momento Revista de Fısica, No. 60, Ene - Jun 2020 67

REGENERACION DEL ORGANO CUTANEOMEDIANTE INGENIERIA DE TEJIDOS

CUTANEOUS ORGAN REGENERATION BY VIRTUEOF TISSUE ENGINEERING

Mauricio Rojas1, Daniel Solera1, Carolina Herrera1, Jose

Vega-Baudrit1,2

1 Escuela de Quımica, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.2 Laboratorio Nacional de Nanotecnologıa LANOTEC-CeNAT-CONARE, Costa Rica.

(Recibido: 10/2019. Aceptado: 12/2019)

Resumen

La ingenierıa de tejidos es una ciencia que busca desarrollarsustitutos de tejido y organos para mantener, restauraro aumentar las funciones de sus contrapartes heridas oenfermas in vivo. El organo cutaneo es el tejido queconstituye la mayor extension en el cuerpo humano, y ala vez es el organo mas externo, lo cual, consecuentemente,hace que sea el organo mas propenso a herirse. Debido aesta problematica las investigaciones y esfuerzos con finesde solucionar este problema son constantes. El enfoque dela revision es el de presentar metodos recientes a traves delos cuales la ingenierıa de tejidos, utilizando compuestosbiocompatibles, ha logrado una satisfactoria regeneraciondel organo cutaneo, esto incluira la revision del uso demetodos para la regeneracion de tejidos, tales como laimpresion 3D y el uso de andamios polimericos, apositosbiodisenados y celulas madre.

Palabras clave: Ingenierıa de tejidos, regeneracion, polımeros,

biocompatibilidad.

Jose R. Vega-Baudrit: jvegab@gmail.com doi:10.15446/mo.n60.82752

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Abstract

Tissue engineering’s inherent purpose is to develop skin andorgan substitutes to sustain, restore or enhance woundedor sick skin functions in vivo. The cutaneous organ tissuemakes up the largest organ extension within the humanbody, and it is also the most outward organ, which makes itthe most prone to injury. Due to these problems, constanteffort and research has been made looking to solve them.The review’s focus is to present recent methods throughwhich tissue engineering, using biocompatible compounds,has achieved a successful cutaneous organ healing. This willinclude the review of tissue engineering methods such as3D printing and the usage of a polymeric scaffold, wounddressings and stem cells.

Keywords: Tissue engineering, skin, cutaneous organ, regeneration,

biocompatible polymers.

1. Introduccion

La piel es la barrera entre el ambiente interno y externo de unapersona, ademas es el organo mas grande del cuerpo humano [1].El dano en esta es causado principalmente por quemaduras, heridascronicas como ulceras venosas, escision de la piel, tumores y otrasafecciones dermatologicas. Segun la OMS, cada ano se atribuyen300,000 muertes a quemaduras, mientras que 6 millones de pacientesen todo el mundo sufren quemaduras cada ano. Ademas, mas de 6millones de personas sufren de ulceras cutaneas cronicas, solo enlos Estados Unidos, mas de 3 millones de pacientes sufren heridascronicas [2]. Debido a la presencia de celulas madre, la epidermisque se encuentra herida es capaz de estimular auto regeneracion. Sinembargo, en caso de lesiones profundas o quemaduras, el proceso desanacion no es adecuado, y esto conlleva a una herida cronica [1].La curacion de heridas y por lo tanto, la regeneracion del tejidode la piel es un proceso muy bien coordinado que depende devarios factores como el tipo de herida, dano tisular por quemadura,traumatismo fısico, condiciones de humedad alrededor de la herida,inflamacion e infecciones secundarias [3].

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La ingenierıa de tejidos ha surgido como un nuevo campoprometedor para el tratamiento de lesiones cutaneas [2]. El principalobjetivo es restaurar y mejorar la funcion de los tejidos, ya seagenerando sustitutos nuevos biocompatibles, o bien mediante lareconstruccion de los tejidos [3]. La compleja cascada de tecnicaspara regeneracion de heridas es una fuente primordial de innovacionen el campo de la ingenierıa de tejidos blandos [4]. Varios sustitutosde la piel (celularizados o acelulares, que contienen componentesdermicos y/o epidermicos) estan disponibles comercialmente. Sinembargo, debido a la ineficiencia para el tratamiento de heridasy quemaduras graves o grandes, la investigacion aun esta enprogreso. Se consideran diferentes estrategias de ingenierıa tisularpara abordar los inconvenientes actuales de los sustitutos de la piel,y recientemente se han publicado una gran cantidad de artıculos querevisan las estrategias actuales [5].

2. Ingenierıa de tejidos

El objetivo de la ingenierıa de tejidos es el de desarrollar sustitutosde tejido y organos para mantener, restaurar o aumentar lasfunciones de sus contrapartes heridas o enfermas in vivo [6].

En la decada anterior se encontraron numerosos productos quemuestran potencial en aplicaciones clınicas. Aunque muchos de losproductos que entran al mercado son heredados de eras anteriores,las pruebas clınicas exitosas para la aplicacion de tejidos disenadosmediante ingenierıa de tejidos han sido muy limitadas debido aobstaculos persistentes que evitan el logro de funciones biologicasde constructos celularizados debido a la compatibilidad incompletacon su huesped [6].

Uno de los principales obstaculos que se presentan en la ingenierıade tejidos, es que muchos de los tejidos disenados no poseen porcompleto las mismas caracterısticas que el tejido funcional queestan reemplazando. La falta de compatibilidad total se atribuyeen parte al poco conocimiento cuantitativo existente relacionadoa los mecanismos de respuesta de adaptacion que modifican laarquitectura de los tejidos disenados posterior a su trasplante invivo [7].

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La estrategia actual utilizada en ingenierıa de tejidos se basaen el diseno ex-vivo de la expansion biocompatible, seguida desu implantacion en las areas danadas. Generalmente se utilizanbiomateriales variados en la ingenierıa de tejidos. El rol de losbiomateriales es el de proveer soporte mecanico y transportede masa temporales para fomentar la adhesion, proliferacion ydiferenciacion celulares, ademas de controlar el tamano y formadel tejido regenerado [7].

La clasificacion de los sustitutos de piel puede estar basadaen la duracion del recubrimiento, permanentes, semipermanentesy temporales; tambien en las caracterısticas estructurales,epidermico, dermico o dermo-epidermico; en la composicion delsustituto de piel, celular o acelular; y, similarmente se puede basaren el tipo de biomaterial utilizado, biologico (autologo, alogenico,xenogenico) o sintetico (biodegradable, no biodegradable) [1].

