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Molekulargenetik - Gentechnik
Organisation von Genen in einem Chromosom und Beispiel für den Aufbau eines Gens bei Wirbeltieren
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Wenige Gene, viele Schalter
Die Anzahl der Gene sagt über die Komplexität eines Tieres wenig aus. Kleine Steuermoleküle namens miRNA, die die Aktivität von Genen an- und abschalten können, scheinen darüber viel bessere Auskunft zu geben.
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Genomische Zuchtwertschätzung
Schema der PCR
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Ergebnis der Gelelektrophorese
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) auf DNA-Ebene
Erfassung genetischer Variabilität auf der DNA-Ebene
= genomischer Zuchtwert
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Ein SNP auf DNA-Ebene
S..ingle
N..ucleotide
P..olymorphisms
(Einzelnukleotid-Polymorphismen)
Veränderungen einzelner Basenpaare in in codierten Regionen eines DNA-Strangs begründen genetische Variationen für Leistungs- u. Fitnessmerkmale.
Bsp: Basenfolge AAGCCTA AAGCTTA
Wenn diese Punktmutation eine Keimzelle (Eizelle, Spermium) eines Tieres betrifft, können Nachkommen dieser Tiere diese Mutation erben und der SNP kann sich nach mehreren Generationen in der Popula-tion etablieren.
Jedes Genom besitzt Vielzahl von SNPs.
Beispiele:
Mensch: (= 1 SNP je 1000 Basenpaare (bp) ..>4 Mio SNP bekannt)
Rind: Bei ca. 3 Miard. Basenpaare des Ringergenoms wurden ca. 2,5 Mio. variable ( = polymorphe) Stellen gefunden.
SNPs sind Stellen in der Erbsubstanz, in der die zugehörige Basenfolge in mehr als einer Variante vorkommt.
Interessante Merkmale: Nutzungsdauer, Lebensleistung
SNPs
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Nachweis der Hybridisierung durch Abfangen eines Fluoreszenzsignals.Die Ologonukleotidsonde trägt an ihren Enden zwei Marker. -Einer ist ein Fluoreszenfarbstoff- der andere ist eine „ abfangende
Verbindung“
Hybridisiert die Sonde nun mit der Ziel-DNA (des zu untersuchenden Tieres bzw. Patienten), dann werden die beiden Enden des Oligonukleotides getrennt und der Fluoreszenzfarbstoff emittiert das Signal („molekulares Leuchtfeuer“)
Prinzip der Arbeitsweise mit den DNA-Chips:Links: Ausschnittsvergrößerung des Chips. Die auftragenden Sonden tragen an den Enden die zugehörige Base. Der DNA-Strang des zu untersuchenden Tieres ist rot dargestellt. Falls es sich an die Sonde anlagert (= gelbes Signal); falls nicht: kein Signal (= dunkel, blau).Rechts oben: Die gelben Stellen markie-ren die Anlagerungen (Hybridisierung). Das zu untersu-chende Tier trägt die Base A und G; rechts unten: Nachweis aller DNA-Bereiche, an denen eine Hybridisie-rung stattfand, mittels sogenannter Fluoreszenzmarkierung; automatisch erfassbar über Laser-Scanning-Mikroskopie
Nachweis der Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten DNA (eines Testtieres/ Patienten) mit einer zugehörigen Sonde auf einem DNA-Chip
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Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie
Millionen von DNA-Molekülen(oligos) in einer Zelle, >200.000 Zellen, >20.000 Gene
markierte RNA Fragmente binden spezifisch an DNA Moleküle
Messbares Signal
Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie
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Hybridisierter Mikroarray
Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie
Erfassung genetischer Variabilität auf DNA-Ebene=
genomischer Zuchtwert
Verwendung von DNA-Chips (z.B. 50.000 Marker / Chip) kann 50.000 SNPs erkennen.
Anhand geeigneter Daten aus der Leistungsprüfung von Milchkühen können nun mithilfe von Assoziationsstudien die Effekte einzelner SNPs innerhalb der Population geschätzt werden.
Der genomische ZW = die Summe der geschätzten Effekte aller erfassten SNPs bezüglich eines Merkmals.
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Ableitung der SNP-Effekte
• Voruntersuchungen: Schätzung der Effekte der 50.000 SNPs auf ein Merkmal (Milchleistung) entspricht dem Vergleich der Tiere untereinander (Gruppe A zu Gruppe B).
