforço dispendido
nesta área. No entanto, muitos aspectos estão ainda por esclarecer, nomeadamente o modo como
obter populações puras das células diferenciadas desejadas em equilíbrio com a manutenção do
potencial mitótico no sentido de obter enxertos efectivos.
DEFINIÇÃO
Para definição do conceito de células estaminais são comummente usados dois
parâmetros: a sua origem e o seu potencial. Quanto à origem, as células estaminais podem ser
embrionárias, adultas, ou do cordão umbilical. Duas características necessárias para a definição
do seu potencial são: a capacidade ilimitada de auto-renovação sem senescência; e o potencial de
diferenciação terminal em um ou mais tipos celulares, in vitro e in vivo como resposta a estímulos
fisiológicos.
Uma avaliação dos tipos celulares que existem tendo como parâmetro o potencial de
diferenciação levam-nos a definições de totipotência, pluripotência, multipotência e unipotência.
Células totipotentes resultam das divisões iniciais a partir do ovo em estado de mórula, e
possuem a capacidade de originar todas as células diferenciadas do organismo, incluindo tecidos
extra-embrionários da linhagem da trofoectoderme.
Como descendentes directos das células totipotentes encontram-se as células
pluripotentes, com capacidade de originar linhagens celulares presentes nos três folhetos
embrionários. Podendo já existir no ser adulto, as células multipotentes possuem a capacidade de
auto-renovação e formação de múltiplos tipos celulares diferenciados, mas restritos a um
determinado tecido, órgão ou sistema fisiológico. Em organismos adultos, a localização deste tipo
celular é variada, e a sua função é a manutenção do nível de células maduras, sendo as peças
fundamentais na regeneração de tecidos danificados ou doentes. A fronteira da definição de
células estaminais é ocupada por células unipotentes que originam apenas um tipo celular mas
que mantêm a propriedade de auto-renovação, característica que as distingue das não-estaminais.
CÉLULAS ESTAMINAIS EM CULTURA
Para obtenção de células estaminais embrionárias em cultura, embriões no estado de
blastocisto são plaqueados intactos ou, após isolamento da massa celular interna, em camadas de
células de suporte mitoticamente inactivadas (revisto em Friel et al., 2005). A expansão de culturas
homogéneas de células estaminais de qualquer outro tipo ex vivo não é trivial, devido à elevada
percentagem de diferenciação presente nas culturas. O motivo deste facto não está ainda
25
esclarecido, mas pensa-se ser devido à elevada dependência das células relativamente ao nicho
de onde são provenientes, ou à incapacidade de criação de condições de cultura que mimetizem
completamente o meio natural que sustente a auto-renovação (Conti et al., 2005). Por outro lado
não está ainda excluída a possiblidade da existência de um nível mínimo de divisão assimétrica,
mesmo in vivo, por parte das células estaminais embrionárias que levará sempre à presença de
uma certa percentagem de diferenciação.
O factor responsável pela manutenção da capacidade de auto-renovação em culturas com
células de suporte foi identificado no final dos anos 80. Inicialmente denominado Differentiation
Inhibiting Activity (DIA), é hoje mais conhecido como Leukemia Inhibitory Factor (LIF). Com a
descoberta deste membro da família das citocinas, foi possível a cultura de células estaminais
embrionárias em placas cobertas com gelatina, na presença adicional de soro.
VIAS ENVOLVIDAS NA AUTO‐RENOVAÇÃO
No que diz respeito ao LIF, a sua ligação aos receptores específicos (LIFR-β e gp130)
despoleta a activação de duas importantes cascatas de sinalização intracelulares, nomeadamente
a JAK-Stat e SHP2-Erk (Figura 2.10). A activação do receptor de membrana β (LIFR-β), resulta na
formação de complexos STAT3 que, quando translocados para o núcleo, controlam a transcrição
de genes importantes na auto-renovação (Friel et tal, 2005). Caso a ligação seja feita via gp130,
inicia-se uma cascata de transfosforilações envolvendo as cinases Raf e MAPK (MEK)
constituindo um sinal de pró-diferenciação em células estaminais embrionárias. Deste modo, a
eficiência com que as células em cultura mantêm o potencial de auto-renovação é em parte
consequência de um balanço de sinais destas duas vias.
Por outro lado, a expressão do gene oct4 contribui também para a auto-renovação das
células estaminais embrionárias. No entanto, a sua expressão não é suficiente para a manutenção
deste estado de pluripotência, estando dependente da acção dos complexos STAT3.
O gene nanog está também envolvido neste processo, sendo a sua expressão controlada
por Oct4.
Experiências levadas a cabo por Ying e colaboradores (Ying et al., 2003) referem a proteína
BMP4, como participante adicional no processo de manutenção do potencial de auto-renovação
das células estaminais embrionárias, induzindo a transcrição de genes Id, inibidores de
diferenciação. A ligação das BMPs ao seu receptor podem também activar vias inibidoras de auto-
renovação, como a via MAPK. Deste modo, é necessário definir-se um balanço entre a activação
do complexo STAT3, expressão dos genes Id, e actividade da via MAPK (Figura 2.10) para manter
o potencial de auto-renovação nas células estaminais.
26
Figura 2.10. Vias de sinalização principais (LIF e BMP) envolvidas na auto-renovação de células estaminais embrionárias.
O LIF activa tanto a via JAK-Stat como a via de pró-diferenciação MAPK. A acção do BMP é inibidora de neurogénese no
entanto, a sua capacidade de induzir diferenciação noutras linhas celulares é bloqueada pela via LIF/Stat3
(Adaptado de Friel et al., 2005).
A principal diferença entre auto-renovação de células embrionária estaminais humanas e de
murganho é a de que a presença de LIF não é necessária para manter a capacidade de auto-
renovação de células estaminais humanas, como acontece com as de murganho. Pelo contrário, é
imprescindível a presença de basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) para a manutenção desse
potencial (revisto em Friel et al. 2005).
Em ensaios in vitro, após propagação de células estaminais, o objectivo é a diferenciação
das mesmas num tipo celular predefinido. No entanto, para se ter controlo sobre o processo de
diferenciação é necessário ter conhecimento detalhado das vias envolvidas. Uma das vias
conservadas entre organismos para determinação na linhagem neural é a via de sinalização
Notch.
SINALIZAÇÃO NOTCH NA AQUISIÇÃO DE IDENTIDADE NEURAL
O gene Notch codifica para uma proteína transmembranar de 300kD. É a interacção desta
proteína com um dos seus ligandos que direcciona o destino das células portadoras do receptor
para um estado não diferenciado por inibição da diferenciação neural. Este processo é
responsável pela inibição lateral, essencial para o normal desenvolvimento embrionário de
mamíferos (revisto em Chiba, 2006).
Em Drosophila, Delta e Serrate são as duas proteínas transmembranares identificadas
como ligandos de Notch; em vertebrados, Delta e Jagged e em C.elegans, LAG-2 e APX-1.
As proteínas ajusante das interações Delta-Notch são os factores de transcrição Supressor
of Hairless [Su(H)], CBF1/RJBk em mamíferos, e LAG-1 em C.elegans. Por outro lado os genes do
locus Enhancer of split [E(spl)] que codificam para proteínas nucleares basic helix-loop-helix
(bHLH) têm também um papel importante (Figura 2.11). Em conjunto com Groucho, estas inibem a
expressão de genes proneurais Achaete-Scute.
27
Figura 2.11. Via de sinalização Notch.
Ligação do ligando Delta (verde) a um dos receptores Notch (roxo) da célula adjacente origina duas clivagens proteolíticas,
mediando a libertação do domínio intracelular do Notch (Nicd). Este entra no núcleo com a proteína de ligação ao DNA
CSL (CBF1, Su(H) e LAG-1) (laranja). O co-activador Mastermind (verde) e outros factores de transcrição são recrutados
pelo complexo CSL, enquando co-repressores (azul e cinzento) são libertados (Adaptado de Bray, 2006).
Em vertebrados, aos primeiros genes homólogos dos inibidores neurais E(spl) foram
atribuídas as designações de hes1 e hes3 (Baek et al., 2006). Posteriormente outros foram
caracterizados, sendo quatro os descritos como existentes no tubo neural em rato: hes1, hes3,
hes5 e hes6, com padrões distintos, mas sobreponíveis (Revisto em Kageyama et al., 2007).
Figura 2.12. Expressão dos genes hes em secções transversais do tubo neural de galinha.
Os quatro genes hes são expressos na região ventricular do tubo (A), onde Notch-1 é expresso (B). Imagens sobrepostas
(C) demonstram sobreposição em expressão (DAPI a azul. Vermelho e verde são originados de hibridações in situ).
Expressão de genes hes não está presente em neurónios diferenciados, como mostrado pelo marcador neuronal
complementar TUJ-1 (D) Escala = 50μm (Adaptado de Fior et al., 2005).
Mesmo após conhecimento exaustivo das vias envolvidas na diferenciação na via neural in
vivo, é necessário o estabelecimento in vitro de ensaios sólidos e reprodutíveis de todos os passos
em questão.
2.1.5. DIFERENCIAÇÃO NEURAL IN VITRO
Partindo de células estaminais embrionárias várias metodologias foram desenvolvidas com
o intuito de reproduzir in vitro a neurogénese, envolvendo a produção de precursores neurais e de
células neuronais diferenciadas. Destacam-se a formação de corpos embrióides na presença de
ácido retinóico (Bain et al., 1996), co-cultura com células de suporte de estroma (Kawasaki et al.,
28
2000) ou diferenciação em monocamada (Ying et al., 2003).
A formação de corpos embrióides resulta da agregação das células estaminais em
suspensão em conjuntos multicelulares e multidiferenciados. Concentrações elevadas de ácido
retinóico induzem primariamente diferenciação neural, induzindo no entanto também mesoderme.
Consequentemente, as culturas finais obtidas são sempre uma mistura muito heterogénea de
vários tipos celulares.
Os ensaios de co-cultura de células estaminais embrionárias com células PA6 de estroma
foram estabelecidos por Kawasaki e colaboradores (Kawasaki et al., 2000). Este tipo de co-cultura
induz diferenciação neural em meio sem soro e sem uso de ácido retinóico.
No Instituto de Medicina Molecular, Lisboa, foi desenvolvido um protocolo de diferenciação
neural em monocamada a partir de células estaminais embrionárias, com base no trabalho de
Austin Smith e os seus colaboradores, do Institute for Stem Cell Research (University of
Edimburgh, UK) (Ying et al., 2003) com células embrionárias estaminais 46C. Estas células
contêm a sequência codificante de GFP regulada pelo promotor do gene sox1. Este gene é o
marcador de neuroectoderme de embrião de rato presente temporalmente mais cedo no
desenvolvimento.
É assim possível monitorizar a diferenciação neural através de observações de
fluorescência dado que a expressão de GFP ocorre apenas aquando da transcrição de sox1. Em
embriões gerados a partir de células desta linhagem a fluorescência proveniente de GFP
encontra-se exclusivamente em células neuroepiteliais (Ying et al., 2003).
Segundo este protocolo, as células estaminais embrionárias são inicialmente mantidas no
estado de pluripotência em meio de cultura suplementado com LIF (Figura 2.13). Três a quatro
dias após a remoção deste factor de inibição de diferenciação já há expressão de marcadores
claros da linhagem neural. Só neste ponto a percentagem de células Sox1-GFP positivas sobe
para valores entre 70-90%, confirmando que os estímulos fornecidos ao meio têm como
consequência a diferenciação das células estaminais em precursores neurais (Figura 2.15).
Figura 2.13. Clusters de células estaminais embrionárias não diferenciadas observadas com luz visível em campo claro
(Escala = 50μm).
Os progenitores neurais (Figura 2.14), após replaqueamento num substrato de Poli-D-
Lisina-Laminina, que aumenta a sobrevivência e potencia a adesão celular, são morfologicamente
distintos das células estaminais suas precedentes: os corpos celulares são opacos, com núcleos
difíceis de distinguir, e as células organizam-se em estruturas em forma de roseta (Figura 2.14).
29
Figura 2.14. Cultura de progenitores neurais no terceiro dia de monocamada em PDL-Laminina, observadas com luz visível
em campo claro.
As células tendem a formar estruturas organizadas em forma de rosetas. Uma roseta encontra-se destacada dentro do
círculo a vermelho (Escala = 30μm).
a. b.
Figura 2.15. Repórter Sox1-GFP para monitorização de diferenciação neural em monocamada.
a. Cinética da população positiva Sox1-GFP. O decréscimo de células GFP+ após o dia 8 de cultura ocorre devido ao facto
de a diferenciação em células da glia e neurónios é acompanhada por uma diminuição da expressão de sox1; b. Número
de células em cultura durante a diferenciação. Dados recolhidos da mesma amostra de a. Deste modo, fica claro que ao
decréscimo do número de células Sox1-GFP positivas se deve a uma diminuição da expressão deste gene e não a uma
diminuição real do número de células em cultura (Adaptado de Ying et al., 2003).
O traçado do gráfico da Figura 2.15a reflecte a capacidade de manutenção do estado de
precursor neural durante 12 dias, após início da diferenciação. Bekman e colaboradores (Bekman
et al.. 2006) revelam que a partir deste ponto a percentagem de células Sox1-positivas decresce
devido a um aumento da diferenciação dos precursores em células da glia e neurónios. Os autores
referem que a percentagem de neurónios no 12º dia de replaqueamento atinge os 30% do número
total de células em cultura.
Para culturas em monocamada de células 46C, estudos de imuno-histoquímica (Bekman et
al., 2006) com marcadores da região apical, como ZO-1 ou o complexo de polaridade PAR,
indicam que os conjuntos de progenitores neurais organizados em rosetas são semelhantes a
pequenos tubos neurais, com domínios apicais bem definidos, à volta dos quais os progenitores
GFP positivos estão distribuídos. Do mesmo modo, componentes presentes nas junções apicais
30
como N-caderina e β-catenina parecem localizar-se apenas na mesma região luminal.
Detecção de neurónios diferenciados pelos anticorpos Tuj1 e HU revelam a presença dos
mesmos na região exterior à roseta, mimetizando a consequência da sua normal migração do tubo
neural para a região ventricular.
Um dos mecanismos ainda pouco estudados mas com importância na determinação da
linhagem neural prende-se com a dinâmica do cálcio nos precursores neurais.
Conhecendo a importância do cálcio em processos de movimento celular e dado que está
reportada a existência de movimento de precursores neurais no tubo neural in vivo, seria do
máximo interesse aliar o estudo do movimento de precursores neurais em cultura de monocamada
com a monitorização da concentração de cálcio nas células em questão.
2.1.6. CÁLCIO
Cada tipo celular exprime um conjunto de componentes do Ca2+-signalling toolkit (Figura
2.16) tendo consequentemente sistemas de sinalização com propriedades espaciais e temporais
distintas.
Figura 2.16. Hipótese de indução-sinalização por cálcio.
Para além da activação de respostas celulares, o cálcio constitui também uma parte de um mecanismo de feedback que
regula transcrição de vários genes e é responsável por manter o conjunto de bombas, canais, buffers e efectores do Ca2+-
signalling toolkit (Adaptado de Berridge et al., 2003).
Pode ocorrer entrada de cálcio para a célula a partir do meio externo devido a uma grande
variedade de estímulos, nomeadamente despolarização, presença de agonistas extracelulares ou
mensageiros intracelulares, ou deplecção dos locais de armazenamento internos. Para o meio
intracelular, a libertação de moléculas de cálcio provenientes do retículo endoplasmático (RE) ou
sarcoplasmático (RS) é controlada pelas diferenças de concentração existentes, ou por
mensageiros como o inositol-1,4,5-trifosofato [Ins(1,4,5)P3], ADP ribose cíclica (cADPr) ou
esfingosina-1-fosfato (S1P). Para remoção do cálcio do citoplasma são activadas a bomba
Na+/Ca2+, Ca2+-ATPase de membrana ou Ca2+-ATPase do retículo sarco(endo)plasmático (Figura
2.17).
31
Figura 2.17. Dinâmica da sinalização por cálcio.
Durante as reacções on, a maioria de cálcio, encontra-se ligado a buffers, enquanto uma pequena proporção se liga a
efectores que activam uma grande variedade de processos. Nas reacções off, o cálcio é libertado e removido da célula por
várias bombas e transportadores: bomba Na+/Ca2+ (NCX), Ca2+-ATPase de membrana (PMCA) ou Ca2+-ATPase do retículo
sarco(endo)plasmático (SERCA). A mitocôndria tem também uma função activa na medida em que incorpora cálcio através
de um transportador uniporta e o liberta para o citoplasma lentamente
(Adaptado de Berridge et al., 2003).
CÁLCIO E O CICLO CELULAR
O ciclo celular das células eucarióticas é dividido em quatro fases distintas: G1, S, G2 e M.
Pode considerar-se que o ciclo começa com Mitose (M), mecanismo a quatro tempos: profase,
metafase, anafase e telofase, seguidos de citocinese, através do qual as células se dividem. Após
divisão celular, ocorre a entrada na interfase, período no qual as células aumentam de volume
continuamente. Dela fazem parte as fases S, G1 e G2. É na fase S que ocorre duplicação de
património genético, constituindo G1 e G2 fases de transição antes e após este período. O tempo
dispendido pelas células em G1 é variável. No entanto, o momento preciso em a célula inicia a
duplicação de DNA está bem determinado. É neste ponto que ocorre a síntese de muitas
proteínas, enzimas e RNA, verificando-se também a formação de organitos celulares. Como
consequência, em G1, e ainda em maior escala em G2, ocorre aumento de volume celular.
Quando as células são privadas de factores de crescimento, saem do ciclo celular e permanecem
num estado de quiescência denominado de fase G0. Moléculas com papel crucial em todo este
processo são as cinases de ciclo celular, que adquirem a sua forma activa por associação com
ciclinas, através de mecanismos ainda pouco conhecidos (Santella, 1998). A existência de
segundos mensageiros que despoletam a iniciação de cascatas de sinalização para activação das
cinases é considerada uma forte hipótese. O Cálcio constitui uma das moléculas mais importantes
como segundo mensageiro possível.