3. Anatomıa de la piel

La piel es la primera lınea de defensa contra el medio exterior yademas ayuda a mantener la termorregulacion del cuerpo humano[8]. Es el organo mas grande, el mas externo y actua como unaenvoltura del cuerpo, lo cual, consecuentemente, hace que sea elorgano mas propenso a herirse. La piel se encuentra cercanamenteintegrada a la fascia endoesqueletica a traves de ligamentosreticulares, venas, nervios y linfaticos [9].

Como se muestra en la figura 1, la piel esta conformada portres capas: epidermis, dermis e hipodermis. La porcion externa dela epidermis (capa cornea) es considerablemente mas permeableal agua que las capas internas, y ademas inhibe la entrada depatogenos y otras sustancias ajenas al cuerpo. Posee una estructuramulticapa con celulas extendiendose desde la membrana basalhasta la dermis. La membrana basal contiene celulas progenitoraslas cuales se diferencian en queratinocitos, y posteriormente losqueratinocitos se diferencian y maduran a la vez que se desplazana la superficie de la piel. La capa queratinizada de celulas muertasen la piel provee cualidades de barrera a la piel. El pigmentocaracterıstico de la piel viene dado por la melanina, la cual esproducida por los melanocitos presentes en la epidermis [10].

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La dermis es la capa mas gruesa de las 3 capas. Es un tejidoconectivo formado por una matriz extracelular, fibroblastos, celulasvasculares endoteliales, folıculos de pilosos, glandulas sudorıparas,glandulas sebaceas, venas sanguıneas y terminaciones nerviosas.Debajo de la dermis se encuentra la hipodermis, la cual es un tejidoadiposo encargado de proveer aislamiento y amortiguacion entre lapiel y las estructuras del esqueleto como el musculo y los huesos.Ademas sirve como area de almacenamiento de energıa [11].

Figura 1. Estructura de la piel humana [1].

4. Heridas y su proceso de curacion

Una herida se puede definir como una disrupcion o dano a unaestructura anatomica y sus funciones como consecuencia de unrompimiento de diferente grado de severidad de las estructurasde un organo. En el caso de la piel, el dano se puede extenderhasta otros tejidos y estructuras tales como el tejido subcutaneo,musculos, tendones, nervios, venas y huesos [12].

Para un adulto mamıfero es desafiante lograr una recuperacion totaldel tejido epitelial despues de haber recibido un dano. Normalmentedespues del proceso de sanacion queda formada una cicatriz que,aunque cumple con los requisitos basicos de prevenir infecciones ydeshidratacion, tambien puede ser considerada como desfavorableya que se pierden atributos sensoriales y termorregulatorios porla ausencia de folıculos pilosos, y glandulas sebaceas. Ademas,debido a su obvia apariencia distinta al resto de la piel, la cicatrizresultante del proceso de sanacion puede culminar en consecuencias

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cosmeticas y psicologicas devastadoras, reduciendo la calidad devida del individuo [13].

La sanacion de heridas es un proceso complejo multicelular queinvolucra fibroblastos, queratinocitos, celulas endoteliales y celulasinflamatorias. El proceso de sanacion sigue una secuencia ordenadade eventos incorporando tres etapas entrelazadas: fase inflamatoria,fase de proliferacion y la fase de remodelacion. Las fases delproceso en la recuperacion de una herida esta reguladas por lacomunicacion entre distintos grupos de moleculas, incluyendo lamatriz extracelular, integrinas, factores troficos y metaloproteinasasde matriz [14].

La fase inflamatoria es un proceso para prevenir hemorragia pormedio de la contencion y bloqueo de la sangre dentro de las paredesde las venas danadas. La hemostasis es un proceso complejo queinvolucra la interaccion de las plaquetas, cascadas de coagulacion deplasma, proteınas fibrinolıticas, y citoquinas mediadoras. Al existiruna herida del tejido el mecanismo hemostatico usa receptoresvasculares y extravasculares en coordinacion con los componentesde la sangre para sellar el dano al sistema vascular y asilarlo delos tejidos circundantes. Al final de la fase inflamatoria las venassanguıneas lesionadas se contraen y la sangre filtrada se coagula,contribuyendo al mantenimiento de su integridad [15, 16].

La fase de proliferacion tiene como objetivo disminuir el area detejido lesionado por contraccion y fibroplasia, estableciendo unabarrera epitelial viable para activar queratinocitos. Esta etapa esla responsable del cierre de la herida como tal, lo cual involucraprocesos de angiogenesis, fibroplasia y reepitelizacion. Este procesoempieza en el microambiente de la lesion dentro de las primeras 48horas y puede permanecer activo hasta 14 dıas despues de la lesion[16].

La fase final de remodelacion tiene como principal objetivo elalcanzar la fuerza tensil maxima a traves de la reorganizacion,degradacion y resıntesis de la matriz extracelular. En esta etapa desanacion ocurre un intento por recobrar las estructuras normales detejido, y el tejido granular es gradualmente remodelado formando

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el tejido cicatrizado el cual es menos celular y vascular, ademas deexhibir un incremento progresivo en la concentracion de fibras decolageno [16, 17].

5. Compuestos biocompatibles promotores de laregeneracion de tejidos

Los tipos de compuestos y sustancias utilizadas en ingenierıade tejidos en casi la totalidad de los casos llevan al menos uncomponente polimerico. Los polımeros disenados para promoverla regeneracion de tejidos pueden clasificarse de manera generalen naturales y sinteticos (figura 2) [5]. La variedad de tipos,combinaciones y aditivos organicos e inorganicos para el polımeroformulado es vasta. Debido a la gran variedad de compuestospromotores de la regeneracion de tejidos, la investigacion y elesfuerzo por encontrar nuevas alternativas que presenten altacompatibilidad con el tejido vivo son continuos.

Polımeros naturales tales como el colageno, quitosano, acidohialuronico, alginato, entre otros, son usados por poseercaracterısticas que los hacen favorables. Entre estas caracterısticaslas mas importantes son su biodegradabilidad, biocompatibilidady su amplia abundancia. La biodegradabilidad de un determinadomaterial natural es una de las caracterısticas mas importantes, yaque estos estan presentes en la matriz extracelular, lo cual haceque las celulas presenten una respuesta buena de compatibilidad yritmo de crecimiento [18].

