Molekularbiologie;ZusammenfassungVonBeelerPatrickStoffumfangderPrüfung

‐ TheoriezudenExperimentendesPraktikums‐ KenntnisderverwendetenMethoden

DurchgeführteExperimente

‐ HefeidentifikationmittelsISTPCRundRestriktionsanalyse(RFLP)‐ SequenzierungdermitochondrialenDNAvonKanninchen(KlassischeDNA

Sequenzierung)‐ KlonierungderSODvonE.coliundExpressioninE.coli‐ FleischartenanalysevonWurstwarenmittelsRealtimePCR,2:Strategien‐ GruppenarbeitAndereKlonierungsstrategien(EukaryotischeSysteme)

1. HefeidentfikationmittelsITSPCRundRestriktionsanalyseRFLPRestriktionsfragmentlängenpolymorphismus,abgekürztRFLP(sprich:"Riflip",vonengl.:

RestrictionFragmentLengthPolymorphism,auchPLP:PCR‐Längen‐Polymorphismus)bezeichnet

UnterschiedevonDNA‐SequenzenhomologerChromosomen,welchealsverschiedene

Restriktionsfragmentmuster(z.B.beiderGelelektrophorese)sichtbarwerden.

DieLängeeinesRestriktionsfragmentswirddurchMutationbeeinflusst,beidereine

ErkennungssequenzfüreinRestriktionsenzymentstehtoderverlorengeht.

Beispiel:EineSequenzenthältbeiPerson1eineSchnittstellefüreinRestriktionsenzym,inder

SequenzbeiPerson2kommtdiesenichtvor.WerdennundieseSequenzenmiteinem

Restriktionsenzymgeschnitten,entstehenbeiPerson1zweiFragmenteundbeiPerson2ein

Fragment.WerdennundieLängenderSequenzenverglichen,kanneinRFLPfestgestelltwerden,

dieFragmentesindunterschiedlichlang,derLocusistpolymorph.

RFLPsdienenu.a.alsgenetischeMarkerbeiderGenkartierung,dasieumsowahrscheinlicher

zusammenvererbtwerden,jenähersiezusammenliegen.Siewerdendarüberhinausauchzur

SuchenachQuantitativeTraitLoci,alsoChromosomenabschnittenmitEinflussaufdie

AusprägungeinesquantitativenMerkmals,sowieinSouthernBlotsgenutzt.

EinespeziellereAnwendungistdieT‐RFLP(TerminaleRFLP).DabeiwerdendieZielgeneinder

PCR(PolymeraseChainReaction)miteinem(oderbeiden)fluoreszenzmarkiertenPrimer

amplifiziert.DieAmplifikationsproduktewerdenmiteinemRestriktionsenzymverdautund

durcheinenautomatisiertenSequenzeranalysiert.Dieserdetektiertnurdiefluoreszierenden

Fragemente(alsodieterminalen).AnwendungzumBeispielzurBestimmungderDiversitätin

einerProbeoderDiversitätsvergleicheentlangeinesGradienten.

Die18S‐,5,8Sund28S‐rRNAGeneeinerTranskriptionseinheitwerdenaufDNA‐Ebenedurchzweisogenannteinternaltranscribedspacer(ITS)getrenntundgemeinsamvoneinemexternaltranscribedspacer(ETS)angeführt(sieheSchemazeichnung).MituntergibtesauchamRepeat‐EndenocheinenETS.AufeinanderfolgendeTranskriptionseinheitenwerdendurchnon­transcribedspacer(NTS)getrennt.PCRamBeispielderITSRegionvonHefen

1. IsolierungchromosomaleDNAvoneinerHefe2. AmplifikationderITS‐Regionausgehendderchr.DNAmittelsPCR3. Agaroseelektrophorese:‐ AuftrennungderPCRProdukte‐ BestimmungderGrössederPCRBandeninbp4. RestriktionsverdauderPCRProduktemitTaqI,ErkennungssequenzTCGA5. Agarosegelelektrophorese:AuftrennungderFragmenteBestimmungderGrösseder

FragmenteinbpLagederInternalTranscribedSpacer(ITS)‐RegionbeiHefen18SrDNA‐‐ITS1—5.8SrDNA—ITS2—26SrDNAITS‐RegionenhabenbeidenverschiedenenHefeneineunterschiedlicheGrösse(Mutationen)EsistegalwelcheHefeesist,amplifiziertwerdenalle,weilallediegleicheRegionhaben.

2. SequenzierungdermitochondrialenDNAvonKanninchen(KlassischeDNA

Sequenzierung)HierbezieheichmichaufdieDidesoxy­Methode

DidesoxymethodenachSanger

DieDidesoxymethodenachSangerwirdauchKettenabbruch­Synthesegenanntundstellteine

enzymatischeMethodedar.SiewurdevonSangerundCoulsonum1975entwickeltundbereits

1977mitdererstenvollständigenSequenzierungeinesGenoms(BakteriophageφX174[2])

vorgestellt.[3]SangererhieltfürseineArbeitenzurDNA‐SequenzierungzusammenmitGilbert

1980denNobelpreisfürChemie.

PrinzipderDNA‐SequenzierungnachderDidesoxy‐Methode.dNTPistdieallgemeineAbkürzungfüreinNukleosidtriphosphatundkannfürdATP,dCTP,dGTPoderdTTPstehen.ddNTPssinddieentsprechendenDidesoxy‐VariantenderdNTPs.DerEinbaueinesddNTPsführtzumAbbruchderPolymerisationsreaktion.DieblauenPunkteam5'‐EndedesPrimersstellteineMarkierungdar(z.B.einefluoreszierendeGruppe),mittelsderdieSyntheseproduktespäterimGelsichtbargemachtwerdenkönnen.AlternativlassensichauchradioaktivmarkierteNukleosidtriphosphatezurPolymerisationsreaktioneinsetzen.

AusgehendvoneinemkurzenAbschnittbekannterSequenz(Primer)wirddurchdasEnzym

DNA‐PolymeraseeinerderbeidenkomplementärenDNA‐Strängeverlängert.Zunächstwirddie

DNA‐DoppelhelixdurchErwärmungdenaturiert,woraufhinEinzelsträngefürdasweitere

VorgehenzurVerfügungstehen.InviersonstgleichenAnsätzen(allebeinhaltendievier

Nukleotide)wirdjeeinedervierBasenzumTeilalsDidesoxynukleosidtriphosphat(ddNTP)

zugegeben.DieseKettenabbruch‐ddNTPsbesitzenkeine3'‐Hydroxygruppe:Werdensieinden

neusynthetisiertenStrangeingebaut,isteineVerlängerungderDNAdurchdieDNA‐Polymerase

nichtmehrmöglich,dadieOH‐Gruppeam3'‐C‐AtomfürdieVerknüpfungmitder

PhosphatgruppedesnächstenNukleotidsfehlt.InderFolgeentstehenDNA‐Fragmente

unterschiedlicherLänge,dieinjedemAnsatzstetsmitdemgleichenddNTPenden.Entwederist

derPrimeroderessinddieddNTPsradioaktivmarkiert.NachderSequenzier‐Reaktionwerden

diemarkiertenAbbruchprodukteausjedemAnsatzmittelsPolyacrylamid‐Gelelektrophorese

derLängenachaufgetrennt.DurchVergleichdervierAnsätzekannmandieSequenz,nachder

EntwicklungdesradioaktivenGelsaufeinemfotografischenFilm,ablesen.Diedementsprechend

komplementäreSequenzistdieSequenzderverwendeteneinsträngigenDNA‐Matrize.Als

Sequenzier‐ReaktionkommtheutzutageeineVariationderPolymerase‐Kettenreaktion(PCR)

zumEinsatz.AndersalsbeiderPCRwirdnureinPrimereingesetzt,sodassdieDNAnurlinear

amplifiziertwird.

SeitAnfangderneunzigerJahrewerdenvorallemmitFluoreszenz‐FarbstoffenmarkierteDidesoxynukleosidtriphosphateeingesetzt.JedesdervierddNTPswirdmiteinemunterschiedlichenFarbstoffgekoppelt.DieseModifikationerlaubtes,allevierddNTPsineinemReaktionsgefäßzuzugeben,eineAufspaltungingetrennteAnsätzeundderUmgangmitRadioisotopenentfällt.DieentstehendenKettenabbruchproduktewerdenmittelsKapillarelektrophoreseaufgetrenntundmitHilfeeinesLaserszurFluoreszenzangeregt.DieddNTPsamEndejedesDNA‐FragmenteszeigendadurchFluoreszenzunterschiedlicherFarbeundkönnensovoneinemDetektorerkanntwerden.DasChromatogramm(dieAbfolgederFarbsignale,dieamDetektorerscheinen)gibtdirektdieSequenzderBasendessequenziertenDNA‐Strangeswieder.