32
Em células somáticas de mamíferos, oscilações espontâneas de cálcio podem ser
observadas durante a transição entre fase G0 e G1, correlacionadas com a activação de genes
que permitem a reentrada no ciclo celular. Antes da fase S, oscilações promovem síntese de DNA,
enquanto um aumento da concentração de cálcio intracelular ocorre na transição de G2 para a
mitose.
Em células estaminais embrionárias de murganho, foi já demonstrada a existência de picos
de cálcio não sincronizados entre as células vizinhas, confinados a transições de G1 para a fase S
(Kapur et al., 2007).
Figura 2.18. Imagens bidimensionais adquiridas em microscópio confocal de células estaminais embrionárias de rato,
incubadas com Fluo-4 AM.
A. Oscilações espontâneas dos níveis de cálcio intracelular; B. A fluorescência normalizada de células individuais é
representada em função do tempo. Os números dos traçados correspondem às células individuais marcadas em A, e os
asteriscos aos instantes de tempo da aquisição das imagens (Adaptado de Kapur et al., 2007).
Conhecendo a existência de sinalização por cálcio em células estaminais em cultura, é
assim relevante determinar o papel deste elemento na indução neural
CÁLCIO E A INDUÇÃO NEURAL
O modelo de indução neural previa a existência de sinais inibitórios, como as BMPs,
membros da família de TGF-β, que bloqueiam a via neural, em detrimento da epidermal. Este facto
sugere que os indutores neurais como Noggin e Chordin actuavam bloqueando directamente a
interacção entre as BMP e os seus receptores, inibindo a transdução da via de sinalização (Figura
2.19).
33
Figura 2.19. Modelo de indução neural e epidermal em embrião de Xenopus laevis.
A. No caso de indução epidermal, a transdução do sinal a partir da ligação de BMP leva à formação de complexos entre
proteínas Smad que, quando translocadas para o núcleo, activam a expressão de genes epidermais, reprimindo os a
transcrição dos neurais; B. No caso de indução neural, indutores neurais como Noggin inibem a ligação das BMP com os
seus receptores de membrana, resultando na expressão de genes neurais (Adaptado de Moreau et al., 2004).
Contudo, experiências em Xenopus laevis mostraram que uma estimulação dos canais de
cálcio tipo-L, que permite um aumento transiente do cálcio intracelular, provoca também indução
neural mesmo na presença de BMP. Dados adicionais de alteração do destino epidermal para
neural após aumento da concentração de cálcio intracelular levaram à formulação de um novo
modelo (Figura 2.20): do mesmo modo que Noggin e Chordin impedem a ligação das BMPs aos
seus receptores no modelo anterior, esta via de inibição está também presente. Como dado
adicional, foi descrito o bloqueio da cascata de Smads através da calcineurina, uma fosfatase
dependente de cálcio, e a activação de uma cinase (CaMkinaseII) pelo cálcio que conduz à
transcrição imediata de genes envolvidos na aquisição do destino neural.
Figura 2.20. Novo modelo de indução neural em Xenopus laevis.
O cálcio desempenha o papel principal, através da activação da calcineurina que previne a fosforilação das Smads. Por
outro lado, o cálcio é também responsável pelo controlo da transcrição de genes, tanto directamente, como via activação
da calcium calmodulin kinase type II (CaMKII). Os canais de tipo L são activados após ligação do BMP a indutores neurais
(Adaptado de Moreau et al., 2004).
34
INDICADORES DE CÁLCIO
Dada a importância dos fluxos de cálcio entre os meios extra e intra-celulares em vários
processos, nomeadamente a aquisição de identidade neural, foram desenvolvidos diferentes
fluoróforos passíveis de incorporação nas células em estudo com o objectivo da monitorização da
concentração de cálcio intracelular. Os fluoróforos do grupo Indo, Fluo, Fura e Oregon constituem
alguns exemplos.
Todos os indicadores de cálcio são baseados em BAPTA (ácido 1,2-bis-(2-
aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’-tetraacético), um homólogo de EGTA insensível a pH. Tal como o
último, BAPTA retém uma elevada sensibilidade para o Ca2+ (Kd ~ 100 nM a pH 7.0) na presença
de concentrações potencialmente competidoras de Mg2+ para este composto químico. Como
resultado da aromatização dos Azotos alifáticos do EGTA, o BAPTA tem elevadas taxas de
criação e rompimento da ligação com Ca2+.
Indicadores baseados em BAPTA são incorporados nas células por uma transformação
temporária dos carboxilatos em acetometil ésteres (AM). Estas moléculas hidrofóbicas não
carregadas difundem-se passivamente através das membranas celulares libertando o indicador de
policarboxilato após clivagem da parte éster por esterases intracelulares (Yuste et al, 2005),
podendo aumentar assim a sua fluorescência após ligação ao cálcio.
Figura 2.21. Obtenção de Fluo-4, fluorescente e impermeável na membrana celular (direita) a partir da esterificação de um
outro composto (esquerda), não fluorescente e permeável celular.
O local de ligação do Ca2+ dos indicadores derivados de BAPTA pode também ser
modificado de modo a alterar a afinidade do composto para o metal numa elevada gama de
concentrações, desde nanomolar até milimolar (Figura 2.22).
35
Figura 2.22. Modificações estruturais da molécula de BAPTA para formação dos compostos Fluo
(Adaptado de ‘Invitogen.com’).
Para incorporação do fluoróforo nas células de interesse, vários protocolos sugerem a
incubação a 37ºC com uma solução do fluoróforo e observação imediata da fluorescência
adquirida.
EXEMPLO DE APLICAÇÃO
No córtex cerebral, os neurónios pós-mitóticos têm movimentos de migração da região
onde são produzidos para a sua posição final da camada granular interna. Durante a migração, o
movimento das células é caracterizado por uma alternância entre fases estacionárias e
movimentos na mesma direcção, mas em sentidos opostos, sendo a taxa de migração
aparentemente controlada pela concentração externa de cálcio e o seu influxo através dos canais
de tipo L (Komuro et al., 1996). Experiências com indicadores de cálcio (Fluo-3 e Fura-Red) em
culturas de cerebelo revelam que cada fase do movimento “saltatório” das células está
correlacionada, temporalmente, com a frequência e amplitude de flutuações espontâneas de cálcio
intracelular (Figura 2.23).
Figura 2.23. Movimento celular é acompanhado de flutuações de cálcio. A. Representação em função do tempo das
alterações de fluorescência devido a níveis de cálcio de uma célula em migração; B. Direcção e distância percorrida pela
mesma célula durante cada minuto do ensaio de medição de níveis de cálcio. Imagens da migração foram adquiridas a
cada 30s durante 45min, após incubação das células com 1mM de Fluo-3 (Adaptado de Komuro et al., 1996).
36
2.2. MICROSCOPIA
Datam de 1660 as primeiras observações de vasos capilares por Marcello Malpighi (1628-
1694) com recurso a um microscópio. No entanto, é ao nome de Robert Hooke (1635-1703) que
comummente se associam os primeiros passos dados na evolução desta área. Seu
contemporâneo, foi Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) o responsável pelas primeiras
observações de seres vivos a elevadas ampliações.
Em 1830 Joseph Lister resolveu matematicamente o problema da aberração esférica,
facultando a prova necessária para que Ernst Abbe (1840-1905) e Carl Zeiss (1816-1888)
publicassem um artigo científico em 1877 definindo o conceito de distância de resolução,
formalmente tida como Lei de Abbe. Foi da responsabilidade desta dupla a invenção das
objectivas de imersão a óleo, fixando o limite máximo de resolução de 0,2μm para microscopia de
luz visível, situado actualmente em 0,1620μm. No entanto, técnicas recentes permitem atingir
resoluções de poucos Å, recorrendo à obtenção de padrões de interferência com luz visível.
PRINCÍPIOS FÍSICOS
A maior parte das propriedades dos instrumentos de formação de uma imagem
(telescópios, câmaras ou microscópios) podem ser interpretados a partir dos fundamentos da
Óptica. Qualquer superfície esférica pode ser considerada uma lente, na medida em que altera o
sentido de um feixe de raios paralelos se colocada na sua linha de propagação. Neste sentido,
todas as lentes têm distâncias focais definidas, nos dois sentidos a partir dela, definidas no eixo
comum a partir do seu centro. A distância focal determina o local do ponto focal, situado na
intersecção dos raios refractados pela lente (Figura 2.24).
Figura 2.24. Representação do processo de formação de uma imagem com uma lente convexa
(Adaptado de ‘OLYMPUS’).
Para discussão da maior parte dos princípios subjacentes aos fenómenos de microscopia é
suficiente considerar a luz como um campo escalar. Contudo, uma onda luminosa tem natureza
electromagnética e por isso, pode ser representada por uma função periódica (1),
A(x,t) = A0 sin(k(x-vt)) (1)
onde A0 representa a amplitude da onda. O argumento da função seno é linear tanto na
posição (x) como no tempo (t), de modo a representar a sua propagação no espaço a uma
37
determinada velocidade (v). A direcção de propagação será +x para valores positivos de v, e no
sentido contrário para valores negativos de v. A(x,t) pode ser representado tanto no eixo espacial,
dado um instante de tempo, como no eixo temporal, fixada uma coordenada x. No caso de uma
representação tridimensional, a função de onda terá de ser definida como
A(r,t) = A0 sin(k.r-ωt+ϕ) (2)
A equação (2) representa uma onda monocromática normal ao vector k que se propaga na
direcção definida no espaço tridimensional por r (Figura 2.25).
Figura 2.25. Representação de uma onda electromagnética, com as suas componentes eléctrica e magnética
(Adaptado de ‘OLYMPUS’).
Devido ao facto de a função seno ter uma frequência natural de 2π, é a constante k que
estipula o comprimento de onda λ. Em (1), k não é mais que o equivalente à norma de k em (2).
k = ||k|| = 2π/λ (3)
A frequência da onda, ν, pode ser vista como o número de ciclos que ocorrem por unidade
de tempo, tal que o produto da frequência pelo comprimento de onda originará a velocidade v de
propagação da onda (4).
νλ = v (4)
ω/k = v (5)
Em (5) a frequência angular ω virá então expressa em rad/seg.
Para a luz no vácuo, vem que v = c.
Quando uma onda passa por uma fronteira onde o índice de refracção é diferente, a
velocidade da onda é alterada pelo custo de alteração do comprimento de onda e não da
frequência (4), característica intrínseca e constante. Por outro lado, pode explicar-se o desvio de
trajectória de um raio ao atravessar dois meios com propriedades diferentes através da lei da
refracção de Snell-Descartes (6).
n1 sin(θ1)= n2 sin(θ2) (6)
O índice de refracção, n, (7) apresenta-se como o rácio entre a velocidade da luz e a
velocidade da onda em cada material (vi).
ni = c/vi (7)
38
Tabela 2.1. Índices de refracção de alguns meios usados em cultura de células
(adaptado de Yuste et al., 2005).
Tipo de material Índice de refracção
Ar 1,00028
Água 1,333
Meio de cultura ou salino 1,335
Células animais 1,36
Óleo de imersão 1,51
Vidro 1,52
Numa abordagem quântica, a energia transportada pela onda é proporcional à densidade
de fotões e energia transportada por cada um (8).
e = hν = hc/λ (8)
onde h representa a constante de Planck.
CÂMARAS CCD
Dado às suas características de desempenho quando incorporadas em equipamentos de
imagiologia, as câmaras CCD são comummente em microscopia como transdutor dos sinais
luminosos provenientes da amostra. Como aspectos importantes tem-se o seu ecrã plano,
linearidade de resposta em diferentes janelas de operação, possibilidade de variação do tamanho
e tipo de pixel e baixo ruído associado (Yuste et al., 2005).
Figura 2.26. Princípio de funcionamento de uma câmara CCD
(Adaptado de “Basics of Light & Imaging”, OLYMPUS).
A resolução de um detector CCD é apenas determinado pelo tamanho de cada pixel. Deste
modo, imagens com a maior resolução possível terão de ser adquiridas com o sensor utilizando o
menor tamanho de pixel disponível. Duas estruturas adjacentes são resolvidas pela câmara CCD
se os seus máximos forem aquiridos por pixeis diferentes com, pelo menos um pixel com sinal de
menor intensidade entre os anteriores. Isto significa que um objecto necessita de, no mínimo, dois
39
pixeis para ser adquirido sem perda de informação, levando a que a mínima separação entre
objectos que a CCD consegue verdadeiramente distinguir equivalente ao tamanho de dois pixeis
unitários. Assim,
Resolução da CCD = 2 x Xp (9)
sendo Xp o tamanho de um pixel (µm).
Por outro lado, a resolução da imagem é dependente da magnificação da objectiva e
qualquer outro sistema de lentes anterior à câmara de transdução. No caso de uma CCD,
Xim = Xobj x Mobj x Mtl (10)
onde Xim é o tamanho da imagem, Xobj o tamanho do objecto, Mobj a ampliação da objectiva,
e Mtl a ampliação de qualquer outro conjunto de lentes (se não existir, Mtl = 1), se usadas.
FOTOMULTIPLICADORES
Um fotomultiplicador é um tubo de vidro, sob vácuo, constituído por um fotocátodo que
recebe os impulsos luminosos e liberta electrões por efeito fotoeléctrico. Estes electrões são
multiplicados por um sistema formado por um conjunto de eléctrodos (10 a 14), os dínodos, que
termina num ânodo onde se recolhe o sinal (Figura 2.27). O sinal de saída é assim uma corrente
proporcional ao número de fotões incidentes no fotocátodo, e à voltagem aplicada aos terminais
do fotomultiplicador.
Figura 2.27. Princípio de funcionamento de um fotomultiplicador
(Adaptado de “Basics of Light & Imaging”, OLYMPUS).
ELECTRON MULTIPLYING CCD (EMCCD)
As câmaras EMCCD são consideradas soluções híbridas entre as câmaras CCD e os
fotomultiplicadores. Os fotões provenientes da amostra são recebidos inicialmente por uma CCD
e, como ao ecrã da câmara está acoplado um sistema de aumento de ganho, existe uma
multiplicação considerável do sinal recebido. Esta amplificação é feita por um mecanismo de
ionizações sucessivas, semelhante ao presente num fotomultiplicador.
A principal vantagem deste sistema é a redução do ruído de leitura que, mesmo em
condições de baixo ganho, é aproximadamente de um electrão. Consequentemente tem-se um
aumento de sensibilidade para este tipo de detector.
40
2.2.1. MICROSCOPIA DE LUZ TRANSMITIDA
MODELO DE ABBE
A relação entre abertura e resolução num microscópio foi primeiramente reportada por
Abbe a partir de um modelo que considerava a amostra como sendo uma grelha de difracção
imersa num meio com índice de refracção n (com comprimento de onda igual a λ0/n, sendo λ0 o
comprimento da onda no vácuo). Este modelo retrata exactamente o que acontece em
microscopia de luz transmitida, na qual existe coerência espacial entre os raios que penetram na
amostra numa direcção particular. Se a grelha for iluminada por um conjunto de ondas
monocromáticas planas provenientes do condensador, a luz transmitida forma um conjunto de
padrões de difracção que se deslocam em ângulos perfeitamente definidos relativamente ao
ângulo de incidência da luz.
Para uma grelha composta por fendas de período p, iluminada por uma luz de comprimento
de onda λ0/n, máximos de difracção ocorrerão a ângulos θN, nos quais o incremento do percurso
do feixe é um múltiplo exacto do comprimento de onda em questão. Este requisito garante
interferência construtiva (11).
p sin(θN) = N λ0/n , com N = 0, ±1, ±2, ±3, …, ±Nmáx (11)
onde Nmáx é definido pelo requisito de |sin(θN)| ≤ 1.
Quando as ondas planas incidentes são oblíquas à amostra, com ângulo de incidência de
θi, a condição para interferência construtiva resulta de uma pequena modificação de (11).
p (sin(θN)-sin(θi)) = N λ0/n (12)
Caso particular surge quando θi = -θmáx, que conduz a que a ordem zero de interferência
saia e entre na objectiva com um ângulo de -θmáx, e o primeiro máximo ocorra a +θmáx. Está assim
estipulado o limite de resolução do microscópio
pmin (sin(θmáx)-sin(-θmáx)) = pmin (2sin(θmáx)) = λ0/n
equivalente a
pmin = λ0/(2n.sin(θmáx)) (13)
A quantidade n.sin(θmáx) refere-se à abertura numérica, NA, do sistema óptico.
Em casos onde a abertura numérica do condensador, NAcond, difere da da objectiva, NAobj,
(13) passa a
pmin = λ0/(NAcond+NAobj) (14)
É neste ponto que se torna clara a importância do condensador em sistemas de aquisição
de imagem de luz transmitida. Esta parte do sistema não tem como objectivo apenas a
concentração de luz no campo de visão, mas também controla os ângulos de incidência da luz na
amostra, garantindo que a abertura numérica da objectiva está a ser maximamente utilizada na
captação de todas as possíveis ordens de difracção de todos os elementos constitutivos da
amostra passíveis comparação com a rede de difracção de Abbe.
De maior importância é o limite de resolução intrínseco do microscópio, determinado pela
41
difracção da luz em toda a óptica usada, com a mínima distância detectável entre dois pontos
luminosos dada pelo critério de Rayleigh (15). Esta igualdade refere que para dois pontos serem
detectáveis é necessário que os seus máximos se situem a uma distância angular tal que à
posição do máximo de um ponto corresponda, pelo menos, ao mínimo do outro (Deus et al.,
2000).
d = 0.61 x λ/NA (15)
sendo d a distância mínima detectável entre dois pontos, λ o comprimento de onda da luz, e
NA a abertura numérica da objectiva em uso.
CAMPO CLARO
Na sua forma mais básica, sem necessidade de recorrer a qualquer tipo de filtros, a
microscopia de campo claro pode ser útil na visualização de estruturas onde o contaste da
amostra, intrínseco ou após colorações, é por si suficiente para uma descrição do objecto em
estudo. As imagens são formadas por alterações da absorvância dos elementos constituintes da
amostra, originando diferentes intensidades colectadas pelo detector.