Un caso de uso de polımeros naturales es la investigacion deHuan et al. En dicha investigacion se sintetizaron, por medio deuna reaccion de derivatizacion a base de quitina en medio acuosocon KOH/Urea, derivados cuaternizados de β-quitina, los cualesmostraron cualidades antibacteriales debido a las cargas positivasgeneradas en la estructura por los grupos acetaamido. Ademas,las estructuras cuaternizadas de β-quitina mostraron promover laneovascularizacion, crecimiento de tejido granular y regeneracionde fibras de colageno [19].

Los biomateriales sinteticos pueden ser biomateriales naturalesmodificados o materiales completamente sinteticos. Este tipode materiales pueden ser biodegradables o no biodegradables.

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Entre los materiales no biodegradables es comun el uso dederivados de polietileno, politetrafluoroetileno, polimetilacrilatos,poliacrilamidas, polieteres, polisiloxanos, poliuretanos,polietilenglicol entre otros [20]. Este tipo de materialestienen ventajas tales como la no inmunogenicidad, buenareproductibilidad, adecuadas propiedades mecanicas y formasdisenadas a la medida [18].

Figura 2. Fibras de colageno y elastina en una dermis normal (a, b) yen tejido de cicatriz hipertrofico (c, d). En las imagenes por microscopıa deexcitacion por dos fotones (a, c) los grupos de colageno son verdes y las fibrasde elastina rojas. En las imagenes de microscopıa electronica de transmision(b, d) el colageno (letra C) es gris claro y la elastina (letra E) es gris oscuro.Mientras que las fibras de elastina gruesas y largas son visibles entre los gruposde colageno en la dermis normal, en la cicatriz hipertrofica la elastina esta

dispersa como fibras delgadas entre los grupos de colageno [5].

Entre otros polımeros sinteticos utilizados se encuentra el polımerode bloque formado por una secuencia de polietilenglicol, polipropilenglicol y polietilenglicol (PPG-PEG-PPG). Este es unpolımero ampliamente utilizado en biomedicina debido a suspropiedades unicas en solucion, habilidad de autoensamblaje y bajatoxicidad [21].

Entre los biomateriales sinteticos biodegradables es comun el usode poliesteres, poli(α-hidroxiacidos), polilactonas, poliortoesteres,

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policarbonatos, polianhıdridos y polifosfacenos. Estos materialesbiodegradables pueden ser disenados de modo que se puedacontrolar su cinetica de degradacion junto con su ritmo de factorde liberacion de crecimiento [18, 22].

En un caso de biomateriales sinteticos, Dobreikina et al. prepararonuna serie de geles a base de poliacrilamida (PAM) con redessemi-interpenetrantes para fines de ingenierıa de tejidos. Losgeles fueron preparados por polimerizacion de radicales libres ensolucion acuosa con PAM como cadena de union principal conun radio de 1:100 entre el monomero (goma gellan o xantano)y la PAM para la formacion de una red semi-interpenetrada. Lapresencia de polisacaridos a diferentes concentraciones mejora labiocompatibilidad del gel, ademas de aumentar significativamenteel modulo de Young y el potencial electrico del gel sintetico.Las estructuras desarrolladas en este estudio tienen la ventaja deque presentan un comportamiento no lineal en la tension versusdeformacion, lo cual es caracterıstico de los tejidos blandos [23].

6. Avances y tecnicas de ingenierıa de tejidos

6.1. Impresion 3D

En los ultimos 25 anos se han logrado avances significativosen el desarrollo de sustitutos disenados in vitro que imitanla piel humana, ya sea para ser utilizados como injertos parala sustitucion de la piel perdida, o para el establecimiento demodelos de piel humana in vitro [24]. El concepto de ingenierıade tejidos se formalizo en 1993, al detallarse las caracterısticasy aplicaciones de los andamios (soportes) tridimensionales (3D)biodegradables. Los andamios 3D son microestructuras que sirvende base para la colocacion de las celulas y los factores necesariospara la regeneracion cutanea; estos deberıan ser muy porosos,tener redes de poros bien interconectadas y tener un tamanode poros consistente y adecuado para la migracion e infiltracionde celulas. Posteriormente, de 1993 al 2002, se aplicaron variastecnicas de fabricacion convencionales para la produccion deandamios 3D, como la union de fibras, la separacion de fases,el moldeado y la formacion de espuma, etc. Sin embargo, estos

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metodos tienen un gran inconveniente: no permiten un controlsuficiente de la arquitectura de los andamios, la red de poros y eltamano de los poros, lo cual da lugar a andamios 3D inconsistentesy poco ideales, puesto que la simple siembra de celulas sobreandamios polimericos preformados no es suficiente para replicarcompletamente las sofisticadas interacciones de la matriz celulardentro de los tejidos naturales [25, 26]. Ademas, se deben mejoraraspectos del proceso de produccion de este sustituto de piel conlos metodos mencionados, como el tiempo necesario para producirla superficie requerida para cubrir una quemadura extensa o unaherida grande, y la necesidad de automatizar y estandarizar aquellosprocesos que se realizan manualmente [24]. Para superar esteproblema, se propuso el uso de metodos de impresion 3D parafabricar andamios personalizados con tamano y estructura de porocontrolado; esta tecnologıa se ha convertido en una herramientaflexible en la medicina regenerativa y proporciona una plataformapara enfrentar estos desafıos [24, 25].

Las tecnologıas utilizadas por los sistemas de bioimpresion 3Dpermiten una mayor precision en la relacion espacial entre loselementos individuales del tejido deseado [27]. Como resultado,entre 2003 y hasta el presente ano, la cantidad de estudiosen el campo de la impresion 3D para la ingenierıa de tejidosse ha multiplicado, y las tecnicas de impresion han mejoradodrasticamente, trasladandose de 2D a 3D [25, 28]. La bioimpresion,tambien conocida como creacion rapida de prototipos, fabricacionsolida de formas libres o fabricacion aditiva [26, 27], se puededefinir como “el uso de la tecnologıa de impresion 3D que incorporacelulas vivas viables con biomateriales para fabricar tejidos uorganos sofisticados” [26]. Debido al alto control del tamanode la gota y el ritmo de deposicion, las impresoras utilizadasen esta tecnologıa poseen la habilidad de imprimir con altaresolucion y exactitud; ademas, esta tecnologıa no solo permitela deposicion simultanea de diferentes biomateriales y multiplestipos de celulas, sino que tambien proporciona flexibilidad en eldiseno y fabricacion de construcciones personalizables de tejidosespecıficos para pacientes, lo que demuestra un gran potencial para

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la fabricacion de construcciones complejas de tejidos multicelulares3D [18, 26–29].