3. KlonierungderSODvonE.coliinE.coli

3.1 DieGrundlagendesKlonierensKlonierungensindeineeinfacheAngelegenheit.ManverdautVektorundDNA‐Fragment,reinigtsie,ligiertsiemiteinanderundtransformiertdiewildeMischung,diedabeientsteht,inBakterien.AnschliessendmussmannurnochunterdenBakterieneinesmitdemgewünschtenKlonselektierenundfertigistdieKlonierung.DieSchwierigkeitenimDetail:DerVektor:MeistentscheidetmansichzuBeginnseinerArbeitenfüreinenKlonierungsvektorundbleibtbeidiesem.ManbenutztauchimmerwiederdiegleichenSchnittstellen.ObwohlmanfürdieeinzelneLigationnurwenigVektorbenötigt(25‐50ng),solltemandeswegenimmergleichgrössereMengen(1‐5mikrog)präparieren,d.h.ordentlichverdauenundgegebenenfallsdesphosphorylieren,aufreinigunen,aufeineKonzentrationvon25ng/mikroleinstellenundwegfrieren.VerdautmandenVektormitzweiRestriktionsenzymen,setztmaneinkleinesStückPolylinkerfrei,dasbeideranschliessendenLigationstört,weilsokleineDNAFragmenteweitbesserindenVektorliegiertwerdenalsdasFragment,dassmaneigentlichhineinbekommenmöchte.IstdasPolylinkerstückenkürzerals10bis15Basen,wirdmanesbeiderEthanolfällunglos,isteslänger,solltemandasVektorfragmentübereine

GelelektrophoresevomPolylinkerfragmenttrennenunddenVektorausdemGelaufreinigen.WennmandenVektormitnureinemRestriktionsenzymschneidet,entstehenzweikompatibleEnden,diewiedermiteinanderliegierenkönnen.ManhatdamitdenFeindindereigenenVektor‐DNAundderAnteilanWunschklonenistmeistminimal.MankanndiesesProblemverringernindemmandieVektor‐DNAdesphoshoryliert.UmgangssprachlichsprichtmanauchCIPen.DasPrinzip:NachdemRestriktionsverdaubleibenanden5`‐EndenderDNA‐FragmentenPhosphatresetezurück,diefürdieLigationbenötigtwerden.EntferntmandiesemiteinerPhosphatase,kannkeineSelbstligationdesVektorsmehrstattfinden.DasFragment,dasmanhieinbefördernmöchte,besitztdagegennochbeidePhosphatresteundkanndaherseinerseitsimmernochmitderVektor‐DNAligieren,zumindestmiteinemderbeidenStränge.DasDNA­Fragment:DerschwierigsteSchrittistmeist,geeigneteRestriktionssschnittstellenfürdieKlonierungzufinden.IstdiesesProblemgelöst,verdautmandieDNA,trenntdieFragmenteübereinAgarosegelundisoliertdasgewünschteDNA‐FragmentausdemGel.DasFragmentwirdanschliessendineineVektor‐DNAligiert,diemitdengleichenRestriktionsenzymengeschnittenwurde.MitunterwillmaneinenganzbestimmtenVektorfürdieKlonierungverwenden,dochstelltsichheraus,dasserkeinepassendenSchnittstellenbesitzt.Bevormananfängt,sichverzweifeltdieHaarezuraufen,solltemanvorsichtshalberkurzprüfen,obsichnichtwenigstenseinpaarSchnittstellenfinden,diekompatibleÜberhängeproduzieren.

3.2 KlonierenvonPCR‐ProduktenEinebesondereHerausforderungstelltdieKlonierungvonPCR‐Produktendar.DerklassischeWeg,beschriebenvonScharfetal.1986,bestehtdarin,anden5`‐EndenderbeidenverwendetenPrimerjeweilseineRestriktionssschnittstelleunterzubringen.NachderReinigungwirddasPCR‐ProduktgeschnittenundineinenpassendenVektorkloniert.DieSchwierigkeitbestehtdarin,dasseinigeRestriktionsenzymeandenEndeneinesFragmentsnurschlechtscheniden.DamandenErfolgeinersolchenOperationnursehrschlechtüberprüfenkann,ähneltderVorgangeinwenigeinemGlücksspiel.EinweitereNachteilderMethodebestehtdarin,dassmannichtimmerzweiPrimermitRestriktionsschnittstellenzurHandhat.FindigeGeisterarbeitendeshalbschonseiteinigerZeitaneinersimplerenundallgemeineranwendbarenMethode.EineklassischeLösungbestehtdarin,dasPCRFragmentineinenglatt,z.B.mitEcoRVgeschnittenenVektorzuklonieren.AmplifiziertmanPfuoderPwo,funktioniertdasauchganzgut,verwendetman,wiesomeistens,dieTaq‐Polymerase,istdieAusbeutenurmittelmässig,weildiesedieNeigunghat,andas3`‐EndedersynthetisirtenDNAeinezusätzlicheBaseanzuhängen.IstdieBaseam5`‐EndedesPrimerseinT,istdieChance,einglattesEndezuerhalten,nochamgrössten.UmbeiderKlonierungdenAnteilanKlonenmitInsertzuerhöhen,bietensicheingieganzpfiffigeMethodenan.HierwirdaufdieMehtodederTA‐Klonierungeingegangen!EinAnsatzbasiertaufderEntdeckung,dassdieTaq‐PolymerasekeineFragmentemitglattenEndenproduziert,sonderneinenmeistunspezifischenÜberhangvoneinerBaseschafft.DieseBaseistinderMehrzahlderFälleeinAdenosin,allerdingsnichtimmer.EineBaseÜberhangistnichtviel,aberbesseralsnichts.DurchdieKonstruktioneinesVekorsmitThymidinüberhanglassensichPCR‐FragmenteleichterklonierenalsinVektorenmitglattenEnden.DieMethodewirdalsTA‐Klonierungbezeichnetundnatürlichgibt’sdafürKITSmitfertigenT‐Vektor,z.B.beiInvitrogen.MankanndenVektoraberauchselbstherstellen,indemmanglattgeschnittenenVektormitTaq‐PolymeraseunddTTPimpassendenPufferfür2hbei70°Cinkubiertundanschliessendreinigt.

3.3 PlamidealsVektorenPlasmidesindzirkuläredoppelsträngigeDNA‐Moleküle,diesichunabhägigvombakteriellenGenominBakterienvermehrenkönnen.DieMinimalausstattungeinesPlasmidsbestehtauseinemReplikationnsstart(originofreplication,ori),einemSelektionsgen(meisteinAntibiotikaresistenzgen)undeinerKlonierungsstelle(cloningsite),umfremdeDNAinsPlasmideinschleussenzukönnen.DarüberhinauskannnocheineMengeandererSequenzendrinstecken,beispielsweisezweiterSelektionsmarkerodereinPromoterzwecksExpressiondeseingeschleustenGens.Plasmidvektorensindüblicherweise2.5bis5kblang,jenachdem,wassiesoanEigenschaftenbesitzen.WeildieGrösseeinesPlamidsimPrinzipnichtbeschränktist,kannmanjedeMengeDNAinsiehineinklonieren,dasmachtsiezuwunderbarenWerkzeugeninderMolekularbiologie.InderPraxiserweisensichPlamsideallerdingsdochalsrechtbeschränkt,manverwendetsiedahermeistfürdieKlonierungvonFragmentenvon0bis5kbLänge.AuchlängereFragmentekönneninPlasmideeingeschleustwerden,dochwirddieKlonierungüblicherweiseumsoschwieriger,jelängerdasFragmentist.DerReplikationsursprungentscheidetüberdieZahlderPlasmidkopien,dieeinBakteriumenthält.Sindeswenigeralszwanzig,bezeichnetmanesalslow‐copyPlasmid,währendrichtigehighcopyPlasmideinmehrerenhundertKopienjeBakteriumvorliegenkönnen.Üblicherweiseverwendetmanhigh‐copyPlasmide,weildieAusbeutebeiPlasmidpräparationenhöherist,dochkanndiegrosseKopienzahlmanchmalhinderlichsein.DieKlonierungsstelleenthältSchnittstellen,dieinderRegelnureinmalimVektorvorkommen.Dieserlaubt,denVektorfürdieKlonierungzuschneiden,ohneintausendkleineStückchenzuzerlegen.TheoretischreichteineeinzigesolcheSchnittstelleaus,aberumdieVektorenmöglichstvielseitigzumachen,enthaltendiemeistengängigenPlasmidvektorenzehnbiszwanzigdavon,mansprichtdannvoneinermultiplecloningsiteMCS.DieKlonierungsstellekannineinemGenliegen,dasinaktiviertwird,wenneinDNA‐FragmentindenVektorkloniertwird.DieserlaubteineeinfachereSelektiondergewünschtenKlonenachderKlonierung‐einesehrnützlicheEigenschaft,wennmanbedenkt,dasshäufignureinkleinerTeilderKolonien,diemannacheinerKlonierungaufderAgarplattevorfindet,auchdengewünschtenKlonenthält.AmhäufigstenwirddieBlau‐weissSelektionverwendetdieaufeinerUnterbrechungdeslacZ‐Gensberuht.LacZkodiertfürdasneueN‐terminalealpha‐Fragmentderbeta‐Galactosidase,dassalleinekeineBeta‐Galactosidase‐Aktivitätbesitzt.BringtmanesaberzusammenmitdemebenfallsinaktivenC‐terminalenomega‐Fragment,wirddieseAktivitätaufwundersameWeisewiederhersgestellt,einVorgang,deralsalpha‐Komplementationbezeichnetwird.DurchInsertationweisssonstblau.