2.2.2. FLUORESCÊNCIA
Até ao momento, a microscopia de fluorescência tem sido o método mais largamente usado
para estudo de estruturas fixadas ou vivas, muito devido à elevada especificidade dos marcadores
fluorescentes para vários componentes celulares e moleculares. A elevada especificidade na
detecção das mesmas também contribui em muito para esta primazia.
Neste sentido, foi a introdução da GFP (Green Fluorescent Protein) em 1998 que permitiu
uma revolução no conceito de fluorescência na biologia celular moderna. Tratando-se de uma
proteína proveniente da medusa Aequorea victoria a sua fluorescência é devida a p-
hidroxibenzildeneimidazoliona formada numa reacção auto-catalítica dos aminoácidos 65 a 67
(Ser-Tyr-Gly) na proteína nativa. Devido ao facto de a parte fluorescente estar confinada ao
interior da molécula (Figura 2.28), a GFP tem elevada estabilidade e resistência a desnaturação
por proteases e quenching por Oxigénio e alterações de pH. O pico de excitação situa-se a
488nm, com máximo de emissão a 507nm.
42
Figura 2.28. Estrutura da GFP, com a localização da parte fluorescente evidenciada no seu interior.
Fusões GFP podem ser facilmente obtidas por técnicas de recombinação standard no seu
terminal amino ou carboxil, no entanto, é necessária a verificação de que a introdução dessa
sequência codificante não interfere com a viabilidade celular.
MECANISMOS DE ABSORÇÃO/EXCITAÇÃO
O processo de fluorescência foi primeiramente descrito por Stokes em 1852 e consiste na
emissão de luz por moléculas excitadas após absorção de fotões de determinado comprimento de
onda. A diferença entre os comprimentos de onda dos fotões emitidos e os que provocaram a
excitação depende apenas das orbitais mais externas do fluoróforo específico.
O estado fundamental onde se encontram a maior parte dos electrões do fluoróforo antes
da absorção de luz é designado por S0. A energia transferida para estes é convertida em cinética
vibracional e rotacional, provocando alteração do estado energético dos electrões na molécula.
Ocorre transição para um estado excitado se os fotões incidentes ultrapassarem um determinado
limiar de valor de energia, apenas dependente do seu comprimento de onda, segundo (8). As
orbitais para as quais a transição ocorre são denominadas de Si (i=1,2,…,n), aumentando i com o
aumento da distância ao núcleo e, como tal, da energia necessária para a transição. Como em
cada estado electrónico existem vários estados vibracionais e rotacionais, para excitação de um
fluoróforo para um determinado estado excitado, são possíveis fotões com energias
correspondentes a um intervalo de comprimentos de onda. Deste modo, o espectro de excitação
dos fluoróforos consiste em picos com desvio padrão diferente de zero e não somente por deltas
de Dirac.
Vários processos de perda de energia podem ocorrer a partir daqui. Dentro do mesmo
estado excitado, os electrões podem perder alguma da sua energia vibracional, dando origem à
denominada relaxação vibracional. Caso essa transição ocorra entre estados vibracionais de
níveis energéticos diferentes, trata-se de conversão interna. Ambos estes mecanismos ocorrem
sem emissão de radiação, colocando o electrão no estado vibracional e rotacional de menor
energia dessa orbital. Libertação de fotões de fluorescência ocorre a partir deste ponto, quando os
electrões perdem toda a sua energia no retorno ao estado fundamental.
Fluorescência não é o único processo pelo qual os electrões voltam ao estado fundamental.
43
Pode também formação de tripletos energéticos, com libertação de luz de fosforescência,
responsáveis em parte pelo processo de fototoxicidade deste tipo de iluminação.
Figura 2.29. Diagrama de Jablonski.
A luz absorvida excita electrões do fluoróforo para um nível energético superior. Vários mecanismos intermédios podem
ocorrer, havendo emissão de luz de fluorescência pelo regresso do electrão ao seu estado fundamental após um intervalo
de tempo de 10ns (Adaptado de “Basics of Light & Imaging”, OLYMPUS).
FONTES DE LUZ
As fontes de luz mais comuns para microscopia de fluorescência são lâmpadas de mercúrio
a alta pressão, arcos de Xénon ou lâmpadas de metal halide, um híbrido entre as anteriores.
Como output, ambas apresentam uma luz concentrada branca, mas possuem características
diferentes a nível de componentes espectrais (Figura 2.30). Os arcos de Mercúrio têm a maior
parte da luz com comprimentos de onda em torno de picos centrados nas linhas de emissão do
átomo em fase gasosa, nomeadamente a: 254nm (UV), 265nm (UV), 365nm (UV), 405nm
(violeta), 436nm (azul), 546nm (verde), e 578nm (amarelo). Esta fonte é ideal se existir uma
grande coincidência entre a banda de excitação de um determinado fluoróforo e estes picos. Fora
destes valores, a potência da lâmpada é aproximadamente nula. Pelo contrário, os arcos de
Xénon emitem um contínuo de frequências entre 250 e 800nm, mas menos intensas.
Figura 2.30. Espectros de emissão das lâmpadas de Mercúrio e Xénon
(Adaptado de “Basics of Light Microscopy & Imaging”, OLYMPUS).
44
FILTROS USADOS
O primeiro elemento de filtragem num microscópio de epifluorescência é um conjunto de
três filtros alojados num cubo: filtro de excitação, de emissão e um dicróico.
I. O filtro de excitação, um passa-banda ou passa-baixo, transmite apenas os comprimentos
de onda específicos que excitam o fluoróforo em questão. Usualmente a sua nomenclatura está
relacionada com o tipo de fluoróforo com que podem ser usados.
II. O filtro de emissão tem como função a selecção dentro de uma janela de comprimento
de onda específico toda a luz de emissão proveniente da excitação específica do fluoróforo
pretendido. O valor do pico máximo desta luz é sempre de maior comprimento de onda que a luz
de emissão (Figura 2.31), devido à libertação de uma parte da energia de excitação no processo
de relaxamento.
Este tipo de filtros tanto pode ser passa-alto como passa banda.
Figura 2.31. Representação esquemática de um espectro de excitação e emissão de um fluoróforo genérico
(Adaptado de “Basics of Light Microscopy & Imaging”, OLYMPUS)
III. O espelho dicróico é uma pequena peça com uma superfície plana interna disposta num
ângulo de 45º relativamente ao caminho óptico. A cobertura desta área torna-o altamente
característico, por reflectir apenas uma cor, correspondente à luz de excitação, e transmitir outra
cor, a luz de emissão.
Figura 2.32. Representação esquemática da disposição de todos os constituintes de um sistema de aquisição de
microscopia de fluorescência
(Adaptado de Haragushi et al., 1999).
45
CONSTRUÇÃO DA IMAGEM
A formação da imagem num sistema óptico de fluorescência difere bastante de
microscópios de luz transmitida. Os estados moleculares que dão origem à fluorescência têm um
tempo finito de vida de alguns nanosegundos e, normalmente, cada molécula de fluoróforo emite
fluorescência de modo independente. Para substituição do modelo de Abbe (Secção 2.2.1), tem-
se agora um conjunto de pontos emissores de frentes de onda esféricas, representando a emissão
espontânea de luz por moléculas individuais, tendo sido este modelo inicialmente desenvolvido por
Rayleigh (1842-1919) na análise de imagens de estrelas, consideradas elementos pontuais para
os telescópios. Como consequência, a imagem de fluorescência é apenas a sobreposição ou
soma do padrão de intensidade formado por cada fluoróforo pontual da amostra.
Essencialmente o que a objectiva faz é a colecção de uma secção circular da frente de
onda, transformando-a numa onda convergente no plano da imagem. Devido a esta limitação
espacial, a onda deixou de ser completamente esférica, passando a ter modificada a sua
amplitude e fase. Deste modo, em vez de a transformação ser um delta de Dirac, são formados
círculos concêntricos progressivamente atenuados com a distância ao centro, chamados de discos
de Airy (1801-1892), em sua honra.
Figura 2.33. Discos de Airy como uma medida do poder de resolução.
Exemplo de objectivas de diferentes aberturas numéricas: baixa à esquerda, e de mais elevada à direita (Adaptado de
“Basics & Light Microcopy”, OLYMPUS).
2.2.3. MICROSCOPIA CONFOCAL
Muito do crescente interesse pelo uso de microscópios confocais prende-se com o aumento
do número de fluoróforos à disposição dos grupos de investigação molecular e celular.
Infelizmente, imagens de fluorescência são altamente degradadas pela luz refractada ou emitida
pelas estruturas fora do plano de foco. Este problema torna-se particularmente nefasto na
observação de amostras espessas (como cortes de cérebro ou embriões inteiros) e é aumentado
devido à baixa resolução no eixo dos z dos microscópios widefield convencionais.
Grande advento nesta área foi a introdução de microscópios confocais na medida permitem
rejeitar a luz fora do plano de foco, aumentando assim a resolução em z logo na aquisição.
46
ENQUADRAMENTO HISTÓRICO
O princípio subjacente à microscopia confocal foi primeiramente descrito por Marvin Minsky
em 1961: a luz proveniente de um ponto na amostra, após passar pela objectiva, atravessa uma
abertura (pinhole), cujo tamanho, controlável pelo utilizador, define a espessura do plano referente
à luz que se está a colectar. Luz fora do foco pretendido será bloqueada pela abertura. Assim,
apesar de a intensidade de luz recolhida pelo detector ser reduzida, apenas é colectada luz do
plano de foco pretendido. Esta característica, usualmente chamada de seccionamento óptico, é útil
para reconstrução 3-D de estruturas vivas sem o uso de cortes no sentido literal da palavra.
Sendo a iluminação da amostra pontual, por varrimento do campo de observação segundo
eixos ortogonais é formada uma imagem do objecto em estudo.
IMPLEMENTAÇÃO
Segundo Minsky, o modo mais simples de implementação desta tecnologia é a fixação de
todo o percurso da luz, movimentando a amostra debaixo do feixe incidente. Esta opção permite
varrimento de maiores áreas no entanto, torna-se impraticável quando a amostra está ligada
fisicamente a outros sistemas.
Melhoria posterior foi a conjugação de aberturas concêntricas num disco, de Nipkow, tanto
na luz incidente como na transmitida. Este dispositivo permite a iluminação e obtenção de
informação de vários pontos da estrutura ao mesmo tempo, poupando a quantidade de luz a que a
amostra está sujeita.
Varrimento por laser é também uma opção de implementação desta descoberta. No caso
de sistemas baseados em espelhos, a linha de interesse do espectro do laser é seleccionada
através de um modulador óptico-acústico [acousto-optical modulator (AOM)]. O varrimento no
plano da amostra é feito com o recurso a espelhos controlados por galvanómetros que
direccionam o feixe de laser na direcção pretendida. Luz de fluorescência amostra retorna em
sentido contrário e, após passar pelo dicróico, transparente, para o comprimento de onda em
questão, é focado na abertura situada em frente ao detector. O sinal de saída do detector é
correlacionado com a posição computacionalmente controlada dos espelhos, permitindo a
reconstrução de uma imagem a duas dimensões (Yuste et al., 2005).
47
Figura 2.34. Representação esquemática da disposição espacial dos componentes principais num microscópio confocal.
Raios de luz provenientes de regiões fora do plano de foco (laranja) são bloqueados pelo pinhole, não contribuindo para a
formação da imagem (Adaptado de “Confocal Laser Scanning Microscopy – Principles”).
Dado que em biologia há eventos que ocorrem a uma escala muito reduzida de tempo, e
que o uso de galvanómetros, pesados, leva a que o varrimento da amostra seja demasiado lento,
foi tentado o uso de fibra óptica para obtenção de velocidades de varrimento superiores. Através
de uma excitação acústica são formadas ondas de refracção que levam à vibração de um cabo de
fibra óptica, que funciona como pinhole, transmissor e receptor da luz de laser.
Sistemas mais avançados foram desenvolvidos pela Leica e Zeiss recorrendo ao uso de
vários detectores para uma aquisição simultânea de diferentes comprimentos de onda. Dispersão
espectral da luz de fluorescência de emissão por um prisma ou uma rede de difracção são
exemplos usados.
2.3. MICROSCOPIA EM TEMPO REAL DE CÉLULAS
2.3.1. VIABILIDADE CELULAR
Controlo das condições externas à cultura são factor fundamental a ter em conta quando se
pretende fazer aquisições de imagens em tempo real. Para tal existem algumas estratégias de
manutenção da viabilidade celular durante a aquisição de imagens que incluem selecção da
câmara de incubação, temperatura, condições de crescimento, natureza do meio ou osmolaridade
do mesmo. Em geral, as câmaras usadas possuem uma janela de vidro, usualmente da espessura
de uma coverslip, através da qual as imagens são adquiridas, com possíveis entradas para adição
48
de meio de cultura ou seringas de adição de drogas ou microinjecção.
Dado que a função celular é intimamente regulada pela temperatura do meio, uma grande
variedade de métodos estão disponíveis para controlo da temperatura das culturas no
microscópio. Algumas câmaras comerciais de incubação incluem já a possibilidade de
aquecimento. Contudo, há que ter em conta a possibilidade de não estabilidade de temperatura
quando se aquece apenas a câmara de incubação e não todo o sistema de objectivas e platina do
microscópio, dado que estes podem funcionar como escape de calor durante a aquisição. Para tal,
existem sistemas onde a objectiva é aquecida ou todo o microscópio está dentro de uma câmara
aquecida a ar. Esta última solução minimiza movimentos da amostra, para fora do plano focal
pretendido, devidos a expansão térmica dos elementos do microscópio. Dependendo da situação
em causa e dos meios disponíveis, uma ponderação tem de ser feita antes da iniciação de
qualquer experiência com estas exigências.
Células de mamífero são mantidas em condições específicas, usualmente em meio
definido, suplementado com factores de crescimento, e/ou soro animal, contendo um sistema de
tampão com o objectivo de manter um pH constante. A maior parte dos meios usados no
crescimento celular depende de uma atmosfera de 5% CO2 para manutenção de pH fisiológico, o
que pode ser atingido por selamento da câmara após purgar a câmara com CO2 ou mantendo a
câmara numa atmosfera controlada. Em alternativa, existe a opção do uso de meios não
dependentes de CO2.
Independentemente da estratégia adoptada, o seu efeito na viabilidade celular deve ser
testado.
2.3.2. FOTOTOXICIDADE
Uma das causas, ou talvez a principal, da fototoxicidade causada pela exposição de células
a luz de fluorescência é a libertação de radicais livres. De acordo com a Figura 2.29, após
absorção de um fotão, o fluoróforo permanece no estado excitado durante alguns nanosegundos.
Um “bom” fluoróforo decairá de novo para o estado fundamental por libertação de um fotão de
emissão. No entanto, existe a possibilidade de conversão da estrutura energética na de um
tripleto, altamente reactiva, podendo levar à formação de radicais livres, nomeadamente de
Oxigénio. Apesar de a célula ter mecanismos enzimáticos intrínsecos de conversão destes
radicais livres em compostos menos nocivos, esta via tem resultados efectivos se não estiver
saturada, o que acontece se se ultrapassar o limite de fluorescência de cada tipo celular. De modo
a minimizar as possíveis consequências deste efeito pode suplementar-se o meio com scavengers
de elevada especificidade para esses radicais tais como o ascorbato (vitamina C) ou TroloX (um
derivado de vitamina E). Caso não se pretenda fazer muitas alterações ao meio ideal de cultura,
uma outra solução será reduzir o tempo de exposição à fonte de luz.
Um aspecto importante em aquisições de imagens de culturas células de longa duração é a
possibilidade de evaporação do meio de cultura, alterando a osmolaridade do mesmo que resta
sobre as células. Deste modo é necessário ter atenção ao volume de meio usado e às condições
49
de selagem da câmara da incubação, de modo a evitar perdas de meio por evaporação.
2.3.3. SETUP DE AQUISIÇÃO: MAXIMIZAÇÃO DO SIGNAL TO NOISE RATIO (SNR)
FONTES DE RUÍDO
Em imagiologia, as duas fontes principais de ruído existentes são: o ruído do detector e de
iluminação. Em geral, uma escolha cuidada do tipo e condições de funcionamento dos detectores
Cada sistema de transdução reage por emissão de ruído de modo distinto. No caso de
microscópios de varrimento (microscópios confocais de varrimento: Laser Scanning Confocal
Microscopes [LSCMs] e microscópios multifotónicos), a presença do fotomultiplicador pode levar à
libertação de electrões sem que um fotão tenha sido recolhido pelo detector. Esta corrente criada
é chamada de ruído negro, e aumenta com o aumento da voltagem nos terminais do
fotomultiplicador, normalmente controlada na opção de ganho do detector. Caso seja usado um
microscópio widefield, a câmara CCD acoplada introduz ruído associado a cada pixel. A
manutenção de uma temperatura baixa em torno da câmara CCD leva a uma melhoria da
quantidade de ruído presente nas imagens adquiridas. Contudo, a conversão do valor analógico
de cada pixel para um valor digital introduz, por sua vez, também ruído, identificado de forma
exacta, e passível de conhecimento para cada tipo de câmara.
Qualquer sistema de aquisição de imagens assume que a iluminação é constante ao longo
de todo o campo do microscópio e entre os diferentes instantes da experiência. No entanto, existe
uma variância espacial no que toca a intensidade de iluminação não desprezável, em parte devida
a variações de potência da fonte de alimentação da lâmpada. Este aspecto assume maior
importância aquando do uso de luz visível ou de fluorescência. Em microscópios de varrimento,
este problema é minimizado, podendo ser negligenciada a participação desta fonte de ruído no
processamento das imagens obtidas.