La bioimpresion generalmente contiene los siguientes tres pasos:en primer lugar, recopilar informacion precisa de tejidos yorganos para la designacion del modelo y la seleccion demateriales; en segundo lugar, transferir la informacion a una senalelectrica para controlar la impresora para imprimir los tejidos;en tercer lugar, crear una estructura estable [29]. Aunque labioimpresion se ha desarrollado ampliamente en los ultimos anos,las tecnologıas actuales implementadas en la bioimpresion son ensu mayorıa incapaces de imprimir organos solidos funcionales. Lasinvestigaciones han abordado este problema desarrollando plantillasque podrıan usarse in vivo para apoyar el desarrollo de organossolidos vascularizados, como los huesos [25, 30].

Variable Inyeccion de tinta Extrusion Asistido por laser DLPProceso de impresion Serial (gota a gota) Serial (lınea a lınea) Serial (punto por punto) Paralelo y continuoVelocidad de impresion Media (mm/s) Lenta (10-50 µm/s) Media (mm/s) Rapida (mm3/s)Resolucion 50 µm 5 µm <500nm 1µmViabilidad celular >85 % 40-80 % >85 % 85-95 %Eleccion de material Termo/pH/foto sensible Termo/foto sensible Fotosensible Fotosensible

Tabla 1. Comparacion de las diferentes tecnicas de bioimpresion mencionadasen [29].

Existen muchos tipos de tecnologıas de bioimpresion, cuatro delas cuales se utilizan ampliamente en la actualidad (Figura 3):impresion basada en inyeccion de tinta, impresion basada enextrusion, impresion asistida por laser, impresion basada en DLP–estereolitografıa de proyeccion optica dinamica (DOPsL)–, y lasdiferencias clave entre estas cuatro tecnologıas de impresion sedescriben en la Tabla 1. La viabilidad celular puede verse afectadapor varios factores, incluida la tecnica de bioimpresion utilizada, lavelocidad de impresion y la especie de celulas de siembra [29, 30].

6.1.1. Bioimpresion de inyeccion de tinta

La aplicacion de impresion de inyeccion de tinta ha sido limitadaen comparacion con los estudios basados en extrusion, debido a laincapacidad inherente del cabezal de impresion para proporcionarun flujo continuo. Las tintas biologicas con viscosidades inferioresa 10 mPa/s se han imprimido mediante de inyeccion de tinta. En

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Figura 3. Tecnicas de bioimpresion. a La bioimpresora de inyeccion de tintaexpulsa pequenas gotas de celulas e hidrogel de manera secuencial para construirtejidos. b La bioimpresora de extrusion utiliza fuerza neumatica o manual paraextruir continuamente una solucion lıquida de hidrogel de celulas. c Esquemadel posicionamiento de una impresora laser. D Esquema de la bioimpresorabasada en DLP –estereolitografıa de proyeccion optica dinamica (DOPsL) [29].

comparacion con otros metodos, la impresion de inyeccion de tintaofrece una velocidad de fabricacion rapida pero bajas densidades decelda. Los metodos de impresion por inyeccion de tinta se puedenclasificar en tres grupos: impresion biologica por inyeccion de tintacontinua, impresion biologica por inyeccion electro-hidrodinamicae impresion biologica por inyeccion de tinta a demanda. Estaultima categorıa es la mas grande y la mas comun que consisteen la bioimpresion de inyeccion de tinta termica, piezoelectrica yelectrostatica, mostradas esquematicamente en la figura 4 [30].

Rimann et al. desarrollo un metodo de impresion todo en uno parala construccion de tejidos blandos usando este tipo de impresion.En este trabajo, se desarrollo y utilizo una tinta biologica basadaen polietilenglicol junto con una impresora biologica de inyeccionde tinta comercial en 3D en desarrollo, la impresion tuvo lugar enambiente esteril. Para verificar la aplicabilidad de su trabajo, se

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Figura 4. Diagrama esquematico del metodo de impresion de inyeccion de tintade gota bajo demanda utilizando Actuadores A) Termicos y B) piezoelectricos.Un cabezal de impresion termica emplea un elemento de calentamiento que elevala temperatura localmente y crea una burbuja que impulsa las gotas a traves dela boquilla. Se utiliza una cabeza piezoelectrica con un material que cambia de

forma en la aplicacion de voltaje y expulsa las gotitas [30].

llevo a cabo una cultura a largo plazo de las estructuras impresas.Los resultados aprobaron la viabilidad y la proliferacion de losfibroblastos dermicos primarios humanos hasta por siete semanas[31].

6.1.2. Bioimpresion por extrusion

La gran popularidad de los metodos basados en extrusion sedebe, principalmente, al metodo de procesamiento definido queconduce a la simplicidad, diversidad y previsibilidad de esta tecnica[29, 30]. Una amplia gama de biomateriales imprimibles y equiposeconomicos se encuentran entre las ventajas de la bioimpresionpor extrusion. La figura 5 ilustra metodos de impresion comunesbasados en la extrusion categorizados en dispensacion neumatica,accionada por piston y por tornillo. En la dispensacion neumatica,la presion del aire proporciona la fuerza motriz requerida, mientrasque en la dispensacion accionada por piston y por tornillo,las fuerzas mecanicas vertical y rotacional inician la impresion,respectivamente. Hay tres factores principales para tener en cuentaen la capacidad de impresion a traves de la bioimpresion porextrusion: 1) capacidad de ajuste de la viscosidad, 2) fase debio-tinta antes de la extrusion, y 3) ventana de biofabricacionespecıfica del material [30]. La viscosidad puede ser una funcion

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de la temperatura o del adelgazamiento por cizallamiento y, porlo tanto, debe ajustarse para diferentes metodos de impresion.Ademas, la tinta biologica debe estar en una fase lıquida para evitarla obstruccion de la boquilla. Finalmente, no todos los biomaterialesson imprimibles y los que son imprimibles pueden no imprimirseen una amplia gama de parametros de procesamiento [29, 30]. Estatecnica fue utilizada por Rees et al. en su investigacion, en la cual seconsideran dos tipos de estructuras impresas en 3D de nanocelulosaoxidada como apositos para heridas. El primer tipo se preparomediante oxidacion mediada por (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il)oxidanilo (TEMPO) y el segundo tipo se preparo mediantecarboximetilacion y oxidacion de peryodato combinados.

