moderne lc/lc-ms-verfahren zur online-analyse ... · hplc-rp-system ˜ polar embedded rp ˜ rp mit...
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Fachhochschule Köln, Institut für Anlagen- und Verfahrenstechnik
Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt
EB312
PB116
gefilterte Luft
FC
ABLUFT
B300
P310
M300
IL300
PB313
TIB315
XTICB311
PB316
LIAB314
B200
ELEKTRISCHEBEGLEITHEIZUNG
Stickstoff
VON VORLAGE-BEHÄLTER
F100
B100
P300
M100
IL100
PB113
TICB115
XTICB111
LIAB114
B110
FIAB117
FIAB317
Base
P120
P130
P140
P210
Base
P100
P110
Säure
P200
B400
P150
P220
EB112
FCB210
Säure
ZUR HPLCH10
H20
ZUR HPLC
W100ZUM SAMMELBEHÄLTER
FCB310
XIB118
XIB118
XIB119
V101 V301
V302
-
Moderne LC/LCModerne LC/LC--MSMS--VerfahrenVerfahrenzur Onlinezur Online--AnalyseAnalyse
biotechnologischer Prozessebiotechnologischer Prozesse
Astrid RehorekAstrid Rehorek
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Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt
InhalteInhalte
1. ProzessanalysentechnikProzessanalysentechnik inin derder BiotechnologieBiotechnologie
2. OnlineOnline--EinzelEinzel-- undund MehrkomponentenanalyseMehrkomponentenanalyse
3.3. OnlineOnline--LC/LCLC/LC--MSMS--BeispieleBeispiele
-- OnlineOnline--Kontrolle eines KläranlagenzulaufsKontrolle eines Kläranlagenzulaufs
-- OnlineOnline--Monitoring in Monitoring in einem anaerobeinem anaerob//aeroben Bioreaktor zur aeroben Bioreaktor zur
ErmittlungErmittlung vonvon optimalenoptimalen ProzessführungsparameternProzessführungsparametern
-- MultiMulti--AnalyserAnalyser BioreaktorsystemBioreaktorsystem
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BioprozessanalysenmesstechnikBioprozessanalysenmesstechnik
UV-VIS Spektrometer (UV-VIS)Insitu- und Online-Monitoring in derflüssigen Phase
Fluoreszens-Spektroskopie Zellkonzentrationsmessung,Zellmetabolismus
Nuklear-Magnetische-Resonaz-Spektroskopie(NMR)
Zellmetabolismus
Fourier-Transformations-Nahinfrarot-Spektrometer(FT IR)
Insitu-Monitoring in komplexen Matrizes,z.B. Fettsäuren in Bioreaktoren
Nah-Infrarot-Spektrometer(NIR)
Gasanalyse
Fourier-Transformations-Mikrowellen-Spektrometer(FT MW)
Gasanalyse (Ozon)
Analysator Einsatz
Biosensoren (Kombination eines Mikroorganismus,Antikörpers, Enzyms, etc. mit einem Messumformer)
In-Situ-Einsatz zellfreier Lösungen,“Realzeit”-signale bei hoherSelektivität
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OnlineOnline messbaremessbare abwasserrelevanteabwasserrelevante SummenparameterSummenparameter
pH-Wert Potentiometrische Methode
TOC/VOC Katalytische Verbrennung mit IR-Detektion (mit VOC-Kanal), Verdünnungund Filterung; UV-VIS
TN Verbrennungs-/Chemilumineszenz-Methode
CSB Oxidierung mit Ozon - Sensorische Sauerstoffmessung in der Gasphase,Elektrochemisch, Spektroskopisch
BSB Erfassung als Kurzzeit-BSB (Respirationsrate)
DOC Reinstwasser DOC (UV-Zersetzung und Leitfähigkeitsmessung)
Messaufgabe Online-Methode
UV-VIS (inline) Xenon Blitzlampe mit DAD, Fiberoptische Spektrometer
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OnlineOnline--AnalytikAnalytik biotechnologischerbiotechnologischer ProzesseProzesse
MultikomponentenanalyseMultikomponentenanalyseSummenparameterSummenparameter
EinzelstoffanalyseEinzelstoffanalyse
ZielZiel:: VordefinierteVordefinierte ProduktqualitätProduktqualität
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ProzessProzess--FlFlüüssigchromatographenssigchromatographen::ModulareModulare HPLCHPLC--BetriebsmessplBetriebsmesspläätzetze oderoder KomplettKomplett--AnalysatorenAnalysatoren
Reaktor
Pumpe
Injektionsventil
HPLC-Pumpe
Eluent
Säule
Detektor
He
Steuerrechner
KommerziellerProzess-LC
Chromatograph
Reaktor
Leitsystem
Regelgröße
Messung
Prozessführung
Stellgröße
Probenahmefilter
Degaser
Ofen
Leitsystem
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KommerzielleKommerzielle LCLC--ProzesschromatographenProzesschromatographen
BayerTechnologyServices
BaychroMAT®
(GC, HPLC, GPC)VerschiedeneDetektoren
Bestimmung derMolmasse inPolymeranlagen,Prozesskontrolle,Nebenkomponentenim ppm-Bereich,Isomerenbestimmung