3.4 Ablauf:SOD:Klonierung,ExpressioninE.coli

1. KenntnisüberdasProtein.SODinCytoplasma?Periplasma?Sekretion?

Glycosielierung?,S‐SBrücken?KorrekteFaltung?Hydrophobizität?2. DNA‐Sequenz,MuSOD,XO3951,Genbank3. DNA‐Isolation,chr.DNAE.coli4. AuswahlKlonierungsvektorfürE.coliPCRTZ/NT‐TOPO(Invitrogen)5. AuswahlDesignPCRPrimer6. Ligation:Vektor+PCR‐Produkt7. TransformationinE.coli:TOP10F+AnzuchtE.coli8. Plasmidisolierung+KontrolleOrierntierung9. TransformationinExpressionsstamm10. InduktionIPTG

11. Reingung+AnalysepolyHIS+SDSPage+WesternBlot

4. TheoriePCR

DiePolymerase­Kettenreaktion(englischPolymeraseChainReaction,PCR)isteineMethode,

umdieErbsubstanzDNAinvitrozuvervielfältigen.DazuwirdeinEnzymverwendet,dieDNA‐

Polymerase.DerBegriff"Kettenreaktion"beschreibtindiesemZusammenhangdieTatsache,

dassdieProduktevorherigerZyklenalsAusgangsstoffefürdennächstenZyklusdienenund

somiteineexponentielleVervielfältigungermöglichen.

DiePCRwirdinbiologischenundmedizinischenLaboratorienfüreineVielzahlverschiedenerAufgabenverwendet,zumBeispielfürdieErkennungvonErbkrankheitenundVirusinfektionen,fürdasErstellenundÜberprüfengenetischerFingerabdrücke,fürdasKlonierenvonGenenundfürAbstammungsgutachten.DiePCRzähltzudenwichtigstenMethodendermodernenMolekularbiologieundvielewissenschaftlicheFortschritteaufdiesemGebiet(z.B.imRahmendesHumangenomprojekts)wärenohnedieseMethodenichtdenkbargewesen.

PCRinderPraxis

PCRwirdeingesetzt,umeinenkurzen,genaudefiniertenTeileinesDNA‐Strangszu

vervielfältigen.DabeikannessichumeinGenoderauchnurumeinenTeileinesGenshandeln

oderauchumnicht‐kodierendeDNA‐Sequenzen.ImGegensatzzulebendenOrganismenkann

derPCR‐ProzessnurrelativkurzeDNA‐Abschnittekopieren.BeieinerStandard‐PCRkönnen

diesbiszuetwa3.000Basenpaare(3kbp)langeDNA‐Fragmentesein.MitHilfebestimmter

Polymerasen‐Gemische,weitererAdditiveinderPCRundoptimalenBedingungenkönnensogar

FragmentemiteinerLängevonüber20–40kbpvervielfältigtwerden,wasimmernochsehrviel

kürzeristalsdiechromosomaleDNAeinereukaryotischenZelle.DasmenschlicheGenom

enthältbeispielsweiseetwadreiMilliardenBasenpaare.

InihrenmomentanenAnwendungsgebietenbenötigtPCRmehreregrundlegendeKomponenten.

Diesesind:

DieOriginal‐DNA,diedenzuvervielfältigendenAbschnittenthält

ZweiPrimer,umaufdenbeidenEinzelsträngenderDNAjeweilsdenStartpunktderDNA‐

Synthesefestzulegen,wodurchderzuvervielfältigendeBereichvonbeidenSeiten

begrenztwird.

DNA‐Polymerase,diebeihohenTemperaturennichtzerstörtwird,umdenfestgelegten

Abschnittzureplizieren(kopieren)(z.B.Taq‐Polymerase)

Desoxynukleosidtriphosphate,dieBausteinefürdenvonderDNA‐Polymerasesynthetisierten

DNA‐Strang

Mg2+‐Ionen,fürdieFunktionderPolymeraseessentiell

Pufferlösungen,dieeinefürdieDNA‐PolymerasegeeignetechemischeUmgebung

sicherstellen

DiePolymerase‐KettenreaktionfindetineinemsogenanntenThermocyclerstatt.DieseMaschine

erhitztundkühltdieinihrbefindlichenReaktionsgefäßepräziseaufdieTemperatur,diefürden

jeweiligenSchrittbenötigtwird.UmVerdunstungzuverhindern,wirdeindichtschließendes

ReaktionsgefäßodereineÖlschichtaufdemReaktionsgemischverwendet.Etwaige

KondensatbildungimDeckeldesGefäßeswirddurcheinenbeheizbarenGerätedeckel(über100

°C)verhindert.

SolldiePCRvorallemalsquantitativerNachweisdienen,empfiehltsichdiesog.RealTimePCR.

DieVerwendungeinerPyrophosphatasekannunterUmständendieEffektivitätderPCRsteigern.DasEnzymkatalysiertdieHydrolysedesvondenNukleotidtriphosphatenabgespaltenenPyrophosphatszuOrthophosphat.PyrophosphatkannalsInhibitorbeiderPCRwirken.

Beispiel

PCR‐Reaktionsgefäße.PCR‐Plattefür96AnsätzemitGummiabdeckung

AlsallgemeinesBeispielseihierdie„Rezeptur“füreinePCR‐Reaktionwiedergegeben(viele

BeispielefürdieverschiedenstenReaktionenfindensichansonsteninderwissenschaftlichen

LiteraturinallenmöglichenVariationen):

1,0µlDNA‐Lösung(100ng/µl)

2,0µlproPrimer(i.d.R.zwei)(10µM)

1,0µlPfu‐,Taq‐oderanderethermostabilePolymerase(1–5U/µl)Pwo,TbrTfi

1,0µl10mMDesoxy‐Nukleotide(dATP,dGTP,dCTP,dTTP),„dNTP“

5,0µl10‐fachkonzentriertePolymerase‐Pufferlösung

38,0µlH2O

50,0µlGesamtvolumenEin200‐µl‐Reaktionsgefäßmitden50µlGemischwirdindenThermocyclergestellt.AlsReaktionsgefäßkönnennebeneinzelnen200‐µl‐Reaktionsgefäßenauchachtzusammenhängende200‐µl‐ReaktionsgefäßeoderPCR‐Plattenfürbiszu96Ansätzeverwendetwerden.DiePlattenwerdenentwedermiteinerGummiabdeckungodereinerselbstklebendenKlarsichtfolieverschlossen.

TheoretischerAblauf

DerPCR‐ProzessbestehtauseinerAnzahlvon12–50Zyklen,dieineinemThermocycler

durchgeführtwerden.DiefolgendenAngabensindalsRichtwertegedacht.MeistmusseinePCR

aufdiespezifischeReaktionhinoptimiertwerden.JederZyklusbestehtausdreiSchritten(siehe

Abbildungunterhalb):

Denaturierung(Melting,Schmelzen):ZunächstwirddiedoppelsträngigeDNAauf94–96°C

erhitzt,umdieSträngezutrennen.DieWasserstoffbrückenbindungen,diediebeiden

DNA‐Strängezusammenhalten,werdenaufgebrochen.ImerstenZykluswirddieDNAoft

fürlängereZeiterhitzt(Initialisierung),umsicherzustellen,dasssichsowohldie

Ausgangs‐DNAalsauchdiePrimervollständigvoneinandergetrennthabenundnur

nochEinzelsträngevorliegen.Manche(sogenanntehotstart‐)Polymerasenmüssen

durcheinenochlängereanfänglicheErhitzungs‐Phase(biszu15Minuten)aktiviert

werden.

Primerhybridisierung(primerannealing):DieTemperaturwirdca.30Sekundenlangaufeiner

Temperaturgehalten,dieeinespezifischeAnlagerungderPrimerandieDNAerlaubt.