Tal como em todos os processos estatísticos, o aumento do N, número de eventos
recolhidos, leva a uma melhoria do sinal de saída pretendido. Assim, sendo uma estatística
Poisson a modelação matemática correspondente à captação de fotões por parte das câmaras, a
incerteza associada a este evento será de N1/2, igual ao valor do rácio entre o sinal e o ruído
(Signal to Noise Ratio: SNR) dado que SNR=N/(N1/2). Deste modo, aumentando o número de
fotões recolhidos, aumentar-se-à a relação SNR. Em experiências com fluorescência, esta
melhoria da relação sinal-ruído pode não ser possível pois poderá conduzir a um aumento do dano
celular. Em montagens onde exista uma câmara CCD existe a possibilidade de fazer binning na
captação, onde um grupo de n x n pixeis adquiridos, é transformado num único na representação
da imagem obtida. Apesar da perda de resolução de um factor de n, existe aumento da
intensidade do sinal de uma potência de n, podendo assim ser reduzida a intensidade da luz de
exposição nesse mesmo factor, com consequente aumento do SNR de n vezes.
50
Figura 2.35. Efeito de binning na aquisição de uma imagem.
(Adaptado de “Basic Light Microscopy & Imaging”, OLYMPUS).
OBJECTIVAS DE IMERSÃO
Dado que existem múltiplas conjugações de componentes ópticos que permitem a obtenção
de uma imagem do objecto em estudo, há que considerar a que fornece maior quantidade de
informação sem introdução de ruído.
A luz que sai da amostra para a objectiva é desviada da sua direcção em interfaces existe
uma grande diferença de índices de refracção. Com a maior parte das observações em
microscópio, isto acontece na fronteira entre o vidro em contacto com a amostra e o ar. Para além
da reflexão total na interface aumentar para raios abaixo do ângulo crítico de 41.8º para este tipo
de fronteira, existe perda de uma grande quantidade de raios provenientes de elevados ângulos.
Esta limitação pode ser suplantada pelo preenchimento do espaço entre objectiva e o vidro com
um fluido de imersão com maior índice de refracção. Deste modo, em sistemas de imersão em
óleo, o vidro da amostra, óleo, e objectiva têm aproximadamente o mesmo índice de
refractividade, tal que os raios se propaguem com o menor desvio em relação à direcção inicial,
reduzindo o número de aberrações esféricas.
Figura 2.36. Influência da utilização de objectivas de ar ou de imersão no percurso óptico da luz.
Notar que a resolução de uma imagem obtida com uma determinada objectiva é função do
parâmetro NA. Contudo, em fluorescência, a intensidade de sinal recolhida é proporcional a NA4.
Assim, um pequeno aumento do valor de NA poderá conduzir a uma melhoria significativa no sinal
colectado.
É esta razão que leva muitas vezes em experiências de fluorescência ao uso de objectivas
de elevada abertura numérica e meios de imersão como água (n = 1,33) ou óleo (n = 1,51).
51
3. OBJECTIVOS
Após percepção dos mecanismos moleculares e celulares inerentes à diferenciação neural
in vivo, e identificação das condições essenciais para o estabelecimento de culturas em
monocamada de células cujo comportamento mimetize o dos precursores neurais no
desenvolvimento de um vertebrado, foi estabelecido como objectivo principal a monitorização e
caracterização da diferenciação neural a partir de culturas de células estaminais embrionárias
usando o protocolo de diferenciação em monocamada estabelecido por Ying e colaboradores
(2003) e modificado por Bekman e colaboradores (Bekman et al., 2006).
Para tal, e definindo objectivos intermédios, foi necessário:
- estabelecer em que medida os progenitores neurais Sox1-GFP positivos revelam o
movimento característico de migração denominado de movimento intercinético nuclear das
células embrionárias neuroepiteliais;
- correlacionar o movimento dos progenitores com as diferentes fases do ciclo celular;
- analisar e processar imagens obtidas de culturas obtidas em tempo real, recorrendo
incialmente ao software ImageJ.
Por outro lado, tendo identificado o papel do cálcio na aquisição de identidade neural por
parte das células da ectoderme e em células do cerebelo, a posteriori fixou-se como objectivo o
desenvolvimento de um protocolo que permitisse monitorizar fluxos de cálcio nas células em
cultura em monocamada.
52
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. CÉLULAS ESTAMINAIS
A linhagem celular utilizada neste trabalho foi a 46C, cedida pelo Dr. Austin Smith (Institute
for Stem Cell Research, Edinburgh University, Scotland, UK), que contém a sequência codificante
da GFP na ORF (open reading frame) do gene sox1, expresso selectivamente nas células
neuroepiteliais de precursores neurais. Dado que a fidelidade da expressão de Sox1-GFP é
mantida in vivo, esta linha celular é uma ferramenta importante na monitorização e quantificação
da aquisição de identidade neural pelas células embrionárias estaminais.
Para monitorização da quantidade de cálcio intracelular foram usadas células S25, que
contêm apenas uma cassete βgeo inserida no locus de sox2. Não foram usadas células 46 C para
estes ensaios porque os marcadores de cálcio utilizados têm picos de excitação sobrepostos com
o espectro de excitação de GFP.
Ambas as linhas são mantidas em cultura a 37ºC, num ambiente húmido com 5%CO2.
Todos os passos de manuseamento das células decorreram em ambiente estéril numa câmara de
fluxo laminar classe II tipo A/B3.
4.2. EXPANSÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS EMBRIONÁRIAS NÃO DIFERENCIADAS
Células estaminais de ambas as linhagens são propagadas sem células de suporte em
placas de plástico cobertas de gelatina [0,1% (v/v) em PBS] em meio de cultura GMEM (Glasgow
modified Eagle’s medium, 1x GIBCO, ref. 21710-025) suplementado com 1% (v/v) de Glutamina
(200mM, 100x, GIBCO ref. 25030-123), 1% (v/v) de solução de Penicilina-Estreptomicina (100x,
GIBCO), 1% (v/v) de Piruvato de Sódio (100mM, 100x, GIBCO ref. 11360-039), 1% (v/v) de
Aminoácidos não essenciais (100x, GIBCO ref. 11140-035), 10% (v/v) de Soro fetal bovino
inactivado (GIBCO, FBS ES-qualified), e 0,001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (0,1M Sigma M-7522),
e posteriormente filtrado com poro de 0,2µm.
Cerca de 3x106 células congeladas em Azoto líquido ou a -80ºC são rapidamente
descongeladas e plaqueadas em GMEM suplementado com LIF (produzido no laboratório para
concentração final de 60pg/µL) em placas de 60mm cobertas com gelatina. Após um dia,
efectuam-se passagens de dois em dois dias, caso a cultura mantenha baixa percentagem de
morte celular, com boa confluência e morfologia correcta. Para cada passagem, lavar as células
aderentes duas vezes com PBS e tripsinizar com 0,1% (v/v) de solução de tripsina em PBS para
cobrir toda a placa (a partir de solução de tripsina 1x: PBS com 0,0025% (v/v) Tripsina GIBCO
25090-028, 0,01% (v/v) de soro de galinha inactivado, e 0,002% (v/v) de 0.5M EDTA) durante 2 a
3 min a 37ºC. Após ressuspensão das células em GMEM suplementado para neutralizar a tripsina,
fazer um spin down ao tubo por centrifugação durante 2 min a 1000rpm. Ressuspender
53
imediatamente as células em GMEM e passá-las para novas placas cobertas de gelatina a 3x104
células/cm2 no caso de expansão.
A última passagem antes de lançamento de High Density a ressuspensão é feita em Esgro
medium (Chemicon) suplementado com LIF (para concentração final de 60pg/µL).
4.3. DIFERENCIAÇÃO EM MONOCAMADA
24 horas antes do início de diferenciação em monocamada passar as células estaminais de
modo similar ao referido na secção 4.2 mas a uma densidade mais elevada: 1x105 células/cm2
(High Density), em Esgro medium suplementado com LIF (para concentração final de 60pg/µL).
Após garantia de boa confluência da cultura por observação ao microscópio de luz visível,
com verificação da existência de clusters bem formados de células estaminais, fazer uma
tripsinização com ressuspensão das células em meio RHB (Stem Cell Sciences). O plaqueamento
seguinte é feito a 1x104 células/cm2 (Ying et al., 2003 refere que o valor que maximiza a
viabilidade celular neste passo de replaqueamento situa-se em 0,5-1,5x104 células/cm2) em placas
cobertas de gelatina, com meio RHB, sem adição de LIF. Sob estas condições, e na ausência de
LIF, as células estaminais embrionárias perdem o seu potencial de pluripotência, direccionando-se
predominantemente para um destino neural.
Após 2 dias de início de diferenciação em monocamada mudar o meio, replaqueando as
células no dia 4 (de modo similar às passagens referidas na secção 4.2).
A percentagem de GFP (ver secção 4.6) na cultura deve ser medida no dia zero e em todos
os replaqueamentos subsequentes. Deve também ser retirada uma amostra da suspensão celular
nestes dias para teste da presença de micoplasma (ver secção 4.7).
4.4. REPLAQUEAMENTOS DIA 4 E 8 DE MONOCAMADA
Para os replaqueamentos de dia 4 e 8 após início de monocamada a tripsinização deve ser
feita como acima mencionado, sendo a ressuspensão em meio RHB. As células são inoculadas
em placas cobertas de PDL-Laminina (ver secção 4.5), a 2-5x104 células/cm2 em meio RHB
suplementado com bFGF (concentração final de 5ng/µL). O meio é mudado a cada dois dias
(entre replaqueamentos).
4.5. SUBSTRATO DE DIFERENCIAÇÃO: PDL‐LAMININA
Para potenciar a adesão dos precursores neurais às placas de cultura, são cobertos os
fundos dos poços de 6-well, e um círculo de vidro de 14 mm ou 20 mm na base de caixas
‘MatTek’, com Poli-D-Lisina Laminina. Para filmagens, o uso de placas com fundo de vidro
justifica-se devido ao facto de o plástico afectar a polaridade da luz incidente na amostra,
introduzindo artefactos na aquisição da imagem.
As soluções usadas são de 10µg/mL de PDL (Sigma P-7280) em PBS, e 2,5 µg/mL de
54
Laminina (Sigma L-2020) em PBS.
Cobrir placas estéreis com a solução de PDL e deixar repousar à temperatura ambiente
durante 1h. Lavar as placas com PBS duas vezes para retirar o excesso de PDL e cobrir com a
solução de Laminina. Deixar as placas a 37ºC e 5% CO2 durante a noite e colocá-las a -20ºC
depois desse tempo, e durante um período máximo de 6 meses.
20min antes de cada utilização as placas devem ser transferidas para a incubadora de
modo a permitir o descongelamento da Laminina e o equilíbrio das soluções. Aspirar a Laminina
em todas as placas imediatamente antes do replaqueamento das células.
4.6. QUANTIFICAÇÃO POR FACS DE AQUISIÇÃO DE DESTINO NEURAL
O uso de células 46C permite a quantificação da percentagem de precursores neurais nas
culturas através de citometria de fluxo devido à inserção da sequência codificante de GFP na
região regulada pelo promotor de sox1, gene expresso exclusivamente em precursores neurais.
Após tripsinização das células (ver secção 4.2), retirar aproximadamente 5x105 células para um
tubo de FACS e ressuspender as células em FACS buffer (4% (v/v) FBS em PBS).
Após adição de 1:200 de Iodeto de Propídio a análise de fluorescência foi feita recorrendo
ao citómetro ‘FACS Calibur’, e com software ‘CellQuest’. A adição de Iodeto de Propídio prende-se
com a necessidade de quantificar o número de células viáveis na cultura. Por existir perda de
integridade da membrana celular quando as células morrem, o Iodeto de Propídio é somente
incorporado nas células mortas, não sendo possível atravessar a membrana das células vivas.
Como resultados, 10000 eventos gated são representados, por exclusão de restos celulares e
células mortas. Eventos gated são todas as células cujas características de tamanho e
complexidade se incluem em intervalos estabelecidos por experiências de calibração do software
para este tipo de aquisições. O controlo negativo, fixado aquando calibração do aparelho é feito
com células S25, não fluorescentes a priori.
Para as culturas de S25, não é possível contabilizar a percentagem de progenitores neurais
em cada passo experimental, na medida em que as células não expressam GFP. No entanto,
estudos anteriores (Bekman et al. 2006) reflectem a eficiência do protocolo para este tipo de
células.
4.7. TESTE DE MICOPLASMA
Antes do início de uma diferenciação em monocamada ou congelamento de células deve
ser testada a ausência de micoplasma nas amostras celulares por um protocolo de amplificação
por PCR de um fragmento conservado de micoplasma. Recolher aproximadamente 1x106 células
e centrifugar a solução celular a 15000 rpm durante 30s à temperatura ambiente. Ressuspender
as células em wash buffer (10mM Tris-HCL, pH 8,3; KCl 50mM; MgCl2 1,5mM) e centrifugar de
novo nas mesmas condições com remoção do sobrenadante no final. Ressuspender as células
55
obtidas numa solução 1:1 de solução A (10mM Tris-HCl, pH 8,3; KCl 100mM; MgCl2 2,5mM) e
solução B [10mM Tris-HCl, pH 8,3; MgCl2 2.5mM; Tween20 1% (v/v); TritonX100 1% (v/v);
proteinase K 120µg/ml (de uma solução stock 20mg/ml em 5mM Tris-HCl pH 7,8 e 50% (v/v)
glicerol)] e incubar a 60ºC durante 1h. A desnaturação da suspensão deve ser feita seguidamente
durante 10min a 90ºC.
O teste de amplificação por PCR de todo o conteúdo desta solução deve ser feito
recorrendo aos primers Pr27: 5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’ e Pr22: 5’-
ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’, construídos de modo a amplificar um gene de micoplasma
correspondente a 16rRNA de aproximadamente 717bp. As condições de amplificação são: 95ºC
5min; seguidos de 30 ciclos de 95ºC 30s, com uma etapa de 58ºC 1,5min e 72ºC durante 1,5min;
com passo final de 72ºC 10min. Como controlo positivo é usado um plasmídeo com uma inserção
correspondente ao gene de micoplasma a amplificar. De modo a confirmar a acessibilidade do
conteúdo genético na preparação efectuada, deve ser usado GAPDH como housekeeping gene
(Fwd: ATTCAACGGCACAGTCAAGG; Rev: TGGATGCAGGGATGATGTTC). A verificação dos
produtos de amplificação é feita em gel de 1% (p/v) agarose.
4.8. MICROSCOPIA
Para manutenção das condições ideais de cultura, é colocada em cima da platina do
microscópio uma caixa incubadora com as culturas de células em caixas ‘MatTek’ no seu interior.
A temperatura interna da câmara deve ser mantida a 38ºC (tendo em conta a dissipação de calor
existente) por recurso a um controlador de temperatura, sendo as células mantidas a pH constante
pela injecção na caixa de um fluxo humidificado de 5% CO2 misturado com ar. Devem ser
somente analisadas culturas livres de contaminação por micoplasma, e nos dias 2, 3 e 4 de
replaqueamento.
Para a detecção das células GFP positivas, dois microscópios foram usados.
Numa primeira abordagem, a aquisição foi feita num microscópio de fluorescência invertido
Zeiss Axiovert 200M (Figura 4.1), com recurso a uma lâmpada de Mercúrio e um conjunto de
filtros, de modo a ter um passa-banda de excitação entre 450nm e 490nm, e um filtro de emissão
entre 515nm e 565nm.
Neste microscópio, a conversão dos fotões emitidos para imagem digital é feita através de
uma BW CCD na base do microscópio. Lentes com ampliações de 20x (Zeiss Plan-Neofluar
NA=0,5 seca) e 40x (Zeiss EC Plan-Neofluar NA=0,75 seca) foram testadas. Imagens das células
a diferentes planos focais foram adquiridas em cada instante de tempo, com intervalos que
variaram entre os 5 a 30min entre diferentes aquisições. Parâmetros como tempo de exposição e
binning foram controlados no software Metamorph (Molecular Devices) de modo a optimizar as
condições de observação sem influência na viabilidade celular e condições de morfologia da
cultura. Foi também manualmente controlada a intensidade da lâmpada por regulação da abertura
do diafragma de campo.
56
Figura 4.1. Microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M
(imagem gentilmente cedida por Ricardo Henriques).
Numa segunda abordagem foram usadas a objectiva sem imersão Plan-Neofluar 20x (NA =
0,5), e a objectiva de imersão de óleo Plan-Neofluar 40x (NA = 1,3) do microscópio confocal de
varrimento Zeiss LSM 510 (Figura 4.2), recorrendo à linha de 488nm do laser de Árgon para
excitação da GFP. Como filtro de emissão foi escolhido um passa-banda entre 505nm e 550nm.
Percentagens de transmissão de laser entre 8% e 16% foram testadas, mantendo a potência do
laser a 25%, menor valor possível antes do início da região de instabilidade do mesmo. Neste
microscópio é também possível, simultaneamente com a excitação a 488nm, obter uma imagem
semelhante ao visível, calculada pelo software com base nas diferenças de percentagem de luz
antes de penetrar na amostra e depois de ser absorvida por esta. A imagem é assim formada
devido às diferentes impedâncias ópticas entre as células, estruturas sub-celulares e meio
envolvente.
Figura 4.2. Microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM 510
(imagem gentilmente cedida por Ricardo Henriques).
Imagens do comportamento das células em cultura foram adquiridas, recorrendo ao
software LSM Image Browser (Carl Zeiss AIM), em intervalos que variaram entre 20 e 30min
durante períodos de tempo até a um máximo de 10h. Foram adoptadas estratégias de aquisição
de até 7 planos de focagem em cada instante de tempo com distâncias que variaram entre 0,3µm
57
e os 2µm. Parâmetros como o número de linhas e colunas de pontos varridos em cada imagem,
velocidade de varrimento, e tempo de exposição de cada ponto foram também sucessivamente
alterados de modo a manter a viabilidade celular. Por outro lado, numa tentativa de redução de
ruído nas imagens e aumento da resolução espacial, o valor de pinhole sofreu alterações nos
diferentes ensaios, de 72µm a 704µm, bem como os valores de ganho do amplificador e detector,
e valor de offset a subtrair à imagem equivalente a potencial ruído de fundo. Aumento do ganho do
detector significa aumento da tensão aos terminais do fotomultiplicador, pelo que conduz,
claramente, a um aumento do ruído negro no sistema.