Dionex DX 800Prozesschromatograph(LC)
UV-, Leitfähigkeits-,und elektrochemischerDetektor
Spurenbest. in Reinstwasser,org. Säuren beiNylonherstellung,Nitrit/NitratKläranlage,Fermenter-Monitoring
Hersteller Bezeichnung Detektoren Anwendungsgebiete
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IonenchromatographischerIonenchromatographischer ProcessProcess--LCLC--AnalysatorAnalysator derder FirmaFirma DIONEXDIONEX
DXDX--800800
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ModulareModulare LC/LCLC/LC--MSMS ProzessanalysentechnikProzessanalysentechnik
AutomatisierteAutomatisierte,, kontinuierlichekontinuierliche OnlineOnline--ProbenahmetechnikenProbenahmetechniken
MikroMikro-- u.u. UltrafiltrationUltrafiltration
MembranextraktionMembranextraktion
Sedimentation/Sedimentation/PorenfiltrationPorenfiltration
AutomatisierteAutomatisierte SPE/ SPMESPE/ SPME
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EB312
PB116
gefilterte Luft
FC
ABLUFT
B300
P310
M300
IL300
PB313
TIB315
XTICB311
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B200
ELEKTRISCHEBEGLEITHEIZUNG
Stickstoff
VON VORLAGE-BEHÄLTER
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PB113
TICB115
XTICB111
LIAB114
B110
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Base
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Base
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Säure
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B400
P150
P220
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Säure
ZUR HPLCH10
H20
ZUR HPLC
W100ZUM SAMMELBEHÄLTER
FCB310
XIB118
XIB118
XIB119
V101 V301
V302
-
OnlineOnline--Kontrolle eines KläranlagenzulaufsKontrolle eines Kläranlagenzulaufs
Etablierung eines automatisierten
Online-Analysensystems,
das die Kläranlage und damit die Umwelt
vor Stoßbelastungen durch
plötzliche, hohe Stoffemissionen
von organischen Einzelkomponenten schützt.
Mit freundlicher Genehmigung der BASF, Dr. Kurz
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Konzeption der BASFKonzeption der BASF-- KläranlagenKläranlagen--OnlineOnline--Überwachung:Überwachung:
ARGUS und HYDRAARGUS und HYDRA
Wasser in Kläranlage OK
Probezeitversetzt
dosieren
GC-MS„ARGUS A“
EDV-Steuerung
AuswertungAlarmsignale
Umwelt-zentrale
Z 75
EDV-Steuerung
AuswertungAlarmsignale
HPLC„HYDRA“
Wasser in Sicherheitsbecken ALARM
GC-MS„ARGUS A“
FiltrationMischprobe
erstellen
bbALängs-
sammler
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Probenvorbereitung für ARGUS und HYDRA Probenvorbereitung für ARGUS und HYDRA
Sandfang Bandfilter Vorlage
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Prinzip von ARGUS / HYDRAPrinzip von ARGUS / HYDRA
ARGUS:• Prinzip: GC/MS-Analyse mit Wasserdirektinjektion• gaschromatographisch erfassbare Stoffe• Messzyklus ca. 40 min (effektiv 20 min; 2 Geräte)• 130 Stoffe kalibriert• Arbeitsbereich: 1-100 mg/L
HYDRA:• Prinzip: Ionenpaarchromatographie mit Dioden-Array-
und Fluoreszenz-Detektion• polare und höhermolekulare Stoffe• Messzyklus: 20 min• ca. 45 Stoffe kalibriert• Arbeitsbereich: 0,1-20 mg/L (sehr stoffspezifisch)
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ARGUSARGUS
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HYDRAHYDRA
1 Probezufuhr
2 Durchflußzelle
3 Injektionsspritze
4 Testlösungen
5 Injektionsventil
6 Laufmittel + Entgaser
7 Pumpe
8 Säulenofen
9 Dioden-Array-Detektor
10 Fluoreszenz-Detektor
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FerndiagnoseFerndiagnose--ToolsTools
a) Fern-Zugriff auf Chromatogramme und Reports über das Internet mit Bereitschaftsdienst-Laptop
b) Fernsteuerung der Geräte
c) Web-Cam zur visuellen Beurteilung von Fehlfunktionen und Anleitung bei Reparaturen
d) Fehlermeldung nach Auswertung der Qualitätskriterien werdenals SMS auf Bereitschaftsdienst-Handy übertragen
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SummarySummary: ARGUS und HYDRA: ARGUS und HYDRA
ARGUS und HYDRA überwachen kontinuierlich den Zulauf der Kläranlage auf ca. 200 organische Einzelstoffeca. 200 organische Einzelstoffe.