DiegenaueTemperaturwirdhierbeidurchdieLängeunddieSequenzderPrimer

bestimmt(bzw.derpassendenNukleotideimPrimer,wenndurchdiesenMutationen

eingeführtwerdensollen=site‐directedMutagenesis).WirddieTemperaturzuniedrig

gewählt,könnensichdiePrimerunterUmständenauchannicht‐100‐%‐

komplementärenSequenzenanlagernundsozuunspezifischenProdukten

(„Geisterbanden“)führen.WirddieTemperaturzuhochgewählt,istdiethermische

BewegungderPrimeru.U.sogroß,dasssiesichnichtrichtiganheftenkönnen,sodass

eszugarkeinerodernurineffizienterProduktbildungkommt.DieTemperatur,welche

diebeidenobengenanntenEffekteweitgehendausschließt,liegtnormalerweise2–3°C

unterdemSchmelzpunktderPrimersequenzen;diesentsprichtmeisteinerTemperatur

von55–65°C.Elongation(Polymerisation,Verlängerung,Amplifikation):SchließlichfülltdieDNA‐PolymerasediefehlendenSträngemitfreienNukleotidenauf.Siebeginntam3'‐EndedesangelagertenPrimersundfolgtdanndemDNA‐Strang.DerPrimerwirdnichtwiederabgelöst,erbildetdenAnfangdesneuenEinzelstrangs.DieTemperaturhängtvomArbeitsoptimumderverwendetenDNA‐Polymeraseab(68–72°C).DieserSchrittdauertetwa30Sekundenje500Basenpaare,variiertaberinAbhängigkeitvonderverwendetenDNA‐Polymerase.ÜblicheThermocyclerkühlendieReaktionsansätzenachVollendungallerZyklenauf4–8°C,sodasseinePCRamAbendangesetztwerdenkannunddieProbenamMorgendaraufweiterverarbeitetwerdenkönnen.

SchematischeDarstellungdesPCR‐Zyklus.(1)Schmelzen(Denaturierung)beica.96°C.(2)Anlagerung(Primerhybridisierung)beica.68°C.(3)Verlängerung(Elongation)beica.72°C(P=Polymerase).ExponentiellesAnwachsendesKurzenProduktes(vonPrimerneingeschlossenerBereich).

ImerstenZyklusentstehenproDNA‐Ausgangsdoppelstrang2DNA‐Stränge,welcheimBereich

derZielsequenzdoppelsträngigsind.NachdemSchmelzenamAnfangdeszweitenZyklusstehen

dadurchdiebeidenursprünglichenDNA‐Einzelsträngeundzweiam3’‐Endeüberlange

EinzelsträngezurVerfügung.Diesistdamitzuerklären,dasslediglicheinStartpunkt(Primer),

nichtabereinEndpunktexaktfestgelegtist.DerAbbruchderStrangsyntheseerfolgtdabei

spätestensdurchdieStrangtrennungimfolgendenDenaturierungsschritt.ImzweitenZyklus

stehendieeingesetzteDNAsowiediegeradegebildetenDNA‐SträngezurVerfügung.An

ErsterererfolgtderselbeProzesswieimerstenZyklus.AndieneugebildetenDNA‐

Einzelstränge,welchean3’bereitsdortendenwosiesollen,lagernsichnunPrimerinder5’‐

Regionan.DienungebildetenSträngehabenkeinen5’‐Überhang,dadiePolymeraseaufdem

TemplateinRichtungdes3’‐Endesliest.AmEndedeszweitenZyklusstehendamiterstmals

ProduktedergewünschtenLängezurVerfügung.IndenfolgendenZyklenvermehrensichdie

gewünschtenProdukteexponentiell(dasieselbstalsMatrizefürweitereStrangsynthesen

dienen),währenddieungewünschtenlangenProdukte(sieheProduktedeserstenZyklus)nur

linearansteigen(nureingesetzteDNAdientalsMatrize).DiesistdertheoretischeIdealfall,in

derPraxisfallenzudemingeringemMaßeauchkürzereFragmentealsdiegewünschteZiel‐DNA

an.DiesekurzenFragmentehäufensichvorallemindenspätenZyklenan,wodurchmeistnur

etwa30Zyklendurchlaufenwerden,uminsgesamtvorwiegendDNAdergewünschtenLänge

undSequenzzuerhalten.

DasPCR‐ProduktkanndurchAgarose‐GelelektrophoreseanhandseinerGrößeidentifiziertwerden.(DieAgarose‐GelelektrophoreseisteinVerfahren,beiderDNAineinAgarose‐GeleingebrachtwirdundanschließendeineSpannungangelegtwird.DannbewegensichdiekürzerenDNA‐SträngeschnelleralsdielängerenaufdenPluspolzu.)DieLängedesPCR‐ProduktskanndurcheinenVergleichmiteinerDNA‐Leiter,dieDNA‐FragmentebekannterGrößeenthältundparallelzurProbeimGelmitläuft,bestimmtwerden.

4.1 RealtimequantitativePCR

DieReal­Time­quantitative­PCR(RTQ­PCR,auchRealTimeDetectionPCR,kurzRTD­PCR)ist

eineVervielfältigungsmethodefürNukleinsäuren,dieaufdemPrinzipderherkömmlichen

Polymerase‐Kettenreaktion(PCR)beruht,undzusätzlichdieQuantifizierungdergewonnenen

DNAermöglicht.DieQuantifizierungwirdmitHilfevonFluoreszenz‐Messungendurchgeführt,

diewährendeinesPCR‐Zykluserfasstwerden(daherderName„RealTime“).DieFluoreszenz

nimmtproportionalmitderMengederPCR‐Produktezu.AmEndeeinesLaufs(deraus

mehrerenZyklenbesteht)wirdanhandvonerhaltenenFluoreszenzsignalendieQuantifizierung

inderexponentiellenPhasederPCRvorgenommen.NurinderexponentiellenPhasederPCR

(diewenigeZyklenineinemLaufdauert)istdiekorrekteQuantifizierungmöglich,dawährend

dieserPhasedieoptimalenReaktionsbedingungenherrschen.DieseMethodeunterscheidetsich

somitvonanderenquantitativenPCR‐Methoden(qPCR),dieerstnachAblaufderPCReine

quantitativeAuswertung(z.B.KompetitivePCR),meistunterEinbeziehungeiner

gelelektrophoretischenAuftrennungderPCR‐Fragmente,vornehmen.

DieReal‐Time‐quantitative‐PCRkannauchfürandereZweckeverwendetwerden,z.B.zur

UnterscheidungzwischenhomozygotenundheterozygotenZellen.

FürdieReal‐Time‐PCRwirdoftdieAbkürzungRT‐PCRverwendet,wasaberauchzuVerwechslungenführenkann,daauchdieReverse‐Transkriptase‐Polymerasekettenreaktionsoabgekürztwird.

Methoden

InterkalierendeFarbstoffe

DieeinfachsteMöglichkeitderQuantifizierungderPCR‐ProdukteistdieNutzungvonDNA‐

Farbstoffen(z.B.EthidiumbromidoderSYBR®GreenI).

DieseFluoreszenzfarbstoffelagernsichindieDNAein(interkalieren)bzw.bindenandie

doppelsträngigeDNA,wodurchdieFluoreszenzdieserFarbstoffeansteigt.DieZunahmeder

Target‐DNAkorreliertdahermitderZunahmederFluoreszenzvonZykluszuZyklus.Die

MessungfindetamEndederElongationinjedemZyklusstatt.

EinNachteildiesesVerfahrensistdiegeringeSpezifität,dazwischenverschiedenenPCR‐

Produktennichtunterschiedenwerdenkann.AußerdemkönnenkeineMultiplex‐Messungen

durchgeführtwerden.

DenerstenNachteilkannmanausgleichen,indemmannachabgelaufenerPCReine

Schmelzkurvenanalysedurchführt,anhanddererdieFragmentlänge(n)unddadurchdie

Spezifitätbestimmtwerdenkann.

BeieinerSchmelzkurvenanalysewirddieDNAaufgeschmolzen,indemdieTemperaturlangsam

kontinuierlicherhöhtwird(50°C‐>95°C).BeieinerfürdasFragmentspezifischen

SchmelztemperaturdenaturiertderDoppelstrangzuzweieinzelsträngigenMolekülen.Dabei

wirdderFluoreszenzfarbstoff(z.B.SYBR®GreenI)freigesetzt,undeswirdeine

Fluoreszenzabnahmeregistriert.DadiedoppelsträngigeDNAvonspezifischenPCR‐Produkten

einenhöherenSchmelzpunkthatalsunspezifischentstehendePrimerdimere,isteine

Unterscheidungmöglich.DieHöhedesPeaksderSchmelzkurvegibtannäherndAuskunftüber

dieMengedesgebildetenFragments.

FRET­Sonden

EineandereMöglichkeitist,denFluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)auszunutzen.