Figura 5. Diagrama esquematico de los metodos comunes de bioimpresionbasados en la extrusion: a neumatico, b accionado por piston y c metodo de

dispensacion atornillado [30].

La tinta biologica de nanocelulosa producida se uso luego paraimprimir estructuras porosas 3D, se estudio para determinar elsoporte del crecimiento bacteriano y se demostro que tiene elpotencial de transportar y liberar componentes antimicrobianosmientras que no permite el crecimiento bacteriano [30, 32]. En otroestudio, se utilizo un hidrogel a base de gelatina, alginato y colagenopara construcciones de tejidos impresos en 3D cargados de celulas.Una parte integral de este trabajo fue controlar la velocidad dedegradacion del hidrogel cambiando la relacion molar de citratode sodio presente en el medio al alginato de sodio presente en elhidrogel. La alta tasa de proliferacion celular indico la posibilidad

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de mejorar la bio-tinta de alginato utilizando el metodo utilizadoen este trabajo. Las celulas madre se encapsularon en una tintabiologica a base de alginato irritado con rayos gamma que se reforzoaun mas mediante la adicion de fibras de PCL [30, 33].

6.1.3. Asistido por laser

La transferencia directa inducida por laser (LIFT, por sus siglas eningles) es una tecnica que permite la deposicion de material de altaresolucion en fase solida o lıquida. Si bien existen varias versiones deesta tecnica, en la figura 3c se ilustra esquematicamente una versionde impresion de material en fase solida. En un estudio, se empleola escritura directa por evaporacion de matriz asistido por laser,una variacion de la tecnica LIFT, para la impresion de celdas. Seuso alginato de sodio cargado con celulas de fibroblastos de ratonNIH 3T3 como tinta biologica junto con cloruro de calcio comoagente de reticulacion. Se estudiaron los efectos de la gelificacion yconcentracion de alginato, el tiempo de gelificacion y la influenciadel laser en la viabilidad celular. Se observo que, despues de 24 h, untiempo de gelificacion mas largo disminuye la viabilidad celular deincubacion debido a la reduccion de la nutricion y la transferenciade oxıgeno a traves de la pared gruesa del gel [30].

6.1.4. Bioimpresion a base de estereolitografıa

La impresion estereolitografica se basa en la polimerizacion depolımeros sensibles a la luz mediante un haz de luz controlado conprecision reflejado por los micro espejos digitales. En comparacioncon otros metodos, la estereolitografıa es una tecnica con altacalidad de impresion, velocidad y viabilidad celular. Sin embargo,se han reportado inconvenientes como resultado del uso de estemetodo. Por ejemplo, se ha informado que la fuente de luz UV, quees el metodo comun de polimerizacion, es danina para las celulas deADN e incluso causa cancer de piel. Para abordar este problema,los sistemas de bioimpresion de estereolitografıa de luz visible hanganado atencion. Como ejemplo, Wang et al. empleo un sistemade bioimpresion compuesto por un proyector de haz y mezclas defoto iniciadores a base de PEGDA, GelMA y erosina Y como tintasbiologicas.

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Los resultados de este trabajo de la bioimpresion de celulas NIH3T3 indicaron que el sistema de bajo costo propuesto es capaz deimprimir y curar con luz visible los hidrogeles con una resolucionde 50 mm y una viabilidad celular relativamente alta. La Figura3 muestra esquematicamente la estereolitografıa utilizando unproyector de haz [30, 34].

6.2. Andamios polimericos

Los andamios pueden estar compuestos de materiales polimericossinteticos o absorbibles, naturales, biologicos, degradables ono degradables [3]. Estos andamios deben exhibir ciertascaracterısticas biologicas, es decir, para apoyar la adhesion,proliferacion y diferenciacion de los queratinocito. Ademas, poseenpropiedades mecanicas y de degradacion apropiadas. Los andamiosdeben ser suficientemente fuertes y elasticos para un manejo facildurante la cirugıa y para soportar movimientos naturales de lostejidos. Ademas, dichos andamios deberıan degradarse solo despuesde una curacion adecuada, lo que podrıa llevar mas de 8 semanas[35]. En la tabla 2 se muestran algunos tipos de andamios, con susrespectivas ventajas, desventajas y futuros prospectos.

Para algunas aplicaciones clınicas, se requiere que los andamiosse reticulen rapidamente in situ, lo que permite un moldeadooptimo hacia el contorno de la herida. En la actualidad,los hidrogeles naturales utilizados para apoyar la regeneracionepidermica se basan principalmente en el colageno o la gelatina,que imitan la matriz extracelular dermica natural, pero a menudotienen propiedades mecanicas y de degradacion insuficiente eincontrolable como se observo anteriormente. Por esta razon sebuscan alternativas como gelatina que se puede reticular, es decir,la metacrilamida de gelatina (GelMA) con propiedades mecanicas,de degradacion y biologicas ajustables para disenar la epidermispara las aplicaciones de ingenierıa de tejidos de la piel. Resultadosrevelan que las propiedades mecanicas y de degradacion de loshidrogeles desarrollados pueden modificarse facilmente variando laconcentracion de hidrogel, con modulos elasticos y compresivosajustados de unos pocos kPa a unos pocos cientos de kPa, y los

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tiempos de degradacion varıan de unos pocos dıas a varios meses[35].

Tipos deandamios

Ventajas Desventajas Futuros prospectos

Porosos

Una alta porosidadproporciona un entornoadecuado para la matrizextracelular (MEC), ademasde proveer nutrientes a lascelulas. Muy utilizados enquemaduras agudas.

La naturaleza porosa limita ladistribucion homogenea de lascelulas. Se necesitan diferentestamanos de poros para los tiposde celulas especıficos y, por lotanto, requieren mucho tiempo.

Se busca mejorar laconectividad de los poros ypor ende, la estructurade los andamios.

Fibrosos

La estructura altamentemicroporosa es favorablepara la adhesion celular,la proliferacion fibrosay la diferenciacion.

Se requiere la funcionalizacionde la superficie para crear lasnanofibras de estos andamios.