• Vergleichgruppe (Bsp.: Referenzgruppe = Gruppe A) mit sicheren Zuchtwerten (> 90% Sicherh.) ca. 3000 Bullen
• Typisierung der Referenzbullen zwecks Ableitung von Beziehungen zwischen genet. Buchstaben (SNPs) und Merkmalen……= Effekt der SNPs auf das Merkmal!
Schritte in der Genomanalyse
1. Genkartierung Erstellung eines Orientierungsrasters zur Lokalisation von Genen auf den Chromosomen mithilfe von genetischen Markern
2. Kopplungsanalyse Herstellung von Beziehungen zwischen Merkmalen und DNA-Markern
3. Einzelgencharakterisierung Aufklärung der Genstruktur bis zur DNA-Sequenz für ein definiertes Merkmal
4. Gendiagnose Erkennung von Genvarianten, die Erbmerkmale beeinflussen
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dGW ZW
• Vollgeschwister haben identisches Pedigree• ZW von Vollgeschwister basiert auf den Ergebnissen der
Eigen- und Nachkommenleistung• Beim dGW fließen die Buchstaben des Tieres ein!• Identische dGWs sind nur bei eineiigen Zwillingen (Klone)
möglich!•• Vollgeschwister haben unterschiedliche SNP-Situationen
deshalb auch unterschiedliche dGWs.• dGWs erreichen Sicherheit von 40 – 60% (abh. von h2)• Vergleich der Sicherheiten des dGW und des ZW
Kuh-ZW hat niedrige Sicherheit, Bullen ZW hat hohe Sicherheit!
dGW ZW
• Basis für dGW ist Blutprobe• Sicherheit für Kalb ist höher als ZW (Pedigree)
Züchter kann mit dGW beste Jungtiere genauer auswählen.
• Eigen- und Nachkommenleistung gehen nicht in dGW ein!
• Bei Vorliegen von Nachkommenleistung ist ZW genauer als dGW! Kombination von dGW + ZW
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Genomische Selektion
Konventionelle Zuchtwertschätzung
ZW
Genomische Zuchtwertschätzung
dGW
gZW
genomisch unterstützter Zuchtwert
Kombination des rein genomischen Zuchtwertes (dGW) mit dem Zuchtwert der bisherigen Zuchtwertschätzung (ZW) zu einem genomisch unterstützten Zuchtwert (gZW)
Kombination dGW & ZW gZW
• Unterschiedliche Sicherheiten der Ausgangszuchtwerte (ZW bzw. dGW) beeinflussen Sicherheit des gZW!
Steigende Anzahl Töchter
Einfluss des dGW
Einfluss des ZW
Ab Sicherheit von 90% des ZW wird gZW fast ausschließlich von ZW bestimmt!
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Verlauf der Sicherheit des genomisch unterstützten Zuchtwertes (gZW) der Merkmale Milchmenge bzw. Nutzungsdauer eines Besamungsbullen bzw. einer Kuh.
Die Sicherheit des rein genomischen Zuchtwertes (gZW) wurde aus Gründen der Vereinfachung im zeitlichen Verlauf konstant gehalten.
Genetische KopplungsanalyseAufzeigen des Abstandes zwischen zwei Genorten
Grundlage der Kopplungsanalyse ist der Genaustausch (Crossing over) und damit der Rekombinationsfrequenz.
Kopplungsanalysen beruhen auf Testkreuzungen von Doppel-, dreifach-der Mehrfachheterozygoten.
Häufigkeit beobachteter „Crossing over“ zw. zwei untersuchtehn „Loci“
=
Maß für die Entfernung zwischen den „Loci“
Je enger die Kopplung, desto geringer der Anteil an Neukombinationen Genorte liegen enger zusammen
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Kopplungsstärke Austauschwert (AW)
Zahl der Neukombinationen
Gesamtanzahl der Kombinationen
Maßstab in Genkarten, die auf Kopplungsanalyse beruhen ist
„Centi Morgan“ (cM)
1 cM
=Chance von 1 %, dass in der natürlichen Rekombination während eines Gene-rationswechsels ein bestimmter Genort von einem anderen getrennt wird.