De modo a reduzir a energia a que as células estavam sujeitas, foi tentada uma abordagem
recorrendo ao pico de 633nm do laser de HeNe do microscópio de varrimento confocal LSM 510.
Dado que este comprimento de onda não excita GFP, as imagens obtidas equivalem a
transmissão. A percentagem de transmissão de laser usada foi muito inferior, 2%,
comparativamente com os ensaios GFP. Dado que não existe fluorescência da cultura quando
excitada com este comprimento de onda, a escolha do filtro de emissão não é importante para
este estudo. Foi usada a objectiva de imersão Plan-Neofluar 40x (NA = 1,3), tendo sido adquiridas
imagens com intervalos de 10min, e 7 planos de focagem por instante de tempo.
Numa terceira abordagem, foram usadas as capacidades de filmagem autónoma e
programável do microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M para obtenção de
imagens de campo claro com luz visível. O único parâmetro de interesse nesta optimização é a
intensidade da lâmpada na medida em que a amostra está sempre iluminada durante as
filmagens. Para a obtenção de boas imagens, foram modificados o binning e tempo de exposição
em cada aquisição. Em cada instante de tempo foram gravadas várias imagens, acima e abaixo
do plano de foco com o objectivo de ser possível uma visualização 3D das rosetas. Foi utilizada a
objectiva com ampliação de 40x.
Em qualquer uma das abordagens com o microscópio de fluorescência invertido Zeiss
Axiovert 200M, antes do início da aquisição foi feita iluminação de Köhler, no sentido de se ter o
máximo aproveitamento da abertura numérica da lente usada. Nestas condições, o condensador e
amostra ficam colocados na posição mais centrada em relação à objectiva, estando a luz de
iluminação focada sobre a amostra. Este tipo de iluminação pode ser feita a uma ampliação baixa,
no nosso caso a 20x.
No final de todas as aquisições dos diferentes modos de aquisição usados, foi testada a
viabilidade celular da cultura por remoção do meio de cultura e adição de solução de Azul Tripano
em PBS (1:10).
Todas as imagens de aquisição foram posteriormente tratadas com o software ImageJ.
58
4.9. INCORPORAÇÃO DO INDICADOR DE CÁLCIO
A concentração intracelular de cálcio nas células em diferenciação em monocamada, a
partir do dia 2 de cada replaqueamento foi monitorizada através da incorporação do indicador de
cálcio Fluo-4, AM (Invitrogen). Para tal foi desenvolvido um protocolo de incorporação do Fluo-4
nas culturas em estudo.
À solução stock de Fluo-4 [1mM em DMSO (SIGMA)] adicionar igual proporção de solução
Pluronic F127 [20% (p/v) stock (SIGMA-P2443) em água]. Agitar e adicionar o tampão [20mM
HEPES pH 7,4 (SIGMA) em HBSS (Gibco - Invitrogen 1417-0088)] para concentrações finais de
Fluo-4 de 4 µM e Pluronic a 0,08% (p/v).
Aspirar o meio de cultura das placas para observação, adicionar a solução preparada e
incubar as células durante 30 min a 37ºC.
Efectuar observações de fluorescência sem realizar qualquer lavagem da solução
adicionada.
4.10. DETECÇÃO DE CÁLCIO
Logo após o período de incubação, a caixa ‘MatTek’ foi transferida para o dispositivo
instalado na platina do microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM510. As condições de
observação foram optimizadas para a fluorescência presente nas amostras. Foi usada a objectiva
de imersão de óleo Plan-Neofluar 40x (NA = 1,3), e o pico de 488nm do laser de Árgon para
excitação do Fluo-4. Como filtro de emissão foi escolhido um passa-banda entre 505nm e 550nm.
Exceptuando a percentagens de transmissão de laser, aqui de 7%, e o intervalo de tempo entre
aquisições, que foi alterado para 1min, todas as condições de observação tinham sido já testadas
anteriormente (512 pixeis de varrimento em x e y, e tempo de exposição de cada pixel de 1,60 µs).
Figura 4.3. Espectro de excitação (centrado em 488 nm) e emissão (centrado em 510 nm) do indicador de cálcio Fluo-4
(Adaptado de ‘Invitrogen’).
59
5. RESULTADOS
5.1. FLUORESCÊNCIA: WIDEFIELD AXIOVERT 200M
Numa primeira abordagem foram adquiridas imagens num microscópio de fluorescência
invertido Zeiss Axiovert 200M.
Sendo o objectivo primordial a descrição do comportamento dos progenitores neurais em
cultura, nas estruturas típicas de roseta formadas nestas condições de monocamada, todas as
aquisições de microscopia foram centradas em regiões onde a densidade e constituição de
rosetas (número de células no plano principal, e maior ou menor sobreposição de células)
permitisse uma boa obtenção de imagens.
Foi usada a objectiva de 40x nas experiências iniciais. Nestes ensaios, apesar da
fluorescência da GFP ser significativa para a distinção de grupos de células, observou-se que o
sinal emitido não era suficientemente intenso para se poder usar binning de 1 sem fazer bleaching
nas culturas, com generalizada morte celular. Deste modo, por aumento do binning para o valor 2,
foi possível a redução do tempo de exposição da amostra à luz de excitação, com aumento da
intensidade de sinal. Como consequência houve uma perda de resolução, apesar de não
significativa para o ensaio.
Os dados das aquisições no microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M
encontram-se sumariadas na Tabela 5.1.
Tabela 5.1. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M de
imagens de culturas em monocamda de células 46C Sox1-GFP.
Dia Passagem Objectiva Binning
Tempo de
exposição
(ms)
Intervalo
de tempo (min)
Número
de planos
adquiridos
Informações
3/4/07 p21_d4+4+1 40x 2 250 10 11 Morte celular
após 20min
4/4/07 p21_d4+4+2 40x 2 500 20 9 Morte celular
após 20min
5/4/07 p21_d4+4+3 40x 2 250 30 3 4h30 de aquisição
23/4/07 p18_d4+3 20x 3 80 30 1 5h30 de aquisição
24/4/07 p18_d4+4 20x 2 60* 30 1 12h de aquisição
26/4/07 p18_d4+4+2 40x 2 80* 30 1 11h de aquisição
30/4/07 40x 2 80 30 1 4h de aquisição
*intensidade da lâmpada reduzida ao mínimo de modo a permitir a obtenção de uma imagem na ocular.
60
Para optimização das condições de observação com manutenção da viabilidade celular, o
primeiro parâmetro a ser modificado foi o tempo de exposição; inicialmente a 250ms, nas últimas
experiências foi fixado a 80ms.
O tempo de intervalo entre aquisições foi também aumentado, permitindo a recuperação,
mesmo que parcial, das perturbações possivelmente causadas pela exposição à luz de
fluorescência.
Nas duas primeiras tentativas de aquisição de imagens de fluorescência foi observada uma
extensa morte celular poucos minutos após o instante inicial. A primeira série de imagens onde é
clara a distinção das estruturas de rosetas com todas as células Sox1-GFP positivas, indicativo da
identidade de progenitores neurais, teve como duração 4h (Figura 5.1).
Figura 5.1. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 5/4/07) num
microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M.
As setas indicam a localização do mesmo progenitor neural em diferentes instantes de aquisição. Condições de
observação: GFP std; Tempo de exposição = 250ms; Binning = 2; Objectiva 40x (Escala = 30μm).
61
t = 0 t = 4h
Figura 5.2. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 5/4/07) num
microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M.
A vermelho estão circundadas duas rosetas. Condições de observação: visível; Objectiva = 40x (Escala = 30μm).
Na Figura 5.2 (t = 0), é possível distinguir duas rosetas, circundadas a vermelho. Por
exposição a luz de 488nm, foram identificadas todas as células constituintes da roseta como
progenitores neurais (Sox1-GFP positivas). Após 1h30 de aquisição, equivalente a 4 instantes de
tempo de aquisição durante esse período, é possível notar movimentos celulares na roseta em
posição mais inferior. No entanto, ao analisar a roseta mais à esquerda uma hora depois (t =
2h30) nota-se que alguns progenitores se desprenderam da região apical. Esta pequena perda da
morfologia característica da roseta pode ser sinal de diminuição de viabilidade celular, facto
confirmado em t = 4h, onde toda a estrutura organizada da placa foi perdida (Figura 5.2).
Possíveis factores não ajustados, como temperatura e quantidade de CO2 efectivo dentro da caixa
poderiam ter causado esta morte celular. No entanto, na restante placa não sujeita a exposição
luminosa as células mantinham a disposição típica em rosetas, sem aumento do número de
células mortas em suspensão. A perda de viabilidade celular é pois apenas devida à fototoxicidade
da luz usada.
Como consequência, deixaram de ser adquiridos vários planos de focagem em cada
instante de tempo, tendo-nos restringido à aquisição de apenas um, o mais central possível no
plano das células. Por outro lado, foi reduzida a intensidade da lâmpada de Mercúrio.
Experiências intermédias de aumento do valor de binning e/ou redução da ampliação para a
objectiva de 20x foram testadas (Figura 5.3 e Figura 5.4). A perda de resolução nestes ensaios
não compensa o aumento do tempo em que a cultura foi mantida em boas condições. Nenhuma
conclusão pode ser retirada de casos em que, mesmo após várias horas de aquisição, existe
morte celular. Não há qualquer garantia que os movimentos dos precursores neurais são
característicos deste tipo de células, ou condicionados já pela morte celular que irá ocorrer. Não
nos foi possível identificar um intervalo de tempo a partir do qual os movimentos da cultura
deixaram de ser característicos para possivelmente serem afectados pelo estado da cultura.
62
Figura 5.3. Imagem de rosetas de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 23/4/07) num microscópio de fluorescência
invertido Zeiss Axiovert 200M.
Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80ms; Binning = 3; Objectiva = 20x (Escala = 50μm).
t = 0 t = 12h
Figura 5.4. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 24/4/07) num
microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M.
Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80 ms; Binning = 2; Objectiva 20x (Escala = 20μm).
t = 0 t = 4h00
Figura 5.5. Imagens de instantes de tempo de aquisição de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 30/4/07) num
microscópio de fluorescência invertido Zeiss Axiovert 200M.
Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80ms; Binning = 2 (Escala = 20μm).
63
As condições mais minimalistas que permitiram um registo de sinal com resolução
suficiente para dedução das características de comportamento celular pretendidas originaram a
obtenção de uma série de imagens durante 4h, cujos instantes de tempo inicial e final estão
representados na Figura 5.5.
Com esta ampliação (40x), valor de binning (igual a 2) e tempo de exposição (80ms com
redução da intensidade da lâmpada de Mercúrio) obtém-se uma resolução suficiente que permite
observar movimentos celulares. Nota-se que todas as células da cultura se movimentam, sendo
impossível seguir núcleos individualmente. Mesmo sob estas condições, a morfologia da cultura
no final da experiência não parece característica deste tipo de células, com alguma
desorganização na região onde estava anteriormente a roseta.
Por conseguinte, uma outra abordagem de microscopia foi tentada.
64
5.2. FLUORESCÊNCIA: CONFOCAL LSM510
Dado que o princípio de funcionamento de um microscópio confocal de varrimento é
bastante diferente de um microscópio de campo claro, os parâmetros a optimizar para redução do
dano na cultura são diferentes dos anteriormente referidos.
As condições usadas em todos os ensaios encontram-se na Tabela 5.2.
Tabela 5.2. Dados referentes às aquisições obtidas no microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM510 de imagens
culturas em monocamada de células 46C Sox1-GFP.
O intervalo de tempo entre aquisições foi de 20min em todos os ensaios.
Dia
Número de
pixeis
em x e y
Objectiva
Tempo de
exposição de
cada pixel
(μs)
Intensidade de
laser (%)
Secção
óptica
(μm)
Número de
fatias
adquiridas
Intervalo em z
entre fatias
(μm)
27/04/07 512x512 20x 1,6 8 348 1 *
28/04/07 512x512x4 20x 1,6 15 704 4 3,0
21/05/07 256x256 40x 6,4 16 158 1 *
22/05/07 256x256x3 40x 6,4 16 136 3 0,3
24/05/07 512x512 40x 1,6 16 139 3 1,0
25/05/07 512x512x3 40x 1,6 16 72 3 0,5
26/05/07 512x512x5 40x 1,6 16 158 5 0,5
* não aplicável
Nas duas primeiras tentativas efectuadas no microscópio confocal de varrimento Zeiss LSM
510, dado que tanto a percentagem de transmissão de laser como a ampliação são reduzidas, as
imagens obtidas apresentam demasiado ruído e baixa resolução (Figura 5.6).
Na tentativa de reduzir a quantidade de laser incidente na amostra, o número de pontos
iluminados por imagem e o tempo de exposição de cada pixel foram alterados de forma síncrona,
mas em sentidos opostos.
Na Figura 5.7 (t = 0) é evidente a organização dos progenitores neurais em roseta, sendo
possível diferenciar os contornos de algumas células GFP positivas. Identificada com setas está
uma célula com movimento radial para o exterior da roseta.
65
a.
b.
Figura 5.6. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/4/07) num microscópio confocal da
varrimento Zeiss LSM510.
a. Luz transmitida; b. GFP. Condições de observação: Laser = 488nm; Intensidade = 15%; Tamanho = 512x512; Tempo
por pixel = 1,6μs; Secção óptica = 704μm; Objectiva=20x (Escala = 30μm).
t = 0
t = 4h20
t = 6h40
t = 11h20
Figura 5.7. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 21/5/07) num microscópio confocal da
varrimento Zeiss LSM510.
Com as setas estão indicadas as posições da mesma célula nos diferentes instantes de tempo. Condições de observação:
Laser = 488nm; Intensidade = 16%; Tamanho = 256x256; Tempo por pixel = 6,4μs; Secção óptica = 158μm; Objectiva =
40x (Escala = 30μm).
66
0 10 20 30 40 50 60 7030
40
50
60
70
80
Tempo (min)Dis
tânc
ia a
o ce
ntro
da
rose
ta (u
m)
0 10 20 30 40 50 60 7055
60
65
70
75
Tempo (min)
Âng
ulo
com
linh
a ho
rizon
tal (
º)
0 10 20 30 40 50 60 700
0.2
0.4
0.6
0.8
Tempo (min)
Vel
ocid
ade
(um
/min
)
Figura 5.8. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula indicada a azul na Figura
5.7. A célula, que se afasta do centro da roseta, mantém um movimento aproximadamente radial (desvio padrão de 2º85’),
com velocidade média de 0,135μm/min.
Adicionalmente ao aumento da resolução (através do aumento do número de pixeis
varridos em ambas as direcções na amostra), foi aumentada em z a fatia óptica adquirida. Por
abertura do pinhole, apesar de o número de aberrações aumentar, a fluorescência colectada
equivale a um maior número de fluoróforos. Reduz-se assim o ruído de Poisson consequência da
aquisição de fluorescência de baixo número de moléculas fluorescentes.
t = 0
t = 3h40
Figura 5.9. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 6/6/07) num microscópio confocal da
varrimento Zeiss LSM510.
Com setas estão indicadas as posições da mesma célula nos instantes de tempo inicial e final. Condições de observação:
Laser = 488nm; Intensidade = 16%; Tamanho = 512x512; Tempo por pixel = 1,6μs; Secção óptica = 322μm; Objectiva =
40x (Escala = 30μm).
67
0 5 10 15 2030
40
50
60
70
80
Tempo (min)Dis
tânc
ia a
o ce
ntro
da
rose
ta (u
m)
0 5 10 15 2040
45
50
55
60
Tempo (min)
Âng
ulo
com
linh
a ho
rizon
tal (
º)
0 5 10 15 200
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Tempo (min)
Vel
ocid
ade
(um
/min
)
Figura 5.10. Dados de velocidades, ângulo com a horizontal e distâncias percorridas pela célula indicada a azul na Figura
5.9.
A célula, que se afasta do centro da roseta, mantém um movimento aproximadamente radial (desvio padrão de 5º48’), com
velocidade média de 0,190μm/min.
Na Figura 5.9, indicada por setas, está a posição nos dois instantes de tempo de uma
mesma célula. Esta move-se com movimento radial, provado pela representação gráfica do ângulo
que o vector direcção instantânea do progenitor forma com uma horizontal arbitrária.
Os valores de velocidades médias dos dois ensaios das Figura 5.7e Figura 5.9 são da
mesma ordem de grandeza: 0,135 e 0,190μm/min, respectivamente.
Como nos ensaios no microscópio confocal de varrimento LSM510 não foram observadas
imagens de mitose, e dado que a duração as filmagens implicaria a existência de divisões em
algumas células das rosetas, foi pensada a hipótese de fototoxicidade na cultura pela exposição à
luz de laser com a energia escolhida.
Foi iniciada uma abordagem de aquisição de imagens de transmissão com laser de menor
energia (633nm).
68
t = -1h50
t = -10min
t = 0
Figura 5.11. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 26/6/07) num microscópio confocal de
varrimento Zeiss LSM510.
As células de interesse encontram-se no centro dos círculos. Condições de observação: Laser = 633nm; Intensidade = 2%;
Tamanho = 512x512; Tempo por pixel = 1,6μs; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).
Na Figura 5.11 pode observar-se a divisão de uma célula, mesmo que não pertencente a
uma roseta bem definida. Uma das características das células em divisão neste tipo de culturas é
a perda de aderência à placa, adquirindo como consequência uma morfologia esférica (t = -1h50)
nos momentos antes da citocinese. Em t = -10min a célula encontra-se já muito alongada, sendo
na imagem seguinte (t = 0) as duas células-filhas claramente visíveis.
Apesar de obtenção de imagens de mitose de células da cultura, esta aproximação
experimental foi abandonada. Foi pensado que para obter imagens equivalentes a visível, uma
abordagem mais interessante poderia ser uma aquisição em campo claro com luz visível pois o
dano ao nível celular poderia ser menor do que uma exposição a laser, mesmo que de baixa
energia.