Los farmacos, moleculasbiologicas, pueden serincorporados en andamiosfibrosos para aplicacionesde liberacion.

HidrogelLa tasa de biodegradacionaltamente biocompatibley controlada.

Poseen una resistenciamecanica limitada debido aestructuras blandas.

El comportamiento dedegradacion de los hidrogelesy la tenacidad debenestar bien definidos.

Microesfera

Tiene caracterısticas fısicascontroladas adecuadas para laadministracion lenta o rapidade medicamentos. Posee unalenta degradacion y por estarazon son exitosos al utilizarseen los trasplantes.

Los metodos de sinterizacionde microesferas a veces noson compatibles con las celulasy reducen la viabilidad celular.

Pueden ser utilizadoscomo transportadorde medicamentos comoantibioticos anticancerıgenos

Compuesto

Son altamente biodegradabley brindan resistenciamecanica. Mayor capacidadde absorcion.

Los subproductos acidos segeneran en la degradacion.Poca afinidad celular.Requieren esfuerzos tediosospara desarrollar andamioscompuestos.

En la actualidad, seestan desarrollandocompuestos de nano-bioceramica y polımeroscon una mayor degradacion.

Acelulares

Se conserva la ECM nativa y,por lo tanto, se mantienen lascaracterısticas anatomicasnormales. Menor respuestainflamatoria e inmune conmayor resistencia mecanica.

Se requiere una descelularizacionincompleta para evitarrespuestas inmunitarias.

Tales andamios sonprometedores para eldesarrollo de organosartificiales.

Tabla 2. Ventajas y desventajas de diferentes tipos de andamios. [3]

En un estudio, las nanopartıculas de plata cargadas con nanofibrasde colageno se fabricaron mediante electro spinning. El objetivofue crear un entorno optimo para la cicatrizacion de heridasutilizando las ventajas intrınsecas de la nanoplata, debido a suamplia actividad antimicrobiana y la nanofibra de colageno sirvecomo un componente estructural primario de la matriz extracelularpara guiar la adhesion celular, el crecimiento y la diferenciacionpodrıan tener un impacto positivo en el proceso de curacion. Unestudio in vivo revelo que la tasa de cicatrizacion de heridas delas esteras de nanofibras compuestas se acelero en comparacion con

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las nanofibras de colageno simple. El analisis histologico revelo unareepitelizacion acelerada, la produccion de colageno y una mejorcontraccion de la herida con nanofibras compuestas de AgNPs.Las nanofibras electrohiladas, que muestran una gran promesa parala fabricacion de materiales nanoestructurados, podrıan ayudar amejorar la calidad del cuidado de las heridas [36].

Electrospinning es la tecnica mas utilizada para la fabricacionde nanofibras continuas debido a su bajo costo y facilidad deimplementacion. La prueba de rasguno in vitro indica que latasa de cierre de la herida del andamio Curdlan/PVA es mejorque el andamio PVA, probablemente debido a las propiedadesinmunomoduladoras del biopolımero. Los resultados indican queel andamio Curdlan/PVA puede ser un material ideal para lasaplicaciones curativas de heridas [37].

Estudios de la regeneracion de tejidos de la piel, utilizanun andamio de hidrogel compuesto de quitina mezclado conpolibutilsuccinato y nanopartıculas de sulfato de condroitina[38]. La quitina es un aposito ideal que imita la matrizextracelular nativa ya que humedece la interfaz de la herida,es permeable al oxıgeno, actua como una barrera para losmicroorganismos, puede eliminar el exceso de secreciones yademas posee propiedades como la compatibilidad inmunologicay flexibilidad [39]. El polibutilsuccinato (PBS) es un polımerosintetico alifatico, biodegradable y biocompatible con excelentespropiedades mecanicas. La concentracion de este posee unainfluencia en la porosidad que es requisito previo para unmejor intercambio de gases y nutrientes. Ademas, la adicion denanopartıculas de sulfato de condroitina (CSnp) incremento laporosidad del andamio, como se observa en el compuesto ternario(Figura 6C). Una porosidad optima es un requisito previo paraun mejor intercambio de gases y nutrientes. Tambien aumentola rugosidad del andamio (Figura 6D, E). Esto aumentarıa laadsorcion de proteınas del andamio y, por lo tanto, aumentarıa launion celular. Este andamio se caracteriza por SEM (microscopioelectronico de barrido), FTIR (espectroscopia de infrarrojo portransformada de Fourier) y se analizo la relacion de hinchamiento

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de los andamios [38]. Los andamios se evaluaron en cuanto ala idoneidad para la aplicacion de ingenierıa tisular de la pielmediante estudios de citotoxicidad, union y proliferacion celularutilizando fibroblastos dermicos humanos (HDF). Los estudios decitotoxicidad y proliferacion celular que utilizan HDF confirman laidoneidad del andamio para la regeneracion de la piel [38].

Figura 6. Imagen SEM de a Quitina, b, d Quitina/PBS, y c, eQuitina/PBS/CSnps [38].

6.3. Apositos para heridas

De manera clasica, el tratamiento de la quemadura es realizadomediante el lavado diario de la herida, la extraccion del tejidomuerto y la colocacion de un aposito antibiotico hasta la formacionde tejido de granulacion y luego el injerto. Se han utilizadodiferentes metodos para el cuidado y el aposito del sitio donantedebido a la facilitacion en la mejora y reduccion de los sıntomas dela herida y, por lo tanto, implica la posibilidad de un sitio donantedesde el mismo lugar posteriormente [40]. La sutura es un metodoque requiere mucho tiempo, destreza profesional y tecnica y puedeinducir reacciones inflamatorias, infecciones secundarias, formacionde cicatrices y edema de heridas; el cierre y la estabilizacionadecuados de los margenes de la herida en su posicion deseadason eventos crıticos que influyen en el exito de cualquier resultadoquirurgico [41, 42]. El grapado requiere el uso de anestesicos, queson caros y pueden generar una aproximacion imprecisa de laherida. Por lo tanto, es fundamental desarrollar adhesivos para

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tejidos que permitan a los cirujanos reemplazar sus tediosas tecnicasconvencionales de sutura o grapado con tecnicas convenientes, nodependientes del operador y seguras [42, 43].