=
Abstand wischen zwei Loci mit einem Austauschwert von 1%
= map unit (Karteneinheit)
1 cM entspricht 1 Million Basenpaare
pr vg
11,0 cM
Genort für Augenfarbe
Genort für Flügelform
Austauschwert nach Kopplung von Doppelheterozygoter (Drosophila)
Bm ep ru
6,3 2,7
10,5
Austauschwert nach Kreuzung von Dreifachheterozygoten
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Kopplung (Linkage)
Zustand in dem von zwei Allelpaaren auf autosomalen Genorten jeweils zwei Allele, die an verschiedenen Loci sitzen, in den Gameten mit größerer Häufigkeit als erwartet gemeinsam vorkommen.
Zwischen den Allelpaaren Aa und Bb besteht Kopplung, wenn A und B bzw. a und b oder A und b bzw. a und B gehäuft in den Gameten auftreten.
Maßstab der Kopplung:
Die Stärke der Kopplung wird quantitativ mit der Rekombinationsrate (r) bestimmt.
0 < r < 0,5
Wert 0: sehr enge Kopplung
Wert 0,5: sehr lockere Kopplung
Doppeltausch
Doppel – crossover
Mehrfachtausch
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Gesetzmäßigkeit der Kopplungsvorgänge
Freie Kombination Kopplung
P: AABB x aabb (AB) (AB) x (ab) (ab)
F1 AaBb (AB) (ab)
Gameten: AB, Ab
aB, ab
(AB), (ab)
F2 A- B- aaB- aabb
9 3 3 1
(AB)(AB) (AB)(ab) (ab)(ab)
1 2 1
Gruppierung der Gene in der Nomenkladur für humane Gene:
• Enzyme und Proteine
• Vererbte klinische Störungen
• Blutgruppen
• Zelloberflächenantigene
• DNA-Segmente
• Virus-assoziierte Marker
• Marker mit noch unbekannter Funktion
• fragile Genbereiche
• mitochrondriale Gene
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Chromosom 1 Chromosom 2
Marker
unbekanntes Gen für Hornlosigkeit
Das Erbgut des Rindes ist auf 29 verschiedenen Chromosomen und den Geschlechtschromosomen X und Y angeordnet. Dort befinden sich 50.000 verschiedene Gene. Davon kennt man jedoch nur für etwa 200 Gene die Lage auf dem Chromosom.
Dagegen sind derzeit weit mehr als 1.000 Marker auf der genetischen Karte be-kannt, die über alle Chromosomen ver-teilt sind. Diese können verwendet wer-den, um unbekannte Gene bestimmten Chromosomenregionen zuzuordnen.
Auf dem Chromosom 1, in der Nähe der Marker B, C, D und E befindet sich z.B. das Gen für die Hornlosigkeit.
A B C D E
Das Schweinegenome
• Jedes Schwein hat:– 38 Chromosome
– 23,000 bis 30,000 Gene
• Gene mapping– Kandidategene
• Speziell bekannte Gene mit großen Effekten
– QTL (Quantity trait loci)• Gebite auf dem Chromosom, die mit einer
Leistung assiziieren.
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Kandidatengene beim Schwein
IGF2 (Ch 2) Muskelgewebe, FettFUT1 (Ch 6) KrankheitsresitenzH-FABP (Ch 6) Wachstum, FettRYR1 (Ch 6) Stress, PSEPRKAG3 (Ch 15) RN/Hampshire Gen,
Rendement Napole Gen(Wasserbindungsvermögen, pH-Wert im Muskel)...Hampshire-Faktor
Genetische Marker
…..sind polymorphe DNA-Sequenzen. Sie stellen Referenzpunkte im Genom dar und deren Lokalisation ist auf dem Chromosom bekannt.
Molekulare Marker sind hoch polymorph und leicht zu charakterisieren. Sie dienen der Schätzung von
-Diversitäten
-Differenzierungen von Rassen
-genetischen Distanzen zwischen Rassen
-Identitäts- und Abstammungskontrollen
-Identifizierungen von Genorten für Merkmale
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Beispiel für Lokalisation eines Gens bei verschiedenen Spezies
Spezies Lokalisation
Rind Chromosom 4
Schwein Chromosom 18
Mensch Chromosom 7, Region q 31.3
ob-Gen
Ort für die Bildung des Hormons Leptin in den Zellen des Fettgewebes (Adipozyten). Beim Fehlen dieses Gens wird kein Leptin gebildet, es tritt
Fettleibigkeit (ob -Obesitas) auf.