5.3. CAMPO CLARO: AXIOVERT 200M
Tendo como base todos os ensaios de fluorescência descritos nos pontos 5.1 e 5.2, foi
tentada uma abordagem de microscopia em campo claro com luz visível.
Estudos anteriores (Bekman et al., 2006) indicam que apenas progenitores neurais (Sox1-
GFP positivos) se organizam em estruturas de roseta, pelo que a confirmação da identidade
neural por exposição a luz de fluorescência nos instantes iniciais da aquisição das séries de
imagens foi abandonada nestes ensaios.
Na optimização, foram alterados parâmetros como binning e tempo de exposição da
câmara. A intensidade da lâmpada foi mantida a menor possível para visualização das imagens
com contraste suficiente para posterior tratamento.
69
t = 0
t = 1h30
t = 1h35
t = 1h50
t = 1h55
t = 2h10
t = 2h20
t = 5h
Figura 5.12. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/6/07) num microscópio de
fluorescência invertido Axiovert 200M.
Com setas estão indicadas duas células distintas antes do momento de citocinese.
Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40 (Escala = 30μm).
Figura 5.13. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/6/07) num microscópio de
fluorescência invertido Axiovert 200M.
Condições de observação: GFP std; Tempo de exposição = 80 ms; Binning = 2; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).
Apesar de as imagens da Figura 5.12 terem pouca qualidade devido às manchas no campo
do microscópio decorrentes da presença de lixo sobre a câmara CCD, estes são os primeiros
resultados da aquisição de imagens de rosetas com luz visível. Durante as cinco horas de
aquisição, podem ser observadas duas mitoses (t = 1h35 e t = 1h50). As células-mãe retraem o
corpo celular em direcção ao lúmen da roseta e adquirem uma forma mais arredondada, perdendo
a adesão quase total à placa imediatamente antes da citocinese. Após a divisão, as células-filhas
aderem à PDL-Laminina. O comportamento após este ponto não tem interesse para o estudo na
medida em que existe destruição da estrutura da roseta. Uma célula desloca-se para o canto
inferior direito (t = 2h20), levando a que todas as células às quais está ligada se movimentem
também nesse sentido. Este comportamento pode ser devido ao pequeno tamanho da roseta ou
pouca densidade de células à sua volta, sem no entanto ter significado biológico relevante.
Partindo de uma primeira abordagem que indicia a possibilidade de obtenção de bons
resultados com esta metodologia, foram desenvolvidos vários ensaios com as mesmas condições
70
experimentais.
Para todas as imagens representadas com uma divisão a ser monitorizada, foi considerado
como tempo zero o instante da citocinese, tendo o tempo valor negativo para instantes anteriores
à divisão, e positivo no sentido contrário.
t = -5h08 t = -3h46 t = -24min t = -22min
t = -4min
t = -2min
t = 0
t = 16min
t = 44min
t = 2h48
t = 3h14
t = 11h30
Figura 5.14. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) num microscópio de
fluorescência invertido Axiovert 200M.
A rosa encontra-se contornada uma célula em divisão em t = 0; a vermelho, as células-filhas.
Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).
A cultura cujas imagens estão representadas na Figura 5.14 foi mantida sob observação na
platina do microscópio durante 16h38m. No final desse tempo, não existiam quaisquer sinais de
menor viabilidade celular. A morfologia celular manteve-se como descrita em estudos anteriores
(Ying et al., 2003) sem destruição da estrutura da roseta. Durante todo o tempo de aquisição, a
roseta manteve-se com movimentos dinâmicos por parte das células ligadas ao seu domínio apical
com existência de 20 divisões nas 49 células iniciais pertencentes à roseta.
71
Dado que o centro da roseta se move no plano durante o tempo de aquisição, foram
registadas as suas coordenadas ao longo do tempo. Os cálculos posteriores de tratamento de
resultados utilizam estes valores como centro de referência para qualquer movimento. Este
procedimento foi adoptado para todos os tratamentos de imagens adquiridas.
Figura 5.15. Imagem de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) num microscópio de
fluorescência invertido Axiovert 200M.
As células seguidas ao longo de todo o filme para cálculo de distância ao centro da roseta e observação de padrões
comportamentais encontram-se numeradas. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20μm).
Para a roseta da Figura 5.15, após terem sido manualmente seguidas todas as células
observadas no instante inicial como pertencentes à estrutura, foi calculada a distância, em cada
instante de tempo, da célula ao centro da roseta. Nos casos em que a célula a ser seguida sai do
campo de observação ou que se divide, a marcação foi interrompida e registado o evento.
Num total de 49 células, cinco grupos com comportamentos comuns podem ser formados:
(i) 9 células nunca ligadas ao centro da roseta; (ii) 12 células com constante conexão ao centro
mas sem divisão durante a aquisição, (iii) 13 células que se dividem no centro da roseta com
retracção do corpo celular imediatamente antes da mitose, (iv) 3 células que se dividem no centro
da roseta sem o padrão de retracção de corpo celular, e (v) 4 células cuja divisão se dá fora do
lúmen da roseta.
72
5.3.1. ANÁLISE DE DISTÂNCIAS
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
20
40
60
80
100
120
140
Tempo (min)
Dis
tânc
ia a
o ce
ntro
da
rose
ta (u
m)
Figura 5.16. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07)
nunca ligadas ao centro da roseta durante a aquisição.
Valores colocados a zero quando a célula sai do campo do microscópio. Célula com menor valor médio de distância
representado a azul tracejado (média de 56,62±8,69 μm). Média das médias de distâncias igual a 75.00±18,25μm.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (min)
Dis
tânc
ia a
o ce
ntro
da
rose
ta (u
m)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 100010
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tempo (min)
Dis
tânc
ia a
o ce
ntro
da
rose
ta (u
m)
a. b.
Figura 5.17. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07)
sempre ligadas ao centro da roseta e que nunca dividem.
Valor médio das médias das distâncias calculados conjuntamente nos dois gráficos de 30,47±9,52 μm.
Por análise dos valores de média de médias entre as células que nunca estão ligadas ao
centro da roseta (Figura 5.16) e as que permanecem sempre ligadas sem divisão (Figura 5.17)
nota-se que a distância média das nunca ligadas é em 53,8% maior do que a referente às que
mantêm ligação com o centro durante toda a aquisição. Dado que todas as células, à excepção da
representada a vermelho em Figura 5.17a. se encontram abaixo dos 55µm, este pode ser um valor
limite a partir do qual esta estrutura celular não consegue manter filamentos de conexão ao centro.
Este valor pode ser considerado como raio máximo suportável da roseta em questão nas
condições de cultura usadas.
De modo a obter um valor de distância mínima ao centro das células que nunca se
dividiram mas que oscilaram dentro da roseta, será necessário excluir as células correspondentes
73
aos traçados azul ciano do gráfico b., e verde do gráfico a. da Figura 5.17. O comportamento
destas células parece ser de afastamento ao centro, provavelmente devido ao facto de estas
terem sido originadas de uma divisão alguns minutos antes do início da aquisição. Pode assim
calcular-se o menor valor de distância ao centro das restantes células, igual a 8,35μm (referente
ao traçado a ciano do gráfico a. da Figura 5.17), com média de valores mínimos igual a
14,4±4,61μm.
Relativamente ao número inicial de 49 células seguidas, é possível registar a divisão de 20
células durante as 16h42 de aquisição. Destas, 80% aproximam-se do centro da roseta antes da
divisão e aí se dividem. Os restantes 20% correspondem a células que se dividem, em média, a
uma distância de 50µm do centro da roseta.
Noutras rosetas foram observadas células em aproximação à região apical e que, devido à
existência de muitas células com o corpo celular no lúmen, não se aproximaram para além de um
determinado raio e dividiram nesse local. Nos 20% de células que dividiram fora da roseta, em
nenhuma foi registado impedimento espacial para aproximação ao lúmen.
Tanto visual como graficamente, é possível distinguir dois modos de divisão das células que
se aproximam do lúmen da roseta para divisão. 82,4% das células em questão, após uma primeira
aproximação, na maior parte das vezes rápida como é visível pelo declive dos traçados dos
gráficos da Figura 5.18, têm um movimento de retracção do corpo celular durante,
aproximadamente, uma hora antes da divisão. A restante percentagem, apesar de a aproximação
ser semelhante, não tem esse movimento explícito.
74
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (min)
Dis
tânc
ia a
o ce
ntro
da
rose
ta (u
m)
a.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (min)
Dis
tânc
ia a
o ce
ntro
da
rose
ta (u
m)
b.
Figura 5.18. Distância ao centro da roseta, em função do tempo, de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07)
que se dividem no centro da roseta com retracção do corpo celular aproximadamente uma hora antes da divisão
(movimento indicado por setas no gráfico).
Para as células estudadas cuja divisão no centro da roseta é acompanhada de retracção do
corpo celular, a distância média de divisão ao centro é de 8,64±1,10μm (Tabela 5.3).
.
75
Tabela 5.3. Dados relativos a células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07) que se dividem no centro da roseta
com movimento de retracção.
Localização
(quadrante)
Número
da célula
(Fig.V3)
Gráfico
(Fig.V6) Cor
Menor distância antes
de retracção (μm)
Distância de
divisão (μm)
1º 2 a. Azul 11,0 9,61
4º 2 a. Verde 6,3 9,18
4º 4 a. Vermelho 10,7 8,65
4º 6 a. Ciano 14,2 9,50
4º 10 a. Magenta 13,1 9,29
4º 13 a. Amarelo 8,05 8,97
2º 5 a. Preto 17,8 7,32
2º 7 b. Azul 14,0 9,87
2º 11 b. Verde 7,58 735
2º 12 b. Vermelho 9,93 7,51
2º 13 b. Ciano 10,9 7,53
3º 1 b. Magenta 14,6 7,38
3º 6 b. Amarelo 11,0 10,19
* não representado graficamente
Com o objectivo de verificar se existe algum limite de aproximação a partir do qual as
células ficam determinadas a divisão, foi calculado o valor mínimo de distância antes do pico de
retracção, igual a 11,5±3,20μm. Confrontando este intervalo com o intervalo [14,4-
4,61;14,4+4,61]μm equivalente aos valores mínimos de distância das células pertencentes à
roseta mas que nunca se dividem, tem-se que, abaixo de 9,79µm de distância, as células
obrigatoriamente dividir-se-ão dentro de aproximadamente 1h. Caso a sua distância mínima
pertença ao intervalo [9,79;14,7]μm, apenas a distância não é parâmetro suficiente para retirar
qualquer conclusão quanto ao destino da célula. Aqui será necessário ter em consideração a
velocidade da célula antes desse ponto. Todas as células que se dividem com retracção do corpo
celular apresentam um decréscimo brusco de distância ao centro da roseta nos instantes
precedentes a atingirem o valor mínimo ao centro antes da retracção. A aceleração média dos
progenitores em aproximação ao centro da roseta, calculada até o instante em que a célula atingiu
a menor distância ao centro antes da retracção, e desde o primeiro máximo local entre [instante
com distância mínima ± (instante da retracção - instante com distância mínima)] é de
0,27±0,14μm/min2 (valor encontrado sem utilizar os dados referentes ao traçado a ciano na Figura
5.18a por se ter acesso apenas ao comportamento do progenitor meia hora antes da divisão). Nos
progenitores que nunca dividem, no intervalo de tempo anterior ao instante em que as células
entram na região delimitada pelo valor crítico de raio não são registadas acelerações com estes
valores.
Para células com distâncias ao centro da roseta entre 9,79µm e 14,7µm, por análise da sua
aceleração pode assim deduzir-se se se irão dividir ou não nos instantes seguintes.
Qualquer célula que se situe num raio superior a 14,48µm não está determinada a divisão
(excepção para os três casos reportados de células que dividem fora do centro da roseta).
76
5.3.2. VELOCIDADES E ÂNGULOS
Da análise de cinco divisões do conjunto das 13 que dividem com retracção do corpo
celular antes do momento de divisão, podem retirar-se parâmetros de dinâmica importantes como
a velocidade de aproximação ao centro da roseta da célula-mãe, velocidade de afastamento do
centro da roseta por parte das células filhas, e ângulos formados entre a direcção de movimento
das células e uma linha horizontal definida arbitrariamente. A Figura 5.19 é o exemplo de um
tratamento de dados para uma célula-mãe (a.) e uma das filhas (b.).
a. b.
Figura 5.19. Análise de distâncias relativamente ao centro da roseta, ângulos com a horizontal, e velocidade de células
46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07).
a. Célula-mãe até ao instante de divisão; b. Uma das células-filhas da roseta.
Contrariamente à célula-mãe que se aproxima da roseta, a célula-filha, apesar de oscilar
muito em redor de determinadas posições, afasta-se da região apical da roseta, identificado pelo
declive positivo do gráfico.
O ângulo relativamente à horizontal de ambas as células é semelhante, em média perto de
55º, o que indica que a entrada da célula-mãe para o lúmen da roseta se dá segundo um raio da
mesma, e a saída dessa região por parte da célula-filha é feita segundo a mesma direcção.
77
Tabela 5.4. Valores de velocidades média e máxima, e valor médio de ângulo com a horizontal das células-mãe em divisão
e filhas 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 28/7/07).
Velocidade média
(μm/min)
Velocidade máxima
(μm/min)
Valor médio de
ângulo com horizontal (º)
1 Célula-mãe 0,36±0,31 1,59±0,32 60,3±6,59
Célula-filha#1 0,67±0,53 7,34±0,64 37,8±6,62
Célula-filha#2 0,41±0,30 1,90±0,31 53,8±11,1
2 Célula-mãe 0,49±0,46 1,81±0,53 44,2±4,91
Célula-filha#1 0,44±0,41 5,14±0,46 49,5±8,75
Célula-filha#2 0,36±0,34 2,21±0,35 39,0±7,31
3 Célula-mãe 0,40±0,36 1,64±0,39 53,0±6,4
Célula-filha#1 0,42±0,41 10,2±0,64 49,1±9,93
Célula-filha#2 0,35±0,34 2,73±0,36 44,9±11,7
4 Célula-mãe 0,29±0,24 1,24±0,26 4,25±3,35
Célula-filha#1 0,25±0,24 1,83±0,25 22,0±13,2
Célula-filha#2 0,46±0,39 2,78±0,40 5,70±5,81
5 Célula-mãe 0,55±0,41 1,83±0,39 52,1±12,6
Célula-filha#1 0,47±0,35 3,81±0,61 34,7±5,25
Célula-filha#2 0,59±0,46 4,28±0,45 27,8±11,8
Por avaliação da Tabela 5.4, o valor médio das médias de velocidades dos progenitores em
aproximação ao centro da roseta é de 0,42±0,35µm/min, tendo estas células como média das
velocidades máximas 1,62±0,38µm/min. O valor médio de velocidades das células-filhas é de
0,44±0,12µm/min. Contudo, é nas velocidades máximas que as diferenças são mais notórias: a
média de velocidades máximas dos progenitores neurais durante o movimento para a região
apical da roseta é significativamente inferior à média do valor máximo de velocidades das células-
filhas, 4,21±2,69µm/min.
Os valores médios de ângulos que as células, tanto células-mãe como filhas, fazem com a
horizontal apresentam desvio padrão compreendido no intervalo [4,03;12,5]º, confirmando-se o
movimento preferencialmente radial deste tipo de células em roseta.
5.3.3. TIPO DE DIVISÃO
Um ponto a considerar na avaliação das divisões dos progenitores neurais na região apical
da roseta é o modo como a separação da célula-mãe é feita: divisão vertical ou horizontal.
Analisando o tipo de divisão que as células dos grupos (iii) e (iv) possuem, 12 das 16
(75,0%) dividem-se de modo vertical, enquanto as restantes 4 (25,0%) têm claramente um padrão
de divisão horizontal.
Por outro lado, é do maior interesse correlacionar o tipo de divisão com o destino das
células-filhas. Quando se observa que as células formadas perdem ligação à região apical da
roseta, assume-se que entraram em diferenciação terminal, sendo denominadas por N.
Adicionalmente algumas destas células rodam 90º relativamente à orientação anteriormente tida.
Células onde não é observado nenhum destes comportamentos são consideradas, neste estudo,
78
como progenitores (P).
Imagens exemplificativas de alguns casos referidos são representadas na Figura 5.20.
t = -4min
t = -4min
t = 0
t = 0
t = 8h40
t = 12h32
a. b.
Figura 5.20. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num microscópio de
fluorescência invertido Axiovert 200M.
As células de interesse no centro dos círculos encontram-se assinaladas com pontos: a. Divisão vertical simétrica; b.
Divisão vertical assimétrica. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20µm).
Em ambos os instantes representados antes da citocinese (a t = 0) na Figura 5.20 é visível
a disposição dos cromossomas em posições diametralmente opostas, figura característica de
anafase (Figura 5.21).
79
Figura 5.21. Imagem de anafase de uma célula 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num microscópio de
fluorescência invertido Axiovert 200M.
A célula de interesse encontra-se assinalada com um ponto. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x
(Escala = 10µm).
Na Figura 5.20a., t = 8h40, as células-filhas encontram-se lado a lado e ligadas ao centro
da roseta, indicando que são progenitores neurais. Deste modo, considera-se a divisão como
vertical simétrica. Pelo contrário, na Figura 5.20b. t = 12h32, a célula-filha com ponto vermelho
não possui já nenhuma conexão com a região apical da roseta, tendo extensões da membrana
localizadas perpendicularmente ao raio da roseta. Este facto denota que a célula em questão
entrou em diferenciação terminal, estando em G0, sendo por isso a divisão denotada como vertical
assimétrica. A outra célula-filha, marcada com ponto azul, encontra-se ainda ligada ao centro da
roseta, prosseguindo em fase G1.
80
t = -4min
t = -2min
t = 0
t = 0
t = 10h38
t = 6h02
a. b.
Figura 5.22. Imagens de cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada (dia 27/7/07) num microscópio de
fluorescência invertido Axiovert 200M.