EinDonor‐Fluorochrom(Reporter‐imZusammenhangmitTaqManSonden),dasdurcheine

Lichtquelleangeregtwird,gibteinenTeilseinerEnergieaneininausreichenderNähe

befindlichesAkzeptor‐Fluorochrom(bzw.einen„dunklen“Quencher‐imZusammenhangmit

TaqManSonden)ab.NimmtderAbstandzwischenAkzeptorundDonorzu,sonimmtFRETund

somitdasFluoreszenzsignaldesAkzeptorsab,währenddasdesDonorszunimmt.Diese

Methodeistsehraufwendigundteuer,bietetaberdieVorteilederhohenSpezifitätdesAssays.

LightCycler®­Sonden(auchHybridisierungs­Sonden)

DieeinfachsteMöglichkeitderNutzungdesFRETzurQuantifizierungvonNukleinsäurenbestehtinderVerwendungvonLightCycler®‐Sonden.Zweiverschiedene,jeweilsmiteinemFRET‐Donorbzw.FRET‐Akzeptor(hierReporter)markierteOligonukleotide,dienebeneinanderandieZiel‐SequenzbindenunddamitdieFluorochromeineinefürdenFRETausreichendeNähebringen,könnenalsSondenfürdieQuantifizierungderPCR‐Produkteeingesetztwerden.DieMessungfindetamEndederAnnealing‐PhaseinjedemZyklusstatt.AuchhierkannsicheineSchmelzkurvenanalyseanschließen.

QuantifizierungvonNucleinsäurenmitHilfederReal‐time‐PCRundLightCycler®‐Sonden.(1)EinsatzvonLightCycler®‐Sonden,diemit2verschiedenenFRET‐Fluorophorenmarkiertwurden.(2)WährendeinesPCR‐ZyklushybridisierendieSondenmitdemkomplementärenDNA‐StrangundermöglichensomiteineFluoreszenzdesAkzeptors.(3)DieAkzeptor‐Fluoreszenz(hierderReporter)steigtproportionalmitderKonzentrationkomplementärerDNA.

TaqMan®­Sonden(auchHydrolyse­Sonden)

EineweiterehäufiggenutzteMöglichkeitdesFRETbestehtinderAnwendungeinerSonde,dieanihremeinenEndemitdemQuencher,anihremanderenEndemiteinemReporter‐Fluoreszenzfarbstoff(z.B.TAMRAundFAM)markiertwird(Double‐Dye‐Oligos,TaqMan®‐Sonde).WenndieTaq‐Polymerase,diezusätzlichzurPolymeraseaktivitäteine5'‐3'‐Exonuclease‐Aktivitätbesitzt,dieSondewährendderSynthesedesGegenstrangesam5'‐Endeabbaut,entfernensichdadurchQuencherundFluorophorvoneinander,undeinesteigendeReporter‐Fluoreszenzkanngemessenwerden.DieMessungfindetamEndederElongationinjedemZyklusstatt.

QuantifizierungvonNucleinsäurenmitHilfederReal‐time‐PCRundTaqMan®‐Sonden.(1)DieFluoreszenzdesReporter‐FluorophorswirdbeiintaktenTaqMan®‐SondendurcheinenQuencherdurchstrahlungsfreieEnergieübertragung(FRET)unterdrückt.(2)WährendeinesPCR‐ZyklushybridisiertdieSondemitdemkomplementärenDNA‐Strang,dieReporter‐Fluoreszenzbleibtzunächstunterdrückt.(3)DieTaq‐PolymerasebautaufGrundihrer5'‐3'‐Exonucleaseaktivitätdas5'‐EndederSondewährendderPCR‐Zyklenab.DieFluoreszenzdesReporterswirdnunnichtmehrdurchdenQuenchergelöschtundkanngemessenwerden.

Quantifizierung

VerschiedeneRechenmodellewerdenfürdieQuantifizierungherangezogen,wobeimeistensein

Referenz‐Gen(z.B.GAPDH,Actin,Tubulin)mitgemessenwird,umeinenrelativenMenge‐

Vergleichdurchzuführen(relativeQuantifizierung).Andere,weitauskompliziertereMethoden

solleneineabsoluteQuantifizierungermöglichen,beiderdiegenaueAnzahlderinderProbe

vorhandenenTemplatesbestimmtwerdenkann.

CT­WertoderauchCp­Wert

IndererstenPhasederAmplifikationeinerPCRistdieTemplatemengebegrenztunddie

Wahrscheinlichkeit,dasssichTemplate,PrimerundPolymerasetreffen,suboptimal,währendin

derdrittenPhasederAmplifikationdieMengederProdukte(DNA,Pyrophosphat,

Monophosphatnucleotide)derartansteigt,dasseszurHemmungdurchdiesekommt,häufiger

Produktfragmentemiteinanderhybridisieren,dieSubstratelangsamverbrauchtwerdenund

letztlichdiePolymerasenundNucleotidedurchdieHitzelangsamzerstörtwerden.Ein

exponentiellerunddaherquantifizierbarerAnstiegfindetsichnurinderPhasedazwischen.

ExponentiellbleibteinePCRbei12bis400Ausgangskopienfürca.30Zyklen,bei200bis3200

für25Zyklenundbeianfänglich3200bis51200fürhöchstens20Zyklen.UmimmeramAnfang

derexponentiellenPhasemessenzukönnen,wirdhäufigderCT‐Wert(ThresholdCycle=

"Schwellenwert‐Zyklus")bzw.derCp‐Wert(CrossingPoint)verwendet,derdenZyklus

beschreibt,andemdieFluoreszenzerstmaligsignifikantüberdieHintergrund‐Fluoreszenz

ansteigt.

Effizienz

DieEffizienzkannaufverschiedeneArtenberechnetwerden,diesichinihremErgebnisleicht

unterscheiden.DieeinfachsteArtistfolgende:

DieEffizienzEkannmitHilfederSteigungmeinerStandardkurveberechnetwerden:[1]

E=10−1/m

EineSteigungmvon−3,32würdesomiteineEffizienzvon100%bedeuten,d.h.eine

VerdopplungderAmplifikateproZyklus.‐3.58eineEffizienzvon90%.

AbsoluteQuantifizierung

EineabsoluteQuantifizierungistaufwändigunddieErgebnissefragwürdig,daherwirddieseArt

derQuantifizierungseltendurchgeführt.Somussu.a.dieEffizienzderreversenTranskription,

diezwischen5und95%liegenkann,bestimmtwerden,z.B.durchVerwendungsynthetisierter

RNAbekannterMenge.

RelativeQuantifizierung

HierfürwirdeineinterneKontrollebenötigt.EineinterneKontrollekanneinGen‐Transkriptsein,dessenSignalverwendetwird,umVariationeninderAusgangsmengedereingesetztenRNAauszugleichen.DieswirdalsNormierungbezeichnet.WeildieGesamtanalyseaufdiesemSignalberuht,istdieWahlderinternenKontrolleeinwichtigerAspektdesExperiments.DieidealeinterneKontrolleistleichtzudetektieren,undderenExpressionsolltenichtwährenddesZellzyklus,zwischenZelltypenoderalsAntwortaufdieexperimentelleBehandlung(z.B.Stress,Medikamente,Krankheit)variieren.

BerechnungmitHilfeeinerStandard­Kurve

Esbestehteinelineare,umgekehrtproportionaleBeziehungzwischendemLogarithmusder

eingesetztenMengeunddemCT.IstdieAusgangsmengebekannt,kanneineStandardkurve

durchAuftragendesLogarithmusderAusgangsmengegegendenCTkonstruiertwerden.Durch

dieGeradengleichungx=(CT−b)/mkannanderStandardkurvefürjedeunbekannteProbeder

LogarithmusderKopienzahlbestimmtwerden.AlleProbenwerdennormiert,indemdie

errechneteKopienzahldesTargetgensdurchdieKopienzahlderinternenReferenzgeteiltwird:

GEN(normiert)=KopienzahlTarget/KopienzahlReferenz

DieunterschiedlicheExpressionzweierProbenrelativzueinanderlässtsichalsQuotient

darstellenundergibteinen‐facheExpression:GEN(normalisiert)(GruppeA)/

GEN(normalisiert)(GruppeB)=n‐FacheExpressionGruppeAzuGruppeB

Berechnungnachderdelta­delta­CT­Methode

DieunterschiedlicheExpressionwirdalsn‐facheExpressionmitHilfedesdelta‐delta‐CT‐Wertes

angegeben.WichtigbeidiesemVerfahrenisteinegleicheEffizienzderbeidenbeteiligtenPCR‐

Reaktionen.DieCT‐Wertewerdenhierbeieinfachvoneinanderabgezogen(delta‐CT),diebeiden

delta‐CT‐WertedereinzelnenGruppen(z.B.krank/gesund,mit/ohneMedikament)

voneinanderabgezogen(delta‐delta‐CT‐Wert)undindieGleichungn‐FacheExpression(Gruppe

AzuGruppeB)=2‐delta‐delta‐CTeingesetzt.