Systeme laufen seit mehreren Jahre mit nahezu100%-iger VerfügbarkeitARGUS: seit 1992, ca. 350.000 AnalysenHYDRA: seit 2001, ca. 100.000 Analysen
Zentrale Überwachung ist billiger als Einzelüberwachung in den Betrieben.
Bei mehreren Einleitern werden kumulative Effekte berücksichtigt.
Systeme werden auch zum Abwassermanagement benutzt.
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EB312
PB116
gefilterte Luft
FC
ABLUFT
B300
P310
M300
IL300
PB313
TIB315
XTICB311
PB316
LIAB314
B200
ELEKTRISCHEBEGLEITHEIZUNG
Stickstoff
VON VORLAGE-BEHÄLTER
F100
B100
P300
M100
IL100
PB113
TICB115
XTICB111
LIAB114
B110
FIAB117
FIAB317
Base
P120
P130
P140
P210
Base
P100
P110
Säure
P200
B400
P150
P220
EB112
FCB210
Säure
ZUR HPLCH10
H20
ZUR HPLC
W100ZUM SAMMELBEHÄLTER
FCB310
XIB118
XIB118
XIB119
V101 V301
V302
-
Unerwünschter Farbe auf der Spur Unerwünschter Farbe auf der Spur ––
LCLC--MSMS--MonitoringMonitoring zur Prozessoptimierung zur Prozessoptimierung der biologischen Behandlung von der biologischen Behandlung von
FarbabwasserkonzentratenFarbabwasserkonzentraten
GefGeföördertrdert duchduch
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Entwicklung von anaerob/aeroben BioEntwicklung von anaerob/aeroben Bio--MembranMembran--ReaktorenReaktorenfür die Behandlung von textilen für die Behandlung von textilen AzofarbstoffAzofarbstoff--AbwasserkonzentratenAbwasserkonzentraten
1998-1999
3-Liter anaerob/aerobe BMR
(ungekoppelt)
Offline-UV/VIS Spektroskopie
Offline pH -Messung
2000-2001
10-Liter gekoppeltes
anaerob/aerobes BMR-System
Online-UF-LC-DAD-Monitoring
Online-RI-Monitoring
Offline pH-&
Redoxmessung
2002-2005
40-Liter anaerob/aerob BMR-System
Automat. Messdatenerfassung
+Steuerung
Online-MF-HPLC-DAD-Spektroskopie
Prof. Dr. A. Rehorek
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Chromatographische Auftrennung von Realproben
FeedFeed
Retentionszeit
We
lle
nlä
ng
e
AnaeroberAnaeroberReaktorReaktor
FarbloseFarblose
IntermediateIntermediate
FarbigeFarbige IntermediateIntermediate
AeroberAeroberReaktorReaktor
HydrolysatHydrolysat
RückverfärbungsprodukteRückverfärbungsprodukte
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SetSet--up und Methodenentwicklung des massenspektroskopischen Verfahrenup und Methodenentwicklung des massenspektroskopischen Verfahrens:s:OnlineOnline--MFMF--HPLCHPLC--DADDAD--ICIC--ESIESI--MS²MS²-- AnalysenverfahrenAnalysenverfahren
AB Qtrap Hybrid-MSESI - negativ Modus
Triple-Quadrupole-Modus:
� Selektive und empfindliche
Quantifizierung mit MRM
IonTrap-Modus:
� Enhanced (E) MS-Scans:
EMS, EPI, EMC, MS3 für
die Strukturanalyse
Kontinuierliche Probenahme mitInline-Mikrofiltrationssonde
75m 1/16“ PEEKI.D. 0,5mm
HPLC-RP-System� polar embedded RP� RP mit TBA+-Ionenpaar
Kationen-Suppressor� Suppression von TBA+
� Suppression von Kationen
DAD
� Monitoring farbigerVerbindungen
� MatrixeffektfreieQuantifizierung
1. Etage
Labor
Textilabwasser
BehandeltesBehandeltes
AbwasserAbwasser
Zweistufiger anaerob/aerober Bioreaktor (2 x 40L)
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StrukturaufklärungStrukturaufklärung vonvon AzofarbstoffintermediatenAzofarbstoffintermediatenmittelsmittels OnlineOnline--LCLC--MS²MS² ausaus RealmatrixRealmatrix
Charakterisierung von primären und sekundären Verbindungen hydrolysierter
Reaktiver Farbstoffe im FeedFeed (Reaktorzulauf aus Realmatrixabwasser)
Identifizierung von primären Abbauprodukten der anaeroben und aeroben
biologischen Behandlung mittels Online-LC-MS2 im KlärschlammKlärschlamm
Strukturaufklärung durch Interpretation von Fragmentierungsmustern
erzeugt aus negativen und positiven Ionen
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Identifizierung von Farbabbau-Intermediaten aus Realmatrix durch Online-LC-MS
Beispiel:Beispiel:
Unbekannte Verbindung, Unbekannte Verbindung,
die im UVdie im UV--Bereich absorbiertBereich absorbiert
TIC of -EMS: from Sample 1 (040901_BMR_AE_EMS_002) of 040903_BM... Max. 4.7e8 cps.
2 4 6 8 10 12Time, min
0.0
5.0e7
1.0e8
1.5e8
2.0e8
2.5e8
3.0e8
3.5e8
4.0e8
4.5e8
7.2
8.9 9.4
9.710.2
7.8
8.1 10.7
11.311.6 12.4
6.5
3.70.61.3 5.2
MassenspektrumMassenspektrum
TotalionenchromatogrammTotalionenchromatogramm
ESI(-)-MS-Scan 50-1700 amu
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XIC of -EMS: 307.9 to 308.4 amu from Sample 1 (040901_BMR_AN_EMS_... Max. 1.4e6 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min
0.0
1.0e5
2.0e5
3.0e5
4.0e5
5.0e5
6.0e5
7.0e5
8.0e5
9.0e5
1.0e6
1.1e6
1.2e6
1.3e6
1.4e6
6.2
9.8 10.23.16.1
-EMS: 6.335 to 6.568 min from Sample 1 (040901_BMR_AE_EMS_002) of... Max. 2.7e6cps.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z, amu
2.0e5
4.0e5
6.0e5
8.0e5
1.0e6
1.2e6
1.4e6
1.6e6
1.8e6
2.0e6
2.2e6
2.4e6
2.6e6
137.2
308.2
264.1
87.1
80.0182.3
97.1
81.0212.3
67.2529.2171.1 225.2278.2 617.3187.3 336.4113.0 770.5663.2397.2 858.5 972.0955.1
Extrahiertes IonenExtrahiertes Ionen--
chromatogrammchromatogramm derder
MassenspurMassenspur
m/zm/z 308308
MassenspektrumMassenspektrum enthältenthält
einen besonders einen besonders
charakteristischencharakteristischen
PeakPeak
Aufnahme einesAufnahme eines
ProduktProdukt-- IonenIonen--
Spektrums der Masse Spektrums der Masse
m/zm/z 308308
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-EPI (308.00) CE (-35): Exp 1, 5.114min from Sample 2 (040504_BMR_A... Max. 3.9e5 cps.
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400m/z, amu
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%125.0
308.3
156.195.0
107.080.0
94.2 170.274.468.8 123.2 151.2 182.2 310.7
NH-SHO O
C6H6NO2S-
Mol. Wt.: 156.18
-26
C10H14NO6S2-
Mol. Wt.: 308.35
NH-SO
O
-126
C8H8NO2S-
Mol. Wt.: 182.22
NH-SO
O-138
C7H8NO2S-
Mol. Wt.: 170.21
OH
C2H5O4S-
Mol. Wt.: 125.12
-183SO3-
C2H3O3S-
Mol. Wt.: 107.11
-18-O3S
NH2
S
O
O
O
SO3-
[M-H]-
ProductProduct ionion chromatogramchromatogram
Identifizierung eines Identifizierung eines IntermediatsIntermediats aus Realmatrix durch Onlineaus Realmatrix durch Online--LCLC--MSMS
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InformationInformation DependentDependent AquisitionAquisition -- IDAIDA
Total Ionen Chromatogram
MS-Scan
m/z, das durch Signalintensität
ein Produkt-Ionen-Scan auslöst
MS-Spektrum
von m/z 373.1
Massenspur von
m/z 373.1
Liste von Ionen
mit m/z,
Retentionszeit
und Kollisions-
energie von
denen
automatisch
ein Produkt-
Ionen-Scan
aufgenommen
wurde.
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HochselektivesHochselektives MonitoringMonitoring vonvon IntermediatenIntermediaten im MRMim MRM--ModusModus
XIC of -MRM (26 pairs): 237.9/80.1amu from Sample 1 (040901_BMR_A... Max. 3380.0 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min
0.0
5.0e4
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
3.7e5
7.6 9.1 10.08.7 10.48.1 11.2 12.35.1 7.45.7 6.00.0
MRM-Scan (50ms)
26 Transienten
XIC of -MRM (26 pairs): 307.9/124.9 amu from Sample 1 (040901_BMR_A... Max. 3.7e5 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9Time, min
0.0
5.0e4
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
3.7e56.1
S/N = 476.3
Peak Int.(Subt.) = 372157.8
! !-Noise-
m/z 308
TIC of -EMS: from Sample 1 (040901_BMR_AE_EMS_002) of 040903_BM... Max. 4.7e8 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min
0.0
5.0e7
1.0e8
1.5e8
2.0e8
2.5e8
3.0e8
3.5e8
4.0e8
4.5e8
7.2
8.99.4
9.7 10.213.6
7.8
8.1 10.7
11.312.4
14.16.5
3.70.61.3 5.2
MS-Scan
50-1000 amu
XIC of -EMS: 307.9 to 308.4 amu from Sample1 (040901_BMR_AE_EMS_... Max. 2.3e7 cps.
1 2 3 4 5 6 7 8 9Time, min
0.0
2.0e6
4.0e6
6.0e6
8.0e6
1.0e7
1.2e7
1.4e7
1.6e7
1.8e7
2.0e7
2.2e76.4
6.2
S/N = 146
Peak Int.(Subt.) = 22462077.8
! !-Noise-
3,3 mal besseres S/N
m/z 308
28
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Arbeitskreis Prof. Dr. Astrid Rehorek AK Prozessanalytik, 1. Kolloquium 17.-18.11.2005, MERCK Darmstadt
Methodenvalidierung mittels simulierter Farbabwässer in Salzlösung
c = µM, n=5 PB Metanilsäure RO107-H TAHNDSDP2 H-Säure RB-OH RB5-HMW 201 173 442 348 319 532 743
RT (min) 2.2 5.4 7.1 7.3 7.5 7.8 8.0Q1 (amu) 200 171.8 441 346.9 317.8 264.6 370.5
Q3 (amu) 107.9 80 186.1 187.1 237.8 80 370.6DP (V) -56 -51 -81 -61 -151 -31 -41
EP (V) -10 -10 -7 -9.5 -7.5 -8.5 -7CEP (V) -13.52 -12 -22 -18 -16 -14 -18
CE (V) -28 -34 -66 -44 -36 -48 -8
CXP (V) 0 0 -4 -4 -4 0 -4LOD (MRM) ***n.b. 0.59 0.001 0.001 0.010 0.003 0.012
LLOD (MRM) - 4.88 0.610 0.153 0.122 4.88 1.22ULOD (MRM) - 78.1 625 78 7.81 313 313
r² *,** - *0.9953 *0.9977 *0.9985 *0.9927 *0.9989 *0.9982RSD (%) - 7.8 6.1 7.0 6.8 6.2 4.7
Wellenlänge (nm) 270 n.b. n.b. 585 300 500 585
LOD (UVVIS) 1.33 - - 0.33 0.26 0.26 0.15LLOD (UVVIS) 9.77 - - 4.88 15.6 2.44 0.61
ULOD (UVVIS) 2500 - - 625 500 625 625r²*,** *0.9997 - - *0.9996 *0.9997 *0.9993 *0.9991
RSD (%) 3.1 - - 3.6 8 4.1 7.0
*quadratische Regression und x-1-Wichtung **lineare Regression und x-1-Wichtung ***n.b. - nicht be
Lineare Mess-
bereiche über
drei Dekaden,
hohe Linearität
MS
MS
DA
D
NWG (abs.) im
pg-Bereich
RSD <10%
29
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HO3S
SO3H
SO3HHO3S
HO3S
HO3S HO3S
HO3S
SO3H
SO3HS
S
OO
N
N
OH
NH2
N
NO O
O
O S
S
OO
N
N
OH
NH2
N
NOO
O
S
SOO
N
N
OH
NH2
N
NO O
S
SOO
N
N
OH
NH2
N
NO O
OH
RB5
[M-H]- m/z=902,8
RB5 (-H2SO4)
[M-H]- m/z=804,8
(2 Isomere)
RB5-V
[M-H]- m/z=706,7RB5-HV
[M-H]- m/z=724,8
(2 Isomere)
HO3S
HO3S
S
SOO
N
N
OH
NH2
N
NO O
OH
RB5-H
[M-H]- m/z=742,8
OH
SO3H
R SO
OOH
R
SO O
R
SOO
O
R SO
O
R = -NH2 oder -N=N-RB5-H
HO3S
HO3S SO
O
N
N
OH
NH2
N
N
OH NH2
SO
O
SOO
O RB5-H+DPBEm/z = 926
(2 Isomere)
HO3S
HO3SSO3H
S
S
OO
N
N
OH
NH2
N
NO O
OH
O
RB5 (-SO3)
[M-H]- m/z 822,8
R=NH2: DPBE m/z 383
Etherbildung
Hydrolyse in Farbstoffsynthese oder Färbprozess
Hydrolyse-
nebenreaktion
MSMS--Identifizierung von HauptIdentifizierung von Haupt-- und Nebenkomponenten und Nebenkomponenten imim FeedFeed (RB5)(RB5)
S
SO
O
N
N
O
NH2
N
HN
O
O
OH
SO3H
O3S-
SO3H
RB5-H+SO2[M-H]- m/z 806
Nebenreaktionsprodukt aus Synthese oder Hydrolyse
sowie weitere, noch nicht identifizierte Verbindungen (UNKs)
30
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IdentifizierungIdentifizierung farbigerfarbiger IntermediateIntermediate mit Onlinemit Online--LCLC--DADDAD--MSMSMSMS
HO3S
SO3H SO3HHO3S HO3S
HO3S
SO
O
NH2
N
NH2
OH
NNH NH2
NHHOOH NH
NH HO
RB5-H -PB
[M-H]- m/z=545,5
TAHNDSDP1
[M-H]- m/z=346,3
Strukturvorschlag
TAHNDSDP2
[M-H]- m/z=347,3
HO3S
HO3S
S
S
OO
N
N
OH
NH2
N
N
OO
OH
RB5-HV
[M-H]- m/z=724,8
HO3S
HO3S
S
S
OO
N
N
OH
NH2
N
N
O O
OH
RB5-H
[M-H]- m/z=742,8
OHHO3S
HO3S S
OO
NH2
N
OH
NH2
N
RB5-H -PB +DPBE
[M-H]- m/z=728,8
SO
O
NH2
O
SO3HHO3S
NH2NH2
HO HO
TAHNDSDP3
[M-H]- m/z=349,3
Strukturvorschlag
1. Stufe der anaeroben Reduktion
2.Stufe der anaerobenReduktion
Autoxidation
HO3S
HO3S
SO
O
NH2
N
NH2
OH
N OH
RB5-HV -PB
[M-H]- m/z=527,5 OH
SO3HHO3S
NH
OHO
TAHNDSDP4
[M-H]- m/z=348,3
Strukturvorschlag
S
SO O
N
N
NH2
OH
N
NO O
OH
O
O3S-
SO3H
S OO
NH2
RB5-H+PB
[M-H]- m/z=926
Neu identifizierte farbige Intermediate in Feed & Anaerob- & Aerob-Bioreaktor
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Blaues Abwasser nach der Anaerobstufe - Reste von blauem Farbstoff ?
200
240
280
320
360
400
440
480
520
560
600
640
680
720
760
nm
rel.
Inte
nsitä
t
m/z 346 TAHNDS DP1
m/z 347 TAHNDS DP2
m/z 545 RB5-H -PB
m/z 706 RB5-V
m/z 725 RB5-HV
m/z 742 RB5-H
m/z 804 RB5 -H2SO4
m/z 968 RB5
Verbindungen, die nachReduktion Rück-verfärbung verursachen
Teilreduzierter Farbstoff
Reaktivfarbstoff als: Teilhydrolysat
Vinyl-Form
Hydrolysat
Ester-Vinyl-Form
Esterfrom
Zunahme
der UV-Absorption
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Identifizierung nicht-farbiger Intermediate mit Online-LC-DAD-MSMS
H2N SO
OOH
NH2
SO O
NH2
SOO
O
p-Base (PB)
[M-H]- m/z=201,2
Di-p-Base-Ether (DPBE)
[M-H]- m/z=383,5
H2N SO
O
vinyl-p-Base (VPB)
[M-H]- m/z=183,2
NH SO
OOH
O
N-Acetamid-p-Base (NAPB)
[M-H]- m/z=243,2
NH
SO
O
S
OH
HO
OO
2-{4-[4-(2-Hydroxy-ethanesulfonyl)-phenyl-amino]-benzenesulfonyl}-ethanol
NH2S
OO
HO
SO3H
NH2S
OO
HO3S
NH2SO
O
OHO3S
2-(4-Amino-benzenesulfonyl)-ethanesulfonic acid
2-Amino-5-(2-hydroxy-ethanesulfonyl)-benzenesulfonic acid
2-[2-(4-Amino-benzenesulfonyl)-ethoxy]-ethanesulfonic acid
Abbauprodukte, die bei der Reduktion
von Reaktivfarbstoffen freigesetzt werden
Neu identifizierte Abbauprodukte,
die als Nebenkomponenten im
Feed vorliegen oder bei der
Reduktion von
Farbstoffnebenkomponenten
freigesetzt werden
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Stoffspezifische Anteile an spektraler Extinktion im VIS-Bereich
XWC of DAD Spectral Data: 585.0 nm from Sample 3 (040901_BMR_AE... Max. 151.5 mAU.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
15010.1
7.7
9.3
13.6 14.08.9
12.9
XWC of DADSpectral Data: 585.0 nmfrom Sample3 (040901_BMR_AN_... Max. 74.9 mAU.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
757.7
7.913.5
10.09.5
1.0 8.63.02.8 3.3 13.23.81.9 6.54.9 11.55.8 6.7
63% TAHNDSDP2
9%TAHNDSDP1
2%TAHNDSDP3
5%UNK349/465
15%TAHNDSDP4
/UNK373
VIS - 585nm ANAEROB
12% TAHNDSDP2
65% TAHNDSDP42% TAHNDSDP3
12% UNK349/465
VIS - 585nm AEROB
34
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Stoffspezifische Anteile an spektraler Extinktion im UV-Bereich
XWC of DADSpectral Data: 270.0nm from Sample 3 (040901_BMR_AE... Max. 715.8mAU.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
70010.2
9.37.7
8.8
6.3 7.513.6 14.7
XWC of DADSpectral Data: 270.0 nm from Sample 3 (040901_BMR_AN... Max. 331.0 mAU.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min
0
50
100
150
200
250
300
3312.4
7.7
6.55.9
10.05.5 7.9 9.38.8
7.3 13.60.1 12.1 14.55.13.3 11.73.9
54% p-Base
7%
ABESA/ABSEESA
4%
DPBE
3%
Sulfanil-
säure
9%
TAHNDSDP2
10%
TAHNDSDP4
77% TAHNDSDP4
1% ABESA/ABSEESA
6% TAHNDSDP2
6% UNK349/465
6% UNK343
UV - 270nm AEROBUV - 270nm ANAEROB
35
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Anaerobe/Aerobe Abbaubarkeit von Anaerobe/Aerobe Abbaubarkeit von FeedFeed--HauptHaupt-- und Nebenkomponentenund Nebenkomponenten
Farbige
Verbidungen
Nicht
abbaubar
Verbindung RT m/z Q1 m/z Q3 Feed AN AEAnaerobe
AbbaubarkeitAerobe
Abbaubarkeit
NAPB 4,0 241,9 132,9 + + + - +UNK384 5,5 384,2 275,2 + + + - +PBSE 6,1 280,2 171,2 + + + - +UNK145 7,0 145,1 65,0 + + + + +RB-OH 8,5 264,5 79,9 + + + + +RB5-H 8,8 370,5 370,5 + + + + -RB5-H+DPBE 8,9 925,2 861,2 + + - + -RB-NH2 9,2 530,0 316,9 + + - + -RB5-H-H2O 9,2 723,9 660,0 + + - + -
RB5-H+SO2 9,4 806,0 236,0 + + - + -
Di-RB5-H 9,7 1467,4 927,4 + - - + -UNK733 9,9 733,0 236,0 + + - + -
RB5-H-2H2O 10 705,9 642,0 + + - + -
ABSEESA 6,4 307,9 124,9 + + + - -ABSESA 6,6 264,2 81,2 + + + - ~
+ vorhanden/
gut abbaubar
- nicht gefunden/
schlecht abbaubar
~ Schwankende
Abbaubarkeit
36
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Anaerob/aerobe Abbaubarkeit vonAnaerob/aerobe Abbaubarkeit von IntermediatenIntermediaten
Nicht
abbaubar
Compound RT m/z Q1 m/z Q3 Feed AN AE
anaerobicdegradability
aerobicdegradability
p-Base 2,4 200 - + + - +DPBE 4,5 383,0 383 - + + - +Sulfanilsäure 5,2 171,8 79,9 - + + - +VPB 5,2 183,0 183 - + - - +HABSA 6,4 188,2 96,2 - + + - +RB5-H-PB 6,5 545,0 264,0 - + + + +UNK371 7,9 371,2 183,2 - + + - +UNK584 9,1 584,2 424,2 - + - - +UNK661 9,4 661,0 501,0 - + + - +UNK373 10,1 373,2 293,2 - + + ~ +
TAHNDSDP3 8,1 347,9 188,1 + + - - ~
RB5-H-PB 8,3 545,0 264,0 - + + + ~
TAHNDSDP3 8,9 347,9 188,1 - + + ~ ~
UNK386 7,8 358,0 278,0 - + + ~ ~
TAHNDSDP2 7,9 346,9 187,1 - + + - -
TANHDSDP1 8,1 345,9 186,1 - + - - -
UNK543 8,4 543,1 463,1 - + + - -
TAHNDSDP4 10,4 348,9 189,1 - + + - -
+ vorhanden/gut abbaubar
- nicht vorhanden/abbaubar
~ schwankende
Abbaubarkeit
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PrimärePrimäre VerursacherVerursacher vonvon RückverfärbungenRückverfärbungen nachnach aeroberaerober BehandlungBehandlung
SO3HHO3S
HO NH
NH HO
TAHNDSDP2
SO3HHO3S
NH2NH2
HO HO
TAHNDSDP3
Strukturvorschlag
NH2S
O
OO
HO3S
ABSEESA
Meist hochsubstituierte aromatische Verbindungen (Naphthalinderivate)
Anionisch durch ein bis mehrere Sulfonsäuregruppen
Nebenkomponenten aus Farbstoff und auch Abbauprodukte der Farbstoffe
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2 3 4 5 6
-500
-400
-300
-200
-100
0
100
[mV
]
PB
RB5-H
TAHNDSDP2 DAD
RB5-H-PB
TAHNDSDP1
E0
E0 ~ -100mVRB5-H-PB
E0 > -100mVRB5-H-PB
TAHNDSDP1
TAHNDSDP2
RB5-H
E0 < -100mV
RB5-H-PBTAHNDSDP1
TAHNDSDP2
RB5-H
Einfluss des Einfluss des RedoxpotenzialsRedoxpotenzials auf die anaerobe Reduktionauf die anaerobe Reduktion
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%Zeit [d]-2 -1 0 1 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
39
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Einfluss des Einfluss des RedoxpotentialsRedoxpotentials auf den Abbau von C. I. auf den Abbau von C. I. ReactiveReactive Black 5 im anaeroben ReaktorBlack 5 im anaeroben Reaktor
SchwellenwertSchwellenwert --225 mV225 mV
Farbstoffe und ihre Nebenverbindungen
Abbauprodukte und Intermediate
Partial Least Square (PLS-1), The Unscrambler® v9.2
40
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Einfluss des Einfluss des RedoxpotentialsRedoxpotentials auf den Abbau von auf den Abbau von NavyNavy Blue im anaeroben ReaktorBlue im anaeroben Reaktor
Schwellenwert:Schwellenwert: ––255 mV (255 mV (TrichromieTrichromie--Versuch)Versuch)
Farbstoffe und ihre Nebenverbindungen
Abbauprodukte und Intermediate
Partial Least Square (PLS-1), The Unscrambler® v9.2
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Abhängigkeit des Abhängigkeit des RedoxpotenzialsRedoxpotenzials von Ethanolgabenvon Ethanolgaben
BMR AN Redox/ AN AE CSB/ Y/ EtOH
-600
-500
-400
-300
-200
-100
0
100
200
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Zeit [d]
E0
[mV
]
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
CS
B [
gL
-1],
Y [
mM
L-1
d-1
],E
tOH
[m
L]
AN E0 CSB AN CSB AE Y EtOH
Kreislaufbetrieb
Stickstoffspülung
des Reaktors
(HRT 2-4 d)
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ErgebnisseErgebnisse Monitoring und Monitoring und OptimierungOptimierung derder BetriebsparameterBetriebsparameter
Die anaerobe Reduktion korreliert mit dem Redoxpotenzial – steuern!
Unvollständige Reduktion von Diazo-Farbstoffen
bei Redoxpotenzialen > -100mV
Autoxidation von Intermediat TAHNDSDP1 zu TAHNDSDP2/DP3/DP4
Raumbelastungen von 0,5-1,5 mML-1d-1 werden bei E0 < -100 mV
ausreichend reduziert, 1,5 - 5 mM -1d-1 benötigen E0 < -250 mV
Beurteilung des stoffspezifische Abbauverhaltens über Online-LC-DAD-
MS Monitoring und Identifizierung der Verursacher von Restfarbtigkeit
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Online monitoring of a bioprocess based on a multiOnline monitoring of a bioprocess based on a multi--analyser system analyser system and multivariate statistical process modellingand multivariate statistical process modelling
ChristianChristian CimanderCimander
Linköping University,Sweden
CarlCarl--FredericFrederic MandeniusMandeniusNovozymes Biopharma AB, Sweden
J. Chem. J. Chem. TechnolTechnol.. BiotechnolBiotechnol..
77, 115777, 1157--1168, 20021168, 2002
44
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Arbeitskreis Chemische VerfahrensArbeitskreis Chemische Verfahrens-- undund
Prozessanalysentechnik an der FH KölnProzessanalysentechnik an der FH Köln
Danke für Ihre Aufmerksamkeit!Danke für Ihre Aufmerksamkeit!