As células de interesse no centro dos círculos encontram-se assinaladas com pontos: a. Divisão horizontal simétrica; b.
Divisão horizontal assimétrica. Condições de observação: Luz visível; Objectiva = 40x (Escala = 20µm).
No que toca a divisões horizontais, as figuras de mitose visíveis nas células em divisão
simétrica não são tão claras. O plano de clivagem da célula-mãe é perpendicular a um raio da
roseta, sobre o qual as células-filhas ficam após divisão. A adesão à placa dá-se imediatamente
após a citocinese na região luminal. Por observação da Figura 5.22a., até ao momento de término
das aquisições, a divisão indica que foram originados dois progenitores, na medida em que ambas
as células-filhas continuam ligadas ao centro da roseta através dos seus prolongamentos de
membrana. No entanto, qualquer conclusão a este respeito é influenciada pela janela temporal
limitada do tempo total de aquisição da série de imagens. Este aspecto está relacionado com a
classificação da divisão da Figura 5.22b. como assimétrica, originando um progenitor e uma célula
em diferenciação terminal. A célula-filha que recebe a porção de membrana basal, em t = 6h02
encontra-se muito afastada do lúmen da roseta, fora da estrutura organizada da mesma. A célula
que, aquando da divisão ficou na região mais apical, permanece no mesmo local, indicando que a
herança da identidade de progenitor poderá estar em relação com a parte de membrana da célula-
81
mãe recebida.
Na roseta representada na Figura 5.20 e Figura 5.22, durante as 15h de aquisição
ocorreram 13 divisões, tendo a roseta inicialmente 33 células ligadas ao lúmen.
Para cálculo do destino das células originadas foram utilizados apenas dados referentes a
aproximadamente 2/3 do tempo total, dado que, para divisões a partir deste instante, a dedução
do destino das células originadas é ainda mais erróneo. A cultura não está monitorizada tempo
suficiente depois da divisão das células no último terço de aquisições para que as conclusões
retiradas sejam pouco afectadas por erros (Tabela 5.5).
Tabela 5.5. Dados do tipo de divisão referentes à cultura de células 46C Sox1-GFP em monocamada.
Depois de cada valor de percentagem e entre parêntesis encontram-se os valores absolutos do número de divisões. P:
progenitor; N: célula em diferenciação terminal.
Simétrica P-P Assimétrica P-N Simétrica N-N Totais
Vertical:
- 27/07/07
- 28/07/07
- 23/08/07
66,7% (6)
60,0% (6)
*
11,1% (1)
10,0% (1)
*
0,00% (0)
0,00% (0)
*
77,8% (7)
70,0% (7)
78,6% (11)
Horizontal:
- 27/07/07
- 28/07/07
- 23/08/07
11,1% (1)
30,0% (3)
*
11,1% (1)
0,00% (0)
*
0,00% (0)
0,00% (0)
*
22,2% (2)
30,0% (3)
21,4% (3)
Totais:
- 27/07/07
- 28/07/07
- 23/08/07
79,8% (7)
90,0% (9)
*
22,2% (2)
10,0% (1)
*
0,00% (0)
0,00% (0)
*
* não aplicável devido a impossibilidade de identificação
Ainda nesta roseta, os acontecimentos: divisão horizontal com geração de dois
progenitores, divisão horizontal com geração de um progenitor e uma célula em diferenciação
terminal, e divisão vertical com geração de um progenitor e uma célula em diferenciação terminal
são equiprováveis, ocorrendo 1 evento deste tipo por cada 6 eventos de divisões verticais com
geração de dois progenitores.
Comparando os valores de percentagens totais obtidos por cálculo do número de divisões
verticais e horizontais pode referir-se que as divisões verticais são, nas três rosetas estudadas, as
mais frequentes, com média de 76,1±5,4% sobre o número de divisões totais. Nos dois casos
estudados de divisão do tipo de célula-filha originada, 1 em cada 6 divisões verticais origina um
par célula em diferenciação terminal-progenitor, sendo as restantes divisões com formação de um
par progenitor-progenitor. Em média 84,9±7,2% do número de divisões numa roseta originam um
par progenitor-progenitor onde, em média, 25,0% são devido a divisões horizontais.
Em nenhuma das rosetas analisadas há observações de divisões simétricas terminais.
Notar que, nos filmes analisados, com uma média de 16h05 de duração, a média do
número de divisões ocorridas é de 14,3±1,5.
82
Tendo identificado algumas características do comportamento dos progenitores neurais nas
culturas em monocamada desenvolvidas, foi iniciado o estabelecimento de condições para
incorporação da solução do fluoróforo Fluo-4 AM nas células e detecção dos níveis de
fluorescência das culturas.
5.4. DETECÇÃO DE CÁLCIO
Após estabelecimento de um protocolo de incorporação de Fluo-4 nas células e incubação
das culturas com a solução do fluoróforo, registaram-se imagens de microscopia confocal com
intervalos de tempo de 1min entre aquisições.
t = 0
t = 2min
t = 4min
t = 6min
Figura 5.23. Imagens de cultura de células S25 em monocamada (dia 5/8/07) num microscópio confocal de varrimento
Zeiss LSM 510 após incubação com Fluo-4.
Condições de observação: Laser = 488nm; Intensidade = 7%; Tamanho = 512x512; Tempo por pixel = 1,6μs; Secção
óptica = 830μm; Objectiva = 40x (Escala = 30μm).
No sentido de uma mais clara representação dos níveis de cálcio intracelulares procedeu-
se à conversão da intensidade registada nos pixeis das imagens de aquisição de microscópio
confocal das culturas incubadas com Fluo-4 para uma escala de cor, cuja gradação está indicada
na Figura 5.23. Nestas imagens são evidentes oscilações de cor, ocorrendo máximos de
intensidade no espaço intracelular. A eficiência do protocolo na incorporação do fluoróforo nas
células pretendidas está assim confirmada, sem existência de fluorescência de fundo,
correspondente ao nível inferior da escala de cor usada.
83
Deste modo, é possível identificar picos instantâneos dos níveis de cálcio, equivalentes a
um aumento da intensidade de detecção de sinal no interior das células. Os níveis registados têm
oscilações entre máximos e mínimos em intervalos de 1min, o menor intervalo detectado pela
aquisição desenvolvida. Neste sentido, pode deduzir-se a presença de diferentes concentrações
de cálcio no espaço intracelular com oscilações nesta escala de tempo.
Durante todo o tempo de aquisição desta série de imagens, 1h30, não são detectáveis
movimentos significativos das células sob observação. Apesar de ocorrerem picos de cálcio
durante esse tempo, não sincronizados nas células em monocamada, a mobilidade celular parece
estar afectada, com redução da velocidade dos progenitores comparativamente com os ensaios
de luz visível.
84
6. DISCUSSÃO
A utilização da linhagem 46C de células estaminais para diferenciação em precursores
neurais é da maior utilidade numa abordagem de microscopia em tempo real na medida em que
se torna assim possível confirmar a presença de precursores no campo do microscópio no
momento da aquisição das imagens, pela garantia da expressão de sox1 nas células
fluorescentes. No entanto, os ensaios de fluorescência revelaram alguns problemas de
optimização de parâmetros para manutenção da viabilidade celular das culturas de monocamada,
bem como para obtenção de imagens com qualidade para análise.
Importante notar que experiências de microscopia em tempo real com células estaminais
em diferenciação em monocamada, não foram reportadas até ao momento.
6.1. OPTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE OBSERVAÇÃO DE PROGENITORES NEURAIS
No que respeita às imagens obtidas no microscópio de fluorescência invertido Zeiss
Axiovert 200M, as células em monocamada apresentam um nível de fluorescência significativo
relativamente ao fundo não fluorescente, mesmo em casos onde a presença de ruído é elevada
(Figura 5.1). O valor de SNR neste tipo de microscópio para as condições experimentais é assim
suficiente para as observações em questão. No entanto, mesmo após minimização da quantidade
de luz incidente na amostra durante todo o tempo de aquisição, as imagens obtidas (Figura 5.5)
não correspondem às idealmente pretendidas. Os dados disponíveis indicam que a luz e modo de
iluminação do microscópio Axiovert 200M são lesivos para os progenitores neurais, em tão inicial
estado de diferenciação, dado que apenas na região da amostra focada pela luz de fluorescência
as células apresentam sinais visíveis de morte celular (Figura 5.1).
Um aspecto a ter em atenção diz respeito ao shutter de iluminação e ao tempo que ele
demora a abrir e a fechar completamente. O shutter do microscópio usado não é ultra rápido,
demorando algum tempo a abrir e a fechar. Durante esse tempo, a amostra está a ser iluminada
sem que haja aquisição de fotões para formação de uma imagem. Dispositivos altamente
sofisticados como o usado pelo sistema DeltaVisionRT (Applied Precision LLC) podem ser
pensados como alternativa pois minimizam o tempo em que a amostra está iluminada, usando
toda a luz emitida para construção da imagem de fluorescência. Idealmente, à abertura do shutter
corresponderia uma imediata aquisição de fotões e conversão pela CCD.
Por outro lado, a baixa eficiência quântica da CCD pode ser um dos motivos que obrigue a
que a iluminação da amostra seja feita durante mais tempo para se obter uma imagem no ecrã.
Para intensidades de sinal baixas (i.e. pequeno número de fotões colectados), os
fotomultiplicadores apresentam-se como soluções mais eficazes na transdução do sinal. Outra
hipótese seria o uso de detectores baseado em EMCCDs, por apresentarem uma sensibilidade
maior e menor ruído de leitura.
Uma nova abordagem foi testada num microscópio confocal, por possuir um princípio de
85
iluminação completamente diferente do anteriormente utilizado, e por ter fotomultiplicadores como
detectores, que permitem um aumento da sensibilidade da detecção de fluorescência.
Nas imagens obtidas foi complicada a identificação do movimento de células individuais. O
grande intervalo de tempo entre aquisições (20min) pode ter sido factor fundamental nesta
dificuldade. Na medida em que nas culturas sob estas condições nunca foi observada uma figura
de mitose, foi colocada de novo a hipótese de toxicidade pela luz laser desta energia.
Quando as culturas foram expostas a um laser de maior comprimento de onda, 633nm, e
por isso, de menor energia, foram pela primeira vez observados quatro eventos de mitose, num
intervalo total de 2h40 de tempo de aquisição (Figura 5.11). Como consequência, deve ser
ponderada no futuro uma abordagem de microscopia confocal com lasers de baixa energia para
este tipo de culturas em monocamada.
Sabe-se que as energias muito elevadas dos fotões incidentes provocam disrupção de
ligações químicas e produção de radicais livres por criação de tripletos energéticos. No entanto, a
redução da energia do laser para valores abaixo de 600nm coloca a iluminação no infra-vermelho
que, apesar de não provocar alterações estruturais nas moléculas constituintes da amostra,
conduz a alteração do seu estado vibracional, com aquecimento implicado. Consequentemente,
com o aumento do comprimento de onda do laser de iluminação têm de ser considerados novos
mecanismos de dano celular, indicando os resultados obtidos para a possível existência de um
intervalo óptimo que inclui os 633nm em que a formação de radicais livres e aquecimento não
ocorrem de modo significativo para a viabilidade da amostra. Especula-se quanto ao potencial uso
de fluoróforos nesta gama de comprimentos de onda para monitorização da dinâmica de
determinadas proteínas em culturas de precursores neurais. Actualmente são já usadas proteínas
fluorescentes (FPs) com comprimento de onda de excitação de 590nm, passíveis de uso em
células vivas.
Com os dados de que dispomos, a observação das culturas em monocamada num
microscópio de campo claro com luz visível é a mais prometedora para os objectivos
estabelecidos.
A luz do espectro do visível mantém a viabilidade de progenitores neurais em
monocamada, nas condições de diferenciação, temperatura e CO2 usadas.
6.2. MOVIMENTO INTERCINÉTICO NUCLEAR
A análise efectuada do comportamento celular de culturas de monocamada de progenitores
neurais revela a presença de uma população dinâmica de células, exibindo mudanças sequenciais
na sua forma e organização estrutural no decorrer do ciclo celular, e em relação com o processo
de diferenciação.
Como representado na Figura 5.14, os progenitores neurais com movimento intercinético
nuclear apresentam uma morfologia bipolar, com um corpo celular alongado, e membrana celular
nas direcções apical e basal da roseta. A posição do núcleo de cada célula varia com o estado do
ciclo celular em que se encontra, ocorrendo as mitoses na região apical. Consequentemente,
86
antes da divisão, estas células neuroepiteliais têm um movimento radial de aproximação ao lúmen
da roseta. Não se observaram nenhuns casos de aproximações tangenciais de progenitores à
região apical da roseta. Em 82,4% das células que se aproximam à região apical existe um
pequeno afastamento, claramente observável mas de difícil quantificação, do corpo celular 1h
antes da citocinese no sentido oposto ao centro da roseta (Figura 5.18). Após este momento, o
padrão de divisão de todas os progenitores é semelhante. A célula desprende quase totalmente da
placa adquirindo uma forma esférica. Desde este instante até à citocinese e distinção clara de
duas células decorrem aproximadamente 15min. As células filhas aderem imediatamente à placa,
ainda na região apical, e saem desta região aproximadamente com o mesmo ângulo de entrada
da célula mãe na roseta (Figura 5.19). Nos minutos iniciais, as células-filhas apresentam-se
fisicamente muito próximas uma da outra com movimentos muitas vezes síncronos.
Não foi possível estabelecer uma distância mínima ao centro da roseta que comprometesse
as células que passassem esse limitar de se dividir. Aparentemente, abaixo de 9,79μm de
distância ao centro da estrutura, as células ficam determinadas à divisão. No entanto, para células
localizadas num arco de círculo com raio interno maior ou igual a este valor e raio externo de
14,7μm, a avaliação da aceleração nos instantes anteriores a esse ponto indicará o destino que
elas adoptarão. As células que irão dividir, em média cerca de 2h05±32min antes do instante em
que têm distância mínima ao centro da roseta antes da retracção, estão situadas a 34μm do
centro. Estes dados indicam que a decisão de divisão por parte de um progenitor é tomada
aproximadamente 2h antes da maior aproximação à região apical da roseta. A este momento
corresponderá um instante durante a fase G2, que determina se a célula pode ou não entrar em
fase M. Estudos anteriores (Miyama et al., 2001) referem 2 a 5 horas como tempo de duração
conjunto das fases G2 e M.
6.2.1. MITOSE
Devido à impossibilidade de determinação exacta do momento de entrada dos progenitores
em fase M, torna-se artificial qualquer comparação com tempos de mitose deste tipo de células em
cultura. No entanto, estudos em cortes de tubo neural de embriões de galinha no dia 1,5 (Wilcock
et al., 2007) indicam como tempo de mitose 28±9min. Os valores de referência in vivo situam-se
nos 32min (Wilcock et al., 2007). Estes valores são maiores que o calculado neste estudo mas da
mesma ordem de grandeza, apontando para um comportamento normal das células das culturas
observadas no que diz respeito à fase M.
A análise das células com movimento intercinético nuclear e com divisão na região apical
da roseta indica uma frequência média de divisão de 0,92±0,20 divisões/h nas culturas. Este valor
corresponde a rosetas com, em média, 41±11 células. Para que a esta frequência média uma
população de 41 células sincronizadas duplicasse seriam necessárias 44h33. Durante este tempo
todas as células dividiriam pelo menos uma vez. Como as células em observação não estão
sincronizadas, este tempo pode ser apenas considerado um estimador máximo de tempo de ciclo
celular. O tempo médio de ciclo celular deste tipo de progenitores é assim igual ou inferior a
87
44h33. Este valor é muito semelhante ao obtido por Bekman e colaboradores (Bekman et al.,
2006) para este tipo de culturas: aproximadamente 2 dias. Um cálculo mais correcto da duração
do ciclo celular dos progenitores em estudo poderia ser deduzido caso as filmagens tivessem sido
prolongadas por mais tempo.
6.2.2. VELOCIDADES DE MIGRAÇÃO
Através da análise do padrão de velocidades das células dispostas em roseta, pode
constatar-se que o movimento intercinético nuclear não é linear nas condições de cultura
utilizadas. Tanto os progenitores em migração para o centro da roseta como as células-filhas após
divisão apresentam intervalos de velocidade constante, intercalados com movimentos “saltatórios”,
onde a velocidade aumenta de valor momentaneamente. Apesar do ruído presente nos gráficos de
velocidades da Figura 5.19 devido a pequenas oscilações de posição das células entre os
diferentes instantes de tempo, é clara a presença de picos de velocidade em ambos os casos.
Aspecto importante é a diferença de valores de velocidade (centrífuga) da célula-mãe no
sentido apical e das células-filhas no sentido basal (centrípeta). Representado como exemplo na
Figura 5.19, em todos os casos de divisões em que foram seguidas células, e apesar de os
valores de velocidades médias serem muito semelhantes, numa análise das velocidades máximas
atingidas, é notória a menor velocidade das células-mãe, progenitores, comparativamente com as
células originadas após divisão. Os valores máximos de velocidades de células-filhas atingem os
10,2µm/min, sendo a média de velocidades máximas dos progenitores neurais em aproximação ao
centro da roseta (1,62±0,38µm/min) 61,5% inferior à média das velocidades máximas das células-
filhas (4,21±0,12µm/min).
Conclusões sobre a duração das fases G2, S e G1 do ciclo celular só poderiam ser
tomadas com recurso a marcadores nucleares como 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU).
Comparando os valores de velocidades das células, tanto células-mãe em aproximação à
região apical, como células-filhas, estes são, em média, 62,5 % superiores aos valores
encontrados nos ensaios de microscopia confocal: 0,135 e 0,190µm/min. Estes valores de
velocidades confirmam a hipótese de diminuição de mobilidade das células quando iluminadas
com laser ou luz de Mercúrio.