NeueQuantifizierungsalgorithmen

UmdieGenauigkeitderrelativenQuantifizierungzuverbessern,sindverschiedene,teilsaufder

delta‐delta‐CT‐MethodebasierendeAnsätzeentwickeltworden.

1.ErweiterungderFormelderdelta‐delta‐CT‐MethodeumdieEffizienzdesjeweiligenPCR‐

Ansatzes,diezuvorineinemProbelaufübereineStandardkurvebestimmtwerdenmuss.

2.MittelsRegressionsanalysenFitderReal‐time‐PCR‐DatensätzeaneineexponentielleFunktion

bzw.inlinearisierterFormaneineGeradengleichung.DerSchnittpunktdieserFunktionenmit

dery‐AchsegibtdannAufschlussüberdieursprünglichimAnsatzvorhandeneDNA‐Menge

(relativeAngabeimVergleichzueinerReferenzprobe).

3.FitderReal‐time‐PCR‐Datenaneinedrei‐odermehrparametrigesigmoideFunktion.Auch

hierwirddierelativeDNA‐Mengeübery(0)bestimmt.

Vorteiledieserneuen,überwiegendnochnichtmarktreifenMethodenliegenindergenaueren

AnalyseundgeringerenVarianzderPCR‐Ergebnisse.BeieinigenMethodenwirddieEffizienzin

jedemeinzelnenProbenansatzberücksichtigtundermöglichtsoeine„singletube“Analyse.

Reproduzier­undVergleichbarkeitderErgebnisse

EinExperimentistgarnichtswert,wennmanesnichtwiederholenkann.HierfüristesabsolutnotwendigdieVersuchsbedingungenkonstantzuhalten.DabeiisthiernichtnurdieKonsistenzderAssay‐Qualität(Primer,Sonden,Polymerase,Pufferetc.)zuberücksichtigen,auchdieGerätemüssendenAnforderungengenügen.BeispielsweiseistbeiBlock‐Systemen(96‐oder384‐Wells)diesogenannteHomogenitätdasgroßeKriterium.DieAssaysmüsseninjedemWelldesBlocksundzudemaufBlöckenbaugleicherGerätegleichgutlaufen.WeiterhindarfsichimzeitlichenVerlaufdieseHomogenitätnichtverändern.Umsicherzustellen,obmanmitdemGerätimLaborsichereExperimentedurchführenkann,solltemaninregelmäßigenAbständenentsprechendeKontrollendurchführen(einigeModelleneigenextremzumAltern!).DabeiwirdeinAssayinvielenReplikatenüberdengesamtenBlockverteiltanalysiert.Ganzklar:dasErgebnissollteimIdealfallüberallgleichsein.JetztsolltedemExperimentatorbewusstsein,inwieweitAbweichungenauchrelevanteAuswirkungenhabenkönnen.DieseAbweichungenlassensichübrigensnichtmittelsteurerWiederholungenausgleichen,dadieserebensokonstantwiederholtwerdenwürde.

4.2 PrimerauswahlEinerseitslässtsichüberdiePrimeramwenigstensagen,weilsiespeziellfürdiegewünschteAmplifikationmassgeschneidertwerden,andererseitsentscheidensieammeistenüberdasGelingenderAmplifikation.SounvorhersehbarihrVerhaltenist,gibtesdocheinigeRegeln,diedieWahrscheinlichkeitdesFunktionierensdeutlicherhöhen.AlsDaumenregelgilt:

‐ PCRPrimerhabennormelerweiseeineLängevon18‐30BasenundbesitzeneinenAnteilvon40%bis60%GuanidinundCytosinG+C.PrimerfürdieAmplifikationextralangerProduktesollten25bis35Basenlangsein.DerPrimersolltenichtmehralsviergleicheBasenmiteinanderenthalten,z:b.AAAA,umFehlhybridisierungenundLeserasterverschiebungenzuvermeiden.DieSchmelztemeperatursollte55‐80°Cbetragen,umausreichendhoheAnnealingtemperaturenzuerlauben.

‐ Am3`‐EndesollteneinbiszweiGoderCsitzen,umeinebessereBindungundElongationzuerhalten,andererseitswirdempfohlen,höchstensdreiGoderCans3`‐Endezupaltzieren,weilsonstfehlhybridisierendePrimerstabilisiertwerden,dadurchsteigtdieGefahrvonunspezifischenAmplifikationsprodukten.

‐ DieSequenzsolltemöglichstspezifischseinfürdasgewünschteAmplifikationsprodukt,sodassdiePrimernuranderrichtigenStellehybridisieren.JemehrverwandteSequenzeninderverwendetenTemplate‐DNAexistieren,destohöheristdieWahrscheinlichkeitfürunterwünschteAmplifikationsprodukte.JekomplexerdieTemplate‐DNA,destogrösserwirddieWahrscheinlichkeit,Artefaktezuamplifizieren.ManbegegnetdemProblemambestenüberdieMöglichkeithoheAnnealingtemperaturen55bis65°C‐soferndiePrimersequenzdashergibt.MitsteigenderTemperatursinktallerdingsdieAnnealingwahrscheinlichkeitunddamitdieAubeute.

‐ DiePrimersolltekeineinternenSekundärstrukturenwieHaarnadelnhairpinsbilden,weildiesedieWahrscheinlichkeitdesHybridisierensmitderTemplate‐DNAreduzieren.

‐ DiePrimerdürfennichtmiteinanderhybridisierenundsollteneienmöglichstgeringeKomplementaritätanihren3`‐Endenbeitzen‐dereinePrimerkannsonstalsTemplatefürdenanderendienen.AufdieseWeiseentstehenstattdesgewüschtenAmpölifikationsproduktesvorallemdiegefürchtetenPrimerdimere.DieMengeannutzbaremPrimerwirddadurchdastischreduziertunddieAmplfikationseffizienzsinktinsBodenlose.

5. DieElektroporation

ElektroporationisteineMethode,Zellmembranenpermeabelzumachen,umsoDNAin

prokaryotischeZellen(Transformation)odereukaryotischeZellen(Transfektion)einzuschleusen

.DieElektroporationwirdhäufiginderMolekularbiologieverwendet.ImBereichder

Lebensmittel‐undBioverfahrenstechnikkanndieElektroporationzurBesserungvon

MassentransportprozessenoderzurInaktivierungvonMikroorganismeneingesetztwerden.

Prinzip

DurcheinelektrischesFeld,dasinderRegeldurcheinenschnellentladendenKondensator

erzeugtwird,werdeninderbehandeltenZellmembranmikroskopischkleineLöchererzeugt,die

sichinnerhalbvonMillisekundenwiederschließen.DieserEffektderElektroporationwurdevon

Zimmermann1974sowieNeumann1972beschrieben.DiePoreninduktionbedingteinen

VerlustderSemipermeabilitätderZellmembranunddieFreisetzungintrazellulärer

Bestandteile.FügtmandemUmgebungsmediumvorheraberfreieDNAhinzu,kanndiesevon

denZellenaufgenommenwerden.

ElektroporationistfaktischmitallenZelltypenmöglich;dieTransformationsratebeidieser

Methodeistextremhoch.

ElektroporationkannauchzurAbtötungvonMikroorganismenverwendetwerden.Obein

industriellerEinsatzdieserMethodezurSterilisierungdiverserSubstanzen(z.B.Wasser)

möglichist,wirdnochdiskutiert.

Verfahren

SchematischeDarstellungeinesElektroporatorsmitKüvette.

KüvettenfürdieElektroporationmitElektrodenausAluminium.

ZurElektroporationbenutztmaneinenElektroporator–einGerät,dasdaselektrischeFeld

erzeugt.DerElektroporatorhateinenPlatzfüreineKüvette,indiemandieZellsuspension

pipettiert.DieKüvetteverfügtüberzweiElektrodenausAluminium.

Normalerweisebenötigtman50MikrolitereinerZellsuspension.VorderElektroporationmischt

manmaximal1MikroliterderPlasmidlösungmitdenZellenein.DieSpannungwirdam

Elektroporatoreingestellt,dieKüvettehineingestecktunddieElektroporationdurchgeführt.Der

VorgangdauerteinigeSekunden.

DieErfolgsratederElektroporationhängtstarkvonderReinheitderPlasmidlösungab;

insbesonderemussdieLösungvonSalzenfreisein.EineunreineLösungkannbeider

ElektroporationzueinerkleinenExplosionführen,wobeidieZellengetötetwerden.Des

WeiterenmüssendieElektrodenderKüvetteganztrockensein.

ImBereichderLebensmittelverarbeitungkommenkontinuierlicharbeitendeSystemezum

Einsatz.DaszubehandelndeGutwirddurcheinenReaktionsraumgefördert,indemanhand

einerodermehrererElektrodenpaareeingepulsteselektrischesFelderzeugtwird.Die

WiederholungsratederImpulsewirdandenProduktstromangepasst.Diebenötigteelektrische

FeldstärkeliegtüblicherweiseineinemBereichvon1kV/cmfürpflanzlicheodertierische

Zellenbzw.10bis40kV/cmfürMikroorganismen.