Metabolische Vermittlerfunktion zwischen Fettgewebe und Gehirn (Beeinflussung des Stoffwechsels (Kohlehydrate) und der Produktion von
Fortpflanzungs- und Wachstumshormonen)
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Erbdefektez. B. CD18, ASS, UMPS, GAA, TG, EPB3,
FECH, MANA, MANB, PYGM, PRNP,CHS, PRG
Wachstumz. B. MH
Milchleistung/Milcheigenschaften
z. B. CASK, PRL, LGB
Rotfaktorz. B. MC1R
Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische Merkmale beim Rind für die gendiagnostische Tests verfügbar sind
Erbdefektez. B. RYR1, LDLR,
ARVWF, GULO
Wachstumz.B. MC4R
Fleischqualität/Stressanfälligkeitz. B. RYR1, HFABP, FABP4, RN
Gesundheitz. B. FUT1
Hautfarbez. B. KIT, MC1R
Futteraufnahmez.B. MC4R
Fruchtbarkeitz. B. RARG, FSHB, RBP4,
ESR, PRLP
Schlachtkörper-zusammensetzung
z.B. MC4R, IGF2
Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische Leistungen beim Schwein für die gendiagnostische Tests verfügbar sind
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1. Polymorphismus2. Assoziation3.Funktionelle
Analyse
direkte Kandidatengene: biologische Funktion eines Genprodukts
QTL-Analysen: Beobachtung der Ko-Segregation von Markern und Merkmal in spez.Familien
funktionelle Kandidaten:Genaktivität in bestimmten Geweben, Phänotypen, Entwicklungsstadien oder Umwelten
positionelleKandidaten
positionelleKandidaten
Genotypi-sierung
RNA Proteine Intermed-därer Phänotyp
Tier
Black BoxGenotypi-
sierung SNPPhänotypi-
sierungLP
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Genom Genotyp
GenvariatenTranskriptom Proteom Struktur
Metabolom
DNA RNA Proteine Intermediäre Phänotypen
Tier
Hochauflösende Phänotypisierung, molekulare Phänotypen, ‚omics‘-techniken
Genotyp – Phänotyp - Abbildung
Bedeutung der Leistungsprüfung
(Phänotypisierung) mit Hilfe causalerMerkmale
d.h. weitgehender Ausschluss vom Umweltfaktoren
Fruchtbarkeit (geb. Ferkel/S. & J)………………Ovulationsrate
305-Tage-Milchleistung……………………Sekretionsleistung der Milchdrüse
Langlebigkeit/Nutzungsdauer……………….Resistenz, etc. etc.
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Genotyp Phänotyp
QTL-AnalysenGenomweite Assoziationsanalysen (GWA)
Genomische Selektion
DNA RNA Protein intermediärePhänotypen
Tier
Genotypisierung
Leistungs-prüfung
& Metabolomics, Histologie, Labormed…
Marker60k SNP-Chip
Phänotypisierung
Produktionsmerkmale:Mast- und Schlachtleistung
Funktionale Merkmale:Adaptabilität, Gesundheit
Produktqualität
Rep
rodu
ktio
n
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Reproduktion ist als biologischer Vorgang essentiell für die Arterhaltung und –entwicklung Fitness
In der Tierzüchtung ist Fortpflanzung essentiell zur Bestandsergänzung und Bereitstellung von Jungtieren für die verschiedenen Nutzungsformen ökonomisch wichtiges Produktionsmerkmal
Reproduktion umfasst eine Reihe physiologischer Vorgänge
paternal maternal embryonal/fötalgenetische Einflüsse:
Umweltabhängigkeit
Fruchtbarkeit – ein komplexes MerkmalErblichkeit
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Merkmale der Reproduktionsleistung - Schwein
Anzahl Ferkel/Sau/Jahr
Aufgezogene Ferkelje Wurf
Würfe/Sau/JahrWurfabstand
Säugedauer GüstzeitAufzucht-verluste
Lebende-geborene
Ferkel
Ovulations-rate
Befruch-tungs-rate
Fötale Sterb-lichkeit
Intervall Absetzen-Brunst
Konzenp-tions-rate
Libido, Spermaqualität♂
Anzahl Nachkommen je Geburt
Reproduktionsfrequenz
Heritabilität der Reproduktionsmerkmale
Rind Schwein
Rastzeit/Güstzeit sehr geringTrächtigkeitsrate sehr geringBesamungsindex sehr geringSchwergeburten moderatTrächtigkeitsdauer moderatGeschlechtsreife moderatZwillingsrate/Ovulationsrate gering moderatWurfgröße geringSpermaqualität moderat