6.2.3. TIPO DE DIVISÃO DOS PROGENITORES NEURAIS
Do número total de divisões (n = 33) registadas em cada roseta analisada, em média 76,1%
das divisões são verticais, i.e. com o plano de clivagem da membrana celular sobre um raio da
roseta. Em 19 divisões foi possível distinguir o tipo células originadas, a partir das quais, e acordo
com a classificação estabelecida na Secção 5.3.3, em 15,8% são criados um par de células com
características diferentes (um progenitor e uma célula em diferenciação terminal). As restantes
divisões (84,2%) são responsáveis pelo aparecimento de dois progenitores.
Deste modo, a população de células que se afastam do lúmen da roseta é constituída por
88
progenitores em fase G1 e células pós-mitóticas em fase G0. Este valor de 84,2% encontrado está
um pouco acima do reportado por Wilcock e colaboradores (Wilcock et al., 2007) em cortes de
tubo neural de embrião de galinha, 66,7%. Contudo, confirma-se a predominância da produção de
progenitores em detrimento de células em diferenciação terminal. Tendo em consideração que
esta comparação é feita entre modelos de vertebrados diferentes, um dos motivos que pode estar
na origem do valor por nós encontrado pode ser a nossa incapacidade de inferência do destino
das células-filhas formadas. Até ao momento final do tempo total de aquisição de imagens, as
células consideradas para a estatística de formação de uma par de progenitores não tinham ainda
perdido a ligação à região apical da roseta. Contudo, não se exclui a hipótese deste processo ter
ocorrido nalguns casos, após ter sido terminada a aquisição das imagens.
Inferência quanto à produção de uma célula em diferenciação terminal foi feita nos casos
em que a célula em questão perde a ligação à região apical da roseta, obtendo uma orientação
rodada de 90º à anteriormente tida. Em analogia com o tubo neural, a célula em diferenciação
terminal tem assim agora as extensões da sua membrana ao longo do eixo dorso-ventral do tubo,
em detrimento do eixo médio-lateral. Um comportamento semelhante foi registado em células de
cortes de tubo neural de galinha (Wilcock et al., 2007) e cortes de retina de embriões de rato no
estado E14-17 (Saito et al., 2003). Importante sublinhar que, para além de modelos animais
diferentes, o ensaio por nós desenvolvido é unicamente in vitro, por comparação com as
experiências de Wilcok e colaboradores e Saito e colaboradores, que desenvolveram toda a parte
experimental em cortes de tecido provenientes de animais. Nos estudos referidos, a confirmação
de aquisição de identidade neural foi obtida posteriormente por ensaios imunohistoquímicos de
fixação com marcadores neuronais, tais como HuC, uma proteína característica de neurónios
diferenciados. Uma abordagem semelhante pode ser pensada no sentido da confirmação da
identidade pretendida. No entanto, uma alternativa a ensaios desta natureza consiste na
confirmação da perda da identidade de progenitor por diminuição e efectivo desaparecimento da
fluorescência dessas células. Apesar da GFP poder ainda encontrar-se no citoplasma nos
instantes imediatamente após a divisão, como a transcrição do gene sox1 termina com a perda de
identidade de progenitor neural, rapidamente as moléculas fluorescentes presentes no citoplasma
sofrem bleaching e as células em divisão terminal podem assim ser facilmente identificadas. Este
é um dos motivos da importância fulcral da optimização de técnicas de observação de
fluorescência neste tipo de culturas, não completamente atingida em tempo útil para a conclusão
deste estudo.
Do número total de divisões simétricas não terminais, 25% são devido a divisões
horizontais. Neste sentido, os dados referentes às divisões analisadas apontam para que exista
uma boa correlação entre a produção de um par de progenitores e o tipo de divisão vertical.
Apesar de haver tendência para divisão nesta orientação as divisões simétricas não são
exclusivamente verticais. Em oposição, as divisões assimétricas têm os dois tipos de orientação
do plano de clivagem. Estes dados estão em concordância com os obtidos por Wilcock e
colaboradores para cortes de tubo neural de galinha. Nada se pode deduzir quanto à existência de
divisões simétricas terminais, por não haver contagens de pares de células em divisão terminal
89
originadas a partir da mesma divisão. Mais uma vez, será necessário aumentar a janela de tempo
total de aquisição das séries de imagens. Caso a monitorização das culturas fosse feita por mais
tempo poderia ser confirmada a identidade de progenitor das células-filhas através da observação
do final do ciclo celular dessas células com existência de nova divisão.
6.3. DETECÇÃO DE CÁLCIO
Os ensaios efectuados para monitorização dos níveis de cálcio intracelular nas células de
roseta (Figura 5.23) apontam para elevada eficiência na incorporação do fluoróforo nas células em
causa. As evidências indicam que o protocolo desenvolvido funciona de modo reprodutível nas
células em monocamada das culturas de progenitores neurais de S25. Para a validação do
método contribuem também os valores nulos de fluorescência de fundo nas imagens. Para além
da eficaz incorporação do fluoróforo, detectado ao nível citoplasmático, são evidentes oscilações
na fluorescência interna dos progenitores, indicando assim a ligação de uma maior ou menor
quantidade de cálcio ao Fluo-4. Notar que a fluorescência desta molécula apenas aumenta
significativamente quando ligada a cálcio, sendo por isso um bom medidor de precisão da
concentração deste ião ao nível intracelular.
A análise dos resultados obtidos revela que ocorrem picos de cálcio no interior das células
em roseta, havendo oscilações de intensidade em intervalos de 1min, o menor intervalo de tempo
registado. De modo a obter um valor exacto de frequência das oscilações seria necessário
aumentar a frequência de aquisição do microscópio por diminuição do intervalo de tempo entre
amostragens. Como não foram detectados movimentos intercinéticos nucleares nas células
usadas neste ensaio não foi possível a partir destes resultados preliminares corroborar a relação
entre a existência de picos de cálcio intracelular e os movimentos dos progenitores. Mais uma vez,
os resultados sugerem a influência nociva da iluminação laser para excitação de moléculas
fluorescentes nos movimentos de migração das células de progenitores neurais em monocamada.
90
7. CONCLUSÃO
O presente estudo apresenta evidência in vitro da presença de movimento intercinético
nuclear de progenitores neurais e do processo de divisão deste tipo de células na região apical de
rosetas, estruturas miméticas do tubo neural formadas em cultura em monocamada.
Os progenitores neurais em vias de divisão migram para o lúmen da roseta, retraem toda a
membrana celular e adquirem uma forma completamente esférica imediatamente antes do
aparecimento dos primeiros sinais de constrição da membrana celular num plano médio da célula-
mãe. Nas culturas em monocamada monitorizadas, 76,1% das divisões ocorrem com o plano de
clivagem sobre um raio da roseta, constituindo as denominadas divisões verticais. Na restante
percentagem, a divisão horizontal origina uma célula na região apical e uma outra mais perto da
região basal. Em qualquer dos casos, a adesão à base da placa de cultura é feita na região apical,
imediatamente após divisão, recuperando as células-filhas a morfologia fusiforme característica
das células neste tipo de condições de cultura. Adicionalmente, as células para as quais se tenha
assumido uma divisão terminal entram em G0, libertando a ligação à região apical da roseta e
migrando para regiões fora dos limites da roseta. Estas células reorientam-se segundo um novo
eixo, análogo ao eixo dorso-ventral no tubo neural.
A abordagem de microscopia de campo claro com luz visível mostrou-se menos nociva no
que respeita à manutenção da viabilidade celular das culturas nas condições de iluminação
usadas. Além disso, proporciona uma aquisição de imagens com boa resolução para análise
manual. A monitorização do movimento de células individuais de modo automático, recorrendo a
técnicas de segmentação, foi muito exigente e morosa dadas as características de contraste das
imagens obtidas. A presença de vestígios celulares em suspensão no meio de cultura, bem como
a dificuldade técnica de remoção de poerias da câmara CCD, contribuíram em grande parte para
esta limitação da metodologia seguida neste estudo. Neste sentido, é da maior utilidade a
optimização das condições de observação em fluorescência das culturas de progenitores neurais.
Tendo o meio de cultura e material em suspensão baixa auto-fluorescência, e dado que é possível
com recurso a técnicas simples de manipulação genética endereçar marcadores fluorescentes a
uma grande quantidade de genes de interesse, o estabelecimento de condições de iluminação e
aquisição de imagens de amostras iluminadas com luz de fluorescência, tanto lâmpadas de
Mercúrio, Xénon ou laser será da maior utilidade. Sendo conhecido o papel de moléculas como
Notch e seus ligandos na diferenciação neural in vivo, a monitorização em tempo real da sua
expressão em culturas poderia abrir caminho para o estudo detalhado destes mecanismos em
culturas em placa e possível extrapolação para in vivo sem necessidade de outros ensaios. Neste
sentido, o desenvolvimento de modelos in vitro que mimetizem exactamente os comportamentos
in vivo das estruturas associadas são da maior utilidade para a comunidade científica. É neste
ponto que a contribuição deste estudo se torna importante.
O estabelecimento de ensaios em microscópios confocais com maior sensibilidade ao nível
de detectores, tais como o Zeiss LSM 510 META, seria uma hipótese para trabalhos futuros.
91
A existência de movimentos intercinéticos nucleares de progenitores neurais foi
tentativamente relacionada os fluxos de Cálcio nessas células (Komuro et al., 1996), o que nos
levou a desenvolver um protocolo para incorporação de repórteres de cálcio nas células
estudadas. Resultados preliminares revelam a eficiência da incorporação do fluoróforo e
consequente ligação a moléculas de cálcio do meio intracelular. Dado que a distribuição do cálcio
é citoplasmática, os níveis de intensidade de sinal detectados corresponderão a variações reais de
concentração. Neste sentido pode concluir-se a existência de variações de concentração de cálcio
intracelular nas células das culturas filmadas, não sendo os picos máximos coordenados entre as
células de uma mesma roseta. Contudo, há em certos casos indícios de pequenos aumentos em
células adjacentes, podendo o fluxo existir devido às gap junctions entre células. Apesar de não
estar esclarecido o papel deste tipo de junções no movimento intercinético nuclear de progenitores
neurais in vivo (Pearson et al., 2005), é conhecido que o posicionamento lado a lado dos
progenitores permite a passagem de moléculas de sinalização, nomeadamente cálcio. No sistema
nervoso central, está bastante bem descrita a participação das gap junctions cuja actividade é
dependente de cálcio na regulação do movimento de células e proliferação, sendo disso um
exemplo os movimento migratórios de neurónios onde existe correlação entre a velocidade e a
frequência e amplitude das alterações de cálcio (Komuro et al., 1996).
Em suma, a importância deste estudo no contexto de células estaminais e processos de
diferenciação centra-se no conhecimento mais detalhado do comportamento dos progenitores
neurais em placa, em culturas de monocamada, como miméticas do comportamento dos
progenitores neurais no ser humano. A relevância deste tipo de avanços torna mais viável a
possibilidade de diferenciação controlada de células estaminais em qualquer tipo de linhagem
celular estável para potenciais aplicações médicas de regeneração de tecidos lesados.
92
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch Signaling: Cell Fate Control and Signal
Integration in Development, Science 284: 770-776 (1999).
Baek JH, Hatakeyama J, Sakamoto S, Ohtsuka T, Kageyama R. Persistent and high levels of Hes1
expression regulate boundary formation in the developing central nervous system, Development
133: 2467 -2476 (2006).
Bain G, Ray WJ, Yao M, Gottlieb DI. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal
gene expression in mouse embryonic stem cells in culture, Biochem. Biophys. Res. Commun. 223:
691-694 (1996).
Basics of Light Microscopy & Imaging. GIT VERLAG, OLYMPUS (www.olympus-europa.com).
Bekman E, Castro CV, Fior R, Henrique D. Neuronal Production in vitro from embryonic stem cells,
Actas Bioq. 7: 61-66 (2006).
Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and
remodelling, Mol. Cell Biol. 4: 517-529 (2003).
Bio-Rad Cellscience Fluorescence Database: http://fluorescence.nexus-solutions.net/frames6.htm
Bray S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex, Mol. Cell Biol. 6: 678-689.
Chenn A, Zhang YA, Chang BT, McConnell SK. Instrinsic Polarity of Mammalian Neuroepithelial
Cells, Molecular and Cellular Neuroscience 11:183-193 (1998).
Chiba S. Notch signalling in stem cell systems, Stem Cells 24: 2437-2447 (2006).
Confocal Laser Scanning Microscopy – Principles. Microscopy form Carl Zeiss.
Deus JD, Pimenta M, Noronha A, Peña T, Brogueira P. Introdução à Física, 2ª edição, Mc Graw
Hill (2000).
Fior R, Henrique D. A novel hes5/hes6 circuitry of negative regulation controls Notch activity during
neurogenesis, Develop. Biol. 281: 318-333 (2005).
Fishell G, Kriegstein AR. Neurons from radial glia: the consequences of asymmetric inheritance,
93
Current Opinion in Neurobiology 13: 34-41 (2003).
Friel R, van der Sar S, Mee PJ. Embryonic stem cells: Understanding their history, cell biology and
signalling, Advanced Drug Delivery Reviews 57: 1894-1903 (2005).
Gilbert S. Developmental Biology, 6th edition, Sinauer (2000).
Goldman RD, Spector DL. Live Cell Imaging – A Laboratory Manual (2003).
Haeckel, E..Die Gastrula und die Eifurchung der Tiere. Jenaische Z. Naturwiss. 9: 402–508 (1875).
Hall BK, Ekanayake S. Effects of growth factor on the differentiation of neural crest and neural
crest cell-derivatives, Int. J. Dev. Biol. 35: 367-387 (1991).
Haragushi T, Ding D-Q, Yamamoto A, Kaneda T, Koujin T, Hiraoka Y. Multiple-color Fluorescence
Imaging of Chromosomes and Microtubules in Living Cells, Cell Struct and Function 24: 291-298
(1999).
Kageyama R, Ohtsuka T, Kobayashi T. The Hes gene family: repressors and oscillators that
orchestrate embryogenesis, Development 134: 1243-1251 (2007).
Kapur N, Mignery GA, Banach K. Cell cycle-dependent calcium oscillations in mouse embryonic
stem cells, Am. J. Physiol. Cell Phisiol. 292: C1510-C1518 (2007).
Kawasaki H, Mizuseki K, Nishikawa S, Kaneko S, Kuwana Y, Nakanishi S, Nishikawa S, Sasai Y.
Induction of Midbrain Dopaminergic Neurons from ES Cells by Stromal Cell–Derived Inducing
Activity, Neuron 28: 31–40 (2000),
Kitner C. Neurogenesis in embryos and in adult neural stem cells, The Journal of Neuroscience
22(3): 639-643 (2002).
Komuro H, Rakic P. Intracellular Ca2+ flutuations modulate the rate of neuronal migration, Neuron
17: 275-285 (1996).
Mayhall EA, Paffett-Lugassy N, Zon LI. The clinical potential of stem cells, Curr. Opin. Cell Biol. 16:
713-720 (2004).
Miyama S, Takahashi T, Goto T, Bhide PG, Caviness VS Jr. Continuity with Ganglionic Eminence
Modulates Interkinetic Nuclear Migration in the Neocortical Pseudostratified Ventricular Epithelium,
Experimental Neurology 169: 486-495 (2001).
94
Moreau M, Leclerc C. The choice between epidermal and neural fate: a matter of calcium, Int. J.
Dev. Biol, 48:75-84 (2004).
Murciano A, Zamora J, López-Sánchez J, Frade JM. Interkinetic nuclear movement may provide
spatial clues to the regulation of neurogenesis, Molecular and Cellular Neuroscience 21: 285-300
(2002).
Pearson RA, Lüneborg NL, Becker DL, Mobbs P. Gap Junctions Modulate Interkinetic Nuclear
Movement in Retinal Progenitor Cells, The Journal of Neuroscience 25(46):10803-10814 (2005).
Rossant J, Tam PL. Mouse development, Patterning, Morphogenesis, and Organogenesis,
Academic Press (2002).
Saito K, Kawaguchi A, Kashiwagi S, Yasugi S, Ogawa M, Miyata T. Morphological asymmetry in
dividing retinal progenitor cells, Develop. Growth Differ. 45: 219-229 (2003).
Sanes DH, Reh TA, Harris WA. Development of the nervous system, 2nd edition, Academic Press
(2006).
Santella L. The role of Calcium in the cell cycle: Facts and Hypotheses, Biochemical and
Biophysical Research Communications 244: 317–324 (1998).
Sasai Y, De Robertis EM. Ectodermal patterning in vertebrate embryos, Dev. Biol. 182: 5–20
(1997).
Sauer EM, Walker EB. Radioautobiographic study of interkinetic nuclear migration in the neural
tube, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 101: 557-560 (1959).
Spemann H, Mangold H. Über die induktion von embryonalanlagen durch implantation artfremder
organisatoren. Wihlem Roux’s Arch. Ent., Mech. Org. 100: 599-638 (1924).
Webb SE, Moreau M, Leclerc C, Miller AL. Calcium transients and neural induction in vertebrates,
Cell Calcium 37: 375-385 (2005).
Weller M, Krautler N,Mantei N, Suter U, Taylor V. Jagged1 Ablation Results in Cerebellar Granule
Cell Migration Defects and Depletion of Bergmann Glia, Dev. Neurosci. 28: 70-80 (2006).
Wilson L, Gale E, Maden M. The role of retinoic acid in the morphogenesis of the neural tube, J.
Anat. 203: 357-368 (2003).
95
Wilson L, Maden M. The mechanisms of dorsoventral patterning in the vertebrate neural tube,
Developmental Biology (2005).
Wolpert L. Principles of development, 2nd edition, Oxford (2002).
Ying Q-L, Stavridis M, Griffiths D, Li M, Smith A. Conversion of embryonic stem cells into
neuroectodermal precursors in adherent monoculture, Nat. Biol. (2003).
Yoshikawa K. Cell cycle regulator in neural stem cells and postmitotic neurons, Neuroscience
Research 37: 1-14 (2000).
Yuste R, Konnerth A. Imaging in Neuroscience and Development, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (2005).
http://www.invitrogen.com
http://www.api.pt
http://www.hamamatsu.com/