4.3ReverseTranskriptase‐Polymerase‐Kettenreaktion

DieReverseTranskriptase­Polymerase­Kettenreaktion(RT­PCR)istdieKombinationaus

zweiMethodenderMolekularbiologie–dieNutzungderReversenTranskriptaseunddie

Polymerase‐Kettenreaktion–umdieGenexpressionvonspezifischenGeneninZellen,Geweben

oderBlutserumnachzuweisen.VerwendetwirddieRT‐PCRinForschungundDiagnostik.

DieTechnik

UmdieTranskriptioneinesGenesnachzuweisen,mussdieabgeleseneRNAuntersuchtwerden.

BeiderAmplifikationvonDNAdurchPolymerase‐Kettenreaktion(PCR)werdenspezifische

DNA‐Polymerasenverwendet,dieDNA‐abhängigsind,d.h.siesindnichtinderLage,RNAzu

amplifizieren.DaherwirdzuersteineReverseTranskriptase(RT)eingesetzt,eineRNA‐

abhängigeDNA‐Polymerase,mitderenHilfeRNAincDNAumgeschriebenwerdenkann.Die

cDNAkannimAnschlussalsAusgangsmaterialineinerPCRverwendetwerden,umspezifische

Sequenzenausdieserzuamplifizieren.

DieProduktederRT‐PCRlassensichanschließendklonierenund/oderelektrophoretischin

einemAgarosegelauftrennen.VerschiedengroßeDNA‐Fragmentewandernunterschiedlich

schnellimGel.DurcheinenFluoreszenzfarbstoff(meistEthidiumbromid)könnendieFragmente

imUV‐Lichtsichtbargemachtunddokumentiertwerden.

DieheuteeingesetztenReversenTranskriptasensindveränderteEnzymvariantenaus

unterschiedlichenRetroviren,wieder„MoloneyMurineLeukemiaVirus“(M‐MLVRT)oder

„AvianMyeloblastosisVirus“(AMVRT).DieverschiedenenVariantendesEnzymssindjenach

Herstellerderartmodifiziertworden,dasssiehöhereSpezifitätoderbessereErträgegenerieren

können,beispielsweisewirddieimEnzymintrinsischvorkommendeRNaseH‐Aktivität

deletiert.

WieandereDNA‐PolymerasenbenötigtaucheineReverseTranskriptaseeinkurzesDNA‐Stück,

einensogenanntenPrimer,zurInitiationderDNA‐Synthese.Oftmalswirdhiereinsogenannter

Oligo‐d(T)‐Primerverwendet,alsomehrereThymin‐Basen,welchekomplementärzumPoly(A)‐

Schwanzam3'‐EndedermRNAsind.ErstimzweitenSchrittderRT‐PCRwerdendannGen‐

spezifischePrimereingesetzt.BeieinermodifiziertenVariante,die"One­StepRT­PCR",werden

stattdessendirektGen‐spezifischePrimerverwendetundbeideReaktionenwerden

hintereinanderimselbenGefäßausgeführt.EineweitereVariantederRT‐PCRistdieRACE­PCR.

DieAbkürzungRT‐PCRbezeichnetgelegentlichauchdieRealtimequantitativePCR,waszu

Verwechslungenführenkann.DiesesolltemitRTQ‐PCRabgekürztwerden.

DasErgebnis

DaeinecDNAzurursprünglichenmRNAkomplementärist,kannausdieseranhanddesgenetischenCodesauchdieAminosäurensequenzeinesProteinsabgeleitetwerden,fürwelchesdiesemRNAkodiert.DaeinemRNAinEukaryotennachihrerTranskriptionbereitsmodifiziertundgespleißtwurde,istsieimGegensatzzumGenauchIntron‐frei.DarüberhinausermöglichtdiesecDNAauchInformationendarüberzuerhalten,obdasdazugehörigeGeninverschiedenenIsoformenexprimiertwird,d.h.diemRNAalternativgespleißtwird.ÜberRT‐PCRlässtsichalsogezieltGenexpressionnachweisen.GenutztwirddieRT‐PCRauchbeiderDiagnosevonRNA‐VirenimBlutserum,wieHIVundinjüngererZeithäufigauchimZusammenhangmitInfluenzaA/H5N1.

6. ProteinexpressionSchematischerAblauf

1. DNA‐Sequenzsuchen; Genbank2. mRNASequenzbestimmen; Intron‐ExonStrukturauflösenundRNASequenz

notierenodercdsistschonohneIntronsExons3. ProteinsequenzundCodonUsage; passtdieCodonUsagezumeinem

Expressionssystem?Glykosilierung?4. ExpressionssystemundVektor; WelcheTags?WelcheSelektion?WieKlonieren?N‐

oder‐CTerminal?Fusion?5. Genbesorgen; mRNAisolierenundRTPCRodersynthetischherstellenlassen6. TransformationinE.coli; VermehrungderKonstrukteundAufreinigung7. Transformation/TransfektioninExpressionsstamm8. SmallscaleExpressionAufreinigungKontrolle9. LargescaleExpression

7. RekombinantesProtein(Kompakt)

RekombinanthergestellteProteinesindEiweiße,diemitHilfevongentechnischveränderten

(Mikro‐)Organismenhergestelltwerden.SeitdemBeginnderEntwicklungderGentechnik

wurdeeineVielzahlbakteriellerOrganismen,PilzenoderSäugetierzellenfürdieHerstellungvon

Fremdproteinen,insbesonderevonpharmazeutischenProteinen,etwavonInsulinoder

Impfstoffengenutzt.BevorzugteSystemefüreinederartigeProduktionsinddasDarmbakterium

Escherichiacoli,verschiedeneHefeartenundSäugetierzellen–dabeimeistensHamsterzellen.

EinfürdiegentechnischeProduktionvonProteinengenutztesSystemsollteverschiedene

Voraussetzungenerfüllen:EssollteinderLagesein,schnellingroßenFermenternmöglichst

kostengünstigzuwachsen.EssolltediegewünschtenSubstanzeneffizientproduzieren,wenn

möglich,insMediumausschleusen(sezernieren).EssollteinsbesonderefürdieProduktionvon

PharmazeutikahohenSicherheitsanforderungengenügenunddieProteineineiner

authentischen,möglichst„menschlichen“Formproduzieren.

AmeinfachstenwirddieInformationfürdasProteinineinenVektorkloniert,einPlasmid,das

dannindenWirtsorganismus,transformiertodertransfiziertwird.

ImFolgendenwerdendiegrundlegendenVorgehensweisenderProteinüberexpressionanhand

desBeispiels„Insulin“beschrieben:

lonierungundTransformation

Promotor‐BereicheinestypischenÜberexpressionsvektors

UmeinBakteriumdazuzubewegen,dasmenschlicheProteinInsulinherzustellen,mussman

ihmdieBauanleitungdafürzurVerfügungstellen.Diesgeschieht,indemmandasInsulin‐Genin

dieBakterienzelleeinschleust.MitdemGenalleinkanndieZelleabernichtsanfangen.Deshalb

bringtmandasInsulin‐GenvorherineinenVektor,derallewichtigenInformationenenthält,

damitdasGenabgelesenwerdenkann.ErwirdvondenBakterienerkannt,vermehrtundbei

einerZellteilungandieTochterzellenweitergegeben.ImArtikelKlonierungistbeschrieben,wie

einsolcherVektormitGen‐Inserthergestelltwird.

DerVektorenthältnebendemInsulin‐GeneinenPromotor(imBildrot),welcheralsStartpunkt

fürdieAblesungdesGens(Transkription)fungiert.MeististderPromotorinduzierbar;erwird

alsoerstdannaktiv,wenneinebestimmteSubstanzzugegebenwird.Diesermöglichtdie

ProduktiondesProteinszubestimmtenZeitpunktenoderabeinerbestimmtenZelldichtesowie

dieProduktionvonProteinen,diefürdieBakterieneigentlichtoxischsind.

TransformationundSelektion

AmAnfangoderamEndedesInsulin‐Genbefindetsicheinsogenanntertag(engl.für

"Markierung").DiesertagdientderspäterenIsolierungundReinigungdesProteins.Tags

bestehenauskleinenPeptidenoderbestimmtenProteinen,diemitdemeigentlichenProtein

fusioniertsind.NachderAufreinigungkanndertagabgespaltenoder–wennesdieFunktion

nichtbeeinträchtigt–amexprimiertenProteinbelassenwerden.