Hasta el momento, se han desarrollado varios tipos de apositospara heridas que incluyen caucho, espuma, nanofibras electrospun,membranas e hidrogel. Entre estos apositos, el aposito de hidrogelpuede mantener un entorno humedo de la herida, absorber losexudados del tejido, permitir que el oxıgeno penetre y enfrıe lasuperficie de la herida, lo que produce un alivio del dolor para lospacientes [44]. En general, los hidrogeles ideales para el apositopara heridas deben tener varias propiedades especiales. Primero,necesitan una fuerza adhesiva adecuada que sea compatible conel fragil tejido de la piel de los pacientes, lo que significa que losadhesivos deben liberarse facilmente de la superficie fragil [42].La mayorıa de los productos adhesivos tradicionales, como losapositos y vendajes adhesivos o medicos, generalmente tienen unafuerza de adhesion excesiva que es propensa a causar traumasy/o dolores localizados en el paciente, especialmente en pacientescon piel fragil, personas de edad avanzada y ninos [42, 45].En segundo lugar, deben ser lo suficientemente resistentes comopara coincidir con el comportamiento mecanico de los tejidosde la piel. En tercer lugar, deben eliminarse facilmente conun trauma local mınimo en la piel del paciente. En cuartolugar, deberıan tener capacidad de re-adherencia para aquellospacientes que requieren un aposito adhesivo para aplicarse enla misma parte del cuerpo repetidamente durante un perıodoprolongado. Finalmente, deben ser biocompatibles, no toxicosy no irritantes para la piel humana [42]. Los hidrogeles sonredes macromoleculares muy hidrofilas, que se producen porreticulacion quımica o fısica de polımeros solubles, estos puedenabsorber y desorber el agua en una direccion reversible, mostrandoestımulos ambientales especıficos como temperatura, pH y fuerzaionica. Por lo tanto, dicha respuesta fisiologica inteligente de loshidrogeles hacia cambios de variables fisiologicos sugiere su usoen varias aplicaciones biomedicas [46]. Se desea encontrar unhidrogel de autocuracion inyectable para heridas con propiedades

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antiinfecciosas, anti-oxidativas y conductivas que promueva lacuracion de heridas en la aplicacion de curacion de heridas, pero sudiseno sigue siendo un desafıo. Especialmente, el aposito de hidrogelinyectable antibacterial antioxidante electroactivo presentado porZhao et al. presenta propiedades singulares, como los farmacos deencapsulacion in situ, rellenando los sitios de la herida (incluso enun espacio irregular), adhiriendose a las heridas. Aunque el apositode hidrogel inyectable llenara el sitio de la herida y se adherira aesta para proteger el sitio del ambiente externo, la mayorıa de loshidrogeles inyectables sin elasticidad robusta pueden experimentarcierta deformacion o dano causado por la fuerza mecanica externadespues de la aplicacion en el sitio de la herida [44].

Zhao desarrolla una serie de hidrogeles conductores inyectablespara autocuracion basados en quitosano cuaternizado-g-polianilina(QCSP) y polietilenglicol-co-poli(glicerolsebacato) quefunciona como grupo benzaldehıdo como aposito electroactivoantibacteriano, antioxidante para la cicatrizacion de heridascutaneas. Estos hidrogeles presentaron buena autocuracion,electro-actividad, capacidad de eliminacion de radicales libres,actividad antibacteriana, adhesividad, conductividad, ındice dehinchamiento y biocompatibilidad. Curiosamente, el hidrogelcon una concentracion de reticulante optima de 1.5 % m/m dePEGS-FA mostro una excelente capacidad de coagulacion de lasangre in vivo, y obtuvo resultados significativamente mejores enel proceso de cicatrizacion de la herida in vivo, en un modelo dedefecto cutaneo de espesor completo, que el hidrogel de quitosancuaternizado/PEGS-FA y que el aposito comercial (pelıculaTegaderm TM), al regular la expresion genica de los factores decrecimiento, incluidos VEGF, EGF y TGF-b, y al promover elgrosor del tejido de granulacion y la deposicion de colageno.Resumiendo, el aposito de hidrogel inyectable electroactivoantibacteriano prolongo la vida util del aposito basandose enla capacidad de autocuracion y promovio significativamente elproceso de curacion de heridas in vivo atribuido a sus propiedadesmultifuncionales, lo que significa que son excelentes candidatospara la cicatrizacion de heridas de piel de todo espesor [44].

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6.4. Tecnicas basadas en el uso de celulas madre

La eleccion del tipo de celula madre correcto, el cual ayude a laregeneracion completa de la piel, es extremadamente importante.Ademas, su identificacion y el aislamiento de poblaciones purasde celulas madre adultas, la optimizacion de los protocolos parala siembra de celulas en matrices y el diseno de la estructurade andamios son factores que deben investigarse mas para laoptimizacion de la reparacion y regeneracion de tejidos [47].

Las propiedades de las celulas madre, al ser sensibles al microentorno, pueden verse influidas por muchos factores fısicos yquımicos, lo cual provoca una baja viabilidad, una proliferacionlimitada y una diferenciacion indeseable en muchos casos [48]. Unaestrategia serıa utilizar un enfoque combinado de celulas madrecon matrices inteligentes que contienen nanopartıculas que puedanimitar el nicho de celulas madre; dirigir, instruir y permitir lasupervivencia de las celulas madre [49].

Las celulas madre mesenquimales (MSC) se pueden obtener devarios tejidos, incluida la medula osea, el tejido adiposo y el cordonumbilical. Se pueden auto renovar, se diferencian de multipleslinajes, y su capacidad para mejorar la cicatrizacion de heridascutaneas ha sido bien caracterizada. Las MSC hacen que el cierre dela herida sea rapido, ademas, aumentan la angiogenesis, promuevenla resolucion de la inflamacion de la herida, regulan la remodelacionde la matriz extracelular y fomentan la regeneracion de la piel [50].Tambien, poseen varias ventajas respecto a las aplicaciones clınicascon el fin de reparar o regenerar tejidos danados, especialmenteporque evitan los problemas eticos que involucra el uso de celulasmadre embrionarias [51].