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Einsatz von Reproduktionsbiotechnologie und Molekulargenetik
Reproduktionsbiotechnologie Modifikation von Ablauf und biologischer Effizient der Fortpflanzungs-vorgänge; Erhöhung der Reproduktionsrate selektierter Individuen
Molekulargenetik Identifizierung von Genen mit Einfluss auf die Fruchtbarkeit; Selektion zur nachhaltigen genetischen Verbesserung der Reproduktionsleistung
Hypothalamus
GnRH
Hypophyse
Milchdrüse
Ovar
LH FSH Prolactin
ActivinInhibinÖstrogenProgesteronAndrogen Uterus}
}
Direkte Kandidatengene abgeleitet von der hormonellen Steuerung der
Reproduktionsvorgänge
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Kandidatengene für männliche Fruchtbarkeit Gen Biologische Funktion
GnRHR …vermittelt die Wirkung des Signals vom Hypothalamus andie Hypophyse (Wise et al., 1984)
FSH-β …stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst dieHodenmorphologie und -funktion (Zanella et al., 1999;Li et al., 1998)
PRLR …stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst dieHodenmorphologie und -funktion (Hondo et al., 1995)
RLN Relaxin-Konzentration in der Samenflüssigkeit ist korreliertmit der Motilität der Spermien (Sasaki et al., 2001)
AR …vermittelt die Wirkung der männlichen Sexualhormone
Androgenrezeptor (AR)
AR ist ein Kandidatengen für Reproduktionsmerkmale:
vermittelt die hormonale Antwort auf Androgene und reguliert die Expression des Zielgens; beeinflusst Zellvermehrung und Differenzierung im Zielgewebe
1. AR vorhanden in Hoden und Ovar (Kimura et al., 1993; Pelletier et al., 2000; Duffy et al.,1999)
2. positive Korrelation zwischen AR mRNA Expressionen und Granulosa-Zelldifferenzierung (Weil et al., 1998)3. AR fördert das Follikelwachstum und die Östrogensynthese durch die Verstärkung des Effekts des Follikel- stimulierenden-Hormons, FSH (Keith et al., 1998; Weil et al., 1999)
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Genomic hat zum Ziel die Feststellung des Status quo zwecks
Nutzung für züchterische Selektion!
Es ist keine genetische
Manipulation!
AndrogenrezeptorSequenzanalyse: cDNA: 3.554 bp
Promotor: 2.459 bpPolymorphismen: SNPs in Promotor und cDNA
INDEL in Promotor und Exon 1(CCTTT)n im 5´-UTR
Frühreife: Chi-square = 48.840; (p< 0.001)Zitzenzahl: Chi-square = 38.311 ; (p=0.032)Assoziationen:
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Genorten für produktionsrelevante Merkmale bei Nutztieren
Tierart Merkmal Chromosom
Rind Doppellender 2
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Kerntransfervorgang in einer vorher enukleierten Empfängerzygote. Im Anschluss an den Transfererfolgt die Fusion beider Anteile
Zygote nach einer Zentrifugation und während der Injektion in den Vorkern
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Mikroinjektion von DNA-Konstrukten in Schweinezygoten. Die Zygoten sind zentrifugiert worden, um die Vorkerne sichtbar zu machen. Es werden 1 - 2 pl (10-12) in einen Vorkern injiziert.
Effizienz der Mirkoinjektion zur Erstellung transgener Tiere
Injizierte Zygoten
Nachkommen /Feten
n %Transgene
n %
Rind 15.019 432 /4269 10,1 26 0,2
Schaf 7.552 955 12,6 55 0,7
Schwein 13.988 1.264/13.446 9,4 93 0,7
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Was kostet ein transgenes
Tier ?
Maus..................80 €
Schwein......20.000 €
Schaf...........48.000 €
Rind...........420.000 €
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