DerVektormitInsulin‐GenwirdinE.coli‐Bakterienzelleneingebracht(Transformation).EinAntibiotikum‐ResistenzgenaufdemVektorsorgtdafür,dassnurdieZellenimAntibiotikum‐haltigenNährmediumwachsen,diedenVektorauchwirklichaufgenommenhaben(Selektion).

EineKoloniewirdbenutzt,umeinegrößereMengeNährmediumanzuimpfen.Auchdieses

MediumenthältAntibiotikum.DieresistentenZellenvermehrensichimNährmediumbei37°C

durchZweiteilung.SobaldeinebestimmteBakterienzahlproMilliliterMedium(OD~0.9)

erreichtist,wirdIPTG(Isopropyl‐β‐D‐thiogalactopyranosid)zugegeben.DieserStoffdientals

Induktor(sieheauch:Lactose‐Operon):DasInsulin‐Genwirddaraufhinabgelesen

(Transkription),dasProteinwirdhergestellt(Translation).

NachdemdieZelleneinigeStundenlangZeitfürdieProteinsynthesehattenundInsulinim

Zellinnerenangereicherthaben,werdendieBakterien"geerntet".Dazuüberführtmandas

NährmediuminZentrifugationsgefäßeundzentrifugiertbeigeringerDrehzahl.DieZellensetzen

sichdabeiamBodendesRöhrchensabundbildeneinenKlumpen(Pellet).DasNährmedium

kannabgegossenwerden.

VonderKoloniezumLysat

DasichdasüberexprimierteInsulinnochindenBakterienzellenbefindet,müssendieseerst

aufgeschlossenwerden(Zellaufschluss).EineweitverbreiteteMethodeistdieUltraschall‐

Behandlung,diedieZellmembranenbeschädigtunddazuführt,dassdieBakteriensichauflösen.

DaindiesemGemischnunauchProteinasenvorhandensind,dienormalerweiseinabgetrennten

BereichenderZellenarbeitenunddefekteProteineabbauen,istesentscheidend,dass

Proteinase‐Hemmstoffe(Proteinase‐Inhibitoren)zugegebenwerden.DieseHemmstoffe

blockierendieproteinabbauendeWirkungderProteinasen.AndernfallswürdedasInsulin

angegriffenundbeschädigtwerden.

ZurEntfernungvonZelltrümmern,nichtaufgeschlossenenZellenundgrößerenZellorganellen

alsPelletwirdderAufschlusserneutzentrifugiert.DasklareLysatkannnundem

entscheidendenReinigungsschrittunterzogenwerden:derAffinitätschromatographie.

ImeigentlichenSchrittderGewinnungdesüberexprimiertenInsulinsspieltderAffinitäts‐Tag

einewichtigeRolle.DiesesAnhängselbestehtauskleinenPeptiden(häufigHexa‐Histidin:His‐

Tag)odereinemProtein(Maltose‐bindendesProtein(MBP),Glutathionyl‐S‐Transferase(GST))

undfungiertanschaulichalseineÖse,anderdasInsulinausderLösungherausgefischtwerden

kann.OhnedieseReinigungshilfewäreessehraufwändig,dasZielproteinausderVielzahl

unterschiedlicherProteineinderZellaufschlusslösungherauszufiltern.

PraktischbenutztmanfürdieAbtrennungdesgewünschtenProteinseineSäule,alsoeineRöhre,

diemiteinerGelmatrixgefülltist.AndieseMatrixsindMolekülegebunden,diespezifischwie

einSchlüsselindasSchloss,alsodenReinigungs‐Tag,passen(Ni2+‐NTAfürHis‐tag;Maltosefür

MBP;GlutathionfürGST).LässtmannundasZelllysatdurchdieSäulefließen,sobindetder

Affinitäts‐TagmitsamtdemInsulinandieMatrix,währendalleanderenProteineunbeeinflusst

amSäulenendewiederzumVorscheinkommen.UmdennochanhaftendeProteinezuentfernen,

spültmandieSäulemiteinerWaschlösung.DerfestenBindungdesTagstutdaskeinen

Abbruch.

UmdasgebundeneInsulinnunwiedervonderSäuleabzulösen(Elution),bedientmansicheinesTricks:manlässteinenElutionspufferdurchdieSäulelaufen,derdenBindungspartnerdesAffinitäts‐TagsinsehrhoherKonzentrationenthält.Dadurchwirderreicht,dassderAffinitäts‐TagbevorzugteinenderfreiinLösungvorkommendenBindungspartnerwählt,undsichsomitvonderSäulenmatrixlöst.

DieAffinitätschromatografieisteinchromatografischesTrennverfahrenzurIsolationeines

AnalytenauseinerLösungverschiedenerStoffe.Voraussetzungist,dasseingeeigneterLigand

(Bindungspartner)zudeminteressierendenAnalyten(Protein)zurVerfügungsteht.Sieisteine

derleistungsfähigstenTrennmethoden.DieverwendetenSäulensindjedochrelativkostspielig,

sodassdasVerfahrennurinbesonderenFällenbeziehungsweiseimkleinenMaßstab

(Labormaßstab)zumEinsatzkommt.

DieTrennungerfolgtmeistinSäulen,kannaberauchimBatchverfahrenvorgenommenwerden.

DerReinigungseffektdieserMethodebasiertentwederaufderspezifischenErkennungeines

ProteinsdurcheinenAntikörperoderbeiEnzymenaufAusnutzungderspezifischenAffinität

einesEnzymszueinemInhibitor,SubstratoderCofaktor.

DiestationärePhase(ofteinGel,z.B.ausquervernetzterAgarose(HandelsnameSepharose®)

wirdmiteinemgeeignetenLiganden(z.B.Antikörper)gekoppelt,derspezifischdenzu

reinigendenAnalytenbindet.HierbeiistinderPraxisdaraufzuachten,dassdieAffinitätgegen

denAnalytennichtzuhochist,dadieElutiondadurcherschwertwird.Umgekehrtkannzur

präparativenReinigungvonAntikörpern(Immunglobulinen)aucheinestationärePhasemit

einemProtein(meistProteinA,GoderL)verwendetwerden,dasbestimmte

Immunglobulinklassenbindet.

Durchführung

DasGemischwirdaufdieSäuleaufgegebenunddieinteressierendeSubstanzwirddurchdie

Ligandengebunden.AlleanderenStoffeverlassendieSäuleschnellwieder,dasiemitdem

Ligandennichtstarkwechselwirken.NacheinemWaschschritt,umunspezifischgebundene

Verunreinigungenzuentfernen,wirdderamLigandengebundeneAnalytdurchVeränderung

derBedingungen(Pufferzusammensetzung)dazugebracht,ebenfallsdieSäulezuverlassen

(Elution).AlsElutionsmittelwirdofteinsaurerPufferodereinLösungsmittel/Wasser‐Gemisch

verwendet.AlternativkönnenauchkompetitivzumZielproteinagierendeSubstanzenoderein

ÜberschussanfreienLigandenzugesetztwerden.DasEluatenthältdengereinigtenund

angereichertenAnalyten.

Beispiele

BeispielefürLigandenzurProteinaufreinigung:

Ligand Zielprotein

Antigen,

ProteinA,ProteinGoderProteinLAntikörper

Substrat,Kofaktor Enzym

Ligand Rezeptor

Lectin Glykoprotein

Nukleinsäure NukleinsäurebindendesProtein

Streptavidin,AvidinBiotin,

ProteinmitStreptavidin‐peptid

Metallionenchelat

wieNi2+‐NTAProteinmitPoly‐histidin‐peptid

FertigesFusionsproteinalsBeispiel­AngabenvonSilvanoThefusionproteinincludesanenhancedGFP(eGFP)becausethisvarianthasagreatermolarextinctioncoefficientthanthewild‐typeandtherebyabettersensitivityduring

theflorescencemeasurement.Theexcitationofthisvariantis488nmandtheemission512nm[KTI‐Project,ThomaR.].TheeGFPisoccupiedwithaHis8‐tagforrelievedpurificationofthefusionproteinwithNi‐NTA(nickel‐nitrilotriaceticacid)affinitychromatography.BetweenthehERG(1‐870)andtheeGFPaTEV(tobaccoeachvirus)proteasecleavagesitewasinsertedwiththeproteinsequenceENLYFQG.Thus,theGFPpartcanberemovedafterthepurificationandthebarehERG(1‐870)proteinwithjustashortforeignaminoacidsequencecanbeanalysed.ThisforeignsequenceattheC‐terminusisGGGRSENLYFQ.TheschemeofthisfusionproteinisshowninFigure3.

Fig.3:Schemeofthefusionprotein.ThemainpartsofitarethehERG(1‐870)sequenceandtheenhancedgreenfluorescentprotein(eGFP).ForrelievedpurificationaHis8‐tagisaddedaswellasaTEVproteasecleavagesitetoseparatethefusionprotein.NandCstandsforN‐terminusandC‐terminus.

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5.5 The Cloning Strategy

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