MOLEKULARNA MOLEKULARNA BIOLOGIJABIOLOGIJA

Doc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićIInstitut za biologiju i ekologijunstitut za biologiju i ekologijuPPrirodnorirodno--matematički fakultetmatematički fakultet

UUniverzitet u Kragujevcuniverzitet u Kragujevcu

MOLEKULARNA BIOLOGIJAMOLEKULARNA BIOLOGIJACILJ: objašnjenje molekularnih osnova vitalnih procesa; šta je suština života?Početak razvoja MB je 30-tih godina XX veka (M. Delbrik)1953.-1963. godine – “dogmatski period”

Dž. Votson, F. Krik, Ž. MonoPrincip redukcionizma, in vitro eksperimentiDanas – pročitan humani genom; genetičko inženjerstvo; Danas – pročitan humani genom; genetičko inženjerstvo; objasniti molekularne osnove diferencijacije, morfogeneze, transmisije signala, psihičkih i mentalnih funkcijaZa MB bitni: DNK, RNK i proteini

strukturalisti, informacionalistiMB prou čava promet informacija u živim sistemimaBiohemija proučava promet materije i energijeNukleinske kiseline je izolovao F. Mišer 1872G. Mendel – nasledni faktori i principi nasleđivanja

1928 Griffith je objavio podatak o transformaciji bakterija

1944 Avery, MacLeod, i McCarty - DNK genetički material

1952 A. Hershey i M. Chase - dokaz da je DNK genetički material

1953 Watson i Crick su determinisali strukturu DNK

1966 Dešifrovan je genetički kod

1970 Izolovan prvi restrikcioni enzim

1973 Boyer i Cohen su otkrili rekombinantnu DNK tehnologiju

1978 Genetički dobijen humani insulin u E.coli

1980 Patentiran genetički manipulisan organizam

1982 Prve animalne vakcine produkovane rekombinovanom DNK tehnologijom

1988 Opisana (PCR) metoda

1996 Prvi rekombinovani protein eritropoetin pripremljen za proizvodnju

2000 Sekvenciran humani genom

� Grifitov eksperiment � Grifitov eksperiment 1928. godine

Streptococcus pneumonieVirulentni (S) i mutirani

(R) soj.� O. Ejveri 1944. g.Ekstrakti soja S – DNK

virulentni materijal

� Eksperimenti Herši i Čejza, 1952.g.; Bakteriofag T2 i E. coli(nasledni materijal virusa je nukleinska kiselina – DNK)

� Ostali dokazi da je DNK nosilac naslednog materijala (informacija):

� DNK je metabolički stabilna u ćelijama� J. Brachet i T. Caspersson su pokazali da je DNK u

nukleusima svih živih ćelija jedne biološke vrste stalna (stalnost količine)

� A. Mirski i H. Ris su stalnost DNK potvrdili citološkim analizama hromozoma

� J. Watson i F. Crick (1953.) su objavili model sekundarne strukture DNK; DNK ima sposobnost samoodržavanja i podložnost promenama

� Centralna dogma molekularne biologije (Crick, 1956.) –protok genetičke informacije kroz generacije i kroz ćeliju; DNK → RNK → protein

�� DOGMA MB DOGMA MB �� GENETIČKI KODGENETIČKI KOD�� 3 nukleotida (kodon) = 1 aminokis.3 nukleotida (kodon) = 1 aminokis.�� Start kodon AUG (GUG)Start kodon AUG (GUG)�� Stop kodoni UAA, UAG, UGAStop kodoni UAA, UAG, UGA�� Izrođenost, univerzalnostIzrođenost, univerzalnost

STRUKTURA NUKLEINSKIH KISELINAPolinukleotidni lanci

Nukeotid – azotna baza (purini i pirimidini), šećer pentoza (riboza i dezoksiriboza), fosforna kiselina

Nukleozid - azotna baza i šećer vezani N-glikozidnom vezom(adenozin, dezoksiadenozin, guanozin, dezokiguanozin, citidin,

dezoksicitin, uridin i dezoksitimidin)

Nukleotidi su estri nukleozida i fosforne kiseline Nukleozid monofosfati (AMP), -difosfati (ADP), -trifosfati (ATP)

- Formiranje polinukleotidnih lanaca (samo nukleozid monofosfati) nukleinskih kiselina – fosfodiestarska veza između OH grupe na C3 atomu pentoze jednog nukleotida i PO4 grupe na C5 atomu pentoze drugog nukleotida- 5’ kraj polinukleotidnog lanca sa slobodnom PO4 grupom

PRIMARNA STRUKTURA DNK – redosled nukleotida u DNK

slobodnom PO4 grupom- 3’ kraj polinukleotidnog lanca sa slobodnom OH grupom- Okosnica polinukleotidnih lanaca su pentoze i fosforne grupe- DNK omogućava raznovrsnostbioloških vrsta (4 vrste nukleotida u DNK molekulu daju ogroman broj kombinacija u redosledu – 4n)

- DNK lanac od više nukleotida (polinukleotidni lanac)- DNK molekul od dva polinukleotidna lanca- Bazno sparivanje vodoničnim vezama (dvogube u paru A-T, trogube u paru G-C)- Lanci antiparalelni- Čargafova pravila:A/T=1; G/C=1; A+G/T+C=1; G+C/A+T≠1

