MOLEKÜLER GENETİK VE

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

Prof.Dr.Öztürk ÖZDEMİR

2005-2006

The Tools of Molecular The Tools of Molecular BiologyBiology

The Tools of Molecular The Tools of Molecular BiologyBiology

REKOMBİNASYON

Rekombinasyon: Yenibileşim - yenidenoluşum. Bir molekülün-hücrenin, atasal “wild type” yada ilkin(orijinal) yapısından farklılık göstermesi durumudur.

I - In vivo rekombinasyon

II- In vitro rekombinasyon

Klon (Clone);

Bir tek atasal diploid hücreden mitoz bölünme yoluyla

birden fazla hücre eldesine denir.

Rekombinant DNA teknolojisi ile sentezlenen

identik DNA/gen kopyalarına denir. ”Gene cloning”

Genetik Klonlamada TarihçeGelişme Araştırıcı Yıl

Deniz hayvanlarında döllenme O.Hertwig 1875

İlk kez anne rahmi dışında döllenme L.Schenk 1878

Tüp ortamında insan yumurta hücresi döllendi MF Menkin 1944

Dondurulmuş sperm ile inek yumurtası döllendi 1952

Deney tüpünde döllenen bir memeli yavru doğdu 1959

Dondurulmuş embriyodan yavru fareler elde edildi 1972

Louise Brown isimli bebek deney tüpünde döllendi anne rahmine yerleştirilerek sağlıklı doğum yaptırıldı 1978

Avusturalyada donmuş embriyodan sağlıklı bir kız çocuğu elde edildi 1984

Genetik Klonlamada TarihçeGelişme Yıl

Kiralık anne Mary Beth bebeğini vermeyi redetti. 1986

Embriyo hücrelerinin çoğaltılmasıyla çok sayıda kuzu elde edildi 1987

İnsan embriyosu klonlandı çok tepki aldı J.Hall 1993

Dolly klonlandı I.Wilmut 1997 Fransada bir dananın 63 klonu elde edildi 1999 Totipotent stem hücrelerinden deneysel organogenezis 2000 Farede gen klonlama yöntemiyle insan kulağı gelişimi sağlandı 2001 Avusturalyada bir at klonlama ile Coada eşek doğurdu 2002

Amerikada ex vivo yapay rahim geliştirildi 2002

Klonlama Tipleri

DNA /Gen düzeyinde klonlama

Hücre düzeyinde klonlama

Organizma /çekirdek düzeyinde klonlama

Başarılı Klonlama Yapabilmek İçin Gen;

Bağımsız olarak replike olabilmeli

Konak hücreye kolaylıkla transfer edilebilmeli

Seleksiyona olanak tanımalı

Memeli Hücrelerine Gen Transfer Teknikleri

Microinjection*** DAAE-Dextran Mediated Electroporation Lipofection Calcium Phosphate*** Protoplast Fusion Polyprene Viral infection*** (Lentivirus, Retrovirus, Adenovirus)

*: Yaygın kullanılan yöntemler

Genetik Klonlamada Kullanılan Vektörler

Plazmid 5-10 kb

Bakteriyofaj 20 kb

Cosmid 50 kb

YAC 100 kb

Baculovirus 150 kb

BAC 200 kb

PAC 250-300 kb

Lentivirus ** ~ 100-200 kb

The construction of Mammalian Transfection Vector For Expression of Cytosine- 5 Specific DNA Methyltransferase

Gene M.Msp1 In Cultured CellsOzturk OZDEMIR

Received 01.05.1997

STOPLAZMİK KALITIM(YUMURTA HÜCRESİ)

• Regülatör - modülatör proteinler

• Yumurta polarity genler

• Segmentasyondan sorumlu genler (25 adet)• Yumurta hücresindeAnterioposterior gradiyent farkı

• Remodelling faktörler ;• zigotik effect

• integrinler

• transkripsiyon faktörleri

• pair-rule genler

• segment polarity genler

• Homeodomeik, Hox (Homeobox) fetusa ait genler

Nükleer Transplantasyon

• Wilmut ve arkadaşları donör hücre olarak 6 yaşında sağlıklı bir koyunun meme epitel hücresi ve resipient hücre olarak ise aynı koyunun metafaz II evresinde bekletilmiş enucleated yumurta hücresi kullandılar. Klonlama sonrası elde edilen ve annesiyle %100 aynı genotip ve fenotipte olan sağlıklı kuzuya DOLLY adını verdiler.

DOLLY Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMİR

Nükleer Klonlamanın Önemi Yumurta hücresinin embriyogeneziste spermden

farklı artı(+) öneminin olduğu,

Ökaryotik hücrenin G0 evresinde totipotent kromatin organizasyonu kazandıği,

Metafaz II evresinde yumurta hücresinin klonlama için en uygun stage olduğu,

Memelilerde eşeysiz üremenin mümkün olduğu,

Bir gen yerine çekirdeğin tamamının transplante olabileceği gösterildi

Klonlama Sonrasında; Unipotent hücrenin totipotent hücreye dönüştürülmesi,

Sinir hücrelerinin rejenerasyonu,

Telomerlerde ” end replicatin problem”giderilerek, yaşlanmanın geciktirilmesi,

Stem hücrelerinden spesifik doku eldesi,

Epigenetik modifikasyonu ile kanser tedavisine yeni bir yaklaşım,

“Ex vivo gene replacement” ile genetik tedavi ve

İnsan genom projesi önemli bir ivme kazanmıştır.

Goals of DNA TechnologyGoals of DNA Technology

1.1. Isolation of a particular gene or sequenceIsolation of a particular gene or sequence

2.2. Production of large quantities of a gene productProduction of large quantities of a gene product1.1. Protein or RNAProtein or RNA

3.3. Increased production efficiency for Increased production efficiency for commercially made enzymes and drugscommercially made enzymes and drugs

4.4. Modification/improvement of existing organismsModification/improvement of existing organisms

5.5. Correction of genetic defectsCorrection of genetic defects