Ademas, las celulas madre mesenquimales derivadas de celulasmadre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC-MSC) son unaalternativa prometedora para la terapia de trasplante de celulasmadre. Los exosomas derivados de celulas madre mesenquimales(MSC-Exos) pueden realizar funciones importantes en la reparacionde tejidos lesionados. Sin embargo, hasta el momento, ninguninforme ha demostrado el uso de hiPSC-MSC-Exos en lacicatrizacion de heridas cutaneas, y se tiene poco conocimiento

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acerca de sus mecanismos subyacentes en la reparacion detejidos. De acuerdo con el presente artıculo, el trasplantede hiPSC-MSC-Exos a sitios de la herida dio lugar a unareepitelizacion acelerada, redujo el ancho de las cicatrices ypromovio la madurez del colageno. Ademas, no solo promoviola generacion de nuevos vasos, sino que tambien acelero sumaduracion en los sitios de la herida. Hallazgos mencionan queel hiPSC-MSC-Exos puede facilitar la cicatrizacion de heridasmediante la promocion de la sıntesis de colageno y la angiogenesis.Dichos datos brindan la primera evidencia del potencial dehiPSC-MSC-Exos en el tratamiento de heridas cutaneas [52].

Por otro lado, en un estudio de las MSC de ratas, se encontroque las luciferasa-Tg Lewis se trasplantaron por vıa intravenosaen un modelo de expansion de tejido de rata para identificar lalocalizacion y la transduccion. Se utilizo un enfoque sistematicopara identificar los genes expresados diferencialmente entre las MSChumanas y los controles estirados mecanicamente. La importanciabiologica de estos cambios fue analizada por medio de metodosbioinformaticos. Se cree que el estiramiento mecanico puedepromover la regeneracion de la piel ya que regula la expresion deMSC de los genes relacionados con la hipoxia, la vascularizacion, laproliferacion celular y una mejora de la MSC trasplantada a la pielexpandida [53].

Segun estudios realizados, la fibroına de seda (SF) sembradacon MSC ha demostrado tener mayores resultados en losmodelos experimentales de cicatrizacion de heridas en lapiel. Rivero, investigo los efectos de la cicatrizacion deheridas de andamios SF electrohilados celularizados con MSCde jalea de Wharton (Wj-MSCs-SF) por medio de unmodelo de ferula de herida por escision de escision murino.Ademas, realizaron un examen inmunohistopatologico despuesdel trasplante en el cual se confirmo la presencia de celulasCD90 positivas similares a fibroblastos humanos infiltradosen la dermis del grupo tratado con Wj-MSCs-SF, queprodujo neoangiogenesis, disminucion del infiltrado inflamatorio yproliferacion de miofibroblastos, menos produccion de matriz de

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colageno y completa regeneracion epidermica. Estos resultados,muestran que las Wj-MSC trasplantadas en la herida por mediode un andamio de fibroına de seda promueve la formacion de untejido bien organizado y vascularizado, se mejora la reepitelizacionde la herida y reducen la formacion de tejido cicatricial fibrotico,destacando efectos terapeuticos potenciales de los enfoques deingenierıa de tejidos basados en Wj-MSC para el tratamiento deheridas no curativas. Datos proporcionan pruebas de que unacombinacion entre el tratamiento de Wj-MSC inyectado en laherida, en conjunto con los andamiajes de SF celularizados quecubrıan la parte de la herida presento una mayor curacion de esta,en comparacion con los tratamientos individuales y el andamio deSF celularizado [54].

En un estudio, se investigo de metodos alternativos al hidrogelde alcohol polivinılico (PVA) proponiendo el complemento conla terapia con celulas madre. Lo anterior se debe a una falta debioactividad para el PVA y la seguridad de la terapia del vastagoque limito su aplicacion. En la bibliografıa consultada (Figura 7),se encontro un metodo en el cual se preparo un aposito hechode PVA (ADSCs / PVA) de celulas madre derivadas de tejidoadiposo (ADSC) para la cicatrizacion de heridas. Un lado delaposito de PVA se modifico con gelatina foto-reactiva (Az-Gel)mediante irradiacion ultravioleta (UV) (Az-Gel / PVA) y, por lotanto, las ADSC podrıan adherirse, proliferar en los apositos dePVA y mantener el otro lado del aposito sin adherir a la herida. Laestructura y la mecanica de Az-Gel / PVA se caracterizo mediantemicroscopıa electronica de barrido (SEM) e instrumentos de pruebade materiales. Posteriormente, la adhesion y la proliferacion deADSC se pudieron apreciar mediante los recuentos celulares y latincion en vivo. Finalmente, se utilizaron experimentos in vitro ein vivo para confirmar el efecto del aposito ADSC / PVA para lacicatrizacion de heridas. Los resultados mostraron que Az-Gel seinmovilizo en el PVA y tuvo un poco efecto sobre las propiedadesmecanicas de los hidrogeles de PVA.

Este, modificado en superficie podrıa favorecer tanto la adhesioncomo la proliferacion de ADSC. Las pruebas de liberacion de

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Figura 7. Fotografıas de la cicatrizacion de heridas en ratas despues dediferentes periodos de tiempo [47].

proteınas indicaron que los factores bioactivos secretados por lasADSC podrıan penetrar en la herida. Finalmente, los experimentosin vitro e in vivo sugirieron que las ADSC / PVA podrıan promoverla cicatrizacion de heridas a traves de factores bioactivos secretoresde las ADSC. El aposito ADSC / PVA no solo promueve lacicatrizacion de la herida, sino que tambien proporcionarıa unanueva forma para una segura aplicacion de celulas madre, quetendrıa un gran potencial para la ingenierıa de tejidos de la piel[47].

Conclusiones

Las celulas madre son responsables directas de la autogeneracion,dependiendo del tipo de lesion.

El cuerpo humano no es capaz, por sı solo, de reparar heridas oquemaduras graves y/o de gran tamano.

La ingenierıa de tejidos esta limitada por la complejidad natural delorgano cutaneo y la diversidad de variantes existentes entre cadaindividuo.

Las celulas madre manipuladas por el ser humano dependen dealgun tipo de soporte.

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Los polımeros son un componente base en la ingenierıa de tejidospor sus caracterısticas estructurales y bioquımicas.

Todas las tecnicas analizadas en este artıculo buscan mejorarel proceso de curacion natural de la piel mediante el uso depolımeros biocompatibles complejos trabajando en conjunto concelulas encargadas del proceso de reparacion natural de este organo.

Debido a la capacidad de configuracion y personalizacion delas caracterısticas de los andamios generados por bioimpresion,ademas de sus notorias ventajas estructurales y fisicoquımicas, estatecnologıa es superior a las demas presentadas, por lo tanto, puedeser el futuro de la ingenierıa de tejidos.

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