SEKUNDARNA STRUKTURA DNK

� Votson i Krik, 1953.g., Nature, Nobelova nagrada � DESNOGIRA DVOLAN ČANA ZAVOJNICA� Komplementarnost (purin i pirimidin; A -T, G-C) i

antiparalelnost dva lanca (u odnosu na 5’-3’ orijentaciju)

� Veliki i mali žljeb; r=2 nm; hod zavojnice = 3.4 nm od 10 nukleotida

A B ZA B Z

� A zavojnice – desnogire, 11 b.p. u jednom navoju; dvolančani RNK molekuli, hibridi RNK -DNK

� B zavojnice – desnogire� Z zavojnice – levogire, 12 b.p. u jednom navoju, bogate GC

nukleotidima

DENATURACIJA DNK

� Denaturacija – narušavanje sekundarne strukture DNK.

� In vitro denaturacija se postiže visokim T i promenom pH rastvora.

� Absorpcija svetlosti talasne dužine od 260 nm. – Dvolančana zavojnica pokazuje hipohromni

efekat a denaturacijom dolazi do hiperhromnog efekta

– posledica interakcija između azotnih baza, pa se prilikom absorbovanja kvanta svetlosti i pomeranja elektrona jedne baze, modifikuje i elektri čno polje oko susedne.

� Krive topljenja – krive koje pokazuju promenu absorbancije u zavisnosti od temperature.

� Tačka topljenja (Tt) – temperatura na kojoj je porast A260jednak polovini maksimalnog porasta absorbance.

�� Tt zavisi od Tt zavisi od –– Unutrašnjih svojstava DNK (bazni sastav, raspored nukleotida u Unutrašnjih svojstava DNK (bazni sastav, raspored nukleotida u

lancu, procenat pravilno sparenih baza i dužina lanca)lancu, procenat pravilno sparenih baza i dužina lanca)–– Karakteristika rastvora (jonska ja čina, pH, polarnost rastvarača, Karakteristika rastvora (jonska ja čina, pH, polarnost rastvarača,

temperatura)temperatura)

�� Molekul DNK koji ima više GC parova teže se topi od Molekul DNK koji ima više GC parova teže se topi od molekula koji ima više AT parova. molekula koji ima više AT parova.

�� Postupak denaturacije DNKPostupak denaturacije DNK(DNK iz timusa govečeta):(DNK iz timusa govečeta):–– Ekstrahovanoj DNK (koja je rastvorena u SSCu) se dodaje oko Ekstrahovanoj DNK (koja je rastvorena u SSCu) se dodaje oko

2 ml pufera (10 mM Tris2 ml pufera (10 mM Tris--HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) i ostavi HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) i ostavi preko noći na +4 preko noći na +4 00C.C.

–– Ukoliko je potrebno rastvorenu DNK razblažiti SSCom.Ukoliko je potrebno rastvorenu DNK razblažiti SSCom.–– Podeliti rastvorenu DNK u 7 epruveta (po 1 ml). Podeliti rastvorenu DNK u 7 epruveta (po 1 ml). –– Prva epruveta ide na led, a ostale šesPrva epruveta ide na led, a ostale šestt u vodeno kupatilo gde se u vodeno kupatilo gde se

temperatura polako povećava od 40 temperatura polako povećava od 40 00C do 90 C do 90 00C. C. Epr. 2 izvaditi kada T dostigne 40 Epr. 2 izvaditi kada T dostigne 40 00C, C, Epr. 3 na 50 Epr. 3 na 50 00C C Epr. Epr. 44 na 60 na 60 00C C Epr. Epr. 55 na 70 na 70 00C C Epr. 6 na 80 Epr. 6 na 80 00C C Epr. 7 na 90 Epr. 7 na 90 00C. C. –– Epruvete odmah stavljati na led i meriti absorbancu na 260 nm Epruvete odmah stavljati na led i meriti absorbancu na 260 nm

(uklju čujući i kontrolu).(uklju čujući i kontrolu).–– Nacrtati krivu topljenja Nacrtati krivu topljenja ii obeleobeležiti tačku topljenja.žiti tačku topljenja.

�� RenaturacijaRenaturacija –– hibridizacijahibridizacija nukleinskihnukleinskih kiselinakiselina�� PriPri kontaktukontaktu polinukleotidnih lanaca, koji imaju komplem entarne polinukleotidnih lanaca, koji imaju komplementarne

redoslede nuklotida, formiraju se dvolančani hibridni molekuliredoslede nuklotida, formiraju se dvolančani hibridni molekuli�� HHibridi DNKibridi DNK --DNK, DNKDNK, DNK --RNK, RNKRNK, RNK --RNKRNK�� KKoli čina hibrida je mera komplementarnosti lanaca nukleinskih oličina hibrida je mera komplementarnosti lanaca nukleinskih

kiselinakiselina�� MMetode razdvajanja makromolekula (nukleinskih kiselina) u etode razdvajanja makromolekula (nukleinskih kiselina) u

gradijentima gustine elektrolita (CsCl)gradijentima gustine elektrolita (CsCl)�� TTehnike hibridizacije ehnike hibridizacije na membrani na membrani �� HHibridizacija ibridizacija